Diagnostic biologique de la Maladie de Willebrand

Diagnostic biologique de la
Maladie de Willebrand
Prérequis :
connaître la physiologie de l’hémostase primaire,
du Facteur Willebrand et d’ADAMTS 13
B. Delahousse - Cours DES 2012

1. Maladie de Willebrand congénitale
1. Définition,
2. Clasification types et sous types
3. Diagnostic biologique
1. Circonstances
2. Tests diagnostiques de dépistage
3. Tests diagnostiques de confirmation de 1 ère intention
et spécialisés de 2 ème intention
4. Prise en charge thérapeutique
1. Tests de réponse au DDAVP
2. Maladie de Willebrand acquise
1. Définition/étiologies
2. Mécanismes physiopathologiques
3. Diagnostic biologique
4. Prise en charge
Plan

Maladie de Willebrand congénitale
1- définition
• Maladie hémorragique :
– antécédents personnels et ou familiaux d’accidents
hémorragiques
• Liée à un déficit quantitatif (types 1 et 3) ou qualitatif (type 2)
du facteur Willebrand (VWF)
• Résulte d’une anomalie moléculaire d’au moins l’un des 2
allèles du gène du facteur Willebrand (VWF)(chromosome12)
• Transmission autosomale dominante ou récessive
• Extrêmement hétérogène sur le plan phénotypique et
génotypique
– Risque hémorragique très variable
– Age du diagnostic très variable

Symptomatologie hémorragique dans la
maladie de Willebrand
Peu spécifique : saignements cutanéo-muqueux dont les plus
significatifs sont :
Ménorragies
Saignement après extraction dentaire
Hémarthroses rares (type 3 ++)
W.L.Nichols et al Hemophilia 2008; 14 : 171-232

Maladie de Willebrand congénitale
2- Classification
Type 1 : déficit quantitatif partiel en VWF
50 à 75% des malades
(transmission dominante)
Types 2 : déficit qualitatif en VWF
15 à 30% des malades
(transmission dominante ou récessive)
Type 3 : déficit quantitatif quasi total en VWF
< 5% des malades
(transmission récessive)

Maladie de Willebrand de type 1
• Antécédents hémorragiques personnels ou
familiaux +++
• Déficit partiel (≤30%) en facteur Willebrand
sans anomalie fonctionnelle associée
• Absence de discordance entre la
concentration plasmatique de facteur
willebrand [VWF:Ag] et les tests fonctionnels
[VWF:RCo] [VWF:CB]
• Diminution équivalente du facteur VIII [FVIII:C]

Mécanismes physiopathologiques des types 1
• Mutations entraînant une
anomalies de sécrétion =
diminution de la
concentration plasmatique
sans altération de la
structure multimérique - taux
circulants 10-50%
• Mutations entraînant une
clairance accélérée =
réduction d’exposition des
multimères à ADAMTS13 :
persistance des multimères
ultra larges- taux circulants
6-12%
– Exemple : mutation
VICENZA clairance x10
Anomalie de sécrétion dans VWD Type 1
Initial
Initial
k Protéolyse
k Sécrétion
k Protéolyse
k Sécrétion
Plasma
=
10-50 U/dl
k Clairance
Clairance accélérée dans VWD Type 1
Plasma
ULVWF
=
6-12 U/dl
k Clairance

Difficulté diagnostique ++ : déficits quantitatifs modérés
en facteur Willebrand (30-50%) ou maladie de Willebrand?
prudence
• Tenir compte :
1. des facteurs de variations des
concentrations plasmatiques du facteur
Willebrand :
• groupes sanguins : taux < chez sujets
de groupe O
• augmentation transitoire dans les
situations suivantes :
– Stress (exemple =anxiété avant
prélèvement chez enfant++)
– Exercice physiaue
– Inflammation
– Grossesse, cycle menstruel..
Répéter les dosages
VWF Moyenne +/- 2 SD
O 75 36 – 157 %
A 106 48 – 234 %
B 117 57 – 241 %
AB 123 64 – 238 %
2. de la symptomatologie hémorragique
associée: ATCD personnels et familiaux
+++ toutefois parfois difficile car signes
cliniques peu spécifiques

Maladies de Willebrand de type 2
• Antécédents hémorragiques personnels ou
familiaux
• Anomalies fonctionnelles du facteur Willebrand
circulant :
anomalies d’interaction avec les plaquettes
types 2A, 2B et 2M
anomalies d’interaction avec le facteur VIII
type 2N

Types 2
+ anomalie d’interaction avec les plaquettes
liée à l’absence des multimères de haut PM
types 2A
liée à une anomalie de liaison du VWF à la
GPIb
type 2M
Perte d’affinité
type 2B Augmentation d’affinité

Mécanismes physiopathologiques des types 2A :
diminution de l’affinité pour la GPIb plaquettaire avec
absence de multimères de HPM
Due à :
– soit une sensibilité accrue à la protéolyse par
ADAMTS 13 mutations dans domaine A2
– soit une anomalie de synthèse des multimères
mutations au niveau du propeptide, des
domaines D1, D3 (multimérisation anormale ±
rétention intracellulaire ± clairance accélérée) ou
du domaine CK (dimérisation anormale)

Multimérisation
ADAMTS13
dimérisation
2A 1 mutations entraînant une synthèse anormale des multimères
(déficit de multimérisation, déficit de dimérisation)
2A 2 mutations entraînant une sensibilité accrue à la protéolyse = type 2A le plus classique

Mécanismes physiopathologiques des types 2B :
augmentation de l’affinité pour la GPIb plaquettaire
mutations au niveau du
domaine A1 (site de liaison à
GPIb) induisant une
conformation « active » du
VWF Augmentation de
l’interaction du VWF avec la
GPIb
Endothélium
Sites potentiels d’action d’ADAMTS13 sur le facteur
Willebrand
Flux sanguin
(forces de cisaillement élevées)
ADAMTS13
Plaquettes
Sous-endothélium
Les multimères de HPM se lient spontanément
aux plaquettes (thrombopénie possible) et sont
alors clivés par ADAMTS13 perte des
multimères de HPM et déficit de l’adhésion des
plaquettes.

Mécanismes physiopathologiques des types 2M (M pour Multimères)
diminution de l’affinité pour la GPIB plaquettaire
avec présence de multimères de HPM
1. mutations dans le domaine A1 interférant avec
la liaison VWF-GPIb sans affecter les multimères
de HPM
2. mutations dans le domaine A3 altération de la
liaison VWF-collagène (variant collagène)

Mécanismes physiopathologiques des type 2N
= anomalie de liaison du VWF au facteur VIII
mutations domaines D’ ou D3 (site de liaison au FVIII)
Variant Normandie : première description en
France* anomalie qualitative avec diminution
importante de l’interaction du VWF avec le FVIII
(VWF:FVIIIB)
Le phénotype est identique à celui de l’hémophilie A
ou parfois est combiné à un taux diminué de VWF:Ag
(FVIII/VWF:Ag < 0.5)
*Nishino et al, Blood 1989; Mazurier et al, Blood 1990

Maladie de Willebrand Type 3
Déficit quasi complet en Facteur Willebrand
Transmission récessive
Homozygote ou hétérozygote composite
Mutations non sens, petites et larges délétions,
défauts d’épissages, petites insertions…

Maladie de Willebrand congénitale
3- diagnostic biologique
Circonstances du diagnostic :
– Symptomatologie hémorragique
– Enquête familiale
– Fortuit : diagnostic biologique d’un
allongement isolé du TCA avec test du
mélange corrigé

Maladie de willebrand congénitale
Tests diagnostiques de dépistage*
• Temps de saignement contreversé (non spécifique et
opérateur dépendant)
• Numération des plaquettes (Normale. Peut être diminuée
dans types 2B)
• Temps de céphaline activé
intensité de l’allongement corrélée avec l’importance du
déficit en FVIII ,
intensité de l’allongement fonction de la sensibilité du
réactif utilisé vis-à-vis des déficits modérés en FVIII.
dans les limites de la normale chez~ 50% des patients
• Temps d’occlusion (PFA-100)
très sensible à toutes les anomalies du VWF sauf celles du
type 2N
*NB :en plus de l’hémogramme et du Test de Quick fait devant tout sd hémorragique

Maladie de Willebrand congénitale
Tests diagnostiques de confirmation de 1 ère intention
• Dosage du facteur Willebrand :
– tests fonctionnels =
• VWF:RCo test de référence: mesure l’activité cofacteur
de la ristocétine du VWF (liaison à la GPIb plaquettaire)
• VWF:CB (collagen binding) mesure la capacité du VWF
à se fixer au collagène non effectué en première
intention (laboratoires spécialisés)
– testimmunologique = VWF:Ag mesure la
concentation plasmatique du facteur Willebrand
indépendamment de sa fonction.
• Dosage du facteur VIII =
– les concentrations plasmatiques de FVIII:C sont liées à la
concentration plasmatique du VWF

Dosage de l’activité cofacteur de la
ristocétine VWF:RCo (test de référence*)
Principe : l’antibiotique Ristocétine (réactif) procure une surface
chargée positivement qui permet aux multimères de haut poids
moléculaires du VWF ( plasma à tester) de se fixer sur des plaquettes
normales ou des membranes plaquettaires (réactif) et de provoquer
leur agglutination.
– Test sur plaque de verre : lecture à l’œil nu de l’agglutination des
plaquettes (ou membranes plaquettaires) en présence de ristocétine et
de dilutions successives de plasma à tester. Le résultat est semi-quantitatif.
– Test adapté sur un agrégamètre : évaluation quantitative de l’activité
cofacteur de la ristocétine.
Valeur de référence ≥ 50%
Prudence : test ayant une mauvaise reproductibilité intra et inter laboratoire nécessité
d’avoir un CQI valeur haute et basse et d’être affilié à un CQE
* NB : autres tests fonctionnels évaluant la liaison à la GPIb
en cours d’évaluation mais n’ont pas remplacé le VWF:RCo de référence

Dosage immunologique du facteur
Willebrand VWF: Ag
• Méthodes ELISA (Stago, Hyphen,Technoclone …)
• Méthodes ELFA(Biomérieux Vidas)
• Méthode d’ immunodiffusion radiale type Laurel
(Helena laboratory Rocket)
• Méthodes Latex automatisées sur appareil
d’hémostase ayant un module immunoturbidimétrie =
Liatest (Instrumentation laboratory, Stago)
Valeurs de références = 50-150%

Dosage fonctionnel du Facteur VIII
FVIII:C
• Principe : TCA effectué sur un mélange dilué de plasma à tester et
d’un plasma réactif déficient en facteur VIII contenant tous les autres
facteurs en concentration normale. Dans ces conditions
l’allongement du TCA observé est directement proportionnel aux
concentrations circulantes de FVIII.
• Les résultats sont exprimés en pourcentages par rapport à une droite
d’étalonnage (Log/Log)
• Prudence : Les droites d’étalonnage sur la majorité des automates
ne sont pas linéaires de 0 à 100%. Deux types de gammes doivent
donc être effectuées, gamme « large » 25-100% et gamme fine (0-
25%). Sur les gammes fines un blanc réactif doit être
systématiquement passé car les plasmas déficients réactifs peuvent
contenir des traces de Facteur VIII.
Valeurs de références = 50-150%

Interprétation des résultats des
tests diagnostiques de 1 ère intention
Type 3 déficits profonds du VWF: RCO et du VWF:AG et du FVIIIC
Type 1 déficit en VWF: RCO proportionnel au VWF :Ag et au FVIII: C
Types 2 déficit plus marqué du VWF:RCO
Rapport VWF:RCo /VWF:Ag > 0.7 : type I
Rapport VWF:RCo /VWF:Ag < 0.7 : types 2 sauf 2N
Nichols et al Haemophilia 2008

Tests spécialisés de deuxième intention:
aide au diagnostic des # types de Willebrand
• Collagen Binding Assay (CBA) VWF:CB
mesure la capacité des multimères de haut poids
moléculaires à se fixer au collagène coaté sur une
plaque ELISA
révélation par immunoconjugué anti VWF /OPD
La source de collagène détermine la spécificité
de l’essai : collagène de type III++
Rapport VWF:CB /VWF:Ag > 0.7 : types I
Rapport VWF:CB /VWF:Ag < 0.7 : types 2 sauf 2N

Protéolyse
augmentée
Multimérisation
anormale

Tests spécialisés de 2 ème intention
orientation du diagnostic des types 2
• Ristocetin Induced Platelet Agglutination
(RIPA)
Normal
1.1
1.0
Type 2a
Type 2b
0.5
0.4
0.3
Agglutination anormale
des Plaquettes
de Willebrand type 2B
aux faibles concentrations
de Ristocétine ≤0.6 mg/ml
0.9
0.8
2.0
1.0
0.2
1 min
1 min
1 min

Tests spécialisés de 2 ème intention
orientation du diagnostic des types 2
Etude de la structure multimérique du VWF par
électrophorèse sur agarose en présence de
dodécylsulfate et révélation par Western Blot
HPM

Tests spécialisés de 2 ème intention
orientation du diagnostic des types 2
Etude de la liaison F Willebrand/ F VIII:
déficitaire dans type 2 N
-Méthode
radioimmunologique (Mazurier
1990)
- Méthode ELISA :
plaque coatée
avec anticorps monoclonal
anti Willebrand
+ dilutions de plasmas à testerincubation,
lavage
+ FVIII recombinantincubation,
lavage
+ anti facteur VIII couplé à la
peroxydase.

Maladie de Willebrand,
3- Prise en charge thérapeutique
3 approches individuelles ou combinées :
• Desmopressine [DDAVP] (Octim ® voie nasale,
Minirin ® voie injectable) : augmentation des
taux circulants de VWF par libération des
réserves endothéliales
nécessite un test pré thérapeutique
• Substitution par concentré de Facteur
Willebrand (± facteur VIII)
• Antifibrinolytique Exacyl®

Test préthérapeutique de réponse à la
Desmopressine
• Injection intraveineuse lente 30 minutes de 0.3µg/kg
de minirin (0.2µg/Kg chez enfant entre 2 et 3ans et
adulte > 60 ans) prévoir restriction hydrique la ½
journée qui suit l’injection
– CI : enfant < 2 ans, femme enceinte, HTA, atherosclérose
• Prélèvement avant l’injection puis 1heure, 2heures
et 4 heures après le début de l’injection pour
dosage VWF:RC0, VWF:Ag, FVIIIC
• Critères de bonne réponse : x 2à 5 des taux à T1h
(30 minutes après la fin de l’injection)

DDAVP et Maladie deWillebrand
VWD Type
Type 1
Type 2A
Type 2B
Type 2M
Type 2N
Type 3
Réponse efficace
Habituellement
Rarement
Contre-indiquée?
Rarement
Occasionnellement
Jamais
Le Willebrand mis en circulation est anormal risque de thrombopénie

Réponses à la Desmopressine (DDAVP) dans VWD Type 1
La demi-vie du VWF dépend du mécanisme
VWF:Ag (U/dL)
100
50
40
30
20
10
Synthèse diminuée
Clairance accélérée
(Vicenza)
0 1 2 3 4 8
Temps après DDAVP (heures)
D’après Casonato et al, Blood 2002; 99: 180-4

Maladie de Willebrand Acquise
• 1 ère description en 1968 (Simone et al.)
• Apparition d’un déficit en VWF chez un
sujets jusque là indemne
• Manifestations hémorragiques non
spécifiques (idem forme congénitale)
• Sujet âgé (60 ans en moyenne)
• Fréquence probablement sous estimée

Maladie de Willebrand Acquise
1- étiologies
tout syndrome
hémorragique
apparaissant au
décours d’une de
ces pathologies doit
faire rechercher
une maladie de
Willebrand acquise
• Syndromes
lymphoprolifératifs++
(48%), myéloprolifératifs
(15%)
• Affections
cardiovasculaires (25%)
(retrécissement aortique)
• Maladies auto-immunes
(2%)
• Tumeurs solides (5%)
– Néphroblastome
– Carcinomes
• Hypothyroidie
• Autres : diabète,
médicaments

Maladie de Willebrand Acquise
2- mécanismes physiopathologiques
1. Présence d’un anticorps anti VWF
– Neutralisant = bloquant site d’interaction avec les
plaquettes ou le collagène (diminution des dosages
fonctionnels correspondants)
– Non neutralisant : diminution du VWF circulant par
accélération de la clairance
2. Adsorption des multimères de HPM sur les cellules
malignes ou sur les plaquettes activées (TE,
pathologies valvulaires cardiaques)
3. Protéolyse par élastase cellulaire ou protéases
palquettaires (Sd myéloprolifératifs)

Maladie de Willebrand Acquise
3- Diagnostic biologique : difficile
• Dosages VWF:RCo, VWF:Ag, FVIIIC profil biologique de
maladies de Willebrand type 1 ou type 2 selon mécanisme
impliqué
• Recherche d’un Anticorps anti Willebrand :
– Test du mélange puis dosage VWF:Ag, VWF:RCo résiduel
mais anticorps peuvent être non neutralisants donc
indétectables
• Dosage du propeptide (témoin d’une synthèse normale)-
Laboratoires spécialisés
– normal contrairement au VWF:Ag
– Peut être non discriminant
• Test à la desmopressine + évaluation ½ vie (mais certaines
formes constitutionnelles ont un VWF à ½ vie réduite)
• Recherche systématique d’une dysglobulinémie monoclonale

Maladie de Willebrand acquise
4- prise en charge recommandations
(Federici et al., TH 2000)
• 1 ère intention = DDAVP
• En cas d’échec du DDAVP :
– 2 ème intention : VWF +/- FVIII
– 3 ème intention : IgIV
• En cas d’hémorragie :
– DDAVP ou VWF+/-FVIII + IgIV
• Surveillance : bilan tous les j pendant
7 à 15j
• Traitement de la cause ++