สไลด์ประกอบการบรรยาย

บทที่ 4
อาหารเลี้ยงเชื้อ และการก าจัดเชื้อ

อำหำรเลี ้ยงเชื ้อจุลินทรีย์ (medium)
จ ำเป็ นต่อกำรเพำะเลี ้ยงจุลินทรีย์ในห้องปฏิบัติกำร
ต้องใช้อำหำรเลี ้ยงเชื ้อที่เหมำะสมกับจุลินทรีย์
จุลินทรีย์ที่ต่ำงชนิดกันก็ต้องกำรสำรอำหำรที่ต่ำงกัน
ช่วยในกำรคัดแยก จ ำแนกจุลินทรีย์: คุณสมบัติเฉพำะของจุลินทรีย์

อำหำรเลี ้ยงเชื ้อที่ดี
มีสำรอำหำรที่เหมำะสมกับจุลินทรีย์ที่ต้องกำร
ชนิดและปริมำณ มีค่ำพีเอช ควำมชื ้น
ปรำศจำกสำรพิษที่จะยังยั ้งกำรเจริญของจุลินทรีย์ที่ต้องกำร
ปรำศจำกจุลินทรีย์อื่น

ความต้องการสารอาหารของจุลินทรีย์
แหล่งไนโตรเจน
แหล่งคาร์บอน
เกลือแร่
วิตามิน

แหล่งไนโตรเจน
จุลินทรีย์แต่ละชนิดมีควำมต้องกำรไนโตรเจนแตกต่ำงกัน
ใช้ไนโตรเจนในรูปที่แตกต่ำงกัน
แก๊สไนโตรเจน
สำรอินทรีย์ไนโตรเจน : โปรตีน กรดแอมิโน เพบไทด์
สำรอนินทรีย์ไนโตรเจน : เกลือไนไตรต์ ไนเตรต แอมโมเนีย
ทั่วไปมักใช้ peptone, tryptones and trypticases

แหล่งคาร์บอน
จุลินทรีย์แต่ละชนิดมีควำมต้องกำรคำร์บอนแตกต่ำงกัน
ใช้คำร์บอนในรูปที่แตกต่ำงกัน
แก๊สคำร์บอนไดออกไซด์
สำรอินทรีย์คำร์บอน : คำร์โบไฮเดรต โปรตีน ลิพิด
สำรอนินทรีย์คำร์บอน : เกลือคำร์บอเนต
ทั่วไปมักใช้น ้ำตำลและแป้ งเป็ นแหล่งคำร์บอน

เกลือแร่
จุลินทรีย์ต้องกำรน้อยมำกเมื่อเทียบกับไนโตรเจน และคำร์บอน
มีบทบำทส ำคัญในกำรควบคุมกระบวนกำร electrolyte ของเซลล์
จุลินทรีย์แต่ละชนิดก็จะต้องกำรเกลือแร่ที่แตกต่ำงกันออกไป
แบคทีเรียที่เจริญในทะเล
archaeobacteria
ชอบควำมเค็มจัด
ไม่เจริญในอำหำรที่มีเกลือต ่ำกว่ำ 12-15%

วิตำมิน
เป็ นสำรประกอบที่จุลินทรีย์ต้องกำรในปริมำณที่น้อย
แต่ส ำคัญต่อกำรด ำรงชีวิตและกำรเจริญเติบโตของจุลินทรีย์
ท ำหน้ำที่เป็ นโคเอนไซม์ในปฏิกิริยำต่ำง ๆ
บำงชนิดต้องกำรวิตำมินส ำหรับกำรเจริญเติบโต

ควำมต้องกำรวิตำมินของแบคทีเรียบำงชนิด
ไทอำมิน (B 1
)
ไรโบเฟลวิน (B 2
)
ไนอำซิน
ไพริดอกซิน (B 6
)
ไบโอทิน
กรดแพนโทเทนิก
กรดโฟลิก
โคบำลำมิน(B 12
)
วิตำมินเค
Bacillus anthracis
Clostridium tetani
Brucella abortus
Lactobacillus spp.
Leuconostoc mesenteroides
Proteus morganii
Leuconostoc dextranicum
Lactobacillus spp.
Bacteriides melaninogenicus
ที่มำ (นงลักษณ์และปรีชำ, 2544, หน้ำ 77)

ชนิดของอาหารเลี้ยงเชื้อ
แบ่งออกเป็ น 2 ชนิดใหญ่ ๆ คือ
อาหารเลี้ยงเชื้อที่จ าแนกตามส่วนประกอบของอาหาร
chemically define media หรือ synthetic media
artificial media หรือ non-synthetic media
อาหารเลี้ยงเชื้อแบ่งตามการใช้ประโยชน์
enriched media selective media
differential media assay media
media for enumeration of microorganism
media for characterization of microorganism
maintenance media

อาหารเลี้ยงเชื้อที่จ าแนกตามส่วนประกอบของอาหาร
chemically define media หรือ synthetic media
อำหำรเลี ้ยงเชื ้อที่ทรำบส่วนประกอบ
ทำงเคมีที่แน่นอนหรืออำหำรสังเครำะห์
นิยมใช้ในห้องปฏิบัติกำร
เปรียบเทียบกำรเจริญต่อกำรใช้
สำรเคมีต่ำง ๆ ที่ทรำบปริมำณ

ไนเตรทบรอท (nitrate broth)
KNO 3 5 กรัม
กลูโคส 5 กรัม
K2HPO 4 0.5 กรัม
CaC l2 .2H 2 O 0.2 กรัม
MgCO 3 0.2 กรัม
น ้ำกลั่น 1 ลิตร

artificial media หรือ non-synthetic media
ไม่ทรำบส่วนประกอบทำงเคมีที่แน่นอนว่ำประกอบด้วยสำรใด ปริมำณเท่ำไร
ส่วนประกอบเป็ นเนื ้อเยื่อพืช เนื ้อเยื่อสัตว์ : สำรอินทรีย์หลำยชนิด
นิยมใช้เพื่อเลี ้ยงจุลินทรีย์ให้เจริญเติบโต

อีโอซินเมทธีลีนบลูอะกำร์
(Eosin methylene blue agar; EMB agar)
Peptone 10 กรัม
K 2 HPO 4 2 กรัม
อีโอซิน 0.4 กรัม
เมทธีลีนบลู 0.065 กรัม
อะกำร์ 15 กรัม
น ้ำกลั่น 1 ลิตร

enriched media
อาหารเลี้ยงเชื้อแบ่งตามการใช้ประโยชน์
ใช้แยกจุลินทรีย์ที่ต้องกำรออกจำกจุลินทรีย์อื่น
เติมสำรที่ส่งเสริมกำรเจริญของจุลินทรีย์ที่ต้องกำร
และยับยั ้งกำรเจริญของจุลินทรีย์อื่น
selenite broth เป็ นอำหำรที่ส่งเสริมกำรเจริญของ Salmonella
มีซิลีไนท์ที่ยับยั ้งกำรเจริญของแบคทีเรียในล ำไส้อื่น ๆ
แต่ส่งเสริมกำรเจริญของซำโมเนลลำ

selective media
ใช้แยกจุลินทรีย์ที่ต้องกำรออกจำกจุลินทรีย์อื่นเช่นเดียวกัน
เติมสำรเคมีบำงอย่ำงเพื่อยับยั ้งกำรเจริญของจุลินทรีย์ที่ไม่ต้องกำร
แต่ไม่มีผลต่อจุลินทรีย์ที่ต้องกำรศึกษำ
(Eosin methylene blue agar; EMB agar)
Peptone 10 กรัม
K 2 HPO 4 2 กรัม
อีโอซิน 0.4 กรัม
เมทธีลีนบลู 0.065 กรัม
อะกำร์ ยับยั ้งกำรเจริญของแบคทีเรียแกรมบวก 15 กรัม
น ้ำกลั่น แต่แบคทีเรียแกรมลบเจริญได้ 1 ลิตร

E. coli
Enterobacter
ที่มำ (http:// www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/ Articleimages/Atlas_ EMB/E.coli_EMB_fig1.jpg, 2007)

differential media
ใช้แยกชนิดของจุลินทรีย์ที่เจริญปะปนกันอยู ่หลำยชนิด
อำศัยควำมแตกต่ำงของโคโลนีขณะเจริญในอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ
จะเติมสำรเคมีบำงชนิดเพื่อใช้เป็ นอินดิเคเตอร์

lood agar
เป็ นอำหำรแข็งที่เติมเลือด
เชื ้อย่อยสลำยเม็ดเลือดแดงได้สมบูรณ์ : เกิด clear zone รอบโคโลนี
เชื ้อย่อยสลำยเม็ดเลือดแดงได้บำงส่วน : เกิดสีเขียวจำง ๆ รอบโคโลนี
เชื ้อย่อยสลำยเม็ดเลือดแดงไม่ได้ : ไม่เกิดบริเวณใสรอบโคโลนี
โคโลนี บริเวณใส
ที่มำ (Nester, Anderson, Roberts and Nester, 2007, p.100)

media for enumeration of microorganism
ใช้ในกำรตรวจนับจุลินทรีย์จำกแหล่งต่ำง ๆ
: จุลินทรีย์ในน ้ำ นม อำหำร ดิน อำกำศ
องค์ประกอบต้องเหมำะกับกำรเจริญของจุลินทรีย์ในตัวอย่ำง
media for characterization of microorganism
ใช้ตรวจสอบสมบัติในกำรเจริญ
สมบัติที่ท ำให้เกิดกำรเปลี่ยนแปลงทำงสรีรวิทยำและชีวเคมีของจุลินทรีย์

maintenance media
ใช้เก็บรักษำจุลินทรีย์ชั่วครำวก่อนที่จะน ำไปวิเครำะห์ในห้องปฏิบัติกำร
เพื่อให้มีชีวิตอยู ่ได้นำนที่สุด โดยที่สมบัติยังคงเดิม
มีกำรลดองค์ประกอบบำงอย่ำงในอำหำรลง : จุลินทรีย์เจริญ
ปลดปล่อยของเสียน้อยลง
โดยทั่วไปจะประกอบด้วย buffer และเกลือแร่เท่ำนั ้น

อำหำรเลี ้ยงเชื ้อบำงชนิดอำจมีคุณสมบัติได้มำกกว่ำหนึ ่งแบบ
Mac Conkey agar : ใช้ส ำหรับแยกแบคทีเรียแกรมลบที่อยู ่ในล ำไส้
สีคริสตัสไวโอเลต และ bile salt
ยับยั ้งกำรเจริญของ G+
G- สำมำรถเจริญได้
selective media

G- ที่เจริญ
ย่อยน ้ำตำลแลกโทสได้
กรด
โคโลนีจะมีสีแดง
ไม่ก่อโรค
ย่อยน ้ำตำลแลกโทสไม่ได้
โคโลนีจะไม่มีสี
สีของ neutral red (indicator) เปลี่ยนแปลง
differential media

Mac Conkey agar
ที่มำ (Nester, Anderson, Roberts and Nester, 2007, p.100)

การท าให้ปราศจากเชื้อ
กำรศึกษำจุลินทรีย์ในห้องปฏิบัติกำร : เพำะเลี ้ยงเป็ นเชื ้อบริสุทธิ ์ ไม่มีสิ่งมีชีวิตอื่น
ต้องก ำจัดจุลินทรีย์
ในพื ้นที่ปฏิบัติกำร
อำหำรเลี ้ยงเชื ้อ
ภำชนะที่ใช้ในกำรเพำะเลี ้ยงจุลินทรีย์

กำรท ำให้ปรำศจำกสิ่งมีชีวิตในอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ วัสดุ และอุปกรณ์ต่ำง ๆ
ที่ใช้ในห้องปฏิบัติกำรที่ใช้กันเป็ นประจ ำมีทั ้งสิ้น 3 วิธี
กำรใช้ควำมร้อนชื ้น
กำรใช้ควำมร้อนแห้ง
กำรกรอง
กำรใช้ควำมร้อนชื ้น
autoclave
ที่มำ (http://www.moe.gov.sg/edumall/tl/digital_resources/biology34.html, 2007)

การท าให้ปราศจากเชื้อด้วยความร้อนชื้น
autoclave เป็ นอุปกรณ์ที่ใช้ในกำรท ำให้ปรำศจำกเชื ้อด้วยควำมร้อนชื ้น
ปรับควำมดันของไอน ้ำให้มีค่ำ 15 ปอนด์ต่อตำรำงนิ้ว
จุดเดือดของน ้ำอยู ่ที่ 121 ° C
สูงพอที่จะท ำลำยเอนโดสปอร์ของจุลินทรีย์

autoclave
ต้องสำมำรถทนต่ออุณหภูมิสูงได้
ไม่เกิดกำรเปลี่ยนลักษณะภำยนอกหรือคุณสมบัติของสำร
ใช้ในกำรท ำให้อำหำรเลี ้ยงเชื ้อ ส ำลีพันปลำยไม้ ให้ปรำศจำกเชื ้อจุลินทรีย์
ใช้ในกำรท ำให้เครื่องแก้ว ปรำศจำกเชื ้อได้โดยใส่สิ่งเหล่ำนี ้ในถุงพลำสติก
ส่วนเวลำที่ใช้ในกำรท ำลำยจุลินทรีย์จะแตกต่ำงกันไป ปกติใช้เวลำ 15-20 นำที
ของเสียหรือวัตถุอันตรำยทำงชีววิทยำ (biohazard) ต้องใช้เวลำอย่ำงน้อย 45 นำที

การท าให้ปราศจากเชื้อด้วยความร้อนแห้ง
ใช้ส ำหรับกำรท ำให้ เครื่องแก้ว
อุปกรณ์โลหะ
สำรบำงชนิด
: ปิ โตรเลียมเจล น ้ำมันแร่ และฟำรำฟิ น
ปรำศจำกเชื ้อจุลินทรีย์
Hot air oven
ใช้อุณหภูมิ 160-180 ° C (320-356 ° F) นำน 2-3 ชั่วโมง
ท ำให้เกิด oxidative destruction ต่อโพรโทพลำซึมของจุลินทรย์
สำมำรถท ำลำยจุลินทรีย์ทุกชนิด รวมทั ้งสปอร์ของแบคทีเรีย
ที่มำ (http://www.labdepotinc.com/Category_Details~id~99.aspx, 2007)

ควำมร้อนแห้งไม่สำมำรถแทรกซึมผ่ำนสิ่งต่ำง ๆ ได้ดีเท่ำกับควำมร้อนชื ้น
ใช้ควำมร้อนสูงกว่ำและเวลำนำนกว่ำ

การท าให้ปราศจากเชื้อด้วยการกรอง
ใช้หลักกำรทำงกำยภำพในกำรก ำจัดจุลินทรีย์จำกสำรละลำยและตัวท ำละลำย
นิยมใช้กับสำรละลำยที่ไม่ทนต่ออุณหภูมิสูง สำรที่ไวต่อควำมร้อน
รวมถึงสำรปฏิชีวนะ น ้ำตำล เอนไซม์
และสำรที่ส่งเสริมกำรเจริญ เช่น วิตำมิน ปรำศจำกจุลินทรีย์
วัสดุกรองท ำจำก polymer สังเครำะห์ หรือ cellulose ester ที่มีรู 0.025-8

มีเฉพำะสำรละลำยเท่ำนั ้นที่ผ่ำนรูพรุนไปได้
ขณะที่แบคทีเรีย ฟังไจ ไวรัสผ่ำนไม่ไปได้
ถูกกรองไว้
ก่อนท ำกำรกรองเครื่องกรองและวัสดุกรองจะต้องท ำให้ปรำศจำกเชื ้อ
ด้วยกำรนึ ่งฆ่ำเชื ้อ ที่อุณหภูมิ 121 ° C นำน 15 นำที
กำรกรองสำรปริมำตร 1-20 มิลลิลิตร
กระบอกฉีดยำดูดของเหลว
แรงดันก้ำนกระบอก
สำรผ่ำนให้ไหลผ่ำนวัสดุกรองลงสู ่ภำชนะปลอดเชื ้อ

ของเหลว
รู
วัสดุกรอง
ของเหลวปลอดเชื ้อ
สุญญำกำศ
ที่มำ (Cowan and Talaro, 2002, p.330)

ค าถามท้ายบท
้
1. อำหำรเลี ้ยงเชื ้อที่ดีควรมีคุณสมบัติอย่ำงไร อธิบำย
2. สำรอำหำรที่จุลินทรีย์ต้องกำรมีกี่ประเภท อธิบำย
3. จงยกตัวอย่ำงอำหำรเลี ้ยงเชื ้อที่ทรำบส่วนประกอบทำงเคมีที่แน่นอน มำ 3 ชนิด
พร้อมแสดงสูตรอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ
4. จงยกตัวอย่ำงอำหำรเลี ้ยงเชื ้อที่ไม่ทรำบส่วนประกอบทำงเคมีที่แน่นอน มำ 3
ชนิด พร้อมแสดงสูตรอำหำรเลี ้ยงเชื ้อ
5. จงอธิบำยควำมหมำยของอำหำรเลี ้ยงเชื ้อประเภทต่ำง ๆ ดังนี เอ็นริชมีเดีย อำหำร
คัดเลือก อำหำรเลี ้ยงเชื ้อที่บอกควำมแตกต่ำง อำหำรที่ใช้วิเครำะห์ อำหำรที่ใช้
ตรวจนับจ ำนวนจุลินทรีย์ อำหำรที่ใช้ศึกษำสมบัติของจุลินทรีย์ และอำหำรที่ใช้
เก็บรักษำจุลินทรีย์
6. กำรก ำจัดสิ่งมีชีวิตที่นิยมใช้ห้องปฏิบัติกำรทำงจุลชีววิทยำ มีกี่วิธี อธิบำย