Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

BỘ Y TẾ 

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI 

PHÍ THỊ BẢO THOA 

Mã sinh viên : 1201576 

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH 

LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG 

CAO ACTISO BẰNG PHƢƠNG PHÁP 

SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ 

HÀ NỘI – 2017

BỘ Y TẾ 

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI 

PHÍ THỊ BẢO THOA 

Mã sinh viên : 1201576 

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH 

LƢỢNG ACID CHLOROGENIC TRONG 

CAO ACTISO BẰNG PHƢƠNG PHÁP 

SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ 

Người hướng dẫn : 

PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh 

Nơi thực hiện: 

Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất 

HÀ NỘI 2017

LỜI CẢM ƠN 

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. 

Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho 

tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. 

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths. Ngô Minh Thúy, giảng viên bộ 

môn Hóa Phân tích – Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã 

giúp đỡ tôi giải đáp những thắc mắc trong quá trình thực hiện luận văn. 

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo, các anh 

chị kỹ thuật viên bộ môn Hoá phân tích - Độc chất - Trường Đại học 

Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập 

và nghiên cứu. 

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn 

bên cạnh ủng hộ, khích lệ tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và 

nghiên cứu. 

Hà Nôi, ngày 10 tháng 5 năm 2017 

Sinh viên 

Phí Thị Bảo Thoa

MỤC LỤC 

Table of Contents 

MỤC LỤC 

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 

DANH MỤC CÁC BẢNG 

DANH MỤC CÁC HÌNH 

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1 

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 3 

1.1 Tổng quan về actiso ............................................................................ 3 

1.1.1 Đặc điểm của actiso ..................................................................... 3 

1.1.2 Phân bố ........................................................................................ 3 

1.1.3 Bộ phận dùng ............................................................................... 4 

1.1.4 Thành phần hóa học ..................................................................... 4 

1.1.5 Công dụng và dạng dùng ............................................................. 5 

1.2 Tổng quan về <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> ........................................................... 7 

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học ................................ 7 

1.2.2 Tác dụng ...................................................................................... 8 

1.2.3 Phương <strong>pháp</strong> xác <strong>định</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> ...................................... 8 

1.3 Tổng quan về cao thuốc .................................................................... 10 

1.3.1 Định nghĩa .................................................................................. 10 

1.3.2 Phương <strong>pháp</strong> điều chế ................................................................ 11 

1.3.3 Yêu cầu chất <strong>lượng</strong> .................................................................... 12 

1.4 Tổng quan về <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> nghiên cứu sắc ký lớp mỏng ................ 13 

1.4.1 Nguyên tắc ................................................................................. 13 

1.4.2 Đại <strong>lượng</strong> đặc trưng ................................................................... 14 

1.4.3 Pha tĩnh ...................................................................................... 14 

1.4.4 Pha động .................................................................................... 15

1.4.5 Khai triển sắc ký ........................................................................ 15 

1.4.6 Phát hiện vết trên sắc ký đồ ....................................................... 16 

1.4.7 Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng ................................................. 16 

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........ 19 

2.1. Đối tượng, nguyên vật liệu, thiết bị và nghiên cứu ............................. 19 

2.1.1. Đối tượng ....................................................................................... 19 

2.1.2. Hóa chất ......................................................................................... 19 

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu: ........................................................ 20 

2.2. Phương <strong>pháp</strong> nghiên cứu ..................................................................... 20 

2.2.1. Nghiên cứu khảo sát chọn điều kiện sắc ký .................................. 20 

2.2.2. Nghiên cứu <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chiết <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong actiso ...... 21 

2.2.3. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích ................................................ 21 

2.2.4. Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xây <strong>dựng</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong 

một số mẫu thực ...................................................................................... 23 

2.2.5. Phương <strong>pháp</strong> xử lý số liệu ............................................................. 24 

CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ........................................ 25 

3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký ................................................. 25 

3.1.1. Chuẩn bị dung dịch ........................................................................ 25 

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC ........................................ 25 

3.2. Khảo sát và lựa chọn <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xử lý mẫu .................................... 28 

3.2.1. Khảo sát dung môi chiết ................................................................ 28 

3.2.2. Khảo sát thời gian chiết ................................................................. 29 

3.3. Quy trình phân tích .............................................................................. 30 

3.3.1. Xử lý mẫu ...................................................................................... 30 

3.3.2. Điều kiện sắc ký ............................................................................ 30 

3.4. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> ...................................................................... 31 

3.4.1. Độ thích hợp của hệ thống............................................................. 31 

3.4.2. Độ chọn lọc ................................................................................... 32 

3.4.3. Khoảng tuyến tính ......................................................................... 33 

3.4.4. LOD - LOQ ................................................................................... 35

3.4.5. Độ lặp lại ....................................................................................... 36 

3.4.6. Độ đúng ......................................................................................... 37 

3.5. Áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong một số mẫu 

cao actiso lưu hành trên thị trường. ............................................................ 38 

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................ 41 

4.1. Về lựa chọn <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích .................................................... 41 

4.2. Về xây <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích ................................................... 42 

4.3. Về việc thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích .......................................... 43 

4.4. Về kết quả nghiên cứu trên mẫu thực .................................................. 44 

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 45 

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 1 

PHỤ LỤC ........................................................................................................ 5 

Phụ lục 1: Sắc ký đồ analog đường chuẩn. ................................................... 5 

Phụ lục 2: Sắc ký đồ analog mẫu thực. ......................................................... 7 

Phụ lục 3: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện phân tích .............................. 10 

Chuẩn bị mẫu .................................................................................... 10 

Điều kiện sắc ký ............................................................................... 10 

Phụ lục 4: Số liệu khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết ............................. 11

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 

HPLC 

CGA 

HPTLC 

TLC 

UV 

SKLM 

UPLC 

: High-performance liquid chromatography 

: Acid <strong>chlorogenic</strong> 

:High-performance thin layer chromatography 

: Thin layer chromatography 

: Ultra violet 

: Sắc ký lớp mỏng 

: Ultra performance liquid chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG 

Bảng 2.1. Các mẫu cao actiso đang lưu hành trên thị trường ................ 19 

Bảng 2.2. Tên và nguồn gốc hóa chất sử dụng trong nghiên cứu .......... 19 

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết ........................................... 28 

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết ............................................ 30 

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống ......................... 31 

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> ............ 33 

Bảng 3.5 . Kết quả xác <strong>định</strong> LOD, LOQ của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>: ............ 35 

Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> (Mẫu CA1) .... 36 

Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> ......................... 37 

Bảng 3.8. Kết quả hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong các mẫu thử ....... 40

DANH MỤC CÁC HÌNH 

Hình 1.1. Cây actiso ................................................................................. 3 

Hình 1.2. Công thức cấu tạo <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> ......................................... 7 

Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động ............................. 27 

Hình 3.2. Phổ hấp thụ của vết ứng với <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> chuẩn ............ 27 

Hình 3.3. Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> trong cao actiso (n = 2) ....................................................... 29 

Hình 3.4. Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống ............................................ 31 

Hình 3.5. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> ................. 32 

Hình 3.6. Sắc ký đồ analog xác <strong>định</strong> tính chọn lọc của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

(Mẫu CA1) ............................................................................................. 33 

Hình 3.7. Sắc ký đồ xác <strong>định</strong> khoảng tuyến tính của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> . 34 

Hình 3.8. Đường biểu diễn mối tương quan giữa <strong>lượng</strong> chuẩn trên vết và 

diện tích pic của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> .......................................................... 34 

Hình 3.9: Sắc ký đồ analog của mẫu chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong xác 

<strong>định</strong> LOD - LOQ .................................................................................... 35 

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu thực .............................................................. 39

ĐẶT VẤN ĐỀ 

Chăm sóc sức khỏe ban đầu và bảo vệ sức khỏe cộng đồng là công việc 

cấp bách và cần thiết. Công nghiệp hóa càng phát triển nhanh thì môi trường 

sống càng có nguy cơ bị suy thoái, vì thế việc phòng và chữa bệnh càng trở lên 

cấp bách. 

Chữa bệnh bằng thuốc y học cổ truyền là một <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> có từ lâu 

đời ở nước ta và cho đến nay nó vẫn giữ một vai trò quan trọng trong nền y 

học nước nhà. Những năm gần đây, các nước trên thế giới có khuynh hướng 

đẩy mạnh việc sử dụng thuốc đông y kết hợp với thuốc tây y trong điều trị một 

số bệnh mãn tính. Ở Việt Nam, thị trường thuốc đông dược và dược liệu làm 

thuốc trở nên rất đa dạng về chủng loại và phong phú về nguồn gốc. Công tác 

kiểm tra chất <strong>lượng</strong> thuốc đặc biệt là thuốc đông dược và dược liệu làm thuốc 

là một nhiệm vụ cấp thiết và quan trọng góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng. 

Actiso có tên khoa học là Cynara scolymus L, thuộc họ cúc 

(Asteraceae), tên gọi khác là artichoke, globe artichoke (Anh); artichaut 

(Pháp). Actiso có rất nhiều tác dụng, một trong các tác dụng quan trọng đó là 

làm tăng <strong>lượng</strong> nước tiểu và <strong>lượng</strong> urê trong nước tiểu, làm giảm hằng số 

Ambard, giảm nồng độ cholesterol máu và urê máu. Thành phần có tác dụng 

giảm béo phì, hạ huyết áp, kháng virus, chống ung thư đại tràng nhờ khả năng 

sửa chữa các tổn thương ADN trên mô hình chuột thực nghiệm là <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> [6]. 

Hoạt chất <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong actiso được biết đến như là một chất 

có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự phát triển của khối u; 

chống sự đột biến gen của tế bào; tiêu diệt chất gây ung thư, làm chậm quá 

trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác dụng chống virus, 

kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp. Đã có một số 

nghiên cứu <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong dược liệu bằng HPLC như 

Dược điển Mỹ [29], Dược điển châu Âu [17], sắc ký lớp mỏng [19], [22], [24] 

1

được công bố. Dược điển Việt Nam 4 chưa có bất kỳ một chuyên luận nào đề 

cập tới <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong dược liệu. Ở Việt Nam mới có công 

bố <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong dược liệu bằng HPLC [5]. 

Sắc ký lớp mỏng được sử dụng nhiều trong <strong>định</strong> tính dược liệu và đã 

trở thành một trong các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> quan trọng được sử dụng trong hầu hết 

các chuyên luận dược liệu (Dược điển Việt Nam IV). Sắc ký lớp mỏng hiệu 

năng cao với hệ thống thiết bị đồng bộ, hiện đại có khả năng tách tốt, độ nhạy 

được cải thiện và đặc biệt là hệ thống phần mềm cho phép phát hiện và <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> các chất đã dần được đưa vào thực tế. Để cung cấp một <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

kiểm nghiệm dược liệu nhanh, đơn giản, có độ đúng, độ chính xác đảm bảo, 

có khả năng ứng dụng rộng rãi. Chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “<strong>Xây</strong> 

<strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong cao actiso bằng 

<strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao”, với các mục tiêu sau: 

- <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> và thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

trong cao actiso bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao. 

- Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPTLC để <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong 

một số mẫu cao actiso lưu hành trên thị trường. 

2

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 

1.1 Tổng quan về actiso 

1.1.1 Đặc điểm của actiso 

Actiso có tên khoa học là Cynara scolymus L., thuộc họ Cúc 

(Asteraceae). Cây thảo lớn, sống hai năm hoặc lâu năm, cao 1 – 1,2 m, có thể 

đến 2 m. Thân ngắn, thẳng và cứng, có khía dọc, phủ lông trắng như bông. Lá 

to, dài, mọc so le, phiến lá xẻ thùy sâu và có răng không đều, mặt trên xanh 

lục, mặt dưới có lông trắng; cuống lá to và ngắn. 

Cụm hoa to mọc ở ngọn thân thành đầu màu đỏ tím hoặc tím lơ nhạt; lá 

bắc ngoài của cụm hoa rộng, dày và nhọn, đế cụm hoa nạc, phủ đầy lông tơ, 

mang toàn hình ống. 

Quả nhẵn bóng, màu nâu sẫm, có mào lông trắng [3], [4], [11]. 

Hình 1.1. Cây actiso 

1.1.2 Phân bố 

Trên thế giới actiso được trồng tập trung ở các nước có biên giới với lưu 

vực Địa Trung Hải. Ở châu Âu, actiso được trồng chủ yếu ở Ý, Tây Ban Nha 

và Pháp. 

3

Actiso là loại cây thảo sống nhiều năm. Cây ưa sáng và ưa ẩm. Qua 

thực tế nhiều năm trồng ở Việt Nam cho thấy actiso sinh trưởng phát triển tốt 

nhất ở một số vùng núi cao như Sa Pa, Đà Lạt nơi có khí hậu ẩm mát. Cây 

trồng ở đây có thể cao tới hơn 1,5 m, ra hoa và kết hạt tốt. Trong khi đó, cây 

trồng ở vùng ngoại thành Hà Nội và một vài nơi khác sinh trưởng kém hơn 

[4], [11]. 

1.1.3 Bộ phận dùng 

Lá actiso thu hái vào năm thứ nhất của thời kỳ sinh trưởng. Có tài liệu 

cho biết là nên thu hái lá còn non vào lúc cây chưa ra hoa. 

Ở Đà Lạt, nhân dân thu hái lá vào thời kỳ trước tết âm lịch một tháng. 

Dược điển Việt Nam IV, quy <strong>định</strong> dùng lá đã phơi hoặc sấy khô. 

Rễ và thân cũng được dùng làm thuốc [3]. 

1.1.4 Thành phần hóa học 

Lá actiso chứa: 

Acid hữu cơ bao gồm: 

- Acid phenol: Cynarin (<strong>acid</strong> 1-3 dicafeyl quinic) và các sản phẩm thủy 

phân (<strong>acid</strong> cafeic, <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>, <strong>acid</strong> neo <strong>chlorogenic</strong>). 

- Acid alcol: <strong>acid</strong> hydroxymethylacrilic, <strong>acid</strong> malic, <strong>acid</strong> lactic, <strong>acid</strong> 

fumaric,… 

- Acid khác: <strong>acid</strong> succinic. 

Hợp chất flavonoid (dẫn chất của luteolin) bao gồm cynarosid (luteolin - 7 

- D - glucopyrano - sid), scolymosid (luteolin - 7 - rutinosid) và cynarotriosid 

(luteolin - 7 – rutinosid - 3’ - glucosid). 

Thành phần khác: 

- Cynaropicrin là chất có vị đắng thuộc nhóm guaianolid. 

- Enzym: oxidase, peroxidase, oxigenase, catalase. Các enzym hoạt động 

mạnh ở pH 4-7,6 và dễ phá hủy hoạt chất trong quá trình phơi, sấy, chế biến. 

- Nhiều chất vô cơ. 

4

Hoạt chất là cynarin, các flavonoid, các <strong>acid</strong> cafeic và <strong>chlorogenic</strong> có 

tác dụng hiệp đồng với cynarin. 

Gân lá chứa ít hoạt chất, đồng thời lại chiếm khối <strong>lượng</strong> lớn của lá, nền 

cần được loại bỏ trước khi chế biến. 

Trong khi chế biên, nếu phơi sấy ở 20-25 o C, thời gian làm khô kéo dài, 

các dẫn xuất polyphenol giảm mất 40%. 

Nếu sấy ở 60 o C, các dẫn xuất polyphenol giảm mất 80%. 

Nếu sấy ở 80 o C hoặc 120 o C, lá chỉ còn vết cynarin. 

Hoa chứa taraxasterol và faradiol. Hai chất này thí nghiệm trên chuột 

nhắt có tác dụng ức chế viêm mạnh do chất 12 - O - tetradecanoyl phorbol - 13 

acetat gây ra [3], [11]. 

T. V. Orlovskaya [28] đã tìm thấy 15 <strong>acid</strong> amin trong lá actiso, 9 trong số đó 

là các <strong>acid</strong> amin thiết yếu: valin, threonin, methionin, isoleucin, leucin, lysin, 

phenylalanin, histidin, và arginin. Tổng hàm <strong>lượng</strong> các <strong>acid</strong> amin thiết yếu là 

4,71% (hoặc 58,29% <strong>acid</strong> amin toàn phần). 

Nassar MI [23] đã xác <strong>định</strong> được 6 flavonoid và một <strong>acid</strong> phenolic từ 

dịch chiết methanol của búp actiso. Ngoài ra, còn có 37 hợp chất khác được 

xác <strong>định</strong> trong dịch chiết dầu dễ bay hơi của búp actiso, phần lớn gồm monovà 

sesquiterpen. 

Dược điển châu Âu (EP) 8.0 qui <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong 

lá actiso khô phải không dưới 0,8% [17]. 

Nguyễn Thị Ánh Nguyệt và cộng sự đã <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> cynarosid và 

scolymosid trong lá actiso Đà Lạt cho thấy hàm <strong>lượng</strong> hai hoạt chất này lần 

lượt nằm trong khoảng 0,34 – 0,61% và 0,17 – 0,21% [10]. 

1.1.5 Công dụng và dạng dùng 

‣ Công dụng: 

- Lá actiso vị đắng, có tác dụng lợi tiểu và được dùng trong điều trị bệnh 

phù và thấp khớp. 

5

- Cụm hoa được dùng trong chế độ ăn kiêng của bệnh nhân đái tháo 

đường vì nó chỉ chứa <strong>lượng</strong> nhỏ tinh bột, phần carbon hydrat gồm phần lớn là 

inulin. 

- Ngoài việc dùng đế hoa và lá bắc để ăn, actiso được dùng làm thuốc 

thông tiểu tiện, thông mật chữa các bệnh suy gan, thận, viêm thận cấp và mạn, 

sưng khớp xương. Thuốc có tác dụng nhuận tràng và lọc máu nhẹ đối với trẻ 

em. Dạng dùng là lá tươi hoặc khô, đem sắc (5-10%), hoặc nấu cao lỏng, với 

liều 2-10g lá khô một ngày. Có khi chế thành cao mềm hay tĩnh mạch. Có thể 

chế thành dạng cao lỏng đặc biệt dùng dưới hình thức giọt. 

- Người ta còn dùng thân và rễ actiso thái mỏng, phơi khô, công dụng như 

lá. 

- Theo Ủy ban về thảo dược của cơ quan dược phẩm châu Âu [16], actiso 

và các chế phẩm từ được sử dụng cho các trường hợp suy thận, ung thư, giải 

độc, chứng khó tiêu, rối loạn túi mật, cholesterol cao, tăng đường huyết, vàng 

da, rối loạn chức năng gan, buồn nôn (châu Âu); trị mụn trứng cá, thiếu máu, 

viêm khớp, xơ vữa động mạch, hen, suy giảm bài tiết mật, viêm phế quản, tiểu 

đường, rối loạn tiêu hoá, sốt, đầy hơi, sỏi mật, gout, xuất huyết, trĩ, cholesterol 

cao, tăng huyết áp, tăng đường huyết, viêm, suy thận, rối loạn chức năng gan, 

béo phì, viêm tuyến tiền liệt, thấp khớp, ứ nước, loét, viêm niệu đạo (Brazil); 

dùng actiso cho các trường hợp phù, cao huyết áp, rối loạn chức năng thận, 

suy gan, thiểu niệu (Haiti); … 

‣ Dạng dùng: 

- Actiso có thể được sản xuất dưới dạng trà thảo dược. "Chè atisô" là một 

sản phẩm thương mại tại khu vực Đà Lạt của Việt Nam. 

- Ở các nước trên thế giới như Pháp, Đức, Hungary, Hà Lan…actiso được 

sử dụng ở cả dạng chế phẩm truyền thống (như bột lá khô, dịch chiết nước, 

dịch chiết ethanol, lá khô…) và các dạng bào chế hiện đại (như viên nang 

cứng, viên nén, dung dịch uống, trà thảo dược…) [16]. 

6

Xí nghiệp Liên hiệp Dược tỉnh Lâm Đồng đã bào chế viên bao 

Cynaraphytol. Mỗi viên chứa 0,2 g hoạt chất toàn phần lá tươi actiso tương 

đương với 20 mg cynarin. 

Xí nghiệp Dược phẩm trung ương 26 ở thành phố Hồ Chí Minh đã sản 

xuất trà actiso túi lọc từ thân, rễ và hoa của cây actiso. 

Ngoài ra, còn rất nhiều các chế phẩm bảo vệ sức khỏe chứa thành phần 

actiso trên thị trường Việt Nam. Dược liệu được bán ở dạng búp và lá. 

1.2 Tổng quan về <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

1.2.1 Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 

Hình 1.2. Công thức cấu tạo <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> [27] 

Công thức phân tử: C 16 H 18 O 9 

Trọng <strong>lượng</strong> phân tử: 354,31 

Tên khoa học theo hệ thống IUPAC: <strong>acid</strong> 3R-[[3-(3,4-dihydroxyphenyl)- 

1-oxo-2- propenyl[oxy]-1S,4R,5R-trihydroxy-cyclohexanecarboxylic. 

Tên khác: <strong>acid</strong> 3-0-Caffeoylquinic. 

Acid <strong>chlorogenic</strong> có dạng bột màu trắng hoặc hơi ngà vàng, tan được 

trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl 

sulfoxyd, dimethylformamid… 

Nhiệt độ nóng chảy: 210ºC [27]. 

Acid <strong>chlorogenic</strong> là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất 

là ở 4ºC. 

7

1.2.2 Tác dụng 

Acid <strong>chlorogenic</strong> có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, ức chế sự 

phát triển của khối u, chống sự đột biến gen của tế bào; tiêu diệt chất gây ung 

thư, làm chậm quá trình giải phóng glucose vào tuần hoàn sau bữa ăn; có tác 

dụng kháng virus, kháng khuẩn và chống nấm đi kèm độc tính ở mức độ thấp. 

Acid <strong>chlorogenic</strong> được ứng dụng trong dược phẩm (ngăn bệnh đái tháo 

đường typ 2, bệnh tim mạch…), được thương mại hóa dưới tên Sveltol (tại 

Anh và Na uy). Là một thành phần thêm vào thực phẩm để thúc đẩy quá trình 

giảm cân và dùng trong mỹ phẩm để làm đẹp [15], [19], [21]. 

Tất cả các nghiên cứu riêng lẻ các hợp chất trong actiso cho thấy <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong>, lutein, luteolin-7-O-glucoside có hiệu quả chống oxy hoá cao, 

trong đó <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> là hợp chất chống oxy hóa mạnh nhất. Hơn nữa, 

<strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> cho thấy hiệu quả ức chế HMG-CoA tuyến tụy mạnh, phụ 

thuộc liều <strong>lượng</strong> ở nồng độ từ 5 đến 50 mg/ml [20]. 

1.2.3 Phương <strong>pháp</strong> xác <strong>định</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

Schütz K đã phát triển <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> tính và <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> các hợp 

chất phenolic từ nước ép và bã của búp actiso bằng HPLC với detectơ mảng 

diod và khối phổ [25]. Trong số 22 hợp chất chính, có 11 <strong>acid</strong> caffeoylquinic 

và 8 flavonoid đã được phát hiện. Định <strong>lượng</strong> các hợp chất riêng lẻ được thực 

hiện bằng hiệu chuẩn bên ngoài. Apigenin 7-O-glucuronit được tìm thấy là 

flavonoid chính trong tất cả các mẫu được nghiên cứu. Acid 1,5-di-Ocaffeoylquinic 

là <strong>acid</strong> hydroxycinnamic chủ yếu, với 3890 mg/kg ở búp actiso 

và 3269 mg/kg trong bã dược liệu, trong khi ở nước ép <strong>acid</strong> 1,3-di-Ocaffeoylquinic 

(cynarin) lại chiếm ưu thế, do sự chuyển đồng phân trong quá 

trình chế biến. Hàm <strong>lượng</strong> phenolic toàn phần xấp xỉ 12 g/kg trên dược liệu 

khô cho thấy actiso là một nguồn các hợp chất phenolic triển vọng để sử dụng 

làm chất chống oxy hoá tự nhiên hoặc là thành phần thực phẩm chức năng. 

8

Fritsche đã sử dụng các kỹ thuật sắc ký cột (Sephadex LH-20) kết hợp 

với các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích (HPLC-DAD-MS và HPLC-DAD) để phân 

tách, <strong>định</strong> tính và <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> các hợp chất trong actiso [20]. Trong dịch chiết 

lá actiso có các hợp chất sau: 8-deoxy-11-hydroxy-13-chlorogrosheimin, <strong>acid</strong> 

crypto<strong>chlorogenic</strong>, <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>, <strong>acid</strong> neo<strong>chlorogenic</strong>, cynarin, cynaratriol 

(dự kiến), grosheimin, 8-deoxy-11,13-dihydroxygrosheimin, luteolin-7-Orutinoside, 

luteolin-7-O-glucoside và cynaropicrin. Nồng độ <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

trong khoảng 0,35-18,34 mg/g dịch chiết nước. 

Phương <strong>pháp</strong> LC-ESI-MS/MS đã được phát triển để phân tích và <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> các dẫn xuất <strong>acid</strong> caffeoylquinic, bao gồm <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>, <strong>acid</strong> 1,3-di- 

O-caffeoylquinic (cynarin) và <strong>acid</strong> 1,5-di-O-caffeoylquinic trong búp và lá 

actiso [14]. Việc tách nhanh chóng (ít hơn 4 phút) đạt được dựa trên cột silica 

C18 (50 mm x 2,1 mm; 2,7 μm). Các hợp chất mục tiêu đã được phát hiện và 

<strong>định</strong> <strong>lượng</strong> bằng khối phổ hai lần trong chế độ giám sát đa phản ứng. Khoảng 

tuyến tính từ 0,06 đến 2800 ng/mL đối với <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>, 0,3-3000 ng/mL 

đối với cynarin và 0,24-4800 ng/mL đối với <strong>acid</strong> 1,5-di-O-caffeoylquinic. Độ 

thu hồi trung bình dao động từ 92,1 đến 113,2% với RSD ≤6,5%. 

Theo Dược điển châu Âu EP 8.0 [17], <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong lá và cao 

actiso được <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> bằng HPLC với cột tách C18 (250 × 4,6 mm; 5 µm) 

duy trì ở 40 o C; hệ pha động là gồm A: <strong>acid</strong> phosphoric – nước (0,5:99,5), B: 

<strong>acid</strong> phosphoric – acetonitril (0,5:99,5) chạy theo chế độ gradient thành phần 

pha động, phát hiện bằng detectơ UV ở 330 nm, thời gian phân tích khoảng 40 

phút. Pic của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> được tách ra và có thời gian lưu khoảng 9,1 

phút. Hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> yêu cầu không nhỏ hơn 0,8% tính theo 

dược liệu khô. Cũng trong tài liệu này, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> sắc ký lớp mỏng được sử 

dụng để <strong>định</strong> tính với bản mỏng silica gel thường (hạt 5 – 40 µm) hoặc hạt nhỏ 

2-10 µm, hệ dung môi pha động gồm <strong>acid</strong> formic khan – <strong>acid</strong> acetic – nước – 

ethyl acetat (11:11:27:100), mẫu thử lá actiso được chiết với ethanol 60% 

bằng cách khuấy trong 2 giờ, chất chỉ điểm được sử dụng để pha dung dịch 

9

chuẩn gồm <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> và luteolin – 7 – glucosid. Sau khi triển khai sắc 

ký, bản mỏng được sấy ở 100 o C, phun thuốc thử diphenylboric <strong>acid</strong> 

aminoethyl ester 10 g/l trong methanol, sau đó là dung dịch macrogol 400 50 

g/l trong methanol, phát hiện ở 365 nm. Vết <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> sẽ cho huỳnh 

quang màu xanh nhạt. 

Nhóm các nhà khoa học tại khoa Dược, trường đại học Y Dược thành 

phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu thiết lập chất chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> từ actiso 

đạt độ tinh khiết 92,39% [8] và cynarin đạt hàm <strong>lượng</strong> 94,26% [9]. Nhóm các 

nhà khoa học tại Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương thiết lập chất chuẩn <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> từ Kim ngân hoa đạt độ tinh khiết 98,34 ± 0,66 (%) và đã đưa vào 

thương mại hóa phục vụ công tác kiểm nghiệm thuốc [5]. 

1.3 Tổng quan về cao thuốc 

1.3.1 Định nghĩa 

Cao thuốc là chế phẩm được chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất 

quy <strong>định</strong> các dịch chiết thu được từ dược liệu thực vật hay động vật với các 

dung môi thích hợp. 

Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (sấy khô và chia 

nhỏ đến kích thước thích hợp). Đối với một số dược liệu đặc biệt có chứa men 

làm phân hủy hoạt chất cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng 

cách dùng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> thích hợp khác. 

Cao thuốc được chia làm 3 loại: 

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử 

dụng trong đó cồn và nước đóng vai trò dung môi chính (hay chất bảo 

quản hay cả hai). Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1 ml cao lỏng 

tương ứng với 1 g dược liệu dùng để điều chế cao thuốc. 

Cao đặc: Là khối đặc quánh. Hàm <strong>lượng</strong> dung môi sử dụng còn lại 

trong cao không quá 20%. 

10

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm. Cao 

khô không được có độ ẩm lớn hơn 5%. 

1.3.2 Phương <strong>pháp</strong> điều chế 

Quá trình điều chế cao thường có 2 giai đoạn: 

Giai đoạn I: 

Chiết xuất dược liệu bằng các dung môi thích hợp. Tùy theo bản chất 

của dược liệu, dung môi, tiêu chuẩn chất <strong>lượng</strong> của thành phẩm cũng như điều 

kiện, quy mô sản xuất và trang thiết bị, có thể sử dụng các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chiết 

xuất: ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm kiệt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng 

thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> sử dụng điện trường và các 

<strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> khác. Phương <strong>pháp</strong> ngâm nhỏ giọt thường được sử dụng. Khi đó, 

dược liệu thô đã được chia nhỏ đến kích thước phù hợp, được làm ẩm với một 

<strong>lượng</strong> dung môi vừa đủ rồi đậy kín để yên trong khoảng 2 - 4 giờ. Sau đó, 

chuyển khối dược liệu vào bình ngấm kiệt, thêm <strong>lượng</strong> dung môi vừa đủ đến 

khi ngập hoàn toàn khối dược liệu. Thời gian ngâm lạnh và tốc độ chảy trong 

quá trình chiết có thể thay đổi theo khối <strong>lượng</strong> và bản chất của dược liệu thô 

đem chiết. 

Giai đoạn II: 

Cao lỏng: Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô dịch chiết bằng 

các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> khác nhau để thu được cao lỏng có tỷ lệ theo như quy ước (1 

ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu). Trong trường hợp điều chế cao lỏng 

bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> ngâm nhỏ giọt, tốc độ chảy cuả dịch chiết có thể chậm, vừa 

hay nhanh. Nếu chiết xuất 1000 g dược liệu thì: 

Ở tốc độ chậm: Không quá 1 ml dịch chiết/ phút, 

Ở tốc độ vừa: 1 - 3 ml dịch chiết/ phút 

Ở tốc độ nhanh: 3 - 5ml dịch chiết/ phút. 

11

Để riêng phần dịch chiết đầu đậm đặc bằng 4/5 <strong>lượng</strong> dược liệu đem chiết. 

Sau đó cô các phần dịch chiết tiếp theo trên bếp cách thuỷ hoặc cô dưới áp 

suất giảm ở nhiệt độ không quá 60 ºC cho đến khi loại hết dung môi. Hoà tan 

cắn thu được vào trong dịch chiết đầu đậm đặc và nếu cần, thêm dung môi vào 

để thu được cao lỏng đạt tỷ lệ quy <strong>định</strong>. Cao lỏng có khuynh hướng bị lắng 

cặn vì vậy để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày, rồi lọc. 

Cao đặc và cao khô: Dịch chiết được cô đặc đến khi độ ẩm còn lại 

không quá 20%. Trong trường hợp điều chế cao khô, tiếp tục sấy khô để độ 

ẩm còn lại không quá 5%. Để đạt đến thể chất quy <strong>định</strong>, quá trình cô đặc và 

sấy khô dịch chiết thường được tiến hành trong các thiết bị cô dưới áp suất 

giảm ở nhiệt độ không quá 60 o C. Nếu không có các thiết bị cô đặc và sấy dưới 

áp suất giảm thì được phép cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và 

sấy ở nhiệt độ không quá 80 o C. 

Trường hợp muốn thu cao thuốc có tỷ lệ tạp chất thấp, phải tiến hành 

loại tạp chất bằng các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> thích hợp tuỳ thuộc vào bản chất cuả dược 

liệu, dung môi và <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chiết xuất. 

Có thể cho thêm chất bảo quản hoặc các chất trơ để làm chất mang hay 

để cải thiện các tính chất vật lý. Đối với cao khô có thể sử dụng các bột trơ 

thích hợp hay cao khô của dược liệu sử dụng để điều chỉnh nồng độ hoạt chất 

đến tỷ lệ quy <strong>định</strong>. 

1.3.3 Yêu cầu chất <strong>lượng</strong> 

Đạt các yêu cầu theo quy <strong>định</strong> trong chuyên luận riêng và đạt các yêu 

cầu chung sau đây: 

Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều 

chế cao. 

Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu 

sắc đã mô tả trong chuyên luân riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử 

12

dụng. Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng thuốc, không có 

cặn bã dược liệu và vật lạ. 

Cách tiến hành: Lấy riêng phần phía trên của chai thuốc chỉ để lại khoảng 10 - 

15 ml. Chuyển phần còn lại trong chai vào một bát sứ men trắng, nghiêng bát 

cho chúng chảy trên thành bát tạo thành một lớp dễ quan sát. Quan sát dưới 

ánh sáng tự nhiên, thuốc phải đạt các yêu cầu quy <strong>định</strong>. Nếu không đạt phải 

thử lại lần hai với chai khác, nếu không đạt coi như lô thuốc không đạt chỉ tiêu 

này. 

Mất khối <strong>lượng</strong> do làm khô (nếu không có chỉ dẫn khác): Cao đặc 

không quá 20% và cao khô không quá 5%. 

Hàm <strong>lượng</strong> cồn: Đạt 90 - 110% <strong>lượng</strong> ethanol ghi trên nhãn (áp dụng 

cho cao lỏng và cao đặc). 

Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui <strong>định</strong> trong chuyên luận riêng. 

Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nuớc 

hay hỗn hợp cồn - nước, dư <strong>lượng</strong> dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu 

quy <strong>định</strong> trong Dược điển. 

Dư <strong>lượng</strong> hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu trong Dược điển. 

Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu quy <strong>định</strong> về số <strong>lượng</strong> vi khuẩn 

hiếu khi, vi khuẩn gây bệnh, nấm men, nấm mốc. [1] 

1.4 Tổng quan về phƣơng <strong>pháp</strong> nghiên cứu sắc ký lớp mỏng 

1.4.1 Nguyên tắc 

Sắc ký lớp mỏng (TLC) đã được phát triển từ lâu. Quá trình tách 

bằng TLC được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt kích thước đồng 

nhất được kết dích trên một giá đỡ bằng thủy tinh, nhôm hoặc chất dẻo. 

Lớp mỏng kết dính là pha tĩnh. Các hạt trong pha tĩnh làm nhiệm vụ tách 

13

có thể theo cơ chế: phân bố, hấp phụ, trao đổi ion… Pha động là dung môi 

đơn hoặc đa thành phần [2]. 

1.4.2 Đại <strong>lượng</strong> đặc trưng 

Đại <strong>lượng</strong> đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là 

hệ số lưu giữ R f . Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di 

chuyển của chất phân tích và quãng đường dịch chuyển của pha động. 

R f = d R /d M 

d R : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm). 

d M : Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo 

trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm). 

R f : có giá trị dao động giữa 0 và 1. 

TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu 

điểm như: thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được 

tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm 

xuất phát); thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần – có thể 

thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu trong cùng một bản mỏng cùng một 

lần phân tích, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn; <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này 

cho phép bán <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng 

để đánh giá nhanh chất <strong>lượng</strong> của thuốc; ngoài ra <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> cho phép 

cung cấp hình ảnh sắc ký đồ làm dấu vân tay cho mỗi dược liệu, do đó 

thích hợp cho việc xác <strong>định</strong> nhanh dược liệu [2]. 

1.4.3 Pha tĩnh 

Pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng là các hạt có kích thước 10-30 µm 

được trải đều và kết dính thành lớp mỏng đồng nhất dày khoảng 250 µm 

trên giá đỡ hình vuông. Bản mỏng có sẵn trên thị trường có kích thước 

khác nhau thường 5-20 cm, nhiều khi có đưa thêm các chất phát huỳnh 

quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích [2]. 

14

Trong đó silicagel thường dùng nhất theo cơ chế sắc ký hấp phụ. 

Các loại bản mỏng silicagel: Silicagel G : có trộn thạch cao 5%; Silicagel 

H : không trộn thạch cao; Silicagel GF 254 : có trộn thạch cao và chất huỳnh 

quang (fluorescent) [26] 

1.4.4 Pha động 

Pha động cho TLC thay đổi tùy thuộc vào cơ chế sắc ký. Để tăng 

cường sắc rửa giải, thường kết hợp ít nhất 2 dung môi. Nguyên lý chia 

tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha. Tuy nhiên lựa chọn tối ưu hóa 

sắc ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm. Sau đây là một số gợi ý 

chung nhất cho pha động TLC : 

- Dung môi cần có độ tinh khiết cao. 

- Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số R f nằm trong 

khoảng 0,2÷0,8 đạt độ phân giải cực trị. 

- Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung 

môi phân cực như hỗn hợp n-butanol-nước. Thêm một ít <strong>acid</strong> acetic hoặc 

amoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc <strong>acid</strong> tương ứng. 

- Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân 

cực của pha động sẽ quyết <strong>định</strong> tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị 

số R f của chúng. Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic 

vào dung môi không phân cực như methylbenzen sẽ làm tăng đáng kể trị 

số R f . 

- Sức rửa giải của dung môi trong sắc ký lỏng hấp phụ hoàn toàn có 

thể sử dụng cho TLC với pha tĩnh là slica hoặc alumina [2]. 

1.4.5 Khai triển sắc ký 

Thiết bị khai triển sắc ký thường là bình thủy tinh có nắp đậy kín, 

kích thước phù hợp với bản mỏng (thường cao hơn bản mỏng 4-5 cm). Để 

tăng độ bão hòa dung môi pha động trong bình (nhất là đối với dung môi 

15

có độ nhớt cao, khó bay hơi) người ta đặt một tờ giấy lọc áp sát thành 

bình. 

Sau khi chấm mẫu sắc ký, bản đã khô (đã bay hết dung môi) được 

cho vào bình sắc ký đã bão hòa pha động. Mép dưới bản mỏng được 

nhúng vào pha động nhưng vết chấm còn cách bề mặt pha động khoảng 

0,5 cm. 

lên. 

Có nhiều cách khai triển sắc ký, nhưng cách thông thường là sắc ký 

1.4.6 Phát hiện vết trên sắc ký đồ 

Dựa vào tính chất lý hóa khác nhau của chất phân tích để lựa chọn 

cách phát hiện thích hợp các vết sắc ký. 

Sau đây là một số kỹ thuật thường gặp: 

- Phun thuốc thử hiện màu: Dùng thuốc thử tạo màu với chất phân tích. 

Đôi khi người ta làm nóng bản mỏng để tăng tốc độ phản ứng tạo màu và 

cường độ vết màu. 

- Soi dưới đèn UV: Nhiều vết chất hữu cơ trên sắc ký đồ trở nên tối 

hoặc phát quang sáng khi soi dưới đèn UV ở bước sóng 254 nm hoặc 366 

nm. Một số bản tráng sẵn có chất phát quang không tan đưa vào pha tĩnh 

nên phát huỳnh quang. 

- Dùng densitometer: Thiết bị này đo cường độ tia phản xạ từ bề mặt 

bản mỏng khi soi dưới đèn UV-VIS. Chất phân tích hấp thụ bức xạ được 

ghi lại thành pic sắc ký [2]. 

1.4.7 Ứng dụng của sắc ký lớp mỏng 

1.4.7.1 Định tính 

Thường dựa vào trị số R f của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký 

trong cùng điều kiện. Đôi khi do sắc ký liên tục không sắc <strong>định</strong> được 

tuyến dung môi pha động, người ta dụng hệ số lưu giữ tương đối R f để đặc 

trưng cho chất phân 

16

d 

R,x 

R d R,x : Đường đi của chất phân tích (cm) 

d 

R,c 

d R,c : Đường đi của chất chuẩn (cm) 

1.4.7.2 Thử tinh khiết 

Dùng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất 

thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ. Trong các Dược điển thường qui <strong>định</strong> 

kiểm tra tạp chất có mặt trong dược chất bằng sắc ký lớp mỏng. 

1.4.7.3 Định <strong>lượng</strong>: 

Có hai cách để <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> các chất trong vết sắc ký: 

- Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau 

khi làm sạch dịch chiết, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp 

(phổ hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ…). Phương <strong>pháp</strong> này hiện nay ít dùng vì 

có nhiều trở ngại, lại mất nhiều thời gian. 

- Định <strong>lượng</strong> trực tiếp trên bản mỏng :Đo diện tích hay cường độ màu của 

vết sắc ký. Hiện nay dùng 2 kỹ thuật: 

Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ 

hoặc huỳnh quang. 

Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: 

Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ 

thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử lý dữ liệu 

ảnh bằng máy tính. 

Hiện nay để tăng độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta đưa vào thị 

trường bản mỏng hiệu năng cao (high – performance plates). Bản này được 

tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích thước 

hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn. Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân 

giải được tăng cường bởi vì: 

- Vết sắc ký nhỏ hơn. 

17

- Thời ngan sắc ký ngắn hơn. 

- Lượng dung môi dùng ít hơn. 

Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu 

năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường. Tuy vậy trong kỹ thuật này – kể cả 

HPTLC – sai số của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> dao động trong khoảng 5-10%. Nguồn sai 

số chủ yếu ở khâu đưa mẫu lên bản mỏng [2]. 

18

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 

2.1. Đối tƣợng, nguyên vật liệu, thiết bị và nghiên cứu 

2.1.1. Đối tượng 

- Chất chuẩn: Acid <strong>chlorogenic</strong> hàm <strong>lượng</strong> 99,97%, lô KC.10.16-04.01 của 

Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương. 

- Mẫu cao Actiso: gồm 2 mẫu cao khô và 4 mẫu cao mềm. 

Kí hiệu 

CA1 

CA2 

CA3 

CA4 

CA5 

CA6 

Bảng 2.1. Các mẫu cao actiso đang lưu hành trên thị trường 

Mẫu - Nguồn gốc 

Cao khô - Công ty dược phẩm Traphaco 

Cao mềm – Cao Actiso Đà Lạt 

Cao mềm – Cao lá Ngọc Duy (95% lá, 5% đường) 

Cao mềm – Cao hoa Ngọc Duy (30% hoa, 65% lá, 5% đường) 

Cao khô – Công ty CP BV Pharma 

Cao mềm – Cao Actiso Hà Giang 

2.1.2. Hóa chất 

Bảng 2.2. Tên và nguồn gốc hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 

Hóa chất Độ tinh khiết (%) Nguồn gốc sản xuất 

Methanol 99,0 Trung Quốc 

Ethanol 99,7 Trung Quốc 

Etyl acetat 99,5 Merk, Đức 

Acid acetic 99,5 Trung Quốc 

Acid formic 99,5 Trung Quốc 

Toluen 99,5 Trung Quốc 

Nước cất 2 lần 

Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất 

19

2.1.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu: 

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag với detectơ, phần 

mềm điều khiển Wincat. 

0,1mg. 

filter),... 

- Cân phân tích Metller Toledo (Thụy Sỹ), độ chính xác 0,01mg và 

- Bể lắc siêu âm Helma S60H (Đức). 

- Nồi cách thủy Memmert WNB14 (Đức). 

- Bản mỏng silicagel GF 254 của Merck (Đức) 

- Dụng cụ: các loại pipet, bình <strong>định</strong> mức, màng lọc mẫu (syringe 

2.2. Phƣơng <strong>pháp</strong> nghiên cứu 

Nguyên lý phân tích: Mẫu được chiết theo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> thích hợp, 

dịch chiết được <strong>định</strong> mức, lọc qua màng lọc 0,45 μm, chấm lên bản mỏng, 

triển khai sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. 

2.2.1. Nghiên cứu khảo sát chọn điều kiện sắc ký 

Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 có kích thước 5 × 10 cm; 5 

×20 cm. Thể tích mẫu 25 µl, phát hiện ở bước sóng 366 nm; dựa trên điều 

kiện sẵn có và tham khảo các tài liệu [7], [17], [30] tiến hành khảo sát 

bằng thực nghiệm các hệ dung môi pha động sau: 

- Hệ 1: Ethyl acetat: <strong>acid</strong> acetic: nước (6:1:1) [30] 

- Hệ 2: Ethyl acetat: <strong>acid</strong> acetic: <strong>acid</strong> formic: nước (10:1,1:1,1:2,7) 

[7] 

- Hệ 3: toluen: ethyl acetat: <strong>acid</strong> formic: nước (3:12:1:1) [17] 

Quét phổ ứng với vết của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> từ 200 – 700 nm, chọn bước 

sóng cho đáp ứng cao nhất để dùng trong <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>. 

20

Lựa chọn dung môi khai triển tách được <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> cho vết gọn, Rf 

nằm trong khoảng 0,2 - 0,8 và bước sóng có cực đại hấp thụ. 

2.2.2. Nghiên cứu <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chiết <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong actiso 

Quy trình xử lý mẫu: 

- Cân mẫu vào bình <strong>định</strong> mức, thêm dung môi chiết. 

- Siêu âm trong 15 phút 

- Định mức đến thể tích chính xác. 

- Ly tâm dịch chiết, thu lấy phần dung dịch. 

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm. 

- Phun mẫu lên bản mỏng. 

Khảo sát điều kiện chiết: 

- Dung môi chiết: sử dụng hỗn hợp dung môi methanol - nước với tỷ 

lệ methanol từ 30 – 80% với C = 10%. 

-Thời gian chiết: khảo sát thời gian chiết 15 phút, 30 phút. 

Mỗi điều kiện khảo sát tiến hành lặp lại 2 lần lấy kết quả trung bình. 

Lựa chọn điều kiện chiết cho hiệu suất chiết cao. 

2.2.3. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích 

Xử lý mẫu theo qui trình đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch 

thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> các chỉ tiêu: 

độ đặc hiệu, sự phù hợp của hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, 

giới hạn phát hiện – LOD, giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> - LOQ. 

- Độ đặc hiệu: tiến hành chạy sắc ký lần lượt với mẫu trắng (dung 

môi chiết), mẫu chuẩn và mẫu thử, ghi lại sắc ký đồ. Trên sắc ký đồ mẫu 

trắng phải không xuất hiện vết có R f tương ứng với vết của mẫu chuẩn, R f 

21

của chất phân tích trong mẫu thử phải tương đương với R f của chất phân 

tích trong sắc ký đồ mẫu chuẩn. 

- Sự phù hợp của hệ thống: đánh giá độ ổn <strong>định</strong> của hệ thống với 

R f và diện tích pic khi phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị, 

ghi lại các giá trị R f , diện tích pic. Yêu cầu: RSD của giá trị R f không quá 

2,0% và RSD của diện tích pic của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> phải không quá 3,0%. 

- Độ tuyến tính: tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả 

mối tương quan tuyến tính trong khoảng xác <strong>định</strong> (là khoảng nồng độ đảm 

bảo sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại <strong>lượng</strong> đo được Y và nồng độ chất 

phân tích X). 

<strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> đường chuẩn 4 điểm X1 đến X4 của dung dịch chuẩn 

<strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> ở trong khoảng nồng độ phù hợp. Tiến hành sắc ký theo 

điều kiện đã lựa chọn. Làm lặp lại 3 lần. Xác <strong>định</strong> <strong>phương</strong> trình hồi quy 

tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic chất phân tích. Tính hệ số tương 

quan tuyến tính. Yêu cầu đường hồi qui có dạng đường thẳng với r ≥ 0,99. 

- Độ lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong>: độ lặp lại diễn tả độ chính xác của 

một quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời 

gian ngắn. Tiến hành: chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình xử lý mẫu đã xây 

<strong>dựng</strong>, chạy mẫu trên hệ thống HPTLC, ghi lại sắc ký đồ. Xác <strong>định</strong> độ lệch 

chuẩn tương đối RSD (%) của hàm <strong>lượng</strong> hoạt chất trong mẫu thử. Yêu 

cầu: tại mức hàm <strong>lượng</strong> hoạt chất trong mẫu từ 1% tới nhỏ hơn 10%, theo 

AOAC, độ lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> (RSD) phải ≤ 2,7%. 

- Độ đúng: độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thu được với 

giá trị thực. Độ đúng được xác <strong>định</strong> bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> thêm chuẩn. Thêm 

một <strong>lượng</strong> chính xác chất chuẩn thích hợp vào trong mẫu thử sao cho tổng 

hàm <strong>lượng</strong> chất phân tích trong dung dịch (sau khi xử lý) nằm trong 

khoảng tuyến tính của đường chuẩn. Tiến hành phân tích theo điều kiện đã 

chọn. Dựa vào hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> đã biết trong mẫu thử, <strong>lượng</strong> 

chất chuẩn thêm vào và diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn dịch 

22

thử thêm chuẩn, tính được <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> thu hồi lại trong mẫu 

thử. Yêu cầu (theo AOAC) <strong>lượng</strong> chuẩn tìm lại nằm trong khoảng 

khoảng 97 – 103% với hàm <strong>lượng</strong> hoạt chất trong mẫu từ 1% tới nhỏ hơn 

10%. 

- Giới hạn phát hiện - LOD: Giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất 

của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> được (đối với <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>). Có nhiều cách xác <strong>định</strong> 

LOD khác nhau nhưng trong <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này sử dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> dựa 

trên tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N). Phân tích mẫu chuẩn ở nồng độ thấp 

còn có thể phát hiện tín hiệu của chất phân tích, xác <strong>định</strong> tỷ lệ tín hiệu chia 

cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio, trong đó 

S là chiều cao tín hiệu chất phân tích 

N là nhiễu đường nền). 

Nhiễu đường nền được tính về hai phai của đường nền và tốt nhất là 

tính nhiễu lân cận hai bên của pic, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần 

chiều rộng của pic tại nửa chiều cao. 

LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần 

nhiễu đường nền, thông thường thì lấy S/N = 3. 

- Giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> – LOQ: Giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> là nồng độ tối thiểu 

của một chất trong mẫu thử mà ta có thể <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>. Cách xác <strong>định</strong> LOQ 

tương tự như LOD, tuy nhiên LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó 

tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường thì lấy S/N = 

10. 

2.2.4. Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xây <strong>dựng</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

trong một số mẫu thực 

Cân mẫu thử và xử lý mẫu theo qui trình đã xây <strong>dựng</strong>. Tiến hành 

phân tích bằng HPTLC, tính kết quả theo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đường chuẩn. 

23

2.2.5. Phương <strong>pháp</strong> xử lý số liệu 

Các số liệu được xử lý dựa vào một số hàm trong Microsoft Excel. 

Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE 

Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV 

100SD 

Độ lệch chuẩn tương đối RSD: RSD % 

 

* Tương quan hồi quy tuyến tính: 

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic 

sắc ký (y) và <strong>lượng</strong> chất phân tích trên vết (x): y = ax+b 

__ 

X 

Trong đó: 

Hệ số góc a: Hàm SLOPE 

Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT 

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL 

24

CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 

3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký 

3.1.1. Chuẩn bị dung dịch 

- Dung dịch chuẩn gốc <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>: Cân chính xác khoảng 

5,0 mg chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> (trên cân phân tích có d = 0,01 mg) vào 

bình <strong>định</strong> mức dung tích 5 ml, thêm khoảng 3 ml MeOH, siêu âm trong 

5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều (dung dịch 1). Bảo quản 

ở 2 - 8 o C, dùng trong 1 tháng. (Dung dịch chuẩn gốc <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml). 

- Dung dịch chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>: Pha loãng chính xác dung 

dịch chuẩn gốc <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> bằng MeOH với tỷ lệ thích hợp để 

được dung dịch có nồng độ theo yêu cầu phân tích. 

- Dung dịch thử: tham khảo Dược điển châu Âu 8.0, cân chính xác 

khoảng 0,020 g cao dược liệu cho vào bình <strong>định</strong> mức 5 ml. Thêm 

khoảng 4 ml MeOH 60%. Siêu âm 15 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm 

dung môi vừa đủ tới vạch. Lắc đều. Lọc qua màng 0,45 µm thu được 

dịch chấm sắc ký. 

3.1.2. Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC 

Qua tham khảo các tài liệu và điều kiện hiện có của phòng thí 

nghiệm, tiến hành khảo sát lựa chọn hệ pha động sắc ký. Cố <strong>định</strong> các 

thông số phân tích là bản mỏng silica gel 60 F254, kích thước 5×10 cm 

hoặc 5×20 cm; thể tích chấm 25 µl; phát hiện ở bước sóng 366 nm. 

Chấm và chạy sắc ký đồng thời song song dung dịch thử và dung dịch 

chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> (nồng độ khoảng 0,4 mg/ml). Thực hiện triển 

khai sắc ký với 3 hệ pha động. Kết quả thu được như sau: 

- Hệ 1: Ethyl acetat: Acid acetic: Nước (6:1:1) [30] 

25

Chiều dài đường chạy dung môi: 8 cm. 

R f : 0,27. 

Nhận xét: Mẫu cao dược liệu có tách vết, mẫu 

chuẩn lên cao, tuy nhiên không có vết trong mẫu 

cao trùng vị trí với chất chuẩn. 

- Hệ 2: Ethyl acetat: Acid acetic: Acid formic: Nước 

(10:1,1:1,1:2,7) [7] 


R f : 0,50. 

Nhận xét: Mẫu cao dược liệu có tách vết rõ ràng, 

mẫu chuẩn vết lên cao, trong mẫu cao có vết trùng 

vị trí và màu sắc với vết chuẩn. 

- Hệ 3: Toluen: ethyl acetat: <strong>acid</strong> formic: nước (3:12:1:1) [17] 


R f : 0,14. 

Nhận xét: Mẫu cao dược liệu hầu như không tách 

vết, mẫu chất chuẩn cũng lên vết rất thấp. 

26

15 

10 

5 

cm 0 

Hệ 1 Hệ 2 Hệ 3 

Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động 

Từ các kết quả trên, lựa chọn hệ 2 cho nghiên cứu tiếp theo. 

Tiến hành quét phổ từ 200 - 700 nm tại vị trí vết trong sắc đồ của 

chuẩn đơn ứng với <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>, kết quả thể hiện ở hình 3.2. 

Hình 3.2. Phổ hấp thụ của vết ứng với <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> chuẩn 

27

Lựa chọn bước sóng cực đại là 330 nm để phát hiện khi tích phân 

lấy kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>. 

3.2. Khảo sát và lựa chọn phƣơng <strong>pháp</strong> xử lý mẫu 

- Yếu tố khảo sát: dung môi chiết, thời gian chiết. 

- Đối tượng khảo sát: cao khô actiso CA1. 

- Thông số đánh giá: tỷ số diện tích pic <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> và khối 

<strong>lượng</strong> mẫu chiết. 

3.2.1. Khảo sát dung môi chiết 

Do <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> dễ tan trong methanol và ethanol, dùng dung 

môi này làm dung môi chiết, khảo sát tỷ lệ dung môi methanol - nước, 

ethanol – nước và nước 

Các điều kiện chiết cố <strong>định</strong>: <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chiết siêu âm, thể tích 

dung môi: 5 ml, thời gian chiết: 15 phút, nhiệt độ chiết: không kiểm 

soát, số lần chiết: 1 lần, thể tích chấm: 25 µl. Thông số đánh giá: tỷ số 

diện tích pic <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> và khối <strong>lượng</strong> mẫu chiết. Mỗi điều kiện 

khảo sát lặp lại 2 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả phân tích được 

trình bày trong bảng và hình sau: 

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết 

Tỷ lệ 

dung 

môi 

Lần 1(A/m) 

Lần 2 (A/m) 

Trung bình 

(A/m) 

30 1276910 1107549 1192229 

40 1272679 1139918 1206298 

MeOH 

50 1314793 1165343 1240068 

60 1431127 1168019 1299573 

70 1271395 1152037 1211716 

28

80 1031859 960991 996425 

30 1073357 970582 1021969 

40 1103703 999236 1051470 

EtOH 

50 1105337 1029446 1067391 

60 1136454 1121995 1129225 

70 1103210 1040778 1071994 

80 1071762 991799 1031780 

Nước 1160741 1019644 1090193 

A/m 

1400000 

1200000 

1000000 

800000 

600000 

400000 

200000 

0 

MeOH 

Nồng độ dung môi (%) 

EtOH 

Nước 

30 40 50 60 70 80 

Hình 3.3. Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ dung môi chiết <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> trong cao actiso (n = 2) 

Nhận xét: Kết quả cho thấy đối với cao actiso khi sử dụng dung 

môi MeOH: H 2 O = 60:40, <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> chiết được đều cao 

hơn rõ rệt khi sử dụng các dung môi còn lại. 

= 60:40. 

Vì vậy, chúng tôi lựa chọn hỗn hợp dung môi chiết là MeOH: H 2 O 

3.2.2. Khảo sát thời gian chiết 

Tiến hành chiết mẫu theo quy trình dự kiến, cố <strong>định</strong> các thông 

số: <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> chiết siêu âm, dung môi chiết: MeOH - H 2 O = 60:40, 

số lần chiết: 01 lần, thể tích chấm: 25 µl. Thông số khảo sát: thời gian 

29

chiết 15 phút, 30 phút. Thông số đánh giá: tỷ số diện tích pic <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> và khối <strong>lượng</strong> mẫu chiết. Mỗi khảo sát tiến hành lặp lại 2 

lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả được thể hiện ở bảng sau: 

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian chiết 

Thời gian chiết 

(phút) 

Lần 1 (A/m) Lần 2 (A/m) Trung bình (A/m) 

15 1075024 1033575 1054299,5 

30 1075593 1041713 1058653,0 

Nhận xét: Khi tăng thời gian chiết từ 15 phút lên 30 phút, hàm <strong>lượng</strong> 

<strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong mẫu chiết không thay đổi đáng kể. Do đó, lựa 

chọn thời gian 15 phút để chiết <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> ra khỏi cao dược liệu. 

3.3. Quy trình phân tích 

Từ kết quả khảo sát thu được, chúng tôi lựa chọn điều kiện phân 

tích <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong cao actiso như sau: 

3.3.1. Xử lý mẫu 

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,020 g cao dược liệu cho vào 

bình <strong>định</strong> mức 5 ml. Thêm vào bình <strong>định</strong> mức khoảng 4 ml MeOH 

60%. Siêu âm trong 15 phút. Thêm cùng dung môi vừa đủ đến vạch. 

Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. 

3.3.2. Điều kiện sắc ký 

- Bản mỏng silica gel GF 254 (10 × 20 cm) hoạt hóa ở 110 o C trong 

30 phút. 

- Pha động: Ethyl acetat: <strong>acid</strong> acetic: <strong>acid</strong> formic: nước 

(10:1,1:1,1:2,7) 

- Quãng đường dung môi: 13 cm. 

- Thể tích mẫu: 25 µl. 

30

- Xử lý kết quả: <strong>định</strong> tính đèn UV ở 366 nm xác <strong>định</strong> R f và quan 

sát màu sắc vết; <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> ở bước sóng 330 nm. 

3.4. Thẩm <strong>định</strong> phƣơng <strong>pháp</strong> 

3.4.1. Độ thích hợp của hệ thống 

Phun 6 lần dung dịch chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> có nồng độ chính xác 

khoảng 0,4 mg/ml (tương ứng với 3,88 µg /vết) theo điều kiện sắc ký đã lựa 

chọn (mục 3.3.2), ghi lại sắc ký đồ. Kết quả được trình bày ở bảng sau: 

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống 

TT 1 2 3 4 5 6 TB 

RSD 

(%) 

R f 0,50 0,49 0,50 0,49 0,49 0,50 0,495 1,010 

A 44589,1 42492,8 41058,9 43093,2 42536,6 42758,9 42754,9 2,429 

Hình 3.4. Sắc ký đồ độ thích hợp hệ thống 

Từ các kết quả bảng 3.3 cho thấy: kết quả của 6 lần phân tích lặp lại 

mẫu <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> chuẩn có RSD của R f nhỏ hơn 2% và của diện 

tích pic nhỏ hơn 3%, đạt yêu cầu theo AOAC. Như vậy hệ thống 

HPTLC đạt yêu cầu để phân tích <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>. 

31

3.4.2. Độ chọn lọc 

Độ chọn lọc được đánh giá qua phân tích các dung dịch mẫu thử 

(mẫu CA1), dung môi chiết mẫu, dung dịch chuẩn và dung dịch thử 

thêm chuẩn. Xử lý kết quả với phần mềm WinCAT lấy sắc ký đồ 

analog. Kết quả được trình bày ở hình sau: 

Hình 3.5. Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

Mẫu trắng 

Mẫu chuẩn 

32

Mẫu thử 

Mẫu thử thêm chuẩn 

Hình 3.6. Sắc ký đồ analog xác <strong>định</strong> tính chọn lọc của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

(Mẫu CA1) 

Kết quả ở hình 3.5 và 3.6 cho thấy: trên sắc ký đồ của dung dịch 

mẫu thử có vết chính có cùng màu sắc và R f với vết chính trong sắc ký 

đồ của dung dịch <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> chuẩn. Sắc ký đồ của mẫu trắng 

không xuất hiện các vết tương ứng với vết chính trên sắc ký đồ của 

dung dịch mẫu chuẩn. Do đó, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> có tính chọn lọc đảm bảo 

để phát hiện <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong cao actiso. 

3.4.3. Khoảng tuyến tính 

Từ dung dịch chuẩn gốc của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> nồng độ 1 mg/ml, pha 

loãng chính xác bằng MeOH được các dung dịch chuẩn làm việc. Tiến 

hành sắc ký như điều kiện đã lựa chọn, phát hiện ở bước sóng 330 nm. 

Kết quả là sắc ký đồ cho các thông tin về R f , diện tích pic (sắc ký đồ 

trình bày ở phụ lục 1). <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> trình hồi quy tuyến tính thể 

hiện mối quan hệ giữa khối <strong>lượng</strong> chất phân tích trên vết (x) và diện 

tích pic (y) tương ứng. 

Khối <strong>lượng</strong> chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> cân được ban đầu là 4,85 mg (trên 

cân phân tích có d = 0,01 mg), pha trong bình <strong>định</strong> mức 5 ml. Nồng độ 

dung dịch chuẩn gốc là 0,97 mg/ml. Kết quả thu được như sau: 

Bảng 3.4. Kết quả đánh giá độ tuyến tính của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

33

Lượng <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> 

(µg /vết) 

1,94 2,91 3,88 4,85 

Diện tích pic 20544,6 33277,8 40503,3 53028,6 

Phương trình hồi quy: y = 10791x + 201,45 

Hệ số tương quan: r = 0,9947 

Hình 3.7. Sắc ký đồ xác <strong>định</strong> khoảng tuyến tính của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

60000 

50000 

40000 

A 

y = 10791x + 201.45 

R² = 0.9894 

30000 

20000 

10000 

0 

0 1 2 3 4 5 6 

Chuẩn/vết 

(µg) 

Hình 3.8. Đường biểu diễn mối tương quan giữa <strong>lượng</strong> chuẩn trên vết 

và diện tích pic của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

34

Nhận xét: Kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy trong khoảng 

<strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> là từ 1,95– 4,85 µg/ vết có sự tương quan chặt 

chẽ giữa nồng độ và diện tích pic của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> với hệ số tương 

quan r > 0,99. 

3.4.4. LOD - LOQ 

Từ dung dịch chuẩn gốc <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 1 mg/ml tiến hành pha loãng 

được các dung dịch chuẩn có nồng độ giảm dần: 0,060 – 0,050 – 0,040 – 

0,025 – 0,020 – 0,015 mg/ml tương ứng <strong>lượng</strong> chất/ vết là 0,5820 – 0,4850 – 

0,3880 – 0,2425 – 0,1940 – 0,1455 µg. Tiến hành sắc ký ta thu được kết quả 

sau: 

Sắc ký đồ analog của mẫu chuẩn <strong>acid</strong> 

chlorogen nồng độ 0,020 mg/ml 

Sắc ký đồ analog của mẫu chuẩn <strong>acid</strong> 

chlorogen nồng độ 0,060 mg/ml 

Hình 3.9: Sắc ký đồ analog của chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> xác <strong>định</strong> LOD - LOQ 

Bảng 3.5 . Kết quả xác <strong>định</strong> LOD, LOQ của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>: 

LOD 

LOQ 

Lượng Chiều Chiều S/N Lượng Chiều Chiều cao S/N 

chuẩn/vết 

(µg) 

cao pic cao 

nhiễu 

chuẩn/vết 

(µg) 

cao pic nhiễu 

0,1455 Không phát hiện được 0,3880 68,1 14,8 4,60 

0,1940 37,1 11,2 3,31 0,4850 84,2 9,2 9,15 

0,2425 52,9 13,9 3,81 0,5820 112,7 8,4 13,4 

35

Vậy: Giới hạn phát hiện (LOD) của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> là ở nồng độ 0,020 

mg/ml (tương ứng với <strong>lượng</strong> 0,1940 µg chuẩn/vết). Giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

(LOQ) của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> là ở nồng độ 0,060 mg/ml (tương ứng với <strong>lượng</strong> 

0,5820 µg chuẩn/vết). 

3.4.5. Độ lặp lại 

Tiến hành lặp lại 6 lần song song trên mẫu cao theo điều kiện 

chiết mẫu đã lựa chọn và tiến hành sắc ký. Phát hiện ở bước sóng 330 

nm. Dựa vào đường chuẩn xây <strong>dựng</strong> trong cùng ngày phân tích với r ≥ 

0,99 tính nồng độ <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong dung dịch mẫu thử sắc ký. 

Căn cứ vào <strong>lượng</strong> cân, độ pha loãng của mẫu thử xác <strong>định</strong> được hàm 

<strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong mẫu thử. Độ lặp lại của quy trình phân 

tích được xác <strong>định</strong> dựa vào RSD (%) của 6 kết quả và được trình 

bày trong bảng sau : 

Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> (Mẫu CA1) 

Lần m (g) Diện tích pic Hàm <strong>lượng</strong> (%) 

1 0,0228 43850,5 3,53 

2 0,0226 44304,4 3,59 

3 0,0219 42699,7 3,60 

4 0,0213 43106,9 3,72 

5 0,0203 40028,8 3,69 

6 0,0211 39174,5 3,49 

Trung bình 3,60 

RSD (%) 2,30 

Phương trình hồi qui 

dùng trong tính toán: 

y = 13730x – 11353 

r = 0,9913 

36

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức hàm <strong>lượng</strong> chất phân tích 1 – 10 

% độ lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> (RSD) phải đạt < 2,7%. Kết quả phân 

tích cho thấy độ lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đạt yêu cầu. 

3.4.6. Độ đúng 

Tiến hành theo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> thêm chuẩn. Thêm chính xác 160 µl 

dung dịch chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> có nồng độ 1,00 mg/ml vào 0,020 g 

(cân chính xác khoảng) bột mẫu thử cao actiso, lắc nhẹ cho đồng nhất. 

Xử lý mẫu và phân tích theo qui trình đã xây <strong>dựng</strong> trong mục 3.3.1. 

Làm lặp lại 6 lần song song. Phát hiện ở bước sóng 330 nm. Dựa vào 

đường chuẩn xây <strong>dựng</strong> trong cùng ngày phân tích với r ≥ 0,99 tính 

nồng độ <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong dung dịch mẫu thử sắc ký. Căn cứ vào 

<strong>lượng</strong> cân, độ pha loãng của mẫu thử xác <strong>định</strong> được hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> trong mẫu thử. Từ đó tính <strong>lượng</strong> chuẩn tìm lại. Kết quả thu 

được như sau: 

Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ đúng của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

m (g) 

M 1 (mcg) 

Lƣợng 

chuẩn thêm 

(mcg) 

Diện tích 

pic 

M 2 

(mg) 

M 3 (mg) 

Độ thu 

hồi (%) 

0,0230 828,35 160 56089,9 985,22 156,87 98,04 

0,0217 781,53 160 53372,6 943,65 162,12 101,33 

0,0211 759,92 160 51514,2 915,23 155,31 97,07 

0,0207 745,52 160 50702,3 902,81 157,29 98,31 

0,0224 806,74 160 55132,1 970,57 163,83 102,39 

0,0233 839,16 160 56714,4 994,77 155,62 97,26 

Trung bình 99,07 

RSD 2,06 

Phương trình hồi qui dùng trong tính toán: y = 13075x – 8318,8 

r = 0,9919 

37

Trong đó: 

m: khối <strong>lượng</strong> mẫu thử 

M 1 : Lượng <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong m mẫu thử (mg) 

M 2 : Lượng <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong mẫu thử thêm chuẩn (mg) 

M 3 : Lượng <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> chuẩn tìm lại (mg) 

Theo AOAC, tại mức hàm <strong>lượng</strong> hoạt chất trong mẫu thử nằm trong 

khoảng 1 – 10 %, độ thu hồi của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phải đạt 97-103% và độ 

lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> (RSD) phải đạt < 2,7%. Từ kết quả của bảng 

cho thấy độ thu hồi của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> nằm trong khoảng giới hạn 

cho phép, đạt yêu cầu của AOAC. 

3.5. Áp dụng phƣơng <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> lƣợng <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong một số mẫu 

cao actiso lƣu hành trên thị trƣờng. 

Chuẩn bị dung dịch 

Dung dịch chuẩn: Dung dịch <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> chuẩn gốc trong 

methanol có nồng độ chính xác khoảng 1,00 mg/ml. Pha loãng chính 

xác dung dịch này bằng MeOH thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 

0,20 mg/ml; 0,30 mg/ml; 0,40 mg/ml; 0,50 mg/ml. Lọc qua màng lọc 

0,45 µm. 

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,020 g cao dược liệu cho 

vào bình <strong>định</strong> mức 5 ml. Thêm khoảng 4 ml MeOH 60%. Siêu âm 

trong 15 phút. Thêm cùng dung môi vừa đủ đến vạch. Lắc đều, lọc qua 

màng lọc 0,45 µm. Mỗi mẫu chuẩn bị 3 lần riêng biệt. 

Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký như mục 3.3.2, ghi lại sắc ký 

đồ. Phát hiện bằng đèn UV ở bước sóng 366 nm và lấy kết quả <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> ở bước sóng 330 nm. 

Định tính <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong mẫu thử dựa vào so sánh R f và 

màu sắc vết của hoạt chất xuất hiện trong sắc ký đồ của dung 

38

dịch thử với sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, phát hiện bằng đèn 

UV ở 366 nm. 

Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu thực 

Định <strong>lượng</strong>: Nồng độ <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong dung dịch mẫu thử 

được xác <strong>định</strong> dựa vào đường chuẩn xây <strong>dựng</strong> trong cùng ngày 

phân tích với r ≥ 0,99. Căn cứ vào <strong>lượng</strong> cân, độ pha loãng của 

mẫu thử xác <strong>định</strong> được hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong mẫu 

thử. 

Hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong mẫu thử (%) nguyên trạng 

được tính theo công thức sau: 

6 

m10 

V 

100 

3 

M v10 

Trong đó: 

- m : khối <strong>lượng</strong> chất phân tích/vết tính dựa vào <strong>phương</strong> trình 

tuyến tính (µg). 

- v: thể tích tiêm mẫu ( v = 25 µl) 

- V là thể tích pha mẫu (V = 5 ml) 

- M: khối <strong>lượng</strong> mẫu thử (g). 

Kết quả được trình bày trong phụ lục 2 và bảng sau: 

39

Bảng 3.8. Kết quả hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong các mẫu thử 

Mẫu thử 

Khối <strong>lượng</strong> 

(g) 

Diện tích pic Hàm <strong>lượng</strong> (%) 

Hàm <strong>lượng</strong> 

trung bình 

(%) 

CA2 

CA3 

CA4* 

CA5 

CA6 

0,0311 22120,6 1,62 

0,0340 24122,9 1,58 

0,0328 25859,6 1,72 

0,0199 23703,0 2,66 

0,0223 25928,6 2,53 

0,0207 22871,3 2,50 

0,0404 11677,0 + 

0,0441 13312,9 + 

0,0418 12283,5 + 

0,0210 51534,9 4,59 

0,0213 52967,4 4,63 

0,0208 49457,4 4,48 

0,0419 41212,3 1,92 

0,0413 42004,4 1,98 

1,64 

2,56 

+ 

4,57 

1,92 

0,0399 37706,6 1,88 

Phương trình hồi qui dùng trong tính toán: y = 12806x+10232 

r = 0,9927 

Ghi chú: 

CA4*: vì diện tích pic của chất phân tích nằm ngoài đường chuẩn (nhỏ 

hơn rất nhiều so với giới hạn dưới) nên không tiến hành <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> mẫu 

này, chỉ kết luận mẫu là dương tính có chứa <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>. 

40

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN 

4.1. Về lựa chọn phƣơng <strong>pháp</strong> phân tích 

Acid <strong>chlorogenic</strong> là chất trung gian sinh tổng hợp quan trọng có tác 

dụng chống oxi hóa, hỗ trợ hạ đường huyết, giảm cholesterol máu, … có nhiều 

trong actiso và một số dược liệu khác. Trong Dược điển châu Âu 8.0 [17], 

chuyên luận actiso yêu cầu <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>, nhưng Dược điển 

Việt Nam IV [1] chưa yêu cầu phép thử này do đó cần phát triển <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

để <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> hoạt chất có hoạt tính sinh học phục vụ tiêu chuẩn hóa chất 

<strong>lượng</strong> actiso. 

Phương <strong>pháp</strong> TLC là <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích được phát triển từ lâu và 

được sử dụng rộng rãi trong <strong>định</strong> tính, thử tinh khiết các chất trong nhiều nền 

mẫu khác nhau cho kết quả rất đáng tin cậy. Các chuyên luận riêng trong 

Dược điển Việt Nam IV, TLC là <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> được sử dụng nhiều nhất trong 

kiểm nghiệm thuốc hóa dược và dược liệu, đặc biệt hầu hết các dược liệu đều 

được <strong>định</strong> tính bằng TLC [1]. Các nhà khoa học ở Việt Nam và thế giới đã xây 

<strong>dựng</strong> vân tay (finger print) sắc ký lớp mỏng để <strong>định</strong> tính rất nhiều thảo dược. 

Tuy nhiên, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> bằng sắc ký lớp mỏng vẫn chưa phát triển nhiều do bộ 

phận phát hiện chưa hoàn chỉnh. Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của 

khoa học kỹ thuật lĩnh vực điện tử và công nghệ thông tin, thiết bị HPTLC đã 

được dần hoàn thiện và mang lại ứng dụng khả quan trong <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> chất 

phân tích trong nhiều nền mẫu từ chế phẩm thuốc tân dược đến huyết tương, 

đặc biệt là trong kiểm tra chất <strong>lượng</strong> nguyên liệu thảo dược. HPTLC có đặc 

điểm của sắc ký là vừa tách, vừa <strong>định</strong> tính, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> đồng thời trong cùng 

một lần phân tích, cộng với ưu điểm là yêu cầu xử lý mẫu đơn giản trước khi 

đưa vào hệ thống sắc ký, có thể phân tích đồng thời được nhiều mẫu trong 1 

lần phân tích nên sẽ giảm thiểu được thời gian thời gian phân tích do đó sẽ tiết 

kiệm thời gian và chi phí phân tích. Đối với dược liệu để phục vụ sản xuất, 

một lô nguyên liệu được đóng gói trong số <strong>lượng</strong> bao bì nhiều, có thể thu mua 

41

từ nhiều nguồn khác nhau nên chất <strong>lượng</strong> có thể không đồng nhất do đó cần 

tăng cường số mẫu kiểm tra thì lựa chọn <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPTLC là một <strong>phương</strong> 

án thích hợp. 

4.2. Về xây <strong>dựng</strong> phƣơng <strong>pháp</strong> phân tích 

Cao actiso bán trên thị trường ở hai dạng cao khô và cao mềm do đó 

<strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xử lý mẫu được khảo sát trên mẫu đại diện là cao khô. Xử lý 

mẫu là bước quan trọng quyết <strong>định</strong> độ chính xác của phép phân tích. 

Dung môi chiết mẫu được khảo sát dựa trên độ tan của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> 

trong dung môi. Acid <strong>chlorogenic</strong> dễ tan trong methanol, ethanol nghiên cứu 

đã khảo sát hệ dung môi methanol – nước, ethanol – nước với các tỷ lệ khác 

nhau và nước. Kết quả cho thấy <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong cao actiso chiết 

bằng hệ dung môi methanol – nước với tỷ lệ 60:40 cho hiệu suất chiết cao 

nhất, kết quả này khác so với tác giả Abdul Mutalib A.G Nasser [12] sử dụng 

methanol 80% nên sẽ tiết kiệm được hóa chất hơn. 

Kết quả của nghiên cứu cho thấy thời gian chiết mẫu cũng ảnh hưởng 

đến hàm <strong>lượng</strong> hoạt chất chiết ra. Tuy nhiên khi tăng thời gian chiết từ 15 lên 

30 phút, <strong>lượng</strong> hoạt chất chiết được thay đổi không đáng kể. Do vậy việc lựa 

chọn thời gian chiết 15 phút sẽ giảm được thời gian. 

Phương <strong>pháp</strong> HPTLC để tách và xác <strong>định</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong 

cao actiso được khảo sát về tỷ lệ thành phần pha động, cách phát hiện để 

<strong>định</strong> tính và <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>. 

Thành phần và tỷ lệ pha động được khảo sát dựa trên các tài liệu đã công 

bố và các dung môi thông thường là methanol, toluen, ethyl acetat và các <strong>acid</strong> 

như <strong>acid</strong> formic, <strong>acid</strong> acetic. Ba hệ dung môi đã được khảo sát, trong đó 4 hệ 

có thành phần là toluen: ethyl acetat: <strong>acid</strong> formic: nước (3:12:1:1) R f của <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> rất thấp (0,14); hệ ethyl acetat: <strong>acid</strong> acetic: nước (6:1:1) R f của 

<strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> đạt 0,27 tuy nhiên lại k tác được chất cần phân tích trong mẫu 

thử tương ứng với mẫu chuẩn; hệ etyl acetat: <strong>acid</strong> acetic: <strong>acid</strong> formic: nước 

42

(10:1,1:1,1:2,7) có khả năng tách tốt các chất trong mẫu thử, vết <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> rõ ràng và R f của <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> đạt 0,50 . 

Phát hiện chất phân tích sau khi tách bằng sắc ký lớp mỏng là bước rất 

quan trọng để đánh giá kết quả. Acid <strong>chlorogenic</strong> có huỳnh quang xanh sáng 

dưới ánh sáng tử ngoại 366 nm nên đã lựa chọn điều kiện này để phát hiện 

<strong>định</strong> tính chất phân tích. Mặt khác, phát huy ưu thế của thiết bị có chế độ Scan 

nên vết <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trên sắc ký đồ được quét từ 200 – 700 nm và xác <strong>định</strong> 

được cực đại hấp thụ ở bước sóng 330 nm. Bước sóng này được lựa chọn để 

lấy kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>. Việc lấy kết quả đáp ứng ở bước sóng cực đại cho 

phép tăng độ nhạy của phép phân tích. 

Phương <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> tính, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong actiso trong 

các nghiên cứu đã công bố chủ yếu dùng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC với detector UV 

– DAD [12], [17], [20], hoặc LC-MS/MS [18], [14]. Ngoài xác <strong>định</strong> thành 

phần <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> các nghiên cứu này còn công bố các thành phần 

polyphenol khác có trong actiso như <strong>acid</strong> 1,3-di-O-caffeoylquinic (cynarin) và 

<strong>acid</strong> 1,5-di-O-caffeoylquinic. Với các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này, yêu cầu thiết bị đắt 

tiền, mẫu thử có thể làm sạch bằng cột nhồi Sephadex LH-20 [20] nên sẽ phức 

tạp và đắt tiền hơn. 

4.3. Về việc thẩm <strong>định</strong> phƣơng <strong>pháp</strong> phân tích 

Phương <strong>pháp</strong> phân tích trong nghiên cứu này được thẩm <strong>định</strong> các chỉ tiêu 

độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện 

(LOD), giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> (LOQ). Kết quả cho thấy <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> cho độ 

chọn lọc cao. Khoảng tuyến tính được xây <strong>dựng</strong> trong khoảng <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> 1,94 – 4,85 µg/ vết, kết quả cho thấy có sự tương quan chặt chẽ 

giữa hàm <strong>lượng</strong> hoạt chất và đáp ứng pic sắc ký (diện tích pic sắc ký) với hệ 

số tương quan đều lớn hơn 0,99. Độ lặp lại được đánh giá trên nền mẫu búp 

actiso cho kết quả đáp ứng yêu cầu của AOAC tại mức hàm <strong>lượng</strong> chất phân 

tích 1 – 10 % RSD của 6 lần phân tích song song phải dưới < 2,7% (2,30%). 

43

Độ đúng của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> được đánh giá thông qua độ thu hồi theo <strong>phương</strong> 

<strong>pháp</strong> thêm chuẩn, kết quả cho thấy độ thu hồi của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phải đạt 

97,07% – 102,39% (n = 6) đáp ứng yêu cầu của AOAC là nằm trong khoảng 

97-103% tại mức hàm <strong>lượng</strong> chất phân tích 1 – 10 % [13]. 

4.4. Về kết quả nghiên cứu trên mẫu thực 

Phương <strong>pháp</strong> nhiên cứu này thực hiện trên 6 đối tượng mẫu thực được tiến 

hành thu thập ở khu vực thành phố Hà Nội. Cụ thể là, 2 mẫu cao khô được 

cung cấp bởi Công ty Dược phẩm Traphaco và Công ty CP BV Pharma, 4 mẫu 

cao mềm được mua trực tiếp từ các cửa hàng phân phối của sản phẩm. Kết quả 

cho thấy, cả 6 mẫu thực đều có chứa chất phân tích <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> đều đạt 

R f = 0,50. 

Tuy nhiên <strong>lượng</strong> chất phân tích có trong mẫu lại chênh lệch khá nhiều giữa 

các mẫu thực với nhau. Cụ thể là mẫu có <strong>lượng</strong> chất phân tích cao nhất là 

4,57% (CA5 – cao khô được cung cấp bởi Công ty CP BV Pharma); mẫu có 

chứa hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> thấp nhất chỉ đạt 0,70% (CA4 – cao mềm, 

cao hoa Ngọc Duy), trong khi mẫu CA3 - cao mềm, cao lá Ngọc Duy có hàm 

<strong>lượng</strong> chất phân tích trung bình là 2,56%. Vậy, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPTLC đã giúp 

<strong>định</strong> <strong>lượng</strong> được hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong các mẫu cao actiso đang 

lưu hành trên thị trường và từ đó giúp đánh giá chất <strong>lượng</strong> sản phẩm và quy 

trình sản xuất đang được sử dụng. 

44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 

Kết luận 

Từ kết quả thực nghiệm thu được chúng tôi có kết luận sau: 

1. Đã xây <strong>dựng</strong> và thẩm <strong>định</strong> được <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> xác <strong>định</strong> <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> trong cao actiso bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao. Cụ thể 

là: 

Phương <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong>: Mẫu thử (cao khô, cao mềm) chiết trong 

dung môi methanol – nước = 60:40. Acid <strong>chlorogenic</strong> trong dung dịch mẫu 

thử được tách trên bản mỏng silica gel 60 F254 và rửa giải với pha động là 

etyl acetat: <strong>acid</strong> acetic: <strong>acid</strong> formic: nước (10:1,1:1,1:2,7); thể tích chấm: 25 

µl; <strong>định</strong> tính soi đèn UV ở 366 nm xác <strong>định</strong> R f và quan sát màu sắc vết; <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> ở bước sóng 330 nm. Phát hiện <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong mẫu thử dựa vào 

so sánh R f và màu sắc vết của hoạt chất xuất hiện trong sắc ký đồ của dung 

dịch mẫu thử với sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn. Nồng độ <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> trong dung dịch mẫu thử được xác <strong>định</strong> dựa vào đường chuẩn xây 

<strong>dựng</strong> trong cùng ngày phân tích với r ≥ 0,99. Căn cứ vào <strong>lượng</strong> cân, độ pha 

loãng của mẫu thử và diện tích pic trong sắc ký đồ của mẫu thử xác <strong>định</strong> được 

hàm <strong>lượng</strong> <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> trong mẫu thử. 

Phương <strong>pháp</strong> đã được thẩm <strong>định</strong> các tiêu chí độ chọn lọc, khoảng 

tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong> (LOQ). Kết quả đều đáp ứng yêu cầu của AOAC. 

2. Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> trên 6 mẫu cao actiso đang lưu 

hành trên thị trường cho thấy kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> chênh lệch nhau tương đối 

lớn ( 0,70 – 4,57%). Từ đó cho thấy chất <strong>lượng</strong> cao actiso trên thị trường cần 

được kiểm tra chặt chẽ góp phần nâng cao chất <strong>lượng</strong> sản phẩm chứa actiso 

phục vụ người sử dụng. 

Kiến nghị 

45

Ứng dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> đã xây <strong>dựng</strong> để 

kiểm tra chất <strong>lượng</strong> các loại cao actiso đang được lưu hành nhằm kiểm soát 

chất <strong>lượng</strong> sản phẩm và phục vụ công tác kinh doanh, sản xuất các chế phẩm 

chứa thành phần actiso. 

46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

Tiếng Việt 

1. Bộ Y Tế (2015), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr. 681 

2. Bộ Y Tế (2012), Hóa phân tích-Tập II, NXB Y Học, Hà Nội, tr. 205- 

214 

3. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, NXB khoa học và 

kỹ thuật, tr. 79-81. 

4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, tr. 221-222. 

5. Lê Thị Thu Hiền (2010), Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn <strong>acid</strong> 

<strong>chlorogenic</strong> từ kim ngân hoa phục vụ công tác kiểm tra chất <strong>lượng</strong> 

thuốc, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội. 

6. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam trồng hái, chế biến trị bệnh 

ban đầu, NXB Nông nghiệp, tr. 977-978. 

7. Phạm Lý Hà (2015), Nghiên cứu đa dạng sinh học cây Kim ngân 

(Lonicera SPP.), Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Dược Hà Nội, tr. 33. 

8. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Lê Phan Kim Trang, Phạm Đông Phương 

(2016), Phân lập và thiết lập chất chuẩn <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong>, Tạp chí Dược 

học, 56 (487), tr. 22-27. 

9. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Phạm Phương Chi, Nguyễn Thị Duyên Anh, 

Phạm Đông Phương (2016), Phân lập và thiết lập chất chuẩn cynarin, 

Tạp chí Dược học, 56 (483), tr. 37-42. 

10. Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Trần Thị Hoàng Chi, Phạm Đông Phương 

(2016), <strong>Xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> tính, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> cynarosid và 

scolymosid trong actisô (Cynara scolymus L., Asteracea), Tạp chí 

Dược học, 56 (482), tr. 22-26. 

11. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, 

tr. 33. 

Tiếng Anh

12. Abdul Mutalib A.G Nasser (2012), “Phytochemical Study of Cynara 

scolymus L. (Artichoke) (Asteraceae) Cultivated in Iraq, Detection and 

Identification of Phenolic Acid Compounds Cynarin and Chlorogenic 

Acid”, Phytochemical study of cynara scolymus L.cultivated in Iraq, 

21(1), pp. 6-13 

13. AOAC International (2016), Appendix F: Guidelines for Standard 

Method Performance Requirements. 

14. Aveen Nozad Adham (2015), “Simultaneous estimation of caffeic and 

<strong>chlorogenic</strong> <strong>acid</strong> content in Ammi majus seed by TLC and HPLC”, 

International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 7(6), 

pp. 263-267. 

15. Bin Zhang, Ruiyuan Yang, Yan Zhao, Chun-Zao Liu, Journal of 

chromatography B, “separation of <strong>chlorogenic</strong> <strong>acid</strong> honeysuchle crude 

extracts by macroporous resin”, www.elsevier.com/locate/chromb. 

16. EUROPEAN MEDICINES AGENCY, Assessment report on Cynara 

scolymus L., folium (2011), Committee on Herbal Medicinal Products 

(HMPC). 

17. European Pharmacopoeia 8.0, pp. 1154-1156. 

18. Florinda Fratianni, Rosa Pepe, Filomena Nazzaro (2014), “Polyphenol 

Composition, Antioxidant, Antimicrobial and Quorum Quenching 

Activity of the “Carciofo di Montoro” (Cynara cardunculus var. 

scolymus) Global Artichoke of the Campania Region, Southern Italy”, 

5, pp. 2053-2062 

19. Hisae Oku,Yuko Ogawa, Emiko Iwaokaand Kyoko Ishiguro 

(2011),”Allergy - Preventive Effects of Chlorogenic Acid and Iridoid 

Derivatives from Flower Buds of Lonicera japonica”,Pharmaceutical 

Society of Japan, 34(8), pp. 1330-1333.

20. Jan Fritsche, Christaan M. Beindorff, Markus Dachtler, Hui Zhang, 

Jan G. Lammers (2002), Isolation, characterization and determination 

of minor artichoke (Cynarascolymus L.) leaf extract compounds, 

European Food Research and Technology, 215(2), pp. 149–157. 

21. Li-Mei Wang, Mao-Teng Li, You-Yu Yan, Ming-Zhang Ao, GengWu 

and Long-Jiang Yu (2009), “Influence of flowering stage of Lonicera 

japonica Thunb. On variation in volatiles and <strong>chlorogenic</strong> <strong>acid</strong>”, 

Research Article, 98, pp. 953-957. 

22. Mirna Leonor Sua rez-Quiroz, Angelina Alonso Campos, Gerardo 

Valerio Alfaro, Oscar Gonzalez-Rıos, Pierre Villeneuve, Maria Cruz 

Figueroa-Espinoza (2014), “Isolation of green coffee <strong>chlorogenic</strong> <strong>acid</strong>s 

using activated carbon”, Journal of Food Composition and Analysis, 

33, pp. 55-58. 

23. Nassar MI, Mohamed TK, Elshamy AI, El-Toumy SA, Abdel Lateef 

AM, Farrag AR (Aug 15, 2013), Chemical constituents and antiulcerogenic 

potential of the scales of Cynarascolymus (artichoke) 

heads, 93(10):2, pp 494-501. 

24. Nia Kristiningrum, Yuni Retnaningtyas và Ni Putu Pertiwi (2015), 

“Validated TLC-Densitometry Method for Determination of 

Chlorogenic Acid In Coffee Leaves Extract”, Research Journal of 

Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 6(5), pp. 1138- 

1143. 

25. Schütz K, Kammerer D, Carle R, Schieber A (2004 Jun 30), 

Identification and quantification of caffeoylquinic <strong>acid</strong>s and flavonoids 

from artichoke (Cynarascolymus L.) heads, juice, and pomace by 

HPLC-DAD-ESI/MS(n), 52(13): 4090-6. 

26. Sherma, Joseph Fried, Bernard (2003), Handbook of thin-layer 

chromatography-vol.89, CRC press. 

27. sigmaaldrich.com

28. T.V. Orlovskaya, I.L. Luneva, V.A. Chelombit´ko, Chemical 

composition of Cynarascolymus leaves, Chemistry of Natural 

Compounds 43(2), pp: 239-240. 

29. USP Pharmacopoeia 38, online. 

30. Xianfeng Zhu, Hongxun Zhang, Raymond Lo (2004), Phenolic 

Compounds from the Leaf Extract of Artichoke (Cynara scolymus L.) 

and Their Antimicrobial Activities, J. Agric. Food Chem., 52 (24), pp 

7272–7278.

PHỤ LỤC 

Phụ lục 1: Sắc ký đồ analog đƣờng chuẩn. 

Lượng 

chất/ 

vết (µg) 

Sắc ký đồ analog 

1,94 

2,91

3,88 

4,85

Phụ lục 2: Sắc ký đồ analog mẫu thực. 

Mẫu Sắc ký đồ analog 

CA2 

CA3

CA4 

CA5

CA6

Phụ lục 3: Quy trình xử lý mẫu và điều kiện phân tích 

Chuẩn bị mẫu 

- Dung dịch chuẩn: Dung dịch <strong>acid</strong> <strong>chlorogenic</strong> chuẩn trong methanol 

có nồng độ chính xác khoảng 1,00 mg/ml. Pha loãng chính xác dung 

dịch này bằng MeOH thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,20 

mg/ml; 0,30 mg/ml; 0,40 mg/ml; 0,50 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 

µm. 

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,0200 g cao dược liệu cho vào 

bình <strong>định</strong> mức 5 ml. Thêm vào bình <strong>định</strong> mức khoảng 4 ml MeOH 

60%. Siêu âm trong 15 phút. Thêm cùng dung môi vừa đủ đến vạch. 

Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. 

Điều kiện sắc ký 

- Bản mỏng silica gel GF 254 (10 × 15 cm) hoạt hóa ở 110 o C trong 

30 phút. 

- Pha động: Ethyl acetat: <strong>acid</strong> acetic: <strong>acid</strong> formic: nước 

(10:1,1:1,1:2,7) 

- Quãng đường dung môi: 13 cm. 

- Thể tích mẫu: 25 µl. 

- Xử lý kết quả: <strong>định</strong> tính đèn UV ở 366 nm xác <strong>định</strong> R f và quan 

sát màu sắc vết; <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> ở bước sóng 330 nm.

Phụ lục 4: Số liệu khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết 

1. Khảo sát dung môi chiết 

Tỷ lệ dung 

môi 

Lần 1 Lần 2 

m (g) A (AU) m (g) A (AU) 

30 0,02042 26074,5 0,0215 23812,3 

40 0,02094 26649,9 0,0206 23482,3 

MeOH 

50 0,0203 26690,3 0,0198 23073,8 

60 0,01934 27678,0 0,0206 24061,2 

70 0,02064 26241,6 0,0192 22119,1 

80 0,0213 21978,6 0,0231 22198,9 

30 0,02276 24429,6 0,0208 20188,1 

40 0,01974 21787,1 0,0216 21583,5 

EtOH 

50 0,01842 20360,3 0,0211 21721,3 

60 0,0196 22274,5 0,0197 22103,3 

70 0,0214 23608,7 0,0221 23001,2 

80 0,01964 21049,4 0,0204 20232,7 

Nước 0,0239 27741,7 0,0225 22942,0 

2. Khảo sát thời gian chiết 

Thời gian 

chiết (phút) 

Lần 1 Lần 2 

m (g) A (AU) m (g) A (AU) 

15 0,0202 21715,5 0,0221 22842,0 

30 0,0214 23017,7 0,0206 21459,3

Xây dựng phương pháp định lượng acid chlorogenic trong cao actiso bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?