BCKH Ứng dụng của sắc ký hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích thực phẩm

HCM UNIVERSITY OF TECHNOLOGY 

FACULTY OF CHEMICAL ENGINEERING 

BÁO CÁO KHOA HỌC 

ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM 

Đề tài: 

<strong>Ứng</strong> <strong>dụng</strong> <strong>của</strong> <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> <strong>hiệu</strong> <strong>năng</strong> <strong>cao</strong> (<strong>HPLC</strong>) trong phân tích thực phẩm 

Thực hiện: Nguyễn Văn Tú - PhD Student (51305919) 

TPHCM, 2017

Sưu tầm bởi GV. Nguyễn Thanh Tú # Google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

NỘI DUNG 

www.daykemquynhon.ucoz.com 

I. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT SẮC KÝ 

II. CẤU TẠO CỦA HỆ THỐNG <strong>HPLC</strong> 

III. ỨNG DỤNG <strong>HPLC</strong> TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM 

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa 

1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định


I. TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT SẮC KÝ 


• Nguyên lý: Quá trình tách <strong>của</strong> các cấu tử (chất cần 

phân tích ra khỏi chất nền) dựa trên ái lực khác nhau 

<strong>của</strong> mỗi cấu tử đối với pha tĩnh và pha động. 

• Hệ thống: Pha tĩnh (stationary phase) và pha động 

(mobile phase) 

• Các loại <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> phổ biến: Sắc <strong>ký</strong> khí (Gas 

chromatography) và <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> lỏng (liquid 

chromatography) 




Nguyên tắc <strong>của</strong> quá trình tách 


Tạp phẩm Trang sức Điện tử 
























<strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> đồ 






• Nguyên lý: Quá trình tách <strong>của</strong> các cấu tử 

(chất cần phân tích ra khỏi chất nền) dựa 

trên ái lực khác nhau <strong>của</strong> mỗi cấu tử đối 

với pha tĩnh và pha động. 

• Hệ thống: Pha tĩnh (stationary phase) và 

pha động (mobile phase) 





• Dựa vào mức độ tương tác (ái lực) hoặc kích 


thước khác nhau <strong>của</strong> các chất cần phân tích với 

các nhóm chức (phân cực hoặc không phân cực, 

ion dương hoặc âm...) hoặc với kích thước các 

khoảng trống (rây phân tử) trong cột nhồi mà các 

chất có thời gian lưu lại trong cột khác nhau dẫn 

đến quá trình tách giữa các chất. 




II. CẤU TẠO HỆ THỐNG <strong>HPLC</strong> 


• Hệ thống bơm (Pump) 

• Hệ thống tiêm mẫu (Injection system) 

• Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độ 

cột) 

• Cột <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> (pha tĩnh – stationary phase) 

• Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dung môi) 

• Đầu dò (Detector) 

• Hệ thống xử lý dữ liệu 





<strong>HPLC</strong> System 




Cột <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> 

• Chứa pha tĩnh 


• Được nhồi đầy bằng các hạt nhồi 






• Kích thước cột 

– Dài (L): 5 – 30 cm 

– Đường kính trong (I.D.): 2 – 5 mm 

– Kích cỡ hạt: 3, 5, 10 µm 






• Các loại cột thường dùng trong phân tích: 

– Cột pha đảo (Reverse phase) 

– Cột pha thuận (Normal Phase) 

– Cột trao đổi ion âm (Anion Exchange) 

– Cột trao đổi Ion dương (Cation Exchange) 

– Cột <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> rây phân tử (Size Exclusion) 

– Cột <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> ái lực (Affinity) 

– Cột <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> đẳng điện (Mono P) 

– Cột Ceramic Hydroapatite (CHT) 




Pha tĩnh 


• Sắc <strong>ký</strong> lỏng pha đảo (Reversed Phase Liquid 

Chromatography - RPLC) 

Silica 

Silica 

– Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các 

nhóm chức không phân cực và các nhóm silanol 

C8 

C18 

Silica 

Silanol 




Pha tĩnh 

• Sắc <strong>ký</strong> lỏng pha thuận (Normal Phase Liquid Chromatography 

- NPLC) 


– Pha tĩnh gồm các phân tử silic dioxyt (silica) có gắn các 

nhóm chức phân cực bởi sự thay thế mạch (CH2)nCH3 

bằng các gốc phân cực như gốc Cyano, Amino... 

R 

Silica O 

Si 

(CH 2 ) 3 CN 

R 

Silica 

O 

Si 

R 

R 

(CH 2 ) 3 NH 2 

Amino, NH2 




Pha động 

• Yêu cầu: 


– Độ tinh khiết <strong>cao</strong> (ví dụ: nước/đệm với 

MeOH/ACN) 

– Không phản ứng với chất phân tích và pha 

tĩnh 

– Không có bọt khí 

– Không có bụi 




Pha động 


• Độ phân cực <strong>của</strong> dung môi 

ảnh hưởng mạnh đến quá 

trình <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> 

MeOH/H 2 O 85:15 

ACN/H 2 O 85:15 




Pha động 

• Một số dung môi sử <strong>dụng</strong> trong <strong>HPLC</strong> 


Độ phân cực 

Không phân cực 

Phân cực 

Dung môi 

Hexan 

Isooctan 

Petroleum ether 

Cyclohexan 

Carbon tetrahydrochloride 

Chloroform 

Dichlorometan 

Tetrahydrofuran 

Diethyl ether 

Ethyl acetate 

Aceton 

Acetonitril 

Isopropanol 

Methanol 

Nước 

Acid acetic 

Khả <strong>năng</strong> tan trong nước 

Không 

Không 

Không 

Không 

Không 

Không 

Không 

Có 

Không 

ít 

Có 

Có 

Có 

Có 

Có 

Có 




pH: Pha động 


• pH cũng ảnh hưởng 

đến <strong>hiệu</strong> quả tách giữa 

các chất. Tuy nhiên tùy 

thuộc vào bản chất <strong>của</strong> 

các chất phân tích mà 

ảnh hưởng <strong>của</strong> pH có 

thể làm tăng hoặc giảm 

khả <strong>năng</strong> tách <strong>của</strong> cột. 




ỨNG DỤNG CỦA <strong>HPLC</strong> TRONG PTTP 

• Florfenicol là 1 loại thuốc kháng khuẩn phổ rộng thay thế cho 

kháng sinh Chloramphenicol – là loại kháng sinh chủ yếu dùng 


để trị bệnh nhiễm trùng huyết đường ruột trên cá tra, ba sa …. 

• Florfenicol (2,2-dichloro-N-((1R,2S)-3-fluoro-1- hydroxy-1-(4- 

(methylsulfonyl) phenyl) propan-2-yl) tan tốt trong các dung môi 

phân cực như: Nước, Chlorofrom, Methanol, Ethyl acetate, 

Acetone,... Tan ít trong các dung môi không phân cực như: n- 

hexane, Diether ethyl, Benzene, Petroleum ether,.... 

• Công thức phân tử: C 12 H 14 Cl 2 FNO 4 S 




ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH FLOFENICOL TRONG THỦY SẢN TẠI 

CÁC TRUNG TÂM KIỂM ĐỊNH CHẤT LƯỢNG NÔNG LÂM THỦY SẢN 


• Phương pháp này mô tả qui trình phân tích xác 

định hàm lượng Florphenicol trong các mẫu có 

nguồn gốc động vật bằng phương pháp <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> 

lỏng <strong>hiệu</strong> <strong>năng</strong> <strong>cao</strong> gọi tắt là <strong>HPLC</strong>. Giới hạn 

phát hiện <strong>của</strong> phương pháp 50 µg/kg. 






• Dư lượng Florphenicol trong mẫu được ly trích 


bằng ethyl acetate. Dung môi được làm khô bằng 

dòng khí nitơ, sau đó hoà tan lại bằng pha động 

và làm sạch mẫu bằng n – hexan. Hàm lượng chất 

phân tích được xác định trên hệ thống <strong>HPLC</strong>, cột 

pha đảo C18 và đầu dò UV ở bước sóng 220nm. 






CHUẨN BỊ MẪU 


• Lấy các phần ăn được từ những vị trí khác nhau <strong>của</strong> 

mẫu. Cắt phần mẫu vừa lấy thành từng miếng nhỏ từ 

3-5 cm. Cho phần mẫu vừa cắt (khoảng 100 gam) vào 

máy xay mẫu, xay đến khi mẫu đồng nhất. Giữ mẫu ở - 

18C hoặc thấp hơn cho đến khi phân tích. Khi tiến 

hành phân tích mẫu phải đưa về nhiệt độ phòng. 






Chuẩn bị mẫu trắng: 


• Mẫu trắng là mẫu được xác định không chứa florphenicol. Cân 5.00g ± 0.1g mẫu 

đã được xay nhuyễn vào ống ly tâm 50ml. 

Chuẩn bị mẫu kiểm soát 1 g/g: 

• Cân 5.00g ± 0.1g mẫu trắng đã xay nhuyễn vào ống ly tâm 50ml. Thêm 0.5ml dung 

dịch chuẩn 10µg/ml (7.5.6.5) vào 5.00g mẫu trắng. Để yên 20 phút trước khi phân 

tích. 

Chuẩn bị mẫu thử: 

• Cân 5.00g ± 0.1g mẫu đã được xay nhuyễn vào ống ly tâm 50ml 



PP TIẾN HÀNH 





• Cho 7ml ethyl acetate (V 1 ) vào các ống ly tâm chứa mẫu 

trắng ,mẫu kiểm soát và mẫu thử , đậy nắp. 

• Lắc khoảng 5 phút, ly tâm 7 phút ở tốc độ 6000 vòng 

/phút. 

• Hút 5 ml (V 2 ) lớp trên cho vào ống ly tâm thủy tinh 15ml 

• Làm khô dung dịch bằng hệ thống thổi khí nitơ ở nhiệt độ 

50 0 C. 







• Hoà tan phần cặn bằng 5 ml n- hexan, sau đó cho 

tiếp 1ml (V 3 ) pha động vào, lắc khoảng 10 phút 

trên máy lắc , ly tâm 5 phút, tốc độ 4000v/phút 

• Hút bỏ lớp n – hexan ở trên 

• Lấy lớp dưới lọc qua màng lọc mẫu cho vào chai 

1.5ml. Dung dịch này dùng để phân tích trên thiết 

bị <strong>HPLC</strong> 






ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH TRÊN <strong>HPLC</strong> 


Thời gian chạy: 10 phút 

Pha động: Acetonitril: đệm Ammonium acetate = 

25:75 (v/v) 

Rửa cột: Sau khi mẫu chạy hoàn tất, rửa cột và hệ 

thống <strong>HPLC</strong> với nước cất và acetonitril với lưu lượng 

1ml/phút theo tỉ lệ: 35:65 trong 60 phút 







• Cân bằng cột <strong>sắc</strong> <strong>ký</strong> với pha động 30 phút 

trước khi tiêm mẫu và chuẩn. 

• Thứ tự tiêm: tiêm dãy chuẩn, mẫu trắng, mẫu 

kiểm soát, sau đó tiêm mẫu thử 

• Thể tích tiêm: 100µl. 

• Tốc độ dòng: 1.0ml/phút 

• Bước sóng: 220nm 





PHÂN TÍCH FLORFENICOL THEO TIÊU CHUẨN 

QUỐC TẾ 





PHÂN TÍCH FLORFENICOL THEO TIÊU CHUẨN 

QUỐC TẾ

BCKH Ứng dụng của sắc ký hiệu năng cao (HPLC) trong phân tích thực phẩm

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?