Nghiên cứu định lượng Saponin toàn phần trong Giảo cổ lam

BỘ Y TẾ 

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI 

NGUYỄN THU HƢƠNG 

MÃ SINH VIÊN: 1101243 

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG 

SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG 

GIẢO CỔ LAM 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ 

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ 

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI 

NGUYỄN THU HƢƠNG 

MÃ SINH VIÊN : 1101243 

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG 

SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG 

GIẢO CỔ LAM 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ 

Người hướng dẫn: 

1. PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh 

2. ThS. Ngô Minh Thúy 

Nơi thực hiện: 

Bộ môn Vật lý – Hóa lý 

HÀ NỘI - 2016

www.twitter.com/daykemquynhon 

https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

www.daykemquynhon.blogspot.com 

www.daykemquynhon.ucoz.com 

MailBox : nguyenthanhtuteacher@hotmail.com 

LỜI CẢM ƠN 

Để có thể hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ lòng 

kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, 

người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt cho tôi những 

kinh nghiệm nghiên <strong>cứu</strong> khoa học quý báu. Tôi cũng xin trân trọng gửi 

lời cảm ơn đến ThS. Ngô Minh Thúy, người đã luôn giúp đỡ tôi giải 

quyết những tình huống cấp bách và khó khăn trong suốt quá trình thực 

hiện khóa luận này. 

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật 

viên tại Bộ môn Vật lý – Hóa lý và Hóa phân tích – Độc chất, trường Đại 

học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể hoàn thành 

khóa luận tốt nghiệp đúng hạn. 

Tôi rất cảm ơn công ty Traphaco đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi có đầy 

đủ hóa chất và nguyên vật liệu để tôi hoàn thành khóa luận này với kết 

quả tốt nhất. 

Cuối cùng, tôi muốn cảm ơn mọi người trong gia đình và bạn bè 

đã dành cho tôi những tình cảm, sự cổ vũ và động viên trong cuộc sống 

và học tập. 

Hà Nôi, ngày 12 tháng 05 năm 2016 

Sinh viên 

Nguyễn Thu Hƣơng 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn 

Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú 

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial







LỜI CÁM ƠN 

Mục ục 

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 2 

1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM ................................................... 2 

1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume .................................................. 2 

1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume ................................... 2 

1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume ....................... 2 

1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam .......................... 3 

1.1.2. Đặc điểm loài Gynostemmsa pentaphyllum .................................... 3 

1.1.2.1. Đặc điểm thực vật: .................................................................... 3 

1.1.2.2. Thành <strong>phần</strong> hóa học của G. Pentaphyllum: .............................. 4 

1.1.2.3. Phân bố:..................................................................................... 5 

1.1.3. Tác dụng dược lý và độc tính .......................................................... 5 

1.1.4. Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng. ................... 6 

1.2. ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT TRONG GIẢO CỔ LAM ............. 6 

1.2.1. Phương pháp cân ............................................................................ 7 

1.2.2. Phương pháp đo quang ................................................................... 7 

1.2.3. Phương pháp HPLC ........................................................................ 9 

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN ( UV- 

VIS) .............................................................................................................. 11 

1.3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS. .................................................................... 11 

1.3.2. Định luật Lambert-Beer................................................................. 11 

1.3.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> dung dịch 

một thành <strong>phần</strong> .......................................................................................... 13 




CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 16 








2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ .................................................... 16 



2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................... 16 

2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử .................................................... 16 

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................ 17 

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................... 17 

2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích ................................................. 17 

2.2.2. Thẩm <strong>định</strong> phương pháp ................................................................ 17 

2.2.3. Phân tích mẫu thực ........................................................................ 18 

2.2.4. Xử lý số liệu .................................................................................. 18 

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ...................... 19 

3. 1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG . 19 

3.1.1. Lựa chọn điều kiện đo quang ........................................................ 19 

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu .................................... 20 

3.1.3. Quy trình phân tích ........................................................................ 24 

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ............................... 25 

3.2.1. Tính chọn lọc ................................................................................. 25 

3.2.3. Độ lặp lại ....................................................................................... 28 

3.2.4. Độ đúng ......................................................................................... 30 

3.3. PHÂN TÍCH MẪU THỰC ............................................................... 31 

3.4. BÀN LUẬN ......................................................................................... 33 

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................... 37 

1. Kết uận .................................................................................................... 37 


2. Đề xuất ..................................................................................................... 38 



TÀI LIỆU THAM KHẢO 










MeOH: Methanol 

n-BuOH: n-Buthanol 

G: Gynostemma 

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 













DANH MỤC CÁC BẢNG 

STT TÊN BẢNG TRANG 

1 

Bảng 2.1. Các mẫu dược liệu Giảo cổ lam dùng trong nghiên 

<strong>cứu</strong> 

2 Bảng 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dung môi chiết 26 

3 

4 

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tuyến tính của quy trình <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> 

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với 

mẫu M01 

5 Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 30 

6 

Bảng 3.5. Kết quả hàm <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> tính theo 

Gypenoside XVII trong các mẫu thử 


16 

27 

29 

32 












DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH 

STT TÊN HÌNH TRANG 

1 

Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm <strong>Saponin</strong> 

triterpen tetracyclic (a); Protopanaxadiol (b) 

2 Hình 1.2. Cơ chế phản ứng tạo màu 8 

3 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của gypenoside XVII 10 

4 Hình 1.4. Nguyên tắc của <strong>định</strong> luật Lambert-Beer 12 

5 Hình 1.5. Đồ thị của phương pháp đường chuẩn A = f (C) 14 

6 Hình 1.6. Đồ thị của phương pháp thêm đường chuẩn 15 

7 Hình 3.1. Phổ hấp thụ của gypenoside XVII 20 

8 Hình 3.2. Kết quả khảo sát kỹ thuật chiết 21 

9 Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết 21 

10 Hình 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết 22 

11 

12 

Hình 3.5. Kết quả khảo sát điều kiện tinh chế saponin (n 

= 3) 

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa 

nồng độ saponin gypenoside XVII và độ hấp thụ 


4 

23 

27 








1 



ĐẶT VẤN ĐỀ 



Hiện nay, xu hướng tìm kiếm nguồn thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo 

dược ngày càng tăng. Việt Nam có ưu thế về nguồn cây phong phú và lịch sử 

lâu đời sử dụng dược liệu trong phòng và điều trị bệnh, cũng như bổ dưỡng 

nâng cao sức khỏe của người dân. Gỉao cổ lam hay Bổ đắng ( Việt Nam ) là 

một cây được dùng phổ biến trong dân gian làm thuốc, chè uống và thức ăn. 

Có nhiều nghiên <strong>cứu</strong> cho thấy chế phẩm G. Pentaphyllum rất có lợi cho sức 

khỏe như điều trị bệnh tim mạch, bệnh tiểu đường, ung thư, viêm gan, các 

bệnh thần kinh và có thể giúp giảm bớt căng thẳng, chống viêm, giảm mệt 

mỏi, hạ cholesterol và triacylglycerol. Chất có hoạt tính trong G. 

Pentaphyllum có thể là polysaccharide, flavonoid, saponin, carotenoid, 

clorophyl và sterol. Trong đó, flavonoid và saponin được coi là nhóm chất có 

hoạt tính sinh học chính. 

Do có tác dụng tốt cho sức khỏe nên sản phẩm của G. Pentaphyllum được 

tiêu thụ mạnh trên thị trường ở nhiều nước châu Á, châu Âu và cả ở Hoa Kỳ. 

Các nghiên <strong>cứu</strong> gần đây chỉ ra rằng có sự khác nhau lớn về thành <strong>phần</strong> hóa 

học của các sản phẩm chứa G. Pentaphyllum lưu hành trên thị trường. Sự khác 

nhau về thành <strong>phần</strong> hóa học có thể dẫn đến hiệu lực điều trị, liều, độ ổn <strong>định</strong>, 

hạn dùng, độ an <strong>toàn</strong>... rất khác nhau, do đó cần thiết phải kiểm soát chất 

<strong>lượng</strong> của sản phẩm. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, khóa luận “<strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong giảo cổ lam” được thực hiện với hai mục tiêu: 

- Xây dựng phương pháp <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> 

trong dược liệu Gỉao cổ lam bằng phương pháp quang phổ dùng 

Gypenoside XVII làm chất đối chiếu. 


- Đánh giá hàm <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong một số mẫu 

Giảo cổ lam thu thập được. 








2 





CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 

1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM 

1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume 

1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 

Theo các tài liệu Thực vật dược và phân loại thực vật, Cây cỏ Việt Nam 

[15], chi Gynostemma Blume được xếp vào họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí). 

Vị trí của chi Gynostemma Blume trong hệ thống phân loại thực vật dược 

như sau: 

 

 

 

 

 

 

 

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta 

Lớp Ngọc lan Magnoliopsida 

Phân lớp Sổ Dilleniidae 

Liên bộ Hoa tím Violanae 

Bộ Bí Cucurbitales 

Họ Bầu bí Cucurbitaceae 

Chi Gynostemma. 

1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume 

Chi Gynostemma Blume được mô tả đầu tiên bởi Blume vào năm 1825 dựa 

trên đặc điểm hình thái của loài G. simplicifolium. Từ đó đến nay, đã có thêm 

nhiều loài được mô tả. Các loài thuộc chi Gynostemma có các đặc điểm chung 

như sau [15], [30]: Cây thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm. Lá kép, ít khi là lá 


đơn, lá khía răng cưa. Tua cuốn chẻ đôi, đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa 

khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa đực. Hoa nhỏ, màu trắng 

hoặc lục nhạt, có 3 lá bắc con, cuống hoa có đốt. Đài hoa hình bánh xe, chia 5 








3 





thùy, ngắn. Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền <strong>phần</strong> gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 

5, ở <strong>phần</strong> gốc chỉ nhị hàn liền thành cột. Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 

ô. Nhụy: bầu hình cầu nhỏ, 2 – 3 ngăn, 2 – 3 vòi nhụy với đầu nhụy chia 2 – 3 

đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở, 2 – 3 hạt hình trứng hơi 

dẹt 2 bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi. 

1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam 

Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và 

Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea. Tại Trung 

Quốc có 14 loài (trong đó có 9 loài đặc thù). Tính đến nay đã có 3 loài thuộc 

chi Gynostemma được công bố ở Việt Nam là Gynostemmsa pentaphyllum 

(Thunb.) Makino, Gynostemma laxum (Wall.) Cogn và Gynostemma longipes 

C.Y. Wu in C.Y. WU & S.K. Chen [16]. Loài G. pentaphyllum, loài phổ biến 

nhất và được sử dụng làm thuốc. 

1.1.2. Đặc điểm loài Gynostemmsa pentaphyllum 

1.1.2.1. Đặc điểm thực vật: 

Cây thảo, mọc leo, thân cành mảnh, có góc cạnh, không lông hoặc lông thưa 

thớt ở mấu. Lá kép chân vịt – bàn đạp, 5 – 7 lá chét dài 3 – 9cm, rộng 1,5 – 

3cm, mép lá có răng cưa.Tua cuốn mảnh, xẻ đôi ở đỉnh [10]. Cụm hoa đực 

dạng chùm kép. Hoa có cuống mảnh cỡ 1 – 4 mm; ống đài rất ngắn, thùy đài 

hình tam giác, dài khoảng 0,7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc 

mũi mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5. Cụm hoa cái dạng chùm ngắn hơn hoa 

đực. Hoa cái có đài và tràng giống hoa đực, bầu hình cầu 2 – 3 ô, vòi nhụy 3, 

nhị lép 5, ngắn. Quả không tự mở, hình cầu, đường kính 5 – 6 mm, khi chín 

màu đen. Hạt hình trứng hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu, đỉnh tù, 


gốc hình tim dẹt. Mùa hoa tháng 3 – 10, quả tháng 4 – 12 [3], [9], [10]. 



Cây mọc trên đá vôi, đá hoa cương và đất núi lửa, trong rừng thưa, lùm bụi 

từ vùng đồng bằng đến vùng núi cao 2000m [10]. 






4 



1.1.2.2. Thành <strong>phần</strong> hóa học của G. Pentaphyllum: 



Các nghiên <strong>cứu</strong> đầu tiên đã phát hiện saponin có mặt trong giảo cổ lam 

thuộc nhóm dammaran (hình 1.1.a). Đã có trên 100 saponin trong thành <strong>phần</strong> 

Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu 

trúc, trong đó có 8 saponin giống như loại protopanaxadiol trong ginsenoside 

của Panax ginseng C. A. Mayer là Rb1 (Gypenoside III) [24], [25], Rc [33], 

Rb3 (Gypenoside IV), Rd (Gypenoside VIII), F2 [33], Rg3, malonyl-Rb1 và 

malonyl-Rd [25]. Ngoài ra cũng phát hiện Rf là 1 protopanaxatriol [33] (hình 

1b). Những ginsenoside đó chiếm khoảng 25% tổng gypenoside <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> 

trong cây và là minh chứng đầu tiên của nhóm saponin nhân sâm được tìm 

thấy ngoài họ Araliaceae [32]. Một số Gypenoside XXVIII, XXXVII, LV, 

LXII, LXIII cũng tìm thấy trong loài Gymnema sylvestre (Retz) Schult [19]. 

Các saponin còn lại chiếm <strong>phần</strong> lớn các gypenoside được phát hiện lần đầu ở 

loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino. 

a 


Hình 1. 1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm 

<strong>Saponin</strong> triterpen tetracyclic (a); Protopanaxadiol (b) 

b 








5 





- Giảo cổ lam gồm 2 loại có vị ngọt và vị đắng. <strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> của tác giả [30] 

so sánh thành <strong>phần</strong> các ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, and F2 và saponin 20(S)- 

panaxadiol trong dịch thủy phân của G.Pentaphyllum. Kết quả cho thấy hàm 

<strong>lượng</strong> 4 ginsenoside và 20(S)-panaxadiol trong Gỉao cổ lam, vị ngọt lớn hơn 

nhiều so với Giảo cổ lam vị đắng. 

- Flavonoid trong Giảo cổ lam cũng được xác <strong>định</strong>, gồm có quercetin-di- 

(rhamno)-hexoside, kaempferol 3-O-di-p-coumaroylh-exoside, kaempferol 3- 

O-di-p-coumaroylhexoside, quercetin-rhamno-hexoside, rutin, kaempferolrhamno-hexoside, 

kaempferol-3-O-rutinoside, quercetin and kaempferol [18]. 

1.1.2.3. Phân bố: 

- Loài G. pentaphyllum, loài phổ biến nhất và được sử dụng làm thuốc, phân 

bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Myama, Hàn Quốc, Nhật Bản 

và Việt Nam. 

1.1.3. Tác dụng dược lý và độc tính 

Về tác dụng dược lý 

Trên thế giới loài G. pentaphyllum đã được nghiên <strong>cứu</strong> nhiều về tác dụng sinh 

học, bao gồm tác dụng hạ đường huyết [12], [28], [34], điều trị bệnh tim mạch 

[29], viêm gan [21], các bệnh thần kinh [13] và có thể làm giảm bớt căng thẳng 

[17], [22], chống viêm [21], [23] giảm mệt mỏi [31]. Đặc biệt, tác dụng hạ 

cholesterol và triacylglycerol [7], [14] đã được nghiên <strong>cứu</strong> thử nghiệm lâm 

sàng và được sử dụng làm thuốc tại Trung Quốc, Nhật Bản. 

Các nghiên <strong>cứu</strong> về loài G. pentaphyllum ở Việt Nam cũng cho thấy dược 

liệu Giảo cổ lam có tác dụng chống oxy hóa, hạ cholesterol máu, hạ đường 

huyết, chống khối u [6] và tăng đáp ứng miễn dịch [7]. 









6 



Về độc tính 



Nhóm tác giả Thái Lan Natthakarn Chiranthanut, Supanimit 

Teekachunhatean và cộng sự (2013) đã đánh giá độc tính của dịch chiết 

Gynostemma pentaphyllum Makino trên chuột thí nghiệm kết quả không phát 

hiện được liều gây độc trên chuột (liều 750 mg dược liệu/kg chuột không phát 

hiện gây độc) [26]. 

Thực tế cho thấy, Giảo cổ lam đã được dùng từ lâu đời nhưng vẫn chưa có 

ghi nhận nào về độc tính của dược liệu này được công bố. 

1.1.4. Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng. 

Giảo cổ lam được dùng chủ yếu dưới 2 dạng là trà giảo cổ lam và viên nang 

giảo cổ lam. Các sản phẩm này đều là thực phẩm chức năng, giúp hỗ trợ điều 

trị bệnh mỡ máu cao, huyết áp cao, tiểu đường tuýp II. Ngoài ra các chế phẩm 

còn tăng lưu thông máu, hỗ trợ điều trị đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, giúp dễ 

ngủ, ngủ sâu giấc, tăng khả năng làm việc, giảm căng thẳng, mệt mỏi. 

Các sản phẩm từ Giảo cổ lam được lưu thông rộng rãi trên thị trường như 

Giảo cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Thiên Bảo, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ 

lam Tam Đảo… Các sản phẩm từ Giảo cổ lam cũng được lưu thông nhiều tại 

các nước châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, châu Âu, 

Mỹ,… Hiện nay, công ty Traphaco đang nghiên <strong>cứu</strong> để sản xuất dạng chế 

phẩm thuốc. 

1.2. ĐỊNH LƢỢNG HOẠT CHẤT TRONG GIẢO CỔ LAM 

Các tài liệu công bố gần đây đã khẳng <strong>định</strong> thành <strong>phần</strong> hoạt chất chính 

trong dược liệu Giảo cổ lam là saponin, flavonoid và các polysaccharid. Các 

nghiên <strong>cứu</strong> đã phát hiện được khoảng hơn 100 saponin trong Giảo cổ lam, hầu 


hết các chất này đều có khung dammaran, tuy vậy, không có chất nào chiếm đa 

số. 



Có nhiều phương pháp xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> saponin trong các mẫu giảo cổ 






7 



lam như phương pháp cân, phương pháp quang phổ, phương pháp HPLC. 



1.2.1. Phương pháp cân 

Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu (qua rây số 355) đã xác <strong>định</strong> độ ẩm 

cho vào túi giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform đến khi dịch 

chiết không còn màu. Loại bỏ dịch cloroform. Chiết bằng methanol trong 2 giờ. 

Lọc, lấy dịch lọc cất thu hồi dung môi đến còn khoảng 10 ml, rót từ từ vào 100 ml 

aceton, khuấy đều. Lọc lấy tủa, hòa tan tủa trong 50 ml nước nóng, đun cách thủy 

cho tan hết. Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn và chiết saponin bằng n-butanol 8 lần, 

mỗi lần với 25 ml n-butanol. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi, cô cách thủy 

đến khô. Sấy cắn ở 60 o C đến khối <strong>lượng</strong> không đổi. Cân và tính hàm <strong>lượng</strong> 

saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> theo dược liệu khô [1]. 

1.2.2. Phương pháp đo quang 

Phương pháp đo quang có nhiều ưu thế khi áp dụng cho những hoạt chất 

trong nhóm có cùng dạng cấu trúc, cùng tác dụng sinh học. Đa số các saponin 

ít có nối đôi nên thường chỉ hấp thụ tử ngoại ở vùng sóng ngắn 210 - 195 nm. 

Để có thể <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> được cần thực hiện phản ứng với các thuốc thử khác 

nhau tùy theo cấu trúc của saponin, sản phẩm tạo thành có khả năng hấp thụ ở 

vùng khả kiến. Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng, dựa vào chuẩn làm 

trong cùng điều kiện, tính được hàm <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong>. 

Đối với nhóm triterpenoid có thể dùng thuốc thử vanillin – sulfuric; các 

saponin cho màu tím với thuốc thử này. Một số nghiên <strong>cứu</strong> phản ứng màu của 

saponin khung dammaran, cho thấy chính nhóm OH tại C3 là nguyên nhân gây 

phản ứng loại H2O tạo ra sản phẩm có màu khi tác dụng với Vanillin/acid 

sulfuric đặc. Cơ chế trình bày theo hình 1.2. 


Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh [4] sử dụng 

ethanol 70% chiết saponin từ 10 g dược liệu bằng chiết siêu âm, cất thu hồi 








8 





dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, sấy ở 60 o C đến cắn khô. Hòa tan cắn 

trong nước cất và cho hấp phụ vào cột chứa Diaion HP-20 theo tỉ lệ 1:4 (thể 

tích/thể tích). Để yên 1 giờ, rửa lần lượt bằng nước cất, MeOH 20% và MeOH 

80% đến kiệt saponin (khoảng 200 ml). Thu dịch MeOH 80%, bốc hơi đến 

cắn. Hòa tan cắn thu được bằng MeOH và đem phản ứng với thuốc thử 

vanillin/acid acetic băng 3% và acid perchloric 70%, đặt lên bể điều nhiệt ở 

80 o C trong 10 phút. Làm lạnh nhanh bằng nước đá và đo quang ở bước sóng 

550 nm. Tính kết quả saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> dựa vào chuẩn ginsenoside Rb1. 

Hình 1. 2. Cơ chế phản ứng tạo màu 

Zhuohong Xie, et al., (2010), sử dụng ethanol tuyệt đối chiết 12 g dược liệu 

(đã được làm nhỏ tới kích thước 40 mesh) bằng Soxhlet, dịch chiết cho phản 


ứng với thuốc thử vanillin/ acid acetic 5% và acid perchloric 70%. Để hỗn hợp 

ở 60 o C trong 15 phút Làm lạnh nhanh bằng nước đá và đo quang ở bước sóng 

550 nm. Tính kết quả saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> dựa vào chuẩn là dịch chiết 








9 



gypenoside [36] 



1.2.3. Phương pháp HPLC 

Đây là phương pháp hiện nay được sử dụng nhiều trong <strong>định</strong> tính, <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> các chất nói chung và saponin nói riêng. Người ta có thể <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 1 

thành <strong>phần</strong> hay đồng thời nhiều thành <strong>phần</strong> trong hỗn hợp. Để có thể áp dụng 

cho <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 1 nhóm hoạt chất trong dược liệu cần chọn được 1 chất chỉ thị 

(marker) có tác dụng hoặc chỉ thị phân tích – điều này rất khó giải quyết trong 

<strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin ở Giảo cổ lam vì hiện nay chưa phát hiện chất nào có tác 

dụng nổi trội hoặc có hàm <strong>lượng</strong> lớn nhất. 

Dược điển Hồng Kông, chuyên luận “Gynostemmatis Herba” đối với 

Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino (Cucurbitaceae) tiến hành <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> panaxadiol trong mẫu dược liệu bằng cách hoạt chất được chiết bằng 

methanol, sau đó cô dưới áp suất giảm được cắn. Hòa tan cắn trong acid 

hydrocloric (29,5% kl/tt) và đun hồi lưu trong 4 giờ. Để nguội và chiết bằng 

dicloromethan. Cô dưới áp suất giảm được cắn. Hòa tan cắn trong methanol và 

tiến hành phân tích bằng HPLC với detector tán xạ ánh sáng bay hơi (ESLD). 

Yêu cầu hàm <strong>lượng</strong> panaxadiol (C 30 H 52 O 3 ) không nhỏ hơn 0,094% tính theo 

dược liệu khô. Tuy nhiên, các công bố thu thập được và khảo sát sơ bộ bằng 

thực nghiệm của nhóm nghiên <strong>cứu</strong> chúng tôi thì không phát hiện có panaxadiol 

trong các mẫu Giảo cổ lam Việt Nam dùng trong nghiên <strong>cứu</strong>. 

Tác giả Lu, J.G., et al., [20] đã so sánh hàm <strong>lượng</strong> các chất có trong 

Gynostemma pentaphyllum vị ngọt và vị đắng. Nhóm nghiên <strong>cứu</strong> sử dụng 

UPLC-Q-TOF-MS và HPLC-ELSD để <strong>định</strong> tính và <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> các saponin 

trong 21 mẫu dược liệu. Kết quả đã chỉ ra rằng 10/10 mẫu Giảo cổ lam đắng 

hàm <strong>lượng</strong> 4 ginsenoside Rb1, Rb3, Rd, F2 hầu như không có hoặc rất thấp 


trung bình 8,3 µg/g so với 823,9 µg/g của 11 mẫu Giảo cổ lam ngọt. Cụ thể là 

10/10 mẫu không có Rb1, Rb3, Rd 5/10 mẫu không có, 5/10 mẫu có Rd nhưng 

hàm <strong>lượng</strong> thấp hơn rất nhiều so với loại Giảo cổ lam ngọt (từ 3,6 – 33,7 g/g 








10 





so với 129 – 835 g/g – 11 mẫu nghiên <strong>cứu</strong>), F2 7/10 mẫu không có, 3/10 mẫu 

có F2 nhưng hàm <strong>lượng</strong> thấp hơn rất nhiều so với loại Giảo cổ lam ngọt (từ 2,5 

– 11,2 µg/g so với 8,4 – 476,2 µg/g– 11 mẫu nghiên <strong>cứu</strong>).Tác giả SHI Meirong 

et al. [27] dùng HPLC với detectơ UV đo ở bước sóng 203 nm <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

3 ginsenoside Rb1, Rb3, Rd và gypenoside XVII, XLIX trong 32 mẫu 

Gynostemma pentaphyllum ngọt và đắng thu hái tại các cùng khác nhau ở 

Trung Quốc kết quả cho thấy khoảng 2/3 số mẫu không có chứa Rb1, Rb3, đa 

số các mẫu đều có Gypenoside XVII và XLIX và Rd. 

Tác giả Kao, T.H., et al., đã xác <strong>định</strong> được 34 gypenoside trong 

Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino bằng LC-MS/MS [18]. 

Từ những tài liệu thu thập được, chúng tôi thấy rằng trong Giảo cổ lam có 

rất nhiều saponin (gypenoside) nhưng không có saponin gypenoside nào có 

hàm <strong>lượng</strong> đủ lớn hoặc tác dụng dược lý nổi bật để làm đối tượng <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

do đó lựa chọn đối tượng <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> là nhóm chất saponin sẽ phản ánh chất 

<strong>lượng</strong> của dược liệu Giảo cổ lam khách quan hơn. Chất đối chiếu sử dụng là 

một gypenoside có trong Giảo cổ lam là gypenoside XVII với cấu trúc được 

trình bày ở hình 1.3. 




Hình 1. 3. Công thức cấu tạo của gypenoside XVII 






11 





en-20-yl 

(beta-D 

Tên khoa học: 3β-(β-D-Glucopyranosyloxy)-12β-hydroxy-5α-dammar-24- 

6-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside;(3beta,12beta)-3- 

Glucopyranosyloxy)-12-hydroxydammar-24-en-20-yl-6-O-beta-Dglucopyranosyl-beta-D-glucopyranoside. 

Công thức phân tử: C 48 H 82 O 18 

Trọng <strong>lượng</strong> phân tử: 947.158 

Độ tan: Gypenoside XVII tan trong pyridin, methanol, ethanol. 

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI KHẢ 

KIẾN ( UV-VIS) 

1.3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS. 

Khi tia bức xạ tương tác với vật chất có thể xảy ra một số quá trình: phản 

xạ, hấp thụ, tán xạ, huỳnh quang và quang hóa. Khi đo quang phổ tử ngoại 

khả kiến, người ta mong muốn chỉ có quá trình hấp thụ xảy ra. Vì bức xạ điện 

từ là các hạt mang năng <strong>lượng</strong> nên khi phân tử hấp thụ, nó sẽ kích thích hệ 

electron của phân tử và làm tăng nội năng của nó. Năng <strong>lượng</strong> tổng của một 

phân tử bao gồm: năng <strong>lượng</strong> chuyển động tịnh tiến của phân tử ( Et ), năng 

<strong>lượng</strong> của điện tử ( Ee ), năng <strong>lượng</strong> của các dao động ( Ev ) và năng <strong>lượng</strong> 

của chuyển động quay ( Er ) 

Phương trình biểu diễn: 

E_tổng = Et + Ee + Ev + Er 

(Ee >> Ev >> Er) 

Sự hấp thụ bức xạ tử ngoại – khả kiến có thể làm thay đổi mức năng <strong>lượng</strong> 

điện tử Ee và là nguồn gốc của phổ UV-VIS. Do đó phổ UV-VIS được gọi là 

phổ điện tử. 

1.3.2. Định luật Lambert-Beer. 









12 



Định luật là cơ sở lý thuyết cho phép <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> bằng quang phổ UV-VIS. Khi 



chiếu một chùm tia sáng đơn sắc bước sóng với cường độ ánh sáng I 0 đi qua 

dung dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày l thì cường độ ánh sáng sau đó chỉ 

còn lại I. 

Hình 1. 4. Nguyên tắc của <strong>định</strong> uật Lambert-Beer 

Mối quan hệ giữa I và I 0 được biểu diễn bằng biểu thức: 

I = I 0 .10 -.l.C 

Trong đó: là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch, chỉ phụ thuộc vào bản chất 

chất tan và bước sóng của ánh sáng chiếu vào dung dịch. 

T=I/I o .100% được gọi là độ truyền qua. 

A=(I o -I)/I o .100% được gọi là độ hấp thụ. 

Độ lớn của độ truyền qua T hay độ hấp thụ A phụ thuộc bản chất của chất 

tan, chiều dày lớp mỏng và nồng độ của dung dịch. 

* Điều kiện áp dụng <strong>định</strong> luật: 

- Chùm tia sáng phải đơn sắc. 

- Dung dịch phải có nồng độ nằm trong khoảng thích hợp. 


- Dung dịch phải trong suốt 



- Chất thử phải bền trong dung dịch (khoảng 10-20’) và phải bền dưới tác 






13 



dụng của ánh sáng UV-VIS. 



1.3.3. Ứng dụng quang phổ UV-VIS trong phân tích <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

dung dịch một thành <strong>phần</strong> 

sau: 

Đối với dung dịch một thành <strong>phần</strong> có thể sử dụng các kĩ thuật <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

Tính toán trực tiếp từ mật độ quang đo đƣợc. 

- Với các chất có mật độ hấp thụ riêng biết trước chính xác và ổn <strong>định</strong> ở một 

bước sóng nào đó, người ta có thể đo mật độ quang của dung dịch chất đó 

trong dung môi tương ứng tại bước sóng này. 

- Nồng độ dung dịch tính theo công thức sau: 

A = ε.l.C => C = 

- Muốn áp dụng công thức thì máy quang phổ phải được chuẩn hóa về bước 

sóng và mật độ quang, dung dịch phải trong suốt và có nồng độ đáp ứng của 

<strong>định</strong> luật Lambert – Beer. 

So sánh với dung dịch chuẩn. 

- Để xác <strong>định</strong> nồng độ C t của dung dịch thử, ta tiến hành đo đông thời mật độ 

quang A t của dung dịch thử và A c của dung dịch chuẩn có nồng độ C c biết 

trước trong cùng điều kiện thỏa mãn <strong>định</strong> luật Lambert – Beer. 

- Nồng độ dung dịch thử được tính theo công thức sau: 




Kỹ thuật đƣờng chuẩn. 






14 





- Chuẩn bị từ 5-8 dung dịch chuẩn có nồng độ xác <strong>định</strong> và nằm trong khoảng 

tuyến tính của <strong>định</strong> luật Lambert – Beer. 

- Đo mật độ quang của từng dung dịch chuẩn và vẽ đồ thị biểu diễn mối tương 

quan giữa mật độ quang và nồng độ của các dung dịch chuẩn. Từ đó rút ra 

được phương trình đường chuẩn. 

- Tiến hành đo đồng thời mật độ quang A t của dung dịch thử có nồng độ C t . 

Dựa vào phương trình đường chuẩn thiết lập được ở trên ta tính được C t khi đã 

biết A t . 

- Trường hợp dãy chuẩn không tuân theo <strong>định</strong> luật Lambert – Beer (đường 

chuẩn cong) thì cần làm thêm một số điểm chuẩn nữa với nồng độ gần nhau 

hơn (khác nhau không quá 10%). 

Hình 1.5. Đồ thị của phƣơng pháp đƣờng chuẩn A = f (C) 

Kỹ thuật thêm chuẩn. 

- Thêm chính xác một được dung dịch chuẩn có nồng độ C c xác <strong>định</strong> vào dung 

dịch thử cần xác <strong>định</strong> nồng độ C t . 

- Tiến hành đo mật độ quang của 2 dung dịch trong cùng điều kiện thỏa mãn 

<strong>định</strong> luật Lambert – Beer. 

- Nồng độ dung dịch thử được tính theo côgn thức sau: 









15 



Kỹ thuật thêm đƣờng chuẩn. 



- Thêm những thể tích giống nhau của dãy thử vào dung dịch chuẩn chứa 

những <strong>lượng</strong> khác nhau và chính xác của dãy chuẩn. 

- Tiến hành đo mật độ quang của cả dãy nồng độ vừa thêm thử và xây dựng 

đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang với <strong>lượng</strong> chất chuẩn 

thêm vào. 

- Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành cho ta nồng độ của chất cần <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong>: 

Hình 1.6. Đồ thị của phƣơng pháp thêm đƣờng chuẩn 









16 





CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 

NGHIÊN CỨU 

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 

2.1.1. Nguyên liệu 

Các mẫu Giảo cổ lam sử dụng trong nghiên <strong>cứu</strong> được xác <strong>định</strong> tên khoa học 

(Gynostemma petaphyllum (Thunb.) Makino var. pentaphyllum) tại Lào Cai, 

Hòa Bình và mẫu thu trên thị trường ... Bao gồm: 

TT 

Tên mẫu 

Bảng 2.1. Các mẫu Giảo cổ am dùng trong nghiên <strong>cứu</strong> 

Nơi thu hái/ 

Nguồn gốc 

1 M01 Lào Cai 

2 M02 Lào Cai 

Mô tả 

5 lá, bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược 

liệu 

7 lá, bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược 

liệu 

3 M03 Thị trường Bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược liệu 

4 M04 Hòa Bình Bột thô, màu xanh nâu nhạt, mùi thơm dược liệu 

2.1.2. Chất chuẩn, hóa chất, thuốc thử 

- Chất chuẩn: Gypenoside XVII hàm <strong>lượng</strong> 98,0%, Số lô: CFS201502 của 

Wuhan Chemfaces Biochemical Co. Ltd, Trung Quốc. 

- Hóa chất, thuốc thử: vanilin (Reagent Plus – Sigma Aldrich, Mỹ), acid 

acetic băng (Fluka, Mỹ), acid perchloric (ACS reagent – Sigma Aldrich, Mỹ), 


methanol, ethyl acetat và n-butanol (Merck, Đức). Các hóa chất, thuốc thử đều 

đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích 








17 



2.1.3. Dụng cụ, thiết bị 



- Tủ sấy SHELLAB, Mĩ. 

- Cân phân tích Metller Toledo (d = 0,01 mg), Thụy sỹ. 

- Máy đo hàm ẩm Precisa XM 60, Thụy sỹ. 

- Bể điều nhiệt Sartorius, Đức. 

- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200, Canada. 

- Máy quang phổ UV- VIS Hitachi U-1900 Nhật Bản. 

- Pipet tự động 100 - 1000 µl. 

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 

2.2.1. Xây dựng phương pháp phân tích 

* Khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết mẫu 

- Phương pháp chiết: chiết hoạt chất trong mẫu thử bằng 

phương pháp Soxhlet và siêu âm. Lựa chọn phương pháp cho hiệu 

suất chiết cao với thời gian ngắn. 

- Dung môi chiết: sử dụng các dung môi methanol, aceton và 

ethanol. Lựa chọn dung môi cho hiệu suất chiết cao nhất. 

- Thời gian chiết: chiết mẫu với thời gian chiết khác nhau. Lựa 

chọn phương pháp cho hiệu suất chiết cao. 

* Điều kiện phản ứng và đo quang 

Dựa vào tài liệu [2] đánh giá lại các điều kiện phân tích thay 

đổi nếu cần thiết. 

2.2.2. Thẩm <strong>định</strong> phương pháp 




Thẩm <strong>định</strong> phương pháp phân tích theo hướng dẫn của AOAC với các chỉ 

tiêu: tính chọn lọc, khoảng nồng độ tuyến tính, độ đúng, độ chính xác (độ lặp 






18 



lại). 



- Tính chọn lọc: Chuẩn bị các mẫu gồm dung môi chiết xuất, dung dịch 

chuẩn. Tiến hành phản ứng. Đo độ hấp thụ của các dung dịch này ở bước 

sóng phân tích. Yêu cầu mẫu dung môi chiết xuất phải có độ hấp thụ không 

đáng kể so với độ hấp thụ của dung dịch chuẩn. 

- Khoảng nồng độ tuyến tính: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn (5 mức 

nồng độ) trong methanol. Tiến hành phản ứng. Đo độ hấp thụ của các dung 

dịch này ở bước sóng phân tích. Xây dựng mối tương quan giữa nồng độ và 

độ hấp thụ, đường hồi qui. Yêu cầu hệ số tương quan giữa nồng độ và độ hấp 

thụ không dưới 0,99, đường hồi qui có dạng đường thẳng. 

- Độ chính xác: đánh giá độ lặp lại bằng cách <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> một mẫu dược 

liệu 6 lần song song. Tiến hành đồng thời một mẫu chuẩn. Tính hàm <strong>lượng</strong> 

saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong mẫu dược liệu (khô) theo gypenoside chuẩn. Yêu 

cầu: tại mức hàm <strong>lượng</strong> 1 – 10%, theo AOAC, độ lặp lại của phương pháp 

(RSD) phải nhỏ hơn hoặc bằng 2,7% (nếu ngoài khoảng phải giải thích). 

- Độ đúng: Thêm vào mẫu thử một <strong>lượng</strong> chính xác dung dịch chuẩn, chiết 

và tiến hành phân tích. Tính <strong>lượng</strong> chuẩn tìm lại được. Làm 6 lần song song. 

Yêu cầu (theo AOAC) <strong>lượng</strong> chuẩn tìm lại nằm trong khoảng khoảng 97 – 

103% với hàm <strong>lượng</strong> mẫu 1 - 10% (nếu ngoài khoảng phải giải thích). 

2.2.3. Phân tích mẫu thực 

Mẫu thử được xác <strong>định</strong> hàm ẩm và <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> theo qui trình đã xây dựng, 

mỗi mẫu làm lặp lại 3 lần. Tính kết quả dựa vào chuẩn có nồng độ tương 

đương làm trong cùng điều kiện. 

2.2.4. Xử lý số liệu 


Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại <strong>lượng</strong> 

đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Office Excel. 








19 



CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 



3. 1. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG 

3.1.1. Lựa chọn điều kiện đo quang 

Dựa trên tài liệu tham khảo [4], [36] và thực nghiệm sử dụng về thể tích 

thuốc thử phản ứng, <strong>lượng</strong> chất phân tích, nhiệt độ và thời gian phản ứng, pha 

loãng bằng ethyl acetat [2] hoặc acid perchloric [4], [36], chúng tôi đã lựa chọn 

điều kiện phản ứng tạo sản phẩm có khả năng hấp thụ quang cao nhất, ổn <strong>định</strong> 

và bước sóng có cực đại hấp thụ. Điều kiện cụ thể như sau: 

- Chuẩn bị thuốc thử vanilin trong acid acetic băng 5%: Cân 0,5 g vanilin 

pha trong acid acetic băng vừa đủ 10 ml. 

- Pha dung dịch chuẩn gốc: Lấy chính xác 10,0 mg chất chuẩn gypenoside 

XVII pha trong MeOH vừa đủ 50 ml thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,2 

mg/ml. Bảo quản ở 2-8 o C. Dùng trong 1 tháng. 

- Dung dịch chuẩn: Pha loãng 1,00 ml dung dịch chuẩn gốc trong vừa đủ 

10,0 ml methanol. 

- Phản ứng màu Rosenthaler <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin: lấy 1,00 ml dung dịch mẫu 

cho vào ống nghiệm cô cách thủy đến cắn. Thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5% 

trong acid acetic băng và 1,2 ml acid perchloric 72%. Đậy kín ống nghiệm rồi 

ủ trong trong nồi cách thủy ở 80 o C trong 20 phút. Ngâm ống nghiệm trong 

nước đá rồi chuyển vào bình <strong>định</strong> mức 5 ml, tráng ống nghiệm bằng ethyl 

acetat tập trung vào bình <strong>định</strong> mức trên và bổ sung ethyl acetat tới vạch. Lắc 

đều. 

Quét hấp thụ trong khoảng 420 - 700 nm với mẫu trắng là MeOH (được làm 


phản ứng tương tự mẫu thử). 



Phổ hấp thụ của gypenoside XVII thu được ở hình 3.1, so với tác giả [4], 

[36] thì không dùng acid perchloric mà dùng ethyl acetat. 






20 





3.1.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu 

<strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> chiết xuất saponin 

- Phương pháp chiết: chiết 1g dược liệu bằng phương pháp Soxhlet 4 giờ 

hoặc siêu âm trong 1 giờ bằng dung môi ethanol. Đánh giá hiệu suất chiết dựa 

vào tỷ lệ giữa đáp ứng phân tích (độ hấp thụ) và khối <strong>lượng</strong> A/m. Kết quả là 

<strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> chiết bằng hai phương pháp xấp xỉ bằng nhau (hình 

3.2) do đó chọn phương pháp siêu âm vì giảm thời gian chiết 4 lần so với chiết 

Soxhlet. 

Hình 3.1. Phổ hấp thụ của gypenoside XVII 









21 



0.4 



Hình 3.2. Kết quả khảo sát kỹ thuật chiết 

- Dung môi chiết: chiết 1g dược liệu bằng phương pháp siêu âm trong 1 giờ 

sử dụng các dung môi methanol, aceton và ethanol. Căn cứ vào tỷ số A/m cho 

thấy dung môi methanol chiết được <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> cao nhất (hình 

3.3.). Lựa chọn methanol làm dung môi chiết. 

T ỷ s ố A/m 

0.3 

0.2 

0.1 

0 

C hiết S oxhlet 

C hiết s iêu âm 


Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết 

-Thời gian chiết: chiết 1g dược liệu bằng phương pháp siêu âm bằng 

methanol với thời gian chiết khác nhau từ 30 – 75 phút. Căn cứ vào tỷ số A/m 

cho thấy thời gian chiết là 45 phút cho hiệu suất chiết cao tương đương với 

chiết 60 và 75 phút (hình 3.4.). Lựa chọn thời gian chiết là 45 phút. 

0.5 

0.45 

0.4 

0.35 

0.3 

0.25 

0.2 

0.15 

0.1 

0.05 

0 

Methanol E thanol A c eton 









22 





Hình 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết 

Qua khảo sát đã lựa chọn phương pháp chiết như sau: Cân chính xác 

khoảng 1,00 g bột dược liệu (đã rây qua rây có đường kính mắt rây 0,25 mm) 

cho vào bình <strong>định</strong> mức 50 ml. Thêm khoảng 40 ml methanol, lắc nhẹ, siêu âm 

45 phút. Thêm methanol vừa đủ đến vạch. Lắc đều. Lọc (Dung dịch A). Bỏ 10 

ml dịch lọc đầu. Lấy 5 ml dịch lọc cho vào bình <strong>định</strong> mức 50 ml, pha loãng 

bằng cùng dung môi đến vừa đủ thể tích. Lắc đều. 

<strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> tinh chế saponin 

Trong Giảo cổ lam có hai nhóm chất là saponin và flavonoid. Các chất trong 

hai nhóm này có khả năng chiết vào dung môi methanol khá giống nhau do vậy 

cần loại flavonoid trong dịch chiết methanol. So sánh 2 cách tinh chế saponin từ 

dịch chiết methanol thu được ở trên bằng phương pháp chiết pha rắn và chiết 

lỏng – lỏng. 


0.45 

0.4 

0.35 

0.3 

0.25 

0.2 

0.15 

0.1 

0.05 

0 

30 phút 45 phút 60 phút 75 phút 

Tinh chế bằng chiết pha rắn theo tham khảo tài liệu [4], được thực hiện như 

sau: Lấy 25 ml dịch lọc (dung dịch A) cô cách thủy tới cắn. Hòa tan cắn bằng 

10 ml nước cất hấp phụ vào cột chứa Diaion HP-20 theo tỉ lệ 1:4 (thể tích/thể 

tích). Để yên 1 giờ, rửa lần lượt bằng 100 ml nước cất, 100 ml MeOH 20% và 

MeOH 80% đến kiệt saponin (khoảng 100 ml). Thu dịch MeOH 80%, cô đến 


cắn. Hòa tan cắn thu được bằng MeOH trong vừa đủ 25,0 ml. Pha loãng 

chính xác 5 ml dung dịch này trong vừa đủ 50 ml với MeOH. 








23 





Chiết lỏng – lỏng: n-butanol có khả năng chiết chọn lọc saponin nên tiến 

hành chiết saponin trong dịch chiết trên để loại flavonoid và các chất không tan 

trong dung môi này. Lấy 25 ml dịch lọc (dung dịch A) cho vào bình cất và cất 

thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến còn khoảng 1-2 ml, sau đó dùng n – 

butanol chiết lấy saponin. Qua khảo sát thể tích n-butanol và số lần chiết, quá 

trình chiết được thực hiện như sau: Thêm vào bình cất dung môi thu được ở 

trên 4-5 ml nước cất, chuyển vào bình gạn. Tráng bình với khoảng 5 ml nước, 

chuyển vào bình gạn. Tráng tiếp cốc với 10 ml n – butanol đã bão hòa nước (5 

ml x 2 lần), tập trung vào bình gạn. Lắc trong 5 phút. Tách lấy <strong>phần</strong> n – 

butanol vào bình cầu. Chiết bằng n – butanol 2 lần nữa, lần lượt 10 ml và 5 ml. 

Tập trung dịch chiết n-butanol vào bình cầu. Cô quay tới cắn. Hòa tan cắn 

trong MeOH với lần lượt 10 ml – 5 ml – 5 ml chuyển vào bình <strong>định</strong> mức 25 ml 

và thêm MeOH đến vừa đủ thể tích. Pha loãng chính xác 5 ml dung dịch này 

trong vừa đủ 50 ml với methanol. 

Tiến hành phản ứng màu. Căn cứ vào tỷ số A/m cho thấy khi 

tinh chế loại chất cản trở flavonoid bằng chiết lỏng – lỏng cho kết 

quả cao hơn (hình 5). Lựa chọn điều kiện tinh chế saponin bằng 

phương pháp chiết lỏng – lỏng với dung môi là n-butanol. 


0.6 

0.5 

0.4 

0.3 

0.2 

0.1 

0 


C hiết lỏng - lỏng 

C hiết pha rắn 



Hình 3.5. Kết quả khảo sát điều kiện tinh chế saponin (n = 3) 






24 



3.1.3. Quy trình phân tích 



Từ những kết quả thu được ở trên chúng tôi lựa chọn qui trình phân tích với 

<strong>lượng</strong> mẫu thử được giảm đi 10 lần để không phải pha loãng, tiết kiệm dung 

môi và có thể tăng hiệu suất chiết. Cụ thể như sau: 

Dung dịch thử: Nghiền dược liệu thành bột. Rây qua rây có cỡ mắt rây 0,25 

mm. Cân chính xác khoảng 0,10 g bột dược liệu cho vào bình <strong>định</strong> mức 50 ml. 

Thêm khoảng 40 ml methanol, lắc nhẹ, siêu âm 45 phút. Thêm methanol vừa 

đủ đến vạch. Lắc đều. Lọc. Bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Lấy 25 ml dịch lọc cho vào 

bình cất và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến còn khoảng 1-2 ml. 

Thêm vào bình cất dung môi thu được ở trên bằng 4-5 ml nước cất, chuyển vào 

bình gạn. Tráng bình với khoảng 5 ml nước, chuyển vào bình gạn. Tráng tiếp 

cốc với 10 ml n – butanol đã bão hòa nước (5 ml x 2 lần), tập trung vào bình 

gạn. Lắc trong 5 phút. Tách lấy <strong>phần</strong> n – butanol vào bình cầu. Chiết bằng n – 

butanol 2 lần nữa, lần lượt 10 ml và 5 ml. Tập trung dịch chiết n-butanol vào 

bình cầu. Cô quay tới cắn. Hòa tan cắn trong MeOH với lần lượt 10 ml – 5 ml 

– 5 ml chuyển vào bình <strong>định</strong> mức 25 ml và thêm MeOH đến vừa đủ thể tích. 

- Dung dịch chuẩn: dung dịch gypenoside XVII pha trong MeOH nồng độ 

0,1 mg/ml. 

- Phản ứng màu và đo quang: lấy 1,00 ml dung dịch mẫu cho vào ống 

nghiệm cô cách thủy đến cắn. Thêm 0,2 ml dung dịch vanilin 5% trong acid 

acetic băng và 1,2 ml acid perchloric 72%. Đậy kín ống nghiệm rồi ủ trong 

trong nồi cách thủy ở 80 o C trong 20 phút. Ngâm ống nghiệm trong nước đá rồi 

chuyển vào bình <strong>định</strong> mức 5 ml, tráng ống nghiệm bằng ethyl acetat tập trung 

vào bình <strong>định</strong> mức trên và bổ sung ethyl acetat tới vạch. Lắc đều. 

Đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm mẫu trắng là MeOH (được làm phản 


ứng tương tự mẫu thử). 










25 



- Tính kết quả: Hàm <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong mẫu thử (%) tính theo 

gypenoside XVII được tính theo công thức sau: 

Trong đó: 

A t và A c độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn. 

m t : khối <strong>lượng</strong> mẫu thử (g). 

C c nồng độ gypenoside XVII (g/ml) trong dung dịch chuẩn (đo quang) 

H là độ ẩm của mẫu thử. 

3.2. THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 

3.2.1. Tính chọn lọc 

Tính chọn lọc được đánh giá qua phân tích mẫu placebo (dung môi chiết) và 

mẫu chuẩn (nồng độ gypenoside 0,1 mg/ml). 

Mẫu placebo được chuẩn bị như sau: cô 25 ml methanol tới cắn, thêm vào 

đó 25 ml n-butanol, lắc. Cô quay tới cắn. Hòa tan cắn trong vừa đủ 25 ml 

MeOH (với lần lượt 10 ml – 5 ml – 5 ml chuyển vào bình <strong>định</strong> mức và thêm 

MeOH đến vừa đủ thể tích). 

Tiến hành phản ứng và đo độ hấp thụ của dung dịch mẫu chuẩn và mẫu 

placebo với mẫu trắng là MeOH làm phản ứng tương tự. Kết quả được trình 

bày ở bảng sau: 

A t × C c × 250 

A c × m t × (1-H:100) 

× 100 









26 





Bảng 3.1. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng của dung môi chiết 

Độ hấp thụ 

Ảnh hƣởng của mẫu 

Stt 

Mẫu 

Mẫu placebo 

placebo (%) 

chuẩn 

1 0,483 0,005 

2 0,478 0,005 

3 0,470 0,004 

Trung bình 0,477 0,0047 0,98 

Tại bước sóng <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> (550 nm), mẫu placebo có đáp ứng, tuy nhiên độ 

hấp thụ của mẫu placebo không đáng kể (< 1,0%) so với đáp ứng độ hấp thụ 

của mẫu chuẩn. Do đó, có thể kết luận phương pháp có độ đặc hiệu đáp ứng 

yêu cầu. 

3.2.2. Độ tuyến tính. 

Từ dung dịch chuẩn gốc của gypenoside XVII pha loãng chính xác để được 

các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 150 – 50 µg/ml bằng MeOH. Lấy 

chính xác 1,00 ml mỗi dung dịch chuẩn làm việc vào ống nghiệm, cô cách thủy 

đến cắn và tiếp tục tiến hành như mục 3.1.3. Kết quả khảo sát sự tương quan 

giữa độ hấp thụ và nồng độ của saponin (gypenoside XVII) được trình bày ở 

bảng và hình sau: 









27 



Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính tuyến tính của qui trình <strong>định</strong> ƣợng 



Nồng độ dung dịch chuẩn làm việc 

(µg/ml) 50 75 

Nồng độ dung dịch chuẩn đo 

0 

10 

12 

5 150 

quang (µg/ml) 10 15 20 25 30 

Độ hấp thụ 0,2 

15 

33 

0, 

34 

0,4 

Phương trình hồi qui y = 0,0226x – 0,0128 

Hệ số tương quan 0,9991 

Độ hấp thụ 

0.8 

0.6 

0.4 

0.2 

0 

41 

0,5 

4 

0,67 

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn tƣơng quan tuyến tính giữa nồng độ saponin 

gypenoside XVII và độ hấp thụ 

Kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ khảo sát của saponin gypenoside 

XVII từ 10 đến 30 (µg/ml) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ 

gypenoside XVII và độ hấp thụ với hệ số tương quan r ≈ 1. 

y = 0.0226x - 0.0128 

R 2 = 0.9981 

0 5 10 15 20 25 30 35 

Nồng độ (ug /ml) 









28 



3.2.3. Độ lặp lại 



Độ lặp lại của phương pháp được xác <strong>định</strong> khi phân tích các mẫu song song 

trong cùng một điều kiện thí nghiệm. Tiến hành <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 6 lần độc lập trên 

một mẫu thử theo quy trình chiết mẫu và phân tích đã lựa chọn (mục 3.1.3). 

Tính hàm <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> theo gypenoside XVII trong mẫu thử theo 

dược liệu khô. Kết quả được trình bày trong bảng sau: 









29 



Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ ặp ại của phƣơng pháp với (mẫu M01) 



Stt 

Lƣợng cân mẫu thử (g) 

Độ hấp 

thụ 

1 0,10029 0,492 

Độ ẩm (%) 

Hàm ƣợng 

saponin <strong>toàn</strong> 

<strong>phần</strong> (%) 

6,14 

2 0,10076 0,509 6,32 

3 0,10097 0,497 6,16 

9,22 

4 0,10022 0,486 6,07 

5 0,10059 0,473 5,89 

6 0,10071 0,476 5,92 

Hàm <strong>lượng</strong> trung bình (%) 6,08 

RSD (%) 2,69 

Chuẩn gypenoside XVII: 

Nồng độ (dung dịch chuẩn đo quang): 20 µg/ml 

Độ hấp thụ: 0,440 

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức hàm <strong>lượng</strong> 1 – 10% độ lặp lại của phương 

pháp (RSD) phải đạt nhỏ hơn hoặc bằng 2,7%. Kết quả phân tích cho thấy độ 

lặp lại khi <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> (tính theo gypenoside XVII) trong 

Giảo cổ lam đạt yêu cầu. Như vậy, phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của 


AOAC [11]. 








30 



3.2.4. Độ đúng 



Độ đúng được xác <strong>định</strong> bằng phương pháp thêm một <strong>lượng</strong> chính xác 

saponin gypenoside XVII chuẩn vào mẫu thử đã xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> saponin 

<strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> (M01) là 6,08%, độ ẩm 9,22% sao cho tổng nồng độ nằm trong 

khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành chiết và <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> như ở mục 3.1.3, 

từ kết quả thu được xác <strong>định</strong> độ thu hồi của phương pháp. Thực hiện ở một 

mức nồng độ với 6 lần làm lặp lại riêng biệt. Kết quả thu được như sau: 

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ đúng của phƣơng pháp 

Stt 

Lƣợng 

cân mẫu thử 

(g) 

Lƣợng 

chuẩn thêm 

(×10 -3 g) 

Độ 

hấp thụ 

Lƣợng 

chuẩn thu hồi 

(×10 -3 g) 

Độ thu 

hồi (%) 

1 0,07306 1,2 0,514 1,23 102,48 

2 0,07212 1,2 0,507 1,21 100,83 

3 0,07311 1,2 0,510 1,19 98,84 

4 0,07381 1,2 0,514 1,19 99,03 

5 0,07245 1,2 0,504 1,16 96,75 

6 0,07564 1,2 0,523 1,18 98,29 

Hàm <strong>lượng</strong> trung bình (%) 99,37 

RSD (%) 2,02 

Chuẩn gypenoside XVII: 


Nồng độ (dung dịch chuẩn đo quang): 20,23 µg/ml 



Độ hấp thụ: 0,494 






31 





Với quy trình đã lựa chọn, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> (tính theo 

gypenoside XVII) đã nghiên <strong>cứu</strong> trên nền mẫu thử có độ thu hồi từ 96,75 đến 

102,48%, đa số nằm trong khoảng yêu cầu về thẩm <strong>định</strong> phương pháp đối với 

phân tích mẫu của AOAC (nằm trong khoảng 97 – 103% với hàm <strong>lượng</strong> 1- 

10%), có 1 giá trị độ tìm lại xấp xỉ 97% là do mẫu thử là dược liệu, phép <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> qua nhiều giai đoạn nên kết quả như vậy có thể chấp nhận được. 

3.3. PHÂN TÍCH MẪU THỰC 

Các mẫu Giảo cổ lam được thu hái và xác <strong>định</strong> tên khoa học. Phơi khô. 

Nghiền. Xác <strong>định</strong> hàm ẩm bột dược liệu. Tiến hành chuẩn bị mẫu và phân tích 

như chỉ dẫn ở mục 3.1.3, mỗi mẫu chuẩn bị 3 thử riêng biệt. Kết quả được 

trình bày trong bảng sau: 









32 





Bảng 3.5. Kết quả hàm ƣợng saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> (tính theo gypenoside 

XVII) trong các mẫu thử 

Tên 

mẫu 

M02 

M03 

M04 

Stt 

Khối 

<strong>lượng</strong> 

cân (g) 

Độ hấp 

thụ 

1 0,10715 0,352 

Độ ẩm 

(%) 

Hàm <strong>lượng</strong> 

saponin <strong>toàn</strong> 

<strong>phần</strong> trong mẫu 

thử khô (%) 

4,20 

2 0,10082 0,318 10,0 4,03 

3 0,10267 0,327 4,07 

1 0,10206 0,616 

7,09 

2 0,10046 0,601 9,03 7,03 

3 0,10715 0,637 6,98 

1 0,10333 0,662 

7,52 

2 0,10144 0,659 8,46 7,63 

3 0,10614 0,671 7,42 

Hàm <strong>lượng</strong> 

trung bình (%) 

4,10 a 

7,03 b 

7,53 a 

* Chuẩn: Dung dịch chuẩn gypenoside XVII (dung dịch chuẩn đo quang) 

nồng độ 20 µg/ml. 

a là kết quả tính theo A c = 0,435 

b là kết quả tính theo A c = 0,468 

Kết quả ở bảng trên cho thấy hàm <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong Giảo cổ 


lam khá cao đều lớn hơn 4,0%. Kết quả này cũng tương đồng với công bố về 

hàm <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> của nhóm tác giả Phạm Thanh Kỳ là 4,12 – 

5,10% [5]. 








33 





3.4. BÀN LUẬN 

Trong thời gian gần đây, Giảo cổ lam được thu hái trong tự nhiên, trồng 

tăng lên nhiều do nhu cầu sử dụng dược liệu cũng như sản phẩm chế biến từ 

dược liệu không ngừng tăng lên. Giảo cổ lam là một trong 36 dược liệu nằm 

trong danh mục dược liệu tập trung phát triển qui mô lớn trong Quyết <strong>định</strong> 

1976/QĐ-TTg ngày 30/10/2013 Phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển dược 

liệu đến năm 2020 và <strong>định</strong> hướng đến năm 2030 của Thủ tướng Chính phủ. Để 

đảm bảo chất <strong>lượng</strong> nguồn dược liệu đầu vào phục vụ sản xuất và sử dụng thì 

việc chuẩn hóa hàm <strong>lượng</strong> hoạt chất chính có tác dụng là rất cần thiết. Theo 

các nghiên <strong>cứu</strong> về dược lý, chính saponin là thành <strong>phần</strong> mang lại tác dụng quý 

giá cho dược liệu này. 

Do trong Giảo cổ lam có rất nhiều saponin (gypenoside) nhưng hàm <strong>lượng</strong> 

không đủ lớn nên lựa chọn đối tượng <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> là nhóm chất saponin 

(saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong>) là hợp lý. <strong>Saponin</strong> <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong Giảo cổ lam có thể xác 

<strong>định</strong> bằng phương pháp cân với độ nhạy không cao [1] do đó yêu cầu <strong>lượng</strong> 

mẫu thử nhiều, chiết và tinh chế qua nhiều giai đoạn, thời gian phân tích kéo 

dài (có thể tới 2 ngày làm việc) khó đáp ứng được nhu cầu sản xuất; phương 

pháp quang phổ dựa trên phản ứng Rosenthaler có độ nhạy cao nên chỉ cần 

<strong>lượng</strong> mẫu nhỏ, thời gian xử lý mẫu rút ngắn khoảng 6-8 lần so với phương 

pháp cân. Chuẩn trong <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> của Giảo cổ lam được các 

tác giả lựa chọn là dịch chiết saponin (saponin extracts) [36], ginsenoside Rb1 

[4], [5]. Tuy nhiên, qua các nghiên <strong>cứu</strong> đã công bố thì chưa phát hiện thấy Rb1 

trong Giảo cổ lam Việt Nam, mặt khác khi sử dụng dịch chiết saponin làm chất 

đối chiếu thì thành <strong>phần</strong> dễ thay đổi trong quá trình bảo quản. Do vậy, lựa chọn 

được một gypenoside tinh khiết làm chất đối sẽ dễ dàng cho quá trình kiểm 

nghiệm. Các nghiên <strong>cứu</strong> sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lỏng kết nối 


với khối phổ đã xác <strong>định</strong> được gần 34 gypenoside như panaxadiol, gypenoside 

XVII, XLIX [27],… Căn cứ vào hàm <strong>lượng</strong> gypenoside trong Giảo cổ lam và 

tính sẵn có của chất chuẩn, nghiên <strong>cứu</strong> này lựa chọn gypenoside XVII làm chất 








34 



đối chiếu để <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> theo phương pháp quang phổ. 



Trong Giảo cổ lam ngoài thành <strong>phần</strong> saponin còn có một <strong>lượng</strong> lớn 

flavonoid, acid amin, acid hữu cơ, sterol, đường khử, và polysaccharid. Do đặc 

điểm saponin ít hấp thụ ánh sáng nên muốn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> được saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> 

theo phương pháp đo quang cần phải tiến hành tạo màu bằng phản ứng 

Rosenthaler với thuốc thử vanilin/ acid acetic băng và acid percloric. Trước 

hết saponin trong dược liệu cần được chiết kiệt, sau đó loại các thành <strong>phần</strong> 

có thể ảnh hưởng tới phản ứng tạo màu. Phương pháp chiết có ảnh hưởng lớn 

tới hiệu suất chiết saponin cũng như thời gian phân tích. Hai phương pháp được 

sử dụng trong nghiên <strong>cứu</strong> của chúng tôi là phương pháp đã được một số nghiên 

<strong>cứu</strong> sử dụng siêu âm [4], [36] và chiết soxhlet [1] với dung môi ethanol. Căn 

cứ vào kết quả khảo sát thu được chúng tôi lựa chọn cách chiết bằng siêu âm 

cho hiệu suất chiết tương đương, nhưng rút ngắn thời gian chiết 4 lần so với 

chiết Soxhlet, đặc biệt có thể tiến hành chiết nhiều mẫu trong cùng một lần tiến 

hành. Điều này có thể giải thích là do phương pháp siêu âm có tác dụng tăng 

mạnh tính thẩm thấu và khuếch tán nhờ tác dụng của sóng siêu âm làm tăng 

diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ, 

tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp. Các loại dung môi chiết mẫu được sử 

dụng khảo sát dựa trên độ tan của saponin trong các dung môi thông thường 

như aceton, methanol, ethanol. Kết quả cho thấy chiết bằng methanol cho kết 

quả <strong>lượng</strong> chất chiết được (tỷ số đáp ứng phân tích/khối <strong>lượng</strong>: A/m) cao nhất. 

Kết quả của nghiên <strong>cứu</strong> cho thấy thời gian chiết mẫu cũng ảnh hưởng đến hàm 

<strong>lượng</strong> hoạt chất chiết ra. Cụ thể khi tăng thời gian chiết từ 30 - 45 phút, <strong>lượng</strong> 

saponin chiết được tăng, khi tăng thời gian chiết từ 45 – 75 phút, <strong>lượng</strong> hoạt 

chất chiết được thay đổi không đáng kể. Do vậy việc lựa chọn thời gian chiết 

45 phút có tác dụng tiết kiệm thời gian. Lượng mẫu thử cũng được xem xét, 


các tác giả [1], [4], [36] đều chiết 10 g mẫu thử, sau đó phải pha loãng nhiều 

lần như vậy mất nhiều thời gian và dung môi để chiết kiệt hoạt chất trong dược 

liệu, chúng tôi đã khảo sát <strong>lượng</strong> mẫu chiết ban đầu chỉ bằng 1/10 so với các 








35 





nghiên <strong>cứu</strong> trên (1,00 g), nhưng độ pha loãng mẫu vẫn lên tới 500 lần do đó 

trong qui trình chúng tôi chỉ dùng 0,10 g mẫu thử vẫn đảm bảo yêu cầu. 

Dịch chiết methanol của Giảo cổ lam, ngoài thành <strong>phần</strong> saponin còn có một 

<strong>lượng</strong> lớn flavonoid và các chất có thể tan trong methanol do đó cần tinh chế 

saponin để loại các chất cản trở tới kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>. Dược điển Việt Nam 

IV - chuyên luận Giảo cổ lam khi tinh chế saponin để <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> bằng phương 

pháp cân sử dụng dung môi là n – butanol [1]. Còn khi <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin 

bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao hoặc sắc ký lỏng – khối phổ, dịch chiết dược 

liệu thường được tinh chế bằng chiết pha rắn, tác giả Kao, T.H., et al. (2008) 

dùng cột C18 [18] dùng cột Diaion HP-20 để xử lý dịch chiết methanol trước 

khi tiêm mẫu vào hệ thống LC-MSMS xác <strong>định</strong> các saponin cho kết quả tốt. 

Nhóm tác giả Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ và cộng sự cũng dùng chất 

nhồi Diaion HP-20 để tinh chế saponin sau đó làm phản ứng màu để đo quang 

[4]. Hai phương pháp tinh chế saponin đã được khảo sát là chiết pha rắn với 

chất nhồi Diaion HP-20 và chiết lỏng – lỏng bằng n-butanol. Kết quả cho thấy 

đáp ứng phân tích khi tinh chế saponin theo phương pháp chiết lỏng – lỏng cao 

hơn so với khi tinh chế bằng chiết pha rắn có thể do còn một <strong>lượng</strong> hoạt chất 

chưa được rửa giải hết khi chiết pha rắn. Hơn nữa, chiết pha rắn yêu cầu thiết bị 

phức tạp, cột chiết đắt tiền, người phân tích có kinh nghiệm nên trong nghiên 

<strong>cứu</strong> này phương pháp chiết lỏng – lỏng được sử dụng là phù hợp và có tính 

kinh tế cao. 

Điều kiện phản ứng màu Rosenthaler dựa trên nghiên <strong>cứu</strong> của tác giả [4] với 

nồng độ và thể tích thuốc thử vanilin 5% trong acid acetic băng và acid 

percloric 72%, thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng; mẫu thử sau khi phản 

ứng được làm lạnh và pha loãng bằng ethyl acetat tới thể tích và đo quang. 

Việc sử dụng dung môi hữu cơ ethyl acetat [4] chiếm hơn 2/3 thể tích môi 


trường mẫu đo giúp giảm nồng độ acid nên an <strong>toàn</strong> hơn cho người phân tích 

mà vẫn đảm bảo độ bền vững của sản phẩm phản ứng tạo thành. Hầu hết 

trường hợp <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin bằng quang phổ đều sử dụng phản ứng này 








36 





(phản ứng Rosenthaler). Sản phẩm của phản ứng có màu tím cho cực đại hấp 

thụ ở bước sóng khoảng 550 nm nên khá chọn lọc và có độ nhạy cao (nồng độ 

saponin trong dung dịch đo quang chỉ cỡ 10 µg/ml) do vậy giảm <strong>lượng</strong> mẫu, 

giảm dung môi chiết xuất và tinh chế từ đó giảm thời gian phân tích, giảm 

thiểu ô nhiễm môi trường. 

Phương pháp phân tích trong nghiên <strong>cứu</strong> này được thẩm <strong>định</strong> các chỉ tiêu độ 

chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Kết quả cho thấy phương 

pháp cho độ chọn lọc cao, các dung môi chiết mẫu ảnh hưởng không đáng kể 

tới giá trị đáp ứng (



37 





1. Kết uận 

sau: 

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 

Sau thời gian tiến hành thực nghiệm, khóa luận đã thu được một số kết quả 

Đã xây dựng và thẩm <strong>định</strong> được phương pháp <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> 

<strong>phần</strong> bằng phương pháp quang phổ dùng saponin gypenoside XVII là chất 

đối chiếu với qui trình cụ thể là: 

- Chuẩn bị các dung dịch: 

Dung dịch thử: Bột dược liệu được chiết siêu âm bằng MeOH, sau 

đó tinh chế bằng n-BuOH rồi hòa tan cắn sau cùng với MeOH 

được dung dịch đem đi phản ứng 

Dung dịch chuẩn: dung dịch gypenoside XVII pha trong MeOH 

nồng độ 0,1 mg/ml. 

- Phản ứng màu và đo quang: 

Thuốc thử: Vanilin/ acid acetic băng 5% và acid percloric. Pha 

vừa đủ trong bình <strong>định</strong> mức 5ml bằng ethylacetat. 

Quét phổ trong khoảng 420-700 nm 

Đo độ hấp thụ ở bước sóng 550nm với mẫu trắng là MeOH 

- Tính kết quả: Hàm <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong mẫu thử khô (%) 

tính theo gypenoside XVII được tính toán dựa vào nồng độ chuẩn, độ 

hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, khối <strong>lượng</strong> và độ ẩm của 

mẫu thử, độ pha loãng của dung dịch thử. 

Phương pháp <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> đã được thẩm <strong>định</strong> đáp 

ứng yêu cầu của AOAC đối với mẫu thử dược liệu. Kết quả thu được cho 

thấy các tiêu chí thẩm <strong>định</strong> tính chọn lọc ảnh hưởng của mẫu placebo là 


không đáng kể, khoảng tuyến tính của gypenoside 10 – 30 µg/ml cho 

thấy mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ hoạt chất và độ hấp thụ với 

r = 0.9991, độ lặp lại cao với RSD = 2,69% đạt yêu cầu AOAC (≤ 2,7%), 










38 



độ đúng 99,37%, nằm trong khoảng giới hạn 97 – 103% đối với hàm 

<strong>lượng</strong> mẫu 1-10% theo AOAC. 

Đã áp dụng phương pháp phân tích đối với 4 mẫu dược liệu Giảo cổ lam 5 

lá và 7 lá thu hái tại các nơi khác nhau. Kết quả cho thấy hàm <strong>lượng</strong> 

saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> của 4 mẫu nghiên <strong>cứu</strong> nằm trong khoảng 4,0 – 7,5% 

tính theo dược liệu khô. Kết quả này tương đương với công bố về hàm 

<strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> của các tác giả Việt Nam và Trung Quốc. 

2. Đề xuất 

Trong quá trình thực hiện khóa luận này, loài G.Pentaphyllum đã được <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> trên 16 mẫu khác nhau, tuy nhiên nguồn gốc các loài chưa thực sự 

phong phú. Vì vậy tôi xin đưa ra đề suất sau: 

- Cần thu thập thêm các mẫu của loài này từ các vùng khác nhau trong cả 

nước từ đó đánh giá được vùng cho điều kiện tốt nhất để phục vụ nhu 

cầu canh tác. 

- Cần phân tích, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> các loài khác ở Việt Nam để có thể so sánh 

rõ hơn hiệu quả kinh tế mà từng loài đem lại. 









39 





TÀI LIỆU THAM KHẢO 

Tài liệu tiếng Việt 

1. Bộ Y tế (2015), Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận Giảo cổ lam. 

2. Lê Thị Thanh Thảo, Đỗ Quyên (2015), “Định <strong>lượng</strong> saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong lá 

Đu đủ rừng bằng phương pháp đo quang”, Tạp chí nghiên <strong>cứu</strong> dược và Thông tin 

thuốc số 2, tr. 30-34. 

3. Nguyễn Tiến Dẫn, <strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> thành <strong>phần</strong> hóa học và tác dụng sinh học của cấy 

thất diệp đởm, Luận văn Thạc sĩ Dược học, trường Đại học Dược Hà Nội. 

4. Phạm Tuấn Anh, Phạm Thanh Kỳ, Trịnh Thị Diệp Thanh (2014), “Định <strong>lượng</strong> 

saponin <strong>toàn</strong> <strong>phần</strong> trong giảo cổ la, Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 

trồng ở 3 vùng bằng phương pháp đo quang’’, Tạp chí Dược học số 2, tr. 54. 

5. Phạm Thanh Kỳ (2015), <strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> khảo nghiệm vùng trồng cây Giảo cổ lam 

bảy lá (Gynostemma pentaphyllum (Thumb. ) theo các tiêu chí của GAP, Báo 

cáo đề tài cấp Bộ Y tế. 

6. Phạm Thanh Kỳ, P.T. Hương, T.L.V. Hiền (2007), “<strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> tác dụng ức chế 

khối u của saponin chiết từ Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (thunb.) 

Makino)”, Tạp Chí Thông Tin Y Dược số 11. 

7. Phạm Thanh Kỳ, P.T.P. Phi, P.T.T. Anh (2007), “<strong>Nghiên</strong> <strong>cứu</strong> tác dụng tăng đáp 

ứng miễn dịch của dược liệu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) 

Makino)”, Tạp Chí Thông Tin Y Dược số 5, tr. 35–38. 

8. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, quyển I, tr. 563-575. 

9. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam tập 2, tr. 308-309. 

10. Võ Văn Chi (1997), Từ điển thực vật thông dụng tập 2, tr. 1322-1323. 

Tài liệu tiếng Anh 

11. AOAC International (2012), AOAC official methods of analysis, Appendix K: 

Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part I: AOAC Guidelines for 

single laboratory validation of chemical methods for dietary supplements and 

botanicals 

12. A. Norberg, N.K. Hoa, E. Liepinsh, D. Van Phan, N.D. Thuan, 

H.Jornvall, et al., ( 2004), “ A novel insulin-releasing substance, phanoside, 

from the plant Gynostemma pentaphyllum”, J Biol Chem 279, pp. 41361– 









40 





41367. 

13. Choi, H. S.; Park, M. S.; Kim, S. H.; Hwang, B. Y .; Lee, C. K.; Lee, M. 

K.Molecules (2010) 15 (4), pp. 2814–24. 

14. Ding, Y .; T ang, K.; Li, F .; Hu, Q. Afr . J. Agric. Res (2010) 5 (8), pp. 707– 

711. 

15. Elmer Drew, Merill (1904 – 1992), Note worthy Pilippine plants, Bureau of 

Public Crinting, Manila. 

16. H. Van Lam (2009), “Biodiversity of the genus Gynostemma in the north of 

Vietnam”, Proc. 6th Indochina Conf. Pharm. Sci., pp. 83–88. 

17. Joh, E. H.; Y ang, J. W.; Kim, D. H. Planta Med (2010) 76 (8), pp. 793–5. 

18. Kao, T.H., et al.(2008), “Determination of flavonoids and saponins in 

Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino by liquid chromatography–mass 

spectrometry”, Analytica Chimica Acta, 626(2): pp. 200-211. 

19. K. Yoshikawa, S. Arihara, K. Matsuura, T. Miyase (1991), “Dammarane 

saponins from Gymnema sylvestre », Phytochemistry 31, pp. 237–241. 

20. Lu, J.G., et al.(2013), “Chemical differentiation of two taste variants of 

Gynostemma pentaphyllum by using UPLC-Q-TOF-MS and HPLC-ELSD”; 

J Agric Food Chem 61(1), pp. 90-7 

21. Lin, J. M.; Lin, C. C.; Chiu, H. F .; Y ang, J. J.; Lee, S. G. Am. J. Chin. Med 

(1993), 21(1), pp. 59–69. 

22. Li, L.; Lau, B. H. S. Phytother . Res (1993), 7(4), pp. 299–304. 

23. Lin, C. C.; Huang, P . C.; Lin, J. M. Am. J. Chin. Med (2000), 28(1), pp. 87–96. 

24. L. Nippon Shoji Co., T. Takemoto (1983), “<strong>Saponin</strong>s from Gynostemma 

pentaphyllum”, Jpn. Kokai Tokkyo Koho, JKXXAF JP . 

25. M. Kuwahara, F. Kawanishi, T. Komiya, H. Oshio (1989), “Dammarane 

saponins of Gynostemma pentaphyllum Makino and isolation of 

malonylginsenosides-Rb1, -Rd, and malonylgypenoside V.”, Chem. Pharm. Bull. 

37, pp. 135–139. 

26. Natthakarn Chiranthanut, Supanimit Teekachunhatean, Ampai Panthong, Parirat 

Khonsung, Duangta Kanjanapothi, Nirush Lertprasertsuk (2013), “Toxicity 









41 





evaluation of standardized extract of Gynostemma pentaphyllum Makino”, 

Journal of Ethnopharmacology 149 (2013), pp. 228–234. 

27. SHI Mei-rong, LI Hua, BAI Ge, XIAO Ya-ping (2015), “Quantification of five 

saponins in Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino by HPLC”, Journal of 

Science and Technology of Food Industry (China), Vol. 36, 02 (2015), pp. 49-56. 

28. S. Megalli, F. Aktan, N. M. Davies, B. D. Roufogalis ( 2005), 

”Phytopreventative anti-hyperlipidemiceffects of gynostemma pentaphyllum in 

rats”, J Pharm Pharm Sci 8, pp. 507–515. 

29. Tanner, M. A.; Bu, X.; Steimle, J. A.; Myers, P . R (1999), “The direct release 

of nitric oxide by gypenosides derived from the herb”, Gynostemma 

pentaphyllum, Nitric Oxide , 3 (5), pp. 359–365. 

30. Wu zhengYi, Peter H. Raven, Hong Deynan (2008), Flora of China, vol. 19, 

Science Press China. 

31. Xie, Z.; Liu, W.; Huang, H.; Slavin, M.; Zhao, Y .; Whent, M.; Blackford, 

J.;Lutterodt, H.; Zhou, H.; Chen, P .; Wang, T . T . Y .; Wang, S.; Y u, L. J 

(2010), Agric.Food Chem, 58 (21), pp. 11243–11249. 

32. X. Liu, W. Ye, Z. Mo, B. Yu, S. Zhao, H. Wu, et al. (2004), "Five new 

Ocotillone-type saponins from Gynostemma pentaphyllum”, J Nat Prod 67, pp. 

1147–1151. 

33. Y.C. Ma, J. Zhu, L. Benkrima, M. Luo, L.H. Sun, S. Sain, et al. (1995), “A 

comparative evaluation of ginsenosides in commercial ginseng products and 

tissue culture samples using HPLC”, J. Herbs, Spices, Med.Plants, pp. 341–50. 

34. Y eo, J.; Kang, Y . J.; Jeon, S. M.; Jung, U. J.; Lee, M. K.; Song, H.; Choi, 

M.S. J. Med. Food (2008), 11 (4), pp. 709–16. 

35. Zhao, Y., et al. (2012), Chemical compositions, “HPLC/MS fingerprinting 

profiles and radical scavenging properties of commercial Gynostemma 

pentaphyllum (Thunb.) Makino samples”, Food Chemistry 134(1), pp. 180-188. 

36. Zhuohong Xie, Margaret Slavin, Huiping Zhou, et al., (2010), “Chemical 

Composition of Five Commercial Gynostemma pentaphyllumSamples and Their 

Radical Scavenging, Antiproliferative, and Anti-inflammatory Properties. J. 

Agric”, Food Chemistry 58, pp. 11243–49. 









42

Nghiên cứu định lượng Saponin toàn phần trong Giảo cổ lam

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?