Download ePaper

ỨNG DỤNG CỦA CHIẾT PHA RẮN SPE TRONG VIỆC NÂNG CAO KẾT QUẢ PHÂN TÍCH Y DƯỢC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH

LINK DOCS.GOOGLE: https://drive.google.com/file/d/0B_NNtKpVZTUYQllWX0l3RVdiUm8/view?usp=sharing LINK DOCS.GOOGLE:
https://drive.google.com/file/d/0B_NNtKpVZTUYQllWX0l3RVdiUm8/view?usp=sharing

from daykemquynhon More from this publisher

14.10.2017 Views

“Ứng dụng của chiết pha rắn SPE trong việc nâng cao kết quả phân tích y dược" 1

“Ứng dụng của chiết pha rắn

SPE trong việc nâng cao kết

quả phân tích y dược"

Chiết pha rắn là gì?

SPE là một công nghệ chuẩn bị mẫu có sử

dụng hạt rắn, vật liệu cơ bản dựa trên

nguyên lý của sắc ký, là quá trình phân bố

của các chất giữa 2 pha, trong đó lúc đầu

chất mẫu ở dạng lỏng (pha nước, hay

hữu cơ), chất chiết ở dạng rắn, dạng hạt

nhỏ và xốp đường kính 25 - 70 µm được

nhồi trong 1 loại thiết bị cột để tách các

thành phần khác nhau của 1 mẫu.

chiết pha rắn (Solid Phase Extraction ), hay chiết rắn-lỏng

Điều kiện chiết pha rắn SPE

Tính chọn lọc của pha tĩnh chiết.

Các chất chiết và dung môi rửa giải phải có độ sạch cao

Hệ số phân bố nhiệt động Kfb của cân bằng chiết phải lớn

Quá trình chiết phải xẩy ra nhanh và nhanh đạt cân bằng, nhưng

không có tương tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn

và chất phân tích.

Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch

Không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích trong quá trình chiết

bởi bất kỳ từ nguồn nào.

Sự chiết phải được thực hiện trong điều kiện nhất định phù hợp,

phải lặp lại được tốt và tất nhiên là càng đơn giản dễ thực hiện

thì càng tốt.

Kết hợp SPE với một số thiết bị hiện đại

MSMS EIC 20 ng/mL Salbutamol – 1 mL Urine 78:20:2 Elution Solvent

(Dichloromethane:Isopropanol:Ammonium Hydroxide)

RT: 0.00 - 4.00

Abundance100

Relative Abundance

80

60

40

20

0

Relative Abundance100

80

60

40

20

0

80

60

40

20

0

Relative Abundance100

80

60

40

20

Relative Abundance100

CLEAN SCREEN ®

1.20

1.90

1.97

1.95

1.94

0

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Time (min)

NL: 7.80E6

m/z= 221.60-222.60 F:

+ c ESI w Full ms2

240.10@32.00 [

65.00-500.00] MS 81

cerex

NL: 7.80E6

m/z= 221.60-222.60 F:

+ c ESI w Full ms2

240.10@32.00 [

65.00-500.00] MS 81

certify

NL: 7.80E6

m/z= 221.60-222.60 F:

+ c ESI w Full ms2

240.10@32.00 [

65.00-500.00] MS 81

clean scrn

NL: 7.80E6

m/z= 221.60-222.60 F:

+ c ESI w Full ms2

240.10@32.00 [

65.00-500.00] MS 81

oasis

So sánh kết quả thu hồi Benzoylecgonine từ 1ml nước tiểu ngựa

( quá trình làm sạch đường nền bằng chiết pha rắn)

10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS CleanScreen

PC: CONDOA BEG-TMS CleanScreen

Abundance

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3788.D

Abundance

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3790.D

6000000

4000000

2000000

0

Time-->

5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00

0

Time-->

5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00

10 ng/mL Equine Urine 1 mL BEG-TMS Cerex

Abundance

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3793.D

6000000

PC: CONDOA BEG-TMS Cerex

Abundance

Ion 240.00 (239.70 to 240.70): 3795.D

6000000

4000000

2000000

0

Time-->

5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00

0

Time-->

5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00

Kỹ thuật chiết pha rắn

được coi là “bước nhảy

vọt” trong xử lý mẫu

Nội dung

1. Thiết bị SPE

2. Cơ chế SPE

3. Kỹ thuật SPE

4. Tính khả thi của kỹ thuật SPE

THIẾT BỊ

Cartric, cột nhồi đơn giản

Chất nhồi cột SPE

Thiết bị đi kèm SPE

12

Thiết bị SPE kết nối

Cơ chế

2.1. Các kiểu tương tác chính

1. Phân cực

2. Không phân cực

3. Trao đổi ion

4. Cộng hóa trị

5. Liên kết polyme

2.2. Phân loại cơ chế

Pha

thường

Cơ chế

Pha đảo

Chiết rây

phân tử

Trao đổi

ion

Trao đổi

cation

Trao đổi

anion

2.2.1. Chiết pha thường NPE

Tính năng chính pha tĩnh: ái lực mạnh, phân cực (liên kết H)

Liên kết liên quan: pi-pi và tương tác lưỡng cực

Chất hấp phụ: - silica, diol, diethylamino, cyanopropyl

Ứng dụng tách: - Chất béo, chất phụ gia giàu, carbohydrates,

phenols, vitamins tan trong dầu

Phân tích: - amines, hydroxyls, carbonyls, vòng thơm, các dị

tố (O, S, N, P)

Hỗn hợp: - Không phân cực, hữu cơ

Dung môi rửa giải: - Trung bình đến phân cực cao

2.2.2. Chiết pha đảo RPE

Tính năng chính pha tĩnh: Kỵ nước, không phân cực

Lực liên kết: Lực Vabvander, lực phân tán

Chất hấp phụ: - C2, C3,C4, iC4, tC4, C5, C6, C7, C8,

C10, C12, C18, C20, C30 phenyl, cyclohexyl

Ứng dụng: - Dược phẩm, Thuốc trừ sâu

Phân tích: - Chất trung tính hoặc proton hóa, vòng thơm,

chuỗi ankyl

Nền mẫu (maxtric): - Sinh học, nước, dung dịch đệm

Dung môi rửa giải: - Không phân cực đến phân cực yếu

Nguyên lý pha đảo

2.2.3. Chiết rây phân tử (loại cỡ, gel)

Các chất hấp thu là các hạt silicagen có diện tích bề mặt

lớn, trên bề mặt hạt silic, có các mao quản kích thước lỗ

lớn, 275-300

300A o .

Áp dụng: Chiết tách các hợp chất có khối lượng lớn cỡ

2000D

Tương tác: Đi vào lỗ xốp nhờ tương tác phân cực, kỵ nước

hay trao đổi ion. Thí dụ chất hấp thụ kỵ nước kiểu butyl với

hàm lượng Cacbon nạp khoảng 6%, loại khác là có gắn

nhóm trao đổi ion –COOH,

hàm lượng C khoảng 12,2%

Cột chiết C8 và polyme

(áp

dụng chiết pha đảo)

0 4 8 12 16 20

Time (minutes)

C8

Column

0 4 8 12 16 20

Time (minutes)

Copolymeric

Column

Ảnh hưởng của độ dài chuỗi

(Kết quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE)

4

3.0e

4

2.0e

1

2

3

5

3.0e

4

2.0e

1

3

2

5

4

1.0e

4

0

0 2 4 6 8

C18

4

C2 0

0 2 4 6 8

endogenous

peaks:

area = 71,628

96%

94%

96%

98%

1

2

3

4

5

Butabarbital 64%

Amobarbital 87%

Pentobarbital 88%

Secobarbital 89%

Glutethimide 78%

endogenous

peaks:

area = 11,257

Ảnh hưởng của loại mạch

(Kết

quả sau khi làm sạch mẫu bằng SPE)

3.0e

4

2.0e

2

3

4

5

IST

D

3.0e

4

2.0e

1

3

2

4

5

IST

D

4

1

4

1.0e

4

0 2 4 6 8 10

4

0 2 4 6 8 10

0

Ct4

0

Cn4

Đỉnh nội sinh:

area = 1,336

28%

73%

84%

98%

70%

1

2

3

4

5

Butabarbital 93%

Amobarbital 97%

Pentobarbital 98%

Secobarbital 98%

Glutethimide 96%

Đỉnh nội sinh

area = 18,271

2.2.4. Cơ chế trao đổi ion

Tương tác ion xảy ra giữa chất hấp phụ và chất phân tích

Duy trì pH thích hợp cho quá trình phân tích

Liên kết ion đủ mạnh, giữ lại chất phân tích

Loại bỏ các chất bẩn bằng dung môi thích hợp

Dung môi rửa giải có lực kéo mạnh hơn hoặc thay đổi pH

Cơ chế rửa giải bằng cách đồng thời phá vỡ tất cả các tương tác

Có 2 loại trao đổi ion là trao đổi cation và trao đổi anion

pKa, pH & trạng thái ion hóa

% hợp chất ở trạng thái ion

Chức

Trạng thái ion

2< 1< at pKa 1> 2>

Acid Anion (-) 1 9 50 91 99

Base Cation (+) 99 91 50 9 1

Phase Modification Key feature

SB (SAX) quaternary amine strongly basic anion exchanger

SA (SCX) benzenesulphonic acid strongly acidic cation exchanger

PCA (WCX) propylcarboxylic acid weakly acidic cation exchanger

PSA propylsulphonic acid very strong cation exchanger

Chiết trao đổi cation

Chất trao đổi cation tích điện âm

Chất phân tích mạng điện tích dương

Hình thành liên kết mới

Chất hấp phụ

– Benzenesulfonic acid (mạnh)

– Propylsulfonic acid (mạnh)

– Carboxylic acid (yếu)

Áp dụng: Dược phẩm, thuốc diệt cỏ

Phân tích

– Amines

– Pyrimidines (cations)

Nền mẫu – nước

Dung môi rửa giải trung hòa chất phân tích

Chiết trao đổi anion

Chất hấp phụ trao đổi anion mang điện tích dương

Chất phân tích có tính axit mang điện tích âm

Hình thành liên kết

Chất hấp phụ

– Amin bậc 1, 2

– Aminopropyl (yếu)

– Quaternary amine (mạnh)

– Diethylamino (yếu)

Áp dụng: phosphates, thuốc có tính axit, axit hữu cơ, axit béo, vitamins

Phân tích

– Phosphates

– Carboxylic acids

– Sulfonic acids (cations)

Nền mẫu – nước

Dung môi rửa giải có tính axit để trrung hòa chất phân tích

CAQAX

Cột trao đổi anion

Độ chọn lọc

Silica Backbone

Quaternary Amine anion exchanger

Acetate counter ion

(Standard anion exchanger carries Cl - )

CHQAX

Silica Backbone

Quaternary Amine anion exchanger

Acetate counter ion

(Standard anion exchanger carries Cl - )

Khả năng thay thế của các ion

Strong Cation Exchanger

Si

SO - 3

Benzenesulfonic Acid (BCX)

Strong Anion Exchanger

- Si - (CH 2 ) 3 N + (CH 3 ) 3

Quaternary Amine (QAX)

Độ chọn lọc ion

Ba2+

Cations

Anions

8.7

Ag 2+ 7.6 Benzene Sulfonate 500

Pb 2+ 7.5 Citrate 220

Hg 2+ 7.2 I - 175

Cu + 5.3 Phenate - 110

Sr 2+ -

4.9 HSO 4 85

Ca 2+ -

3.9 CIO 3 74

Ni 2+ -

3.0 NO 3 65

Cd 2+ 2.9 Br - 50

Cu 2+ 2.9 CN - 28

CO 2+ 2.8 HSO - 27

Zn 2+ 2.7 BrO 27

Cs 2+ 2.7 NO 2 24

Rb + 2.6 CI - 22

K + -

2.5 HCO 3 6.0

Fe 2+ -

2.5 IO3 3 5.5

Mg 2+ 2.5 Formate - 4.6

Mn 2+ 2.3 Acetate - 3.2

+

NH 4 1.9 Propionate - 2.6

Na + 1.5 F - 1.6

H + 1.0 OH - 1.0

Li + 0.8

Polymer được thế hóa bề

mặt

R

(-CH-CH 2 ) n -

R

N-CH 3

C=O

CH 3

R

Polymer được thế hóa bề

mặt

R

(-CH-CH 2 ) n -

R

N-CH 3

C=O

CH 3

SO 3 H or

SO 3 H or CH 2 N + R 3

CH 2 N + R 3

Ảnh hưởng của pH đến khả

năng thu hồi khi dùng cột SPE

2

3

4

5

1

2

3 4

5

1

pH 6 pH 5

1

2

3

4

5

Ibuprofen

Meprobamate

Glutethimide

Phenobarbital

Phenytoin

Kỹ thuật

Quy trình chiết SPE

Hoạt hóa cột

Đưa mẫu phân tích lên cột

Loại tạp chất

Rửa giải (giải hấp) chất phân

tích

34

Bước 1

Hoạt

hóa cột

sắc ký

Làm ướt vật liệu nhồi

Loại không khí trong các khoảng

trống trong lớp chất của cột

Không được để chất trong cột bị

khô

…

35

Chất phân tích được đưa lên cột

Bước 2

Mẫu phân

tích được

chảy qua

cột

Một vài thành phần ảnh hưởng

khác cũng có thể bị giữ lại

Các thành phần không tương

tác bị loại ra làm sạch chất phân

tích

36

Giữ lại chất phân tích

Bước 3

Loại bỏ các

chất gây

ảnh hưởng

Nếu mẫu là dung dịch nước, sử

dụng dung dịch đệm hoặc hỗn

hợp nước-dung môi hữu cơ

Nếu mẫu hoà tan trong dung

môi hữu cơ thì khi rửa cột có

thể sử dụng chính dung môi đó

37

Bước 4

Giải hấp

chất phân

tích bằng

dung môi

thích hợp

Dung môi được chọn đặc trưng

để phá vỡ tương tác giữa chất

phân tích và chất hấp phụ với

mục đích rửa giải được chất

phân tích với hiệu quả cao

Dung môi sử dụng rửa giải đồng

thời càng ít chất gây ảnh hưởng

tới phép phân tích càng tốt.

Meprobamate

O

CH 3

O

NH 2

C

O

CH 2

C

CH 2

O

C

NH 2

CH 3

Polar Drug

Copolymeric DAU Column

Ảnh hưởng của dung môi rửa

giải đến độ thu hồi

Hexane/Ethyl Acetate

Methylene Chloride

1 2

1

2

Ibuprofen

Meprobamate

Amphetamine Structures

CH 2

CH

NH

Amphetamine

pKa = 9.9

CH 3

2

Methamphetamine

pKa = 9.9

CH 2

CH

CH 3

NH 2

CH 3

H H H

C C N CH 3

OH CH 3

Ephedrine

pKa = 9.6

Ảnh hưởng của dung môi rửa

giải đến độ thu hồi

1 d-Amphetamine

2 d-Methamphetamine

3 PPA

4 Pseudoephedrine

5 Meperidine

6 Lidocaine

7 PCP

8 Methadone

9 Propoxyphene

10 Cocaine

11 Codeine

12 Diazepam

13 Nordiazepam

14 Chlordiazepoxide

1

2

3

4

Elution:

MeCl 2 / IPA / NH 4 OH

(78/20/2)

Ảnh hưởng của dung môi rửa

giải đến độ thu hồi

1 d-Amphetamine

2 d-Methamphetamine

3 PPA

4 Pseudoephedrine

5 Meperidine

6 Lidocaine

7 PCP

8 Methadone

9 Propoxyphene

10 Cocaine

11 Codeine

12 Diazepam

13 Nordiazepam

14 Chlordiazepoxide

1

2 3

4

Elution:

EA / NH 4 OH

(98/2)

Hoạt hóa cột

1. 2 x 2.5 ml MeOH

2. 2 x 2.5 ml đệm phosphat (0.1M, pH 7.0)

ROBINUL

(GLYCOPYRROLATE)

FROM EQUINE

URINE BY SPE-LCMSMS

500 mg / 14 mL

Chuẩn bị mẫu

1. 5 ml nước tiểu + 3 ml đệm phosphate (0,1M , pH 7.0)

2. Thêm 12.5 (ng) of mepenzolate (chuẩn nội)

3. Thêm 5 ml H 2 O

4. Lắc, ly tâm 5 phút (800v/phút)

5. Đưa dịch trong lên cột SPE

Loại tạp

1. 5 ml MeOH

2. 5 ml H 2 O

Rửa giải

4 ml MeOH + 4 ml ammoni

acetate (0,5M, pH 3.0)

GLYCOPYRROLATE

LCMSMS of Glycopyrrolate

45

Chuẩn bị mẫu

1 mL sản phẩm rau quả hòa tan trong 2 ml nước.

Ví dụ

Chiết nhanh

hàm lượng

chất sơ trong

sản phẩm rau

Điều kiện cột

Cột C18 SPE (nhồi khoảng 3ml) được hoạt hóa với 1 mL

methanol và một thể tích tương đối nước cất

Thêm mẫu/rửa:

Đưa mẫu phân tích lên cột khoảng 5 mL, nước cất được sử

dụng loại bỏ đường và axit hữu cơ.

Rửa giải:

Chất khô [anthocyanines, flavonoids, tannins and/or

alkaloids] được rửa giải với một lượng metanol.Thêm một

chút propanol-2 sẽ cho kết quả tót hơn.

Phân tích

Dùng quang phổ để phân tích dịch chiết.

Sử dụng bản mỏng TLC.

46

Đưa mẫu lên

trên cột tách

47

Rửa loại bỏ

chất bẩn

48

Rửa giải

Thảo luận

4.1. Phạm vi ứng dụng

Môi trường

» Nước, đất

Dược phẩm, y học

» Thuốc, nước tiểu, máu

Thực phẩm

» Nước hoa quả, bảo quản, sữa

Hóa sinh

» Nước, nước tiểu

4.2. So sánh phương pháp

LLE

Dùng 200-500

ml dung môi

SPE

Dùng 2 - 20 ml dung môi

Quá trình lắc liên tục

Hình thành nhũ tương

Độ chọn lọc thấp

Quá trình lọc

Không hình thành nhũ tương

Độ chọn lọc cao

Thời gian 1 - 2 giờ / mẫu

Thời gian 10 - 20 phút / mẫu

4.2. Ưu điểm

Có tính chọn lọc đối với một nhóm hợp chất phân tích

Cân bằng chiết nhanh đạt được và có tính thuận nghịch,

Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất,

Thao tác đơn giản và nhanh hơn các kỹ thuật chiết khác,

Trong quá trình chiết luôn luôn có cả sự làm giầu chất phân tích,

Chất chiết pha rắn không đắt (khoảng 50.000 đ.VN/1cột chiết)

Ưu điểm

Tinh chế nguyên liệu loại tạp chất

Kết hợp với nhiều phương pháp khác cho kết quả cao:

SPE + HPLC, SPE + GCMS

Thu hồi các chất phân tích với hiệu suất cao

Dễ tự động hóa, phù hợp với sắc k y

Giảm lượng dung môi hữu cơ dẫn đến giảm giá thành

4.3. Vi chiết pha rắn

Khái niệm

Dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích X giữa hai

pha không trộn lẫn vào nhau trong đó pha mẫu chứa chất X

là chất lỏng, còn pha chiết là chất rắn.

Pha chiết (que chiết) là các hạt chất rắn xốp cỡ hạt vài

micromet được tẩm lên thanh que nhỏ kim loại hay PE

(1x4mm) tạo thành lớp màng chất chiết dầy khoảng 0,3-

0,5mm bao xung quanh tạo ra que chiết.

Que chiết được để trong hệ xylanh và kim tiêm có thể cắm

qua chiết vào qua nút cao su của bình chứa mẫu cần chiết.

Kiểu chiết và cơ chế chiết

Kiểu chiết

Không gian mẫu

(chất ở dạng lỏng)

Không gian hơi

(chất dễ hóa hơi)

Cơ chế chiết

Hấp phụ pha thường

(chất chiết pha thường)

Hấp phụ pha ngược

(chất chiết pha ngược)

Các bước

THANKS!

TAX Column % Recovery of Pb

at Various Concentrations

120

100

80

60

40

20

0

0.250 ppm 0.050 ppm 1.00 ppm 2.00 ppm

Metal Recoveries on Various Phases

Cu (ll)

Zn (ll)

As (V)

Sn (Vl)

Se (lV)

Hg (ll)

Cr (lll)

PSA 5.50 4.47 0.00 9.11 23.82 57.07 3.39

BCX-HL

18.01 19.21 0.00 29.43 0.62 58.97 9.81

CCX 0.67 0.03 0.00 16.99 0.00 10.66 0.55

TAX 3.73 3.58 0.00 33.69 0.00 23.97 0.55

THX 10.02 0.78 0.67 29.10 11.42 58.97 0.46

NAX 5.92 2.61 0.00 2.20 21.03 46.80 0.85

Solubility

Best wash solvents are those in which

the compound of interest is insoluble.

Example:Vancomycin

Insoluble in Methanol

Wash: 100% methanol

Soluble in H 2 O

Elution: 80:20 methanol/H 2 O

Technical Document P-105

Purification of Small Molecule Libraries

Desalting Samples Using Pharmasil Reverse Phase SPE

Principle: The generation of small molecule libraries for screening against

biological targets has emerged as an area of intense interest in the

pharmaceutical industry. SPE has been demonstrated to expedite work up and

purification of organic molecules synthesized in solution, and in the

automated construction of small molecule libraries. Samples that have been

synthesized in aqueous salt, buffer solutions, or low polarity organic solvents

containing salts may require the removal of those salts prior to analysis.

Pharmasil TM Reverse Phase SPE can be used to desalt these libraries.

Application: This application details the use of Pharmasil CEC18, a

highly loaded reverse phase sorbent, for desalting synthetic mixtures. In

combinatorial chemistry and organic synthesis salts are sometimes present in

the reaction mixtures. Once the reaction is complete, it is usually necessary to

separate the products of the reaction from the salts. If the salt is not removed

it can interfere with further testing as well as ruin expensive analytical

equipment. This can be done using a highly loaded reverse phase SPE

column to selectively remove the salt from the reaction mixture.

Chemistry of Pharmasil CEC18 Sorbent

Advantages of Pharmasil

Based Sorbents

H 3 C

O

H 3 C

CH 3

Si CH 3

O

Si (CH2) 17

O

Si CH 3

CH 3

CH3

• Complete removal of salts

• Clean background

• High recoveries

• High levels of purification of anaytes

• Applicable to a broad range of

compounds

• Simple easy to develop methods

Purification Profile

This profile is based on the use of a Pharmasil CEC18 500 mg column (columns are available with varying

volumes). This column is capable of removal of salts. The method can be scaled up as necessary by using columns

of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately

The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own

specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in

methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.

Sample Pre-treatment

Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using desalting columns is to

adjust the pH of the compound of interest so that it is totally molecular. This may require the addition of an acid or

base. Desalting can be done out of low polarity organic solvents such as hexane or methylene chloride as long as the

compound of interest is protonated.

Column Conditioning

Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.

Column Equilibration

Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH to be >9

If sample is an acid, you want the pH to be

Technical Document P-102

Purification of Small Molecule Libraries

TIN (Sn) Removal by Pharmasil Ion Exchange SPE

Principle: The generation of small molecule libraries for screening against biological

targets has emerged as an area of intense interest in the pharmaceutical industry. Ion

exchange chromatography has been demonstrated to expedite work up and purification

of organic molecules synthesized in solution, and in the automated construction of

small molecule libraries. The advantage of ion exchange chromatography over more

traditional small molecule purification modes such as flash chromatography or HPLC

is that one can reliably predict the elution characteristics of a broad range of molecules

solely by the presence or absence of an ionizable site on the molecule.

Application: This application details the use of Pharmasil TAX, a highly loaded

weak cation exchange sorbent, for the removal of tin catalysts from organic synthesis

mixtures. In combinatorial chemistry and organic synthesis tin compounds are

common catalysts. Once the reaction is complete, it is usually necessary to separate the

products of the reaction from the catalysts. If the catalyst is not removed it can

interfere with further testing as well as ruin expensive analytical equipment. This can

be done using a highly loaded weak cation exchanger to selectively remove the tin

catalyst from the reaction mixture.

Chemistry of Pharmasil TAX Sorbent

COOH

CH 2

Si

H 2

C

H 2

C

H 2

C

N

CH 2 CH 2 N(CH 2 COOH) 2

80

Advantages of Pharmasil Based Sorbents

• Complete removal of tin catalyst

• Clean background

• High recoveries

• High levels of purification of anaytes

• Applicable to a broad range of compounds

• Simple easy to develop methods

Purification Profile

This profile is based on the use of a Pharmasil TAX 500 mg column (columns are available with varying

volumes). This column is capable of removal of up to50mg of tin. The method can be scaled up as necessary by

using columns of higher bed mass of sorbent and increasing the solvent volumes proportionately

The following profile is meant to be a guideline for these types of purifications. Each drug class has its own

specific requirements based on solubility, stability, and pKa and may require slight adjustments in

methodology. Therefore think of the following profile as a beginning rather than a final method.

Sample Pre-treatment

Samples may or may not require pretreatment before addition. The primary concern using ion exchangers is to

adjust the pH of the compound of interest so that it is totally ionized. This may require the addition of an acid or

buffer. Ion exchange can be done out of organic solvents such as methanol or ethyl acetate as long as the compound

of interest is ionized... Tin catalysts are strong cations and are charged across the complete pH range.

Column Conditioning

Condition the column 1 ml of Methanol followed by 1 ml of water.

Column Equilibration

Condition the column with buffer: If sample is a base, you want the pH at 7-8.

If sample is an acid, you want the pH at 3-4.

Sample Application

Apply the sample to the column under gravity. The tin will stick to the column. The volume of the sample is not

important and will probably be dictated by the equipment you use. The critical factor is concentration and capacity

of the sorbent. If the concentration of the tin of exceeds the capacity of the sorbent you will not get the highest

removal of tin. If you think this is a problem use a larger bed mass.

Product Purification

Wash the column with 1ml of buffer used in column equilibration.

Product Elution

Elute compound of interest with 1ml of methanol.

Technical Document P-103

Purification of Small Molecule Libraries

Palladium (Pd) Removal by Pharmasil Ion Exchange SPE