Testmethoden bei der Filtervalidierung

Testmethoden bei der Filtervalidierung 

Regulatorische 

Anforderungen 

• Viability Test 

• Bakterienbelastungstest 

Prozess 

Validierung 

Wirtschaftlicher 

Herstellprozess 

Validierung der Sterilfiltration, Heike Frankl, Olten, 28.09.2005

Viability Test 

Untersuchung potentieller bakterizider Effekte der 

Produktlösung 

• Zugabe von Brevundimonas diminuta 

Hauptkultur zur Produktlösung 

• Probennahme, Filtration und Koloniezahlbestimmung 

nach definierten Zeitpunkten 

Notwendig bei Produkten mit unbekanntem 

Verhalten 

Daraus leitet sich die Methode für den Bakterienbelastungstest 

(BCT) ab 


Viability Test - Akzeptanzkriterium 

If, after the exposure time, no more than a one log reduction 

in count is noted, the formulation can be considered non 

bactericidal. If a reduction in microbiological concentration of 

more than one log is noted, the product should be 

considered bactericidal, and an alternate testing 

methodology may be considered. 

Quelle: PDA Technical Report No. 26 

> 1 Logstufe in Keimreduzierung = bakterizid 


Mögliche BCT Strategien 

Determine & Document 

Viability of B.diminuta 

in Product under 

Process Conditions 

B.diminuta Viable 



B.diminuta Not Viable 



Direct Inoculation of 

B.diminuta into 

Product under 


Precondition Filter with 

Product - followed by 

Microbial Challenge 

Modify Process - 

Adjust Temperature, etc. 

Use Product for 

Time Period Challenge 

Organism is Viable 

Modify Formulation - 

Adjust pH, Remove 

Bacteriacidal Component 

or Product Surrogate 

Change from B.diminuta 

Use Bacteria Isolated from 

Formulation or Environment 

Quelle: PDA Technical Report No. 26 


1 - Mögliche BCT Strategien 





B.diminuta Viable 



Direct Inoculation of 

B.diminuta into 

Product under 



1 – Beispiel für Viability Test Ergebnis 

5 min. 15 min. 30 min. 45 min. 

0.9% NaCl 129 142 119 128 

Produkt Lösung 132 142 135 130 

BCT mit direkter Inokulation 



• Temperaturbereich 40°C 

führt zum Absterben von 

Brevundimonas diminuta 








• Überprüfung der Lebensfähigkeit der 

Testbakterien in Produktlösung 

bei niedrigerer Temperatur möglich 

- direkte Inokulation in Produktlösung 

könnte bei 33 - 35°C möglich sein 

Modify Process - 

Adjust Temperature, etc. 





3 – Mögliche BCT Strategien 











Use Product for 

Time Period Challenge 

Organism is Viable 



5 min. 30 min. 60 min. 180 min. 

0.9% NaCl 124 117 122 122 


BCT mit direkter Inokulation 

Kontaktzeit Bakterien / Testlösung max. 30 

min. 













Modify Formulation - 

Adjust pH, Remove 

Bactericidal Component 

or Product Surrogate 



5 min. 15 min. 30 min. 60 min. 

0.9% NaCl 201 206 209 222 


Indirekter BCT durch separate Filtration der 

Produktlösung und der Bakteriensuspension 


5 – Mögliche BCT Strategien 

BCT mit Bioburden Isolate 

• Wachstum und Größe des 

Testkeims müssen 

reproduzierbar sein 

• Wachstum in der erforderlichen 

Konzentration für den BCT ist 

Voraussetzung 











Change from B.diminuta 

Use Bacteria Isolated from 

Formulation or Environment 


Bakterienbelastungstest 

Validierung der Rückhaltung von Mikroorganismen an Membranfiltern 

• Brevundimonas diminuta überleben 

in der Produktlösung: 

Direkte Inokulation in Produkt 

• Brevundimonas diminuta überleben nicht 

in der Produktlösung: 

Vorbehandlung der Filter mit Produkt – 

nachfolgend indirekter BCT 

• Belastungskonzentration > 10 7 /cm² Filterfläche 

• Testbedingungen simulieren die aktuellen Prozessbedingungen 

(plissierte Filterelemente, Kontaktzeit, 

aktuelles Produkt, Druck, Temperatur, etc.) 


Mikrobiologische Rückhaltung 

Beeinflussende Parameter Medium 

Produkteigenschaften 

• pH 

• Osmolarität 

• Ionenstärke 

• Viskosität 

Produktzusammensetzung 

• Formulierung 

• Oberflächenaktive 

Substanzen 

• Additive 


Mikrobiologische Rückhaltung 

Beeinflussende Parameter Prozess 

Filtertyp 

• Membranstruktur 

• Membranpolymer 

• Oberflächenmodifizierung 

• Porenverteilung 

• Membrandicke 

Prozessbedingungen 

• Temperatur 

• Zeit 

• Durchfluss 

• Druck 

• Sterilisation 


Prinzipieller BCT Aufbau 

pressure gauge 

venting valve 

venting valve 

valves 

test filter 

capsules 

analytical 

disc filters 

peristaltic pump 

syringe / 

sample collection 

test solution / 

Brevundimonas diminuta 

suspension 





• Viability Test 

• Bakterienbelastungstest 

Prozess 

Validierung 



• Adsorptionstest 

• Chemische 

Kompatibilität 


Chemische Kompatibilität 

Es gibt keine spezifischen Empfehlungen oder Richtlinien der Zulassungsbehörden 

zu Testmethoden auf chemischen Kompatibilität. 

Die folgenden Testmethoden werden auch im Rahmen der Qualitätskontrolle 

von Membranfiltern angewendet. 


Chemische Kompatibilität 

Untersuchungen mit 47 mm Membranmaterial 

Messung der folgenden Parameter und Vergleich 

der Werte vor und nach Produktkontakt unter 

Prozessbedingungen 

• Bubble Point 

• Berstdruck 

• Membrandicke 

• Visuelle Inspektion (REM Aufnahmen) 





• Qualifizierung von 

Integritätstestgeräten 

• Produktbenetzte 

Integritätstestwerte 

Prozess 

Validierung 




Produktspezifische Integritätstestgrenzwerte 

Voraussetzung IQ/OQ 

Das verwendete Integritätstestgerät muss 

einer Qualifizierung unterzogen worden sein 

* Überprüfung der Gerätefunktionen 

* Genauigkeit von Messungen 

* Reproduzierbarkeit der Ergebnisse 

* Fehlermeldungen 

* Messwerte außerhalb Spezifikation 



• Bestimmung produkt- und prozessspezifischer 

Integritätstestgrenzwerte 

(nicht-Standardbedingungen) 

• Nötig für Lösungen mit anderen 

Eigenschaften als Wasser 

• Nötig für nicht-Standardbedingungen 

(z.B. Stickstoff als Testgas) 

Wichtig: Es gibt nur 2 Alternativen für die Bestimmung der Integrität 

100% wasserbenetzte Filter (Grenzwerte gemäß Spezifikation der Filterhersteller) 

100% produktbenetzte Filter (produktspezifische Grenzwerte müssen ermittelt werden) 



PDA TR 26 empfiehlt 

produktspezifische 

Spezifikationen durch Tests 

zu bestimmen – 

nicht nur errechnen 

(z.B. durch Vergleich der 

Oberflächenspannung von 

Benetzungsmedien) 









Prozess 

Filter 

Validierung 

Validation 

• Partikelabgabetest 




Test auf Partikelabgabe 

Untersuchung der Partikelabgabe von Filterelementen unter 

Einfluss der Produktlösung 

• Lasertechnik zur Bestimmung der Partikelgröße und Anzahl 

• Testdurchführung gemäß z.B. USP, BP 

(abhängig in welche Länder ein Arzneimittel verkauft werden soll) 

USP = United States Pharmacopoeia 

BP = British Pharmacopoeia 


Akzeptanzkriterien 

• Bakterienbelastungstest: 

100% Rückhaltung von 

1 x 10 7 Brevundimonas diminuta 

pro cm² Filterfläche 

• Chemische Kompatibilität: 

Bewertung gemäß Filterhersteller Standard 

• Test auf Partikelabgabe: 

gemäß der Pharmacopoeia Grenzen 


Überblick Testmethoden - Filtervalidierung 



Prozess 

Filter 

Validierung 

Validation 



• Viability Test, BCT 

• Adsorptionstest 

• Chemische Kompatibilität 





• Partikelabgabetest 

• Analyse extrahierbarer 

Bestandteile 


Definition Extractables - Leachables 

Extractables 

Substanzen, die aus Elastomeren, Plastik oder Überzügen für 

Container-Verschlusssysteme extrahiert werden können, wenn 

sie sich im Kontakt mit (einem) geeigneten Lösungsmittel(n) 

befinden. 

Leachables 

Substanzen, die aus Elastomeren, Plastik oder Überzügen für 

Container-Verschlusssysteme in Kontakt mit der Formulierung 

„ausgelaugt“ werden. 


Potentielle Quellen für Extractables 

Alle Gegenstände, die im Produktionsprozess verwendet 

werden 

Lagertanks, Bags 

Leitungen, Ventile, Pumpen, Dichtungen 

Reinigungsbehälter 

Filter 

– alle Verpackungsmaterialien 

Verschlusskappen 

Ampullen, Flaschen 

Dichtungen 

Etiketten 


Wechselwirkungen zwischen Formulierung 

und Extractables 

- Inaktivierung der Inhaltsstoffe 

– Fällungen, Absorption, Adsorption 

– pH-Wertänderungen 

– Entfärbung 

– ... 

Wechselwirkungen zwischen Extractables und Inhaltsstoffen 

einer Formulierung können nicht vorhergesagt werden. 


Untersuchungsmethoden zur Bestimmung von Extractables 

laut Arzneimittelbücher (USP, BP, JP...) 

TOC-Analyse 

NVR-Analyse 

Korrelation von pH-Wert und Leitfähigkeit 

Bestimmung von Schwermetallen 

Bestimmung oxidierbarer Substanzen 

Plastik-Klassen Tests 

quantitativ, aber nicht spezifisch 


nicht spezifisch 

selektiv 


nicht spezifisch 

Die in den Arzneimittelbüchern beschriebenen Methoden basieren auf 

Modellmedien. Die individuellen Prozessbedingungen oder 

Prozesslösungen werden nicht berücksichtigt. 

USP = United States Pharmacopoeia 

BP = British Pharmacopoeia 

JP = Japanese Pharmacopoeia 


Analysenmethoden 

Unspezifische Analysen – Summenparameter 

• TOC – total organic carbon (Gesamtkohlenstoff) 

• NVR – non volatile residue (nichtflüchtiger Rückstand) 

Spezifische Analysen – Detektion, Identifizierung 

• HPLC – high performance liquid chromatography 

• GC – gas chromatography 

• FTIR – Fourier transform infrared 

• LC/MS – HPLC gekoppelt mit Massenspektroskopie 

• GC/MS – GC gekoppelt mit Massenspektroskopie 


Quantitative NVR Analyse (Non-Volatile Residue) 

Untersuchung des nichtflüchtigen Rückstands 

• Konzentration nichtflüchtiger Substanzen im Arzneistoff 

ist oft weit höher als als die Menge extrahierbarer 

Substanzen 

(gilt auch für TOC Gehalt - gesamter organischer 

Kohlenstoff) 

• Nicht geeignet für hitzelabile Substanzen 


Quantitative NVR Analyse 

Welche Medien sind geeignet? 

• WFI 

• Reine organische Lösemittel 

• Mischungen aus Wasser und reinen org. Lösemitteln 

Welche Medien sind nicht geeignet? 

• Medien, die Wirkstoff, Tenside oder Salze in Konzentrationen 

größer als 10 ppm enthalten 



RP - HPLC – UV 

- detektiert alle UV-aktiven Substanzen 

- unabhängig von der Molekülgröße 

- sehr empfindliche Methode 

- Extractables im Bereich von 0,1 bis 1 ppm detektierbar 

- keine direkte Identifizierung von Substanzen 

GC – MS 

- Trennung und direkte Identifizierung von unbekannten 

Substanzen 

- empfindliche und selektive Analysenmethode 

- Moleküle bis ~ 500g/mol 



GPC (Gelpermeationschromatographie) 

- Trennung von Substanzgemischen nach Molekülgröße 

- keine direkte Identifizierung 

FT – IR Analyse 

- Identifizierung anhand des charakteristischen IR Spektrums 

- Identifizierung nur von gereinigten Substanzen möglich 

(z.B. Fraktionierung aus der HPLC oder GPC) 


Anforderungen an die Analysenmethoden zur Bestimmung 

von Extractables in Wirkstoff- und Endproduktlösungen 

- höchste Sensitivität für Extractables 

- Ausschluss störender Substanzen 

- gute Anwendbarkeit 


HPLC Vortest 

Keine Störung durch 

Produktkomponenten 

DAD1 A, Sig=220,4 Ref=450,80 (SARTO\AP912103.D) 

mAU 

60 

50 

40 

30 

1.758 

2.350 

Störung durch 

Produktkomponenten 

mAU 

60 

50 

40 

DAD1 A, Sig=220,4 Ref=450,80 (SARTO\INTERF.D) 

2.404 2.258 2.183 

2.737 2.658 

2.561 

30 

20 

20 

10 

0 

3.650 3.911 

10 

0 

3.294 

3.808 

5.768 

0 10 20 30 40 50 

min 

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 

min 

Analytical Method: RP-HPLC 


HPLC mit Probenvorbereitung 

Chromatogramm nach Probenaufarbeitung 

Original HPLC Chromatogramm 

mAU 

60 

DAD1 A, Sig=220,4 Ref=450,80 (SARTO\LOSART26.D) 

4.708 

DAD1 A, Sig=220,4 Ref=450,80 (SARTO\INTERF.D) 

50 

mAU 

60 

50 

40 

2.404 2.258 2.183 

2.737 2.658 

2.561 

40 

30 

Spiked Extractables 

30 

20 

20 

10 

3.294 

3.808 

5.768 

10 

0 

1.892 

3.364 

3.721 

6.837 

7.620 

11.818 

24.755 

27.937 

0 

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 

min 

0 10 20 30 40 50 

min 

Analytical Method: RP-HPLC 

Das störende Protein wurde durch Flüssig/Flüssig Extraktion entfernt 

Zum Nachweis, dass potentielle Extractables durch die 

Probenaufarbeitung nicht entfernt würden, wurde die Produktprobe vor 

Aufarbeitung mit Modellextractables gespikt. 


Praktische Aspekte: Beispiel einer Extraktion 

Extraktionsgefäß 

Extraction containment 

mit Filterkerze 

with filter element 

Blank 

Blindwert-Probe 

Shaker 

Schüttler 


Erste Bewertung: 

Vergleich von Chromatogrammen 

mAU 

60 


1.758 

2.350 

mAU 

60 


1.755 

2.396 

50 

40 

30 

20 

10 

3.650 3.911 

• Peaks kommen aus der 

Produktformulierung 

• Können in bezug auf 

Filterextractables 

vernachlässigt werden 

50 

40 

30 

20 

10 

3.644 3.914 

• Es wurden keine 

zusätzlichen Peaks 

detektiert 

• Kein Hinweis auf 

Extractables 

0 

0 

0 10 20 30 40 50 

min 

0 10 20 30 40 50 

min 

Blindprobe (Produkt ohne Filterkontakt) 

Extraktionsprobe (Produkt nach Filterkontakt) 

Analysemethode: RP-HPLC 


Akzeptanzkriterien 

• Extractables Analyse: 

Wenn in der Analyse extrahierbare Bestandteile 

gefunden wurden, muss das Risiko für das 

pharmazeutische Produkt bewertet werden 


Extractables – Analyse: 

Regulatorische Anforderungen 

EC GMP Guide (1992): 

Der Filter sollte das Produkt durch Entfernen von Inhaltsstoffen oder 

Abgabe von Substanzen in dieses nicht beeinflussen. 

ISO Aseptic Processing of Health Care Products (1993): 

...sicherzustellen, dass der Filter und das Filtersystem keine 

unerwünschten Inhaltsstoffe in Gase oder in Flüssigkeiten abgeben, die 

durch den Filter hindurchströmen. 


Regulatorische Anforderungen 

• Materialien für pharmazeutische Anwendungen dürfen keine 

gefährdenden Substanzen oder unerwünscht großen Mengen der 

in Frage kommenden Substanzen abgeben 

• alle Materialien, die in direktem oder indirekten Kontakt mit der 

Formulierung stehen, müssen berücksichtigt werden 

Guidance for Industry 

„Container Closure Systems for 

Packaging Human Drugs and Biologics“ 

FDA, CDER, CBER, May 1999 


ICH Guideline (Q3B Impurities in New Drug 

Products ) 

• gilt für neue Arzneimittel 

• Identifizierung und Quantifizierung von Verunreinigungen 

(Abbauprodukte) gefordert 

• maximal zulässige Menge an Verunreinigung darf 0,1 % 

bezogen auf den Wirkstoffgehalt betragen 

• Toxikologische Einstufung und Bewertung der 

Verunreinigungen 


Risikoabschätzung - zur Diskussion 

Extractables gefunden ? 

nein 

- keine 

weitere Vorgehensweise 

notwendig 

welche ? 

- zusätzliche 

Analysen 

- toxikologische 

Untersuchungen 

ja 

wieviel ? 

Bulkfiltration Abfüllung 

- bei großen - Erstellung eines 

Volumina ist Ausspülprotokolls 

die Verdünnung - wieviel Ampullen 

groß 

müssen verworfen 

- Extractablesfund werden ? 

vernachlässigbar ? 


Extractables Test Strategie (in Anlehnung an die 

FDA Guidance for Industry, Container Closure Systems for 

Packaging Human Drugs and Biologics, May 1999) 

Komponente aus 

Kunststoff 

Filter 

Beutel 

Vials, Flaschen, Ampullen, 

Stopfen, Spritzen, etc. 

Analysenmethode 

HPLC-UV* 

HPLC-UV 

GC-MS 

(mapping) 

HPLC-UV 

GC-MS 

(mapping) 

Extraktionsmedium 




(worst case Lösemittel) 



(worst case Lösemittel) 

* basierend auf den Ergebnissen der relevanten Extractables Mapping Studien 


Zusammenfassung 

• Mit einer einzigen Analysenmethode können nicht immer alle 

Anforderungen erfasst werden 

• Für die Profilerstellung von Extractables werden Modellmedien unter 

„Worst-case“ Bedingungen verwendet 

• Für die Prozeßvalidierung sollte die aktuelle Formulierung verwendet werden 

• Jede Prozeßvalidierung ist eine neue Fall zu Fall Entscheidung 

• Die Verwendung von HPLC, GC-MS und LC-MS für die Extractables Analyse 

mit geeigneten Probenaufbereitungmethoden ermöglichen die 

Analyse von Wirkstoff- und Endproduktlösungen.

Testmethoden bei der Filtervalidierung

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