Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin trong dược liệu ba kích bằng HPLC

BỘ Y TẾ 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 

NGUYỄN THỊ LÊ 

MÃ SINH VIÊN: 1201310 

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG 

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 

RUBIADIN TRONG DƯỢC LIỆU BA 

KÍCH BẰNG HPLC 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 

HÀ NỘI - 2017

BỘ Y TẾ 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI 

NGUYỄN THỊ LÊ 

MÃ SINH VIÊN: 1201310 

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG 

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG 

RUBIADIN TRONG DƯỢC LIỆU BA 

KÍCH BẰNG HPLC 

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ 

Người hướng dẫn: 

1.TS.Lê Thị Kim Vân 

2.ThS.Tống Thị Thanh Vượng 

Nơi thực hiện: 

1.Viện Dược liệu 

2.Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất 

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN 

Trong quá trình thực hiện đề tài“<strong>Bước</strong> <strong>đầu</strong> <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> 

<strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”, ngoài sự làm 

việc nghiêm túc, nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía 

trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu, thầy cô, gia đình và bạn bè. 

Trước hết em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Viện Dược liệu đã tạo 

rất nhiều điều kiện thuận lợi để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. 

Em xin gửi lời cảm ơn đến ThS.Tống Thị Thanh Vượng – GV Bộ môn Hóa 

phân tích – Độc chất đã đóng góp ý kiến, tận tình sửa chữa giúp em hoàn thành 

khóa luận này. 

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Lê Thị Kim Vân – Khoa Bào chế Chế 

biến – Viện Dược liệu, người đã tận tình hướng dẫn em trong quá trình thực hiện đề 

tài. 

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong khoa Bào chế Chế biến – Viện 

Dược liệu đã hỗ trợ em trong quá trình <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong>. 

Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là 

những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy em suốt thời gian học tập tại trường. 

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên và giúp đỡ em trong 

quá trình học tập, <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong>. 

Em xin chân thành cảm ơn! 

Hà Nội, tháng 05 năm 2017 

Nguyễn Thị Lê

MỤC LỤC 

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................... 5 

ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................. 1 

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU BA KÍCH .................................................... 2 

1.1. Ba kích ........................................................................................................... 2 

1.1.1. Tên khoa học ........................................................................................... 2 

1.1.2. Mô tả ....................................................................................................... 2 

1.1.3. Bộ phận dùng .......................................................................................... 2 

1.1.4. Nơi sống và thu hái ................................................................................. 2 

1.1.5. Thành phần hóa học ................................................................................ 3 

1.1.6. Tác dụng dược lý .................................................................................... 5 

1.2. Tình hình <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> đánh giá Dược liệu Ba kích ........................................ 7 

1.2.1. Tiêu chuẩn Dược điển ............................................................................. 8 

1.2.2. Tại Việt Nam ........................................................................................ 11 

1.2.3. Trên thế giới .......................................................................................... 11 

1.3. Rubiadin ....................................................................................................... 13 

1.3.1. Công thức cấu tạo ................................................................................. 13 

1.3.2. Tác dụng dược lý .................................................................................. 13 

1.3.3. Sự phân bố <strong>rubiadin</strong> trong chi Morinda ................................................ 14 

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 16 

2.1. Đối tượng <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> .................................................................................. 16 

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất. ............................................................ 16 

2.3. Nội dung <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> ................................................................................... 17 

2.4. Phương <strong>pháp</strong> <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> ............................................................................. 17 

2.4.1. Định tính các nhóm chất hóa học. ........................................................ 17 

2.4.2. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần trong Ba kích bằng <strong>phương</strong> 

<strong>pháp</strong> đo quang phổ hấp thụ UV-VIS .................................................................. 20 

2.4.3. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC ..................... 21 

2.5. Phương <strong>pháp</strong> xử lý số liệu. .......................................................................... 25 

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. .................................................................. 27

3.1. Xác <strong>định</strong> sự có mặt của một số nhóm chất trong Ba kích và một số hoạt 

chất nhóm anthranoid ............................................................................................ 27 

3.1.1. Kết quả xác <strong>định</strong> một số nhóm chất bằng phản ứng hóa học ............... 27 

3.1.2. Xác <strong>định</strong> sự có mặt của một số hoạt chất nhóm anthranoid bằng TLC 28 

3.2. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần trong Ba kích ........................... 30 

3.2.1. Chuẩn bị dung dịch sắc ký .................................................................... 30 

3.2.2. Xây <strong>dựng</strong> đường chuẩn ......................................................................... 30 

3.2.3. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần ........................................... 31 

3.3. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong Ba kích bằng HPLC ........................... 31 

3.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch sắc ký ............... 31 

3.3.2. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong Ba kích theo 

AOAC 36 

3.3.3. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> Rubiadin trong Ba kích ....................................... 42 

3.4. Bàn luận ....................................................................................................... 43 

3.4.1. Mẫu <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> .................................................................................... 43 

3.4.2. Phương <strong>pháp</strong> <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> ...................................................................... 44 

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 46 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 

STT PHầN VIếT TắT PHầN VIếT ĐầY Đủ 

1 ACN Acetonitril 

2 AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (Association of 

analytical chemists) 

3 BHC Benzene hexachloride (C 6 H 6 C 6 ) 

4 DAD Detector mảng diod (Diod Array Detector) 

5 DDT Dichloro diphenyl trichlorothane (C 14 H 9 C 15 ) 

6 EtOH Ethanol 

7 HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid 

Chromatography) 

8 HSCCC Sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (High speed 

countercurrent chromatography) 

9 LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) 

10 LOQ Giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> (Limit of Qualification) 

11 MeOH Methanol 

12 ELSD Tán xạ bay hơi 

13 RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relactive Standard 

Deviation) 

14 SKĐ Sắc ký đồ 

15 S/N Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise) 

16 STT Số thứ tự 

17 TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) 

18 TT Thuốc thử 

19 UV-VIS Phổ tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet Visible)

DANH MỤC CÁC BẢNG 

STT Tên bảng Trang 

3.1 Kết quả <strong>định</strong> tính một số nhóm chất trong Ba kích 27 

3.2 Gia trị R f của chất chuẩn 29 

3.3 Độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn <strong>rubiadin</strong> 30 

3.4 Hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần của các mẫu thử tính theo 31 

<strong>rubiadin</strong> 

3.5 So sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> khi chiết ở nồng độ EtOH khác nhau 31 

3.6 So sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> khi chiết trong thời gian khác nhau 32 

3.7 Kết quả khảo sát hệ pha động 35 

3.8 Thời gian lưu của mẫu chuẩn và mẫu thử 37 

3.9 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 38 

3.10 Kết quả khảo sát độ lặp lại 39 

3.11 Diện tích pic của dãy dung dịch chuẩn 39 

3.12 Kết quả xác <strong>định</strong> khả năng thu hồi của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 41 

3.13 Kết quả giá trị LOD, LOQ 42 

3.14 Kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong các mẫu thử 43 

3.15 Tỉ lệ<strong>rubiadin</strong> so với anthranoid toàn phần tính theo chuẩn <strong>rubiadin</strong> 43

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ 

STT Tên ảnh, đồ thị Trang 

3.1 Sắc ký bản mỏng sau khi khai triển 29 

3.2 Đồ thị tương quan giữa nồng độ chuẩn <strong>rubiadin</strong> và độ hấp thụ 30 

3.3 SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn với pha động MeOH:H 3 PO 4 0,1% (85:15) 33 

3.4 SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn với pha động MeOH:H 3 PO 4 0,1% (80:20) 33 

3.5 SKĐ<strong>rubiadin</strong> chuẩn pha loãng trog dịch chiết dược liệu với pha 34 

động MeOH:H 3 PO 4 0,1% (70:30) 

3.6 SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn pha loãng trog dịch chiết dược liệu với pha 34 

động MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% (42,5:42,5:15) 

3.7 SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn với pha động MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% 35 

(56,7:26,3:15) 

3.8 SKĐ mẫu thử với pha động MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% 

35 

(56,7:26,3:15) 

3.9 Hình ảnh chồng phổ sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử 36 

3.10 SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn 37 

3.11 SKĐ <strong>rubiadin</strong> trong mẫu thử 37 

3.12 Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ 40

ĐẶT VẤN ĐỀ 

Ba kích là một loại dược liệu quý trong y học cổ truyền. Rễ Ba kích được sử 

dụng rộng rãi với mục đích ôn thận, tráng dương, kiện cân cốt, khử phong và hàn 

thấp. Nhiều <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> về tác dụng dược lý của dịch chiết rễ Ba kích đã được tiến 

hành, chứng minh tác dụng chống viêm, chống loãng xương, điều hòa đường huyết, 

giảm huyết áp. 

Ở Việt Nam, Ba kíchphân bố rộng rãi ở các tỉnh phía Bắc, đặc biệt là Quảng 

Ninh. Trong những năm gần đây, Quảng Ninh đã chủ trương phát triển Ba kích trở 

thành dược liệu đặc trưng của tỉnh: mở rộng khu vực trồng Ba kích và phát triển các 

thương phẩm Ba kích. Tuy nhiên hiện nay trên thị trường dược liệu, Ba kích có rất 

nhiều nguồn như: Ba kích nhập từ Trung Quốc, Ba kích Quảng Ninh, Ba kích Bắc 

Cạn..., rất khó để kiểm soát chất <strong>lượng</strong> dược liệu. 

Với mong muốn tìm hiểu về chất <strong>lượng</strong> dược liệu Ba kích, chúng tôi tiến hành 

đề tài: “<strong>Bước</strong> <strong>đầu</strong> <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> 

trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”. Đề tài được thực hiện với mục tiêu: 

- Xây <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong Ba kích. 

- Sơ bộ xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần và hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> 

trong Ba kích. 

- So sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> so với anthranoid toàn phần và <strong>rubiadin</strong> trong 

Ba kích Quảng Ninh so với các mẫu Ba kích khác trên thị trường. 

1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU BA KÍCH 

1.1. Ba kích 

1.1.1. Tên khoa học 

- Morinda officinalis How.,họ Cà Phê Rubiaceae [3][4][6]. 

- Tên khác: Ba kích thiên, dây ruột gà, chồi hoàng kim, sáy cày[3][4][6]. 

1.1.2. Mô tả 

Ba kích là một loại cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, dài hàng 

mét. Thân non màu tím, có lông, sau nhẵn. Cành non có cạnh, lá mọc đối, hình mác 

hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, cuống ngắn, lúc non có lông dày hơn ở mặt 

dưới, màu xanh lục, sau già lá ít lông hơn và có màu trắng mốc; lá kèm mỏng, ôm 

sát vào thân. Hoa nhỏ, màu trắng sau hơi vàng, tập trung thành tán ở <strong>đầu</strong> cành; đài 

hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ phát triển không đều; tràng hoa 

hàn liền ở phía dưới thành ống ngắn, nhị 4, bầu hạ. Quả hình cầu, rời nhau hoặc 

dính liền thành khối, khi chín màu đỏ, mang đài còn lại ở đỉnh. Mùa hoa: tháng 5-6. 

Mùa quả: tháng 7-10 [3][4][6]. 

1.1.3. Bộ phận dùng 

Bộ phận dùng: Rễ phơi hoặc sấy khô (Radix morindae) [3][4][6]. 

Đặc điểm: Rễ cong queo. Thịt đứt thành từng đoạn, để lộ lõi nhỏ ở bên trong, 

vỏ ngoài màu hồng nhạt, thịt màu hồng hay tím, trên mặt vỏ có nhiều vân dọc. Cắt 

ngang thấy lớp vỏ ngoài rất mỏng, dính chặt vào thịt, thịt dày, giữa có lõi như lõi 

sắn. Lớp gỗ rắn chắc, màu vàng nâu hoặc vàng trắng, đường kính 1-5mm [3][4][6]. 

1.1.4. Nơi sống và thu hái 

Mọc hoang ở ven rừng thứ sinh trung du và miền núi. Gặp nhiều ở Quảng 

Ninh, Hà Tây, Ninh Bình, Vĩnh Phúc, Lạng Sơn, Hà Giang, Hòa Bình. Có nhiều nơi 

như Quảng Ninh, Hà Tây, Vĩnh Phúc trồng để đảm bảo nhu cầu trong nước 

[3][4][6]. 

2

Có thể đào rễ quanh năm, tốt nhất là vào mùa thu-đông, rửa sạch, cắt bỏ rễ 

con, phơi sấy cho gần khô, dập dẹt rồi phơi sấy tiếp đến độ ẩm 13% [3][4][6]. 

1.1.5. Thành phần hóa học 

a. Thành phần hóa học 

Theo nhiều <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> đã công bố, thành phần chính của Ba kích là 

anthranoid, iridoid và polysaccharide. Ngoài ra Ba kích còn chứa một số thành phần 

khác như: saponin, đường khử, acid hữu cơ [3][4][6]. 

STT 

1 

2 

3 

Nhóm hoạt chất 

Iridoid glycoside 

Anthranoid 

Polysaccharide 

Đặc điểm, đại diện 

Trong rễ của cây Ba kích đã tìm thấy các iridoid 

glycoside: asperulosid, monotropein, 

morofficinalosid, acid deacetyl asperulosidic, acid 

asperosidic, acelat apserulosid, morindolide. 

Các anthranoid phân lập được từ rễ cây Ba kích 

khá đa dạng:1-hydroxy-2-methylanthraquinone; 2- 

hydroxy-1-methoxyanthraquinone;<strong>rubiadin</strong>,physcion, 

1,3-dihydroxy-2-methoxyanthraquinone; 3-hydroxy- 

2-methylanthraquimone, digiferruginol,lucidin w- 

ethyl ether; anthraquinone-2-carboxylic acid, 

<strong>rubiadin</strong>-1-methylether,… 

Một số polysaccharid được tìm thấy trong rễ cây 

Ba kích như: nystose, fructofuranosylnystose, inulintype 

hexasaccharide, inulin-type heptasaccharid, 

sucrose, inulin-type trisaccharid, inulotriose, 

inulotretrose, inulopentose, 1-ketose, arabinose, 

galactose, galacturonic acid, acidic polysaccharide… 

1.1.5.2. Nhóm anthranoid 

Đặc điểm[1] 

3

Đây là nhóm hoạt chất có vai trò quan trọng trong dược liệu Ba kích, thành 

phần rất phong phú, 90% hoạt chất thuộc nhóm này có khung 9,10-anthraquinone. 

Đặc điểm, tính chất nhóm anthraquinone: 

- Có màu từ vàng, vàng cam đến đỏ. 

- Dễ thăng hoa.Có thể lợi dụng tính chất này để <strong>định</strong> tính bằng phản ứng vi 

thăng hoa trên lam kính. 

- Tồn tại trong ở dạng tự do và dạng glycoside. Dạng glycoside dễ tan 

trong nước, 

dạng tự do thì tan trong các dung môi hữu cơ. 

- Các anthraquinone 

phát huỳnh quang dưới UV (365nm) cho huỳnh quang 

tím hoặc đỏ nâu. 

- Các anthraquinone có nhóm –OH ở vị trí α có tính acid yếu hơn 

anthraquinone có –OH ở vị trí β. 

- Các anthraquinone tan trong dung dịch NaOH, carbonat và 

hydrocarbonat. 

- Các dẫn chất 1,8-dihydroxy anthraquinone trong dung dịch kiềm tạo 

phenolat có màu đỏ, dưới UV (365nm) cho huỳnh quang tím hoặc đỏ 

nâu. 

- Dẫn chất oxyanthraquinone có ít nhất một nhóm OH α thì cho màu với 

magie acetat trong cồn. Màu đậm nhạt phụ thuộc vào vị trí của nhóm OH 

khác, dẫn chất 1,2-dihydroxy cho màu tím; 1,4-dihydroxy cho maù tía, 

còn 1,6-dihydroxy và 1,8-dihydroxy cho màu đỏ cam. 

Một số anthraquinone 

đã phân lập được trong dược liệu Ba kích 

Hoạt chất 

Công thức cấu tạo 

4

Rubiadin: 

- Công thức phân tử: C 15 H 10 O 4 . 

- Tên khoa học: 1,3-dihydroxy-2-methylanthracene- 

9,10-dione. 

Rubiadin-1-methyl ether: 


- Tên khoa học: 3-hydroxy-1-methoxy-2- 

methylanthracene-9,10-dione. 

Physcion: 


- Tên khoa học: 1,8-Dihydroxy-3-methoxy-6-methyl- 

9,10-anthrachinon. 

1,2-dihydroxy-3-methyl-anthracene-9,10-dione: 

- Công thức phân tử:C 

15 H 10 O 4 

. 

Alizarin 

- Công thức phân tử: C 14 H 8 O 4 

- Tên khoa học: 1,2-Dihydroxyanthracene-9,10-dione 

1.1.6. Tác dụng dược lý 

a. Tác dụng tăng lực 

Trong một <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> khi cho chuột dùng dịch chiết nước 

Ba kích với liều 5- 

10g/kg cơ thể dùng liên tiếp 7 ngày thì thấy có tăng sức dẻo dai. 

5

Trong một <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> khác, khicho chuột uống dịch chiết nước Ba kích với 

liều 15-20g/kg cơ thể bằng đường uống trước khi tiêm NH 4 Cl thì thấy Ba kích có 

tác dụng tăng sức đề kháng chung của cơ thể với các yếu tố độc hại. 

Từ kết quả của 2 thí nghiệm trên chứng tỏ Ba kích có tác dụng bồi bổ cơ 

thể[18][41]. 

b. Tác dụng trên nội tiết 

Một <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> được tiến hành trên chuột cống đực cho thấyBa kích không có 

tác dụng kiểu androgen, nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của 

androgen hoặc tăng cường quá trình chế tiết hoocmon androgen. Ba kích làm tăng 

trọng <strong>lượng</strong> tinh hoàn, cơ nâng hậu môn và túi tinh còn trọng <strong>lượng</strong> tuyến tiền liệt 

không thay đổi đáng kể[6][38]. 

c. Tác dụng trên xương 

Anthraquinon và polysaccharid có liên quan đến việc điều chỉnh cũng như 

tăng cường sự hình thành xương, tăng sinh tế bào tạo xương in vivo, có tác dụng 

trong ngăn ngừa và điều trị bệnh liên quan đến sự tiêu xương. 

Các polysaccharid: có tác dụng bảo vệ, chống mất xương, chống oxy hóa do 

tăng hoạt tính của các enzym chống oxy hóa của cơ thể, làm giảm <strong>lượng</strong> MDA 

(Malodialdehyd) trong chuột cống thử nghiệm. So sánh với chuột được kiểm soát 

bình thường, Polysaccharid làm tăng sự xuất hiện của các gen như BMP-2, Cbfal, 

Rrankl, rOPG, rPPARγ2 mARN. Các gen này đều đóng vai trò quan trọng trong sự 

phát triển, trao đổi chất của xương và sụn [43][14][23][29. 

Ba hợp chất anthraquinone: 1, 3, 8-trihydroxy-2-methoxy-anthraquinone; 2- 

hydroxy-1-methoxy-anthraquinone và <strong>rubiadin</strong> được chứng minh là có tác dụng bảo 

vệ xương khi cắt bỏ buồng trứng ở chuột. Chúng làm giảm các lỗ rò do tiêu xương, 

làm giảm <strong>lượng</strong> tế bào hủy xương đa nhân, ức chế tartrate resistant acid 

phosphates(TRAP), enzym cathepsin K, thụ thể calcitonin (CTR) và carbonic 

anhydrase II (CAII) là những thành phần đặc hiệu cho hoạt động của tế bào hủy 

xương. Ngoài ra, ba hợp chất này còn có tác dụng chặn tín hiệu cho tế bào hủy 

xương của NK- B (nuclear factor kappa B) và JNK (c-Jun N-terminal inases) đồng 

6

thời điều chỉnh tỉ lệ OPG/RANKL (Osteopro-tegerin / receptor activator of NF- 

ligand) của tế bào tạo xương [15][30]. 

B 

d. Tác dụng chống viêm 

Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng với mô hình gây phù bàn 

chân chuột bằng nhũ dịch kaolin 10%, Ba Kích được dùng với các liều <strong>lượng</strong> 5g, 

10g và 20g/ kg cơ thể tiêm dưới da trước khi gây phù. Kết quả cho thấy Ba kích có 

tác dụng chống viêm rõ rệt. 

e. Hạ đường huyết và giảm stress 

Dịch chiết cồn Ba Kích có tác dụng hạ đường huyết và giảm stress oxy hóa 

trên chuột cống đái tháo đường giúp ngăn ngừa các biến chứng của đái tháo đường. 

Ba Kích có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại stress oxy hóa trên tế bào Leydig TM3 

gây bởi hydrogen peroxide[21][24][26]. 

Oligosaccharid: có tác dụng chống trầm cảm, chống tổn thương tế bào thần 

kinh do corticosteron, có rất nhiều thử nghiệm lâm sàng chứng minh viên nang 

oligosaccharid từ Ba kích có thể chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa, hiệu 

quả chữa trị tương đương với fluoxetin hydrochlorid, phản ứng phụ rất ít và nhẹ, có 

thể áp dụng trong chữa trị chứng trầm cảm mức độ nhẹ và vừa [17]. 

Năm hợp chất có tác dụng chống trầm uất: acid succinic, nystose, 1-Ffructosefuranosylnystose, 

hexasaccarid và heptasaccarid [11]. 

f. Tác dụng dự phòng thiếu máu cục bộ 

Với cơ chế ngăn chặn quá trình tang calci quá mức và các gốc oxy tự do, Ba 

kích có vai trò dự phòng thiếu máu cục bộ. Tác dụng này đã được chứng minh qua 

<strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> quan sát ảnh hưởng của Ba Kích đối với tổn thương thiếu máu cục bộ - 

tái tưới máu cơ tim chuột cống trắng16]. 

g. Liều độc 

LD 50 xác <strong>định</strong> trên chuột nhắt trắng bằng đường uống của Ba kích là 193g/kg. 

Như vậyBa kích có độc tính rất thấp [12]. 

1.2. Tình hình <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> đánh giáDược liệu Ba kích 

7

1.2.1. Tiêu chuẩn Dược điển 

a. Chuyên luận Ba Kích dược điển Việt Nam IV[5]. 

- Định tính: 

Lấy 0,10-0,20g bột dược liệu, tiến hành vi thăng hoa sẽ được tinh thể màu 

vàng. Khi thêm dung dịch kiềm, sẽ ngả màu đỏ tím. 

Đun sôi 0,10 g bột dược liệu với 1 ml dung dịch NaOH và 9 ml nước, rồi lọc. 

Thêm HCl cho đến phản ứng hơi acid và 10 ml ether ethylic, lắc. Lớp ether sẽ 

nhuộm màu vàng. Gạn riêng lớp ether, thêm 5 ml dung dịch amoniac, lắc, lớp dung 

dịch amoniac sẽ nhuộm màu đỏ tím bền vững. 

- Sắc ký lớp mỏng: 

Bản mỏng: Silicagel G 

Hệ dung môi khai triển: Ether dầu: ethylacetat: acid acetic băng (7,5:2,5:0,25) 

Dung dịch thử: Lấy khoảng 5 g dược liệu thêm 10 ml nước, lắc để nước thấm 

đều dược liệu, để yên 15 phút, nghiền dược liệu trong cối sứ thành bột ướt, thêm 40 

ml MeOH, cho vào bình cầu miệng mài, đun sôi hồi lưu trên cách thủy trong 30 

phút, lọc, làm bay hơi dung môi đến cạn. Thêm 5 ml nước và 20 ml ether dầu hỏa, 

lắc khoảng 3 - 5 phút, để lắng, gạn lấy phần dịch chiết, làm bay hơi hết dung môi. 

Hòa cắn trong 2 ml MeOH làm dung dịch thử. 

Dung dịch đối chiếu: Lấy 5 g dược liệu Ba kích (mẫu chuẩn) và tiến hành như 

đối với dung dịch thử. 

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl dung dịch đối chiếu và 

dung dịch đối chiếu. Sau khi triển khai, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí, 

phun dung dịch kali hydroxyd trong EtOH. Sắc ký đồ của dung dịch thử phải có các 

vết (2 - 3 vết) màu đỏ, cùng màu sắc và giá trị R f với các vết trên sắc ký đồ của 

dung dịch đối chiếu. 

- Độ ẩm: không quá 15% 

- Tỷ lệ vụn nát: không quá 5% 

8

- Tạp chất: không quá 1% 

- Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính dưới 3mm: không được có 

- Lượng chất gỗ: không nhiều hơn 35% 

b. Chuyên luận Ba Kích dược điển Trung Quốc[16]. 

- Định tính: 

Cân 2,5g bột dược liệu, thêm 25ml EtOH, đun hồi lưu cách thủy trong 1 giờ, 

để nguội, lọc. Bốc hơi dung môi đến khi còn khoảng 1ml làm dung dịch thử. Chuẩn 

bị một dung dịch chuẩn đối chiếu với 2,5g bột dược liệu Ba kích chuẩn trong điều 

kiện tương tự như chuẩn bị dung dịch thử. 

Bản mỏng: Silicagel GF 254 

Dung môi khai triển: Toluen : ethylacetat : acid formic (8:2:0,1) 

Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl dung dịch chuẩn và dung dịch 

thử. Sau khi khai triển sắc ký, sấy khô, kiểm tra các vết dưới đèn tử ngoại 254nm. 

Mẫu thử phải có các vết với vị trí và màu sắc tương tự như các vết có trong mẫu 

chuẩn. 

- Độ ẩm: không quá 15% 

- Tỷ lệ vụn nát: không quá 5% 

- Tạp chất: không quá 1% 

- Tỷ lệ dược liệu xơ, hóa gỗ, đường kính dưới 3mm: không được có 


- Hàm <strong>lượng</strong> các kim loại: 

+ Chì: không nhiều hơn 5 ppm 

+ Arsen: không nhiều hơn 3 ppm 

+ Cadimi: không nhiều quá 0,3 ppm 

+ Sulfur dioxide: không quá 0,2 ppm 

+ Thủy ngân: không quá 0,2 ppm 

- Dư <strong>lượng</strong> thuốc trừ sâu: Tổng DDT: không quá 0,1 ppm, tổng BHC 

không quá 0,2 ppm, tổng aldrin không quá 0,01ppm, endrin: không quá 

0,01ppm 

9

- Tiêu chuẩn về hàm <strong>lượng</strong> nystose: 

Điều kiện khai triển sắc ký: 

Cột: C 18 

Pha động: MeOH-Nước (3:97) 

Detector: ELSD (tán xạ bay hơi) 

Số <strong>lượng</strong> đĩa cột ít nhất là 2000 

Thể tích tiêm mẫu: 10 µl 

Yêu cầu: Hàm <strong>lượng</strong> nystose ít nhất là 2%. 

c. Chuyên luận Ba kích dược điển Hàn Quốc[22] 

- Sắc ký bản mỏng: 

Cân 2,0g bột dược liệu, thêm 15ml EtOH, đun hồi lưu cách thủy trong vòng 1 

giờ, lọc. Bốc hơi dung môi, thu cắn. Hòa tan cắn trở lại bằng 1ml EtOH. Dung dịch 

này được sử dụng làm dung dịch thử. 

Bản mỏng: Silicagel G 

Hệ dung môi khai triển: hexan:ethylacetat (3:2) 

Tiến hành chấm lên bản mỏng 10µl dung dịch thử, khai triển sắc ký. Bản 

mỏng sau khi khai triển được làm khô trong không khí, hiện màu bằng acid sulfuric 

và đốt ở 105 o C trong 10 phút. 

Yêu cầu: Có vết màu tím xuất hiện ở giá trị R f khoảng 0,6. 


- Hàm <strong>lượng</strong> các kim loại nặng: 

+ Chì: không nhiều hơn 5 ppm 

+ Arsen: không nhiều hơn 3 ppm 

+ Cadimi: không nhiều quá 0,3 ppm 

+ Thủy ngân: không quá 0,2 ppm 

- Dư <strong>lượng</strong> thuốc trừ sâu: 

+ Tổng DDT: không quá 0,1 ppm. 

+ Tổng BHC không quá 0,2 ppm 

10

+ Tổng aldrin không quá 0,01ppm, endrin: không quá 0,01ppm, diedrin 

không quá 0,01ppm 

- Sulfur dioxide không quá 30ppm. 

- Mất khối <strong>lượng</strong> do làm khô không quá 13%. 

- Hàm <strong>lượng</strong> tro không quá 6%. 

- Hàm <strong>lượng</strong> acid không tan không quá 1%. 

- Hiệu suất chiết với EtOH pha loãng kgoong nhở hơn 52%. 

1.2.2. Tại Việt Nam 

Hiện tại ở Việt Nam đã có một số công trình <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> kiểm nghiệm Ba kích 

như: Nghiên <strong>cứu</strong> tiến hành đánh giá Ba kích tím ở Ba Chẽ, Quảng Ninh, bước <strong>đầu</strong> 

<strong>xây</strong> <strong>dựng</strong> tiêu chuẩn cho Ba kích Quảng Ninh, tuy nhiên <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> này chỉ mới 

dừng lại ở mức độ <strong>định</strong> tính. Công trình <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> phân lập và <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

monotropein trong Ba kích ở cấp độ luận văn thạc sĩ thực hiện trên Ba kích trồng tại 

Bắc Giang đã chiết xuất, phân lập, tinh chế và xác <strong>định</strong> được hàm <strong>lượng</strong> 

monotropein [8][9] bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC với các điều kiện: 

- Cột sắc ký Rp 18 (4,6mm x 250mm, 5µm) 

- Detector DAD, tốc độ dòng 1ml/phút 

- Thể tích tiêm 10µl. 

- Nhiệt độ cột 25 o C 

- Hệ dung môi pha động: MeOH:H 3 PO 4 0,5% (5:95). 

- <strong>Bước</strong> sóng phát hiện: 237nm 

Kết quả phân lập được monotropein trong Ba kích với hiệu suất 0,05mg/g dược 

liệu. 

1.2.3. Trên thế giới 

Trên thế giới đã có nhiều <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> về phân lập, <strong>định</strong> tính và <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> nhóm 

chất trong dược liệu Ba kíchnhư sau[20][35][39][42][44][39] 

Thứ nhất: Nghiên <strong>cứu</strong> phân lập và <strong>định</strong> tính anthranoid trên các mẫu Ba kích 

Trung Quốc bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC kết hợp với một HSCCC. Phương <strong>pháp</strong> 

11

HPLC sử dụng cột C18(150mm × 4,6mm, 5µm), pha động MeOH-Acid acetic 1% 

theo gradient: 

Thời gian (phút) 

0-25 

MeOH (%) Acid acetic 1% (%) 

55%-75% 45-25% 

Nghiên <strong>cứu</strong> này đã phân lập được 5 anthranoid gồm: 

(1) alizarin-1-methylether 

(2) 1,2-dimethoxy-3-hydroxyanthraquinone 

(3) 1-hydroxy-3-hydroxymethylanthraquinone 

(4) <strong>rubiadin</strong>-1-methylether 

(5) anthragallol-2-methylether 

Thứ hai: Nghiên <strong>cứu</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> so 

màu ở bước sóng 509nm được thực hiện trên các mẫu dược liệu Trung Quốc đã xác 

<strong>định</strong> được hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần là 0,023%. 

Thứ ba: Nghiên <strong>cứu</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> anthranoid bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC sử dụng 

cột C18(250mmx4,6mm, 5µm), hệ pha động: dung môi A: ACN; dung môi B: dung 

dịch acid phosphoric 0,2% với gradient: 

Thời gian (phút) Dung môi A (%) Dung môi B (%) 

0-15 

15-35 

35-80 

5%-30% 95%-70% 

30%-40% 70%-60% 

40%-80% 60%-20% 

Nghiên <strong>cứu</strong> được thực hiện trên các mẫu Ba kích Trung Quốc cho kết quả hàm 

<strong>lượng</strong> 4 hoạt chất thuộc nhóm anthraquinone có trong dược liệu Ba kích gồm: 

(1) 2-hydroxy-3-hydroxymethethyl-anthraquinone: 0,84µg/g-111,15 µg/g. 

(2) 2-hydroxy-1-methoxyanthraquinone: 3,67 µg/g- 211,57 µg/g. 

12

(3) Rubiadin-1-methyl ether: 1,94 µg/g- 98,56 µg/g. 

(4) Rubiadin: 0,78 µg/g- 21,53 µg/g. 

Thứ 4: : Nghiên <strong>cứu</strong> xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> 7 hoạt chất oligosaccharide. Nghiên 

<strong>cứu</strong> đã dùng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với bản mỏng silica gel 

60, hệ dung môi khai triển: n-butanol-isopropanol-nước-acetic acetic acid (7:5:2:1, v/v). 

Sau khai triển cho kết quả phân tách tốt 6 inulin-type oligosaccharide và cho kết quả 

bán <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 6 loại oligosaccharide (DP3-DP9): DP3: 1.77%-10.94%, DP4: 

5.07%-32.31%, DP5: 7.54%-35.53%, DP6: 9.37%-41.09%, DP7: 9.36%-36.36%, 

DP8: 12.74%-48.75%, 48.75%, DP9: 5.34%-21.72%. 

Thứ 5: Nghiên <strong>cứu</strong> <strong>định</strong> tính oligosaccharide bằng HPLC với cộtcyclobond I 

2000, pha động: ACN-nước (65:35), tốc độ dòng: 0.4 mL/phút, thể tích tiêm: 10µl. 

Trên sắc ký đồ có các pic đặc trưng của 11 inulin-type oligosaccharide (DP1- 

DP11). 

1.3. Rubiadin 

1.3.1. Công thức cấu tạo 

1.3.2. Tác dụng dược lý 

Rubiadin có nhiều tác dụng dược lý đã được chứng minh như tác dụng chống 

oxi hóa, tác dụng kháng nấm, tác dụng ức chế tế bào ung thư, chống loãng xương và 

bảo vệ tế bào gan [37][28][15][31][34][30]. 

a. Tác dụng chống oxi hóa 

13

Rubiadinđược chứng minh có khả năng chống lại sự peroxyd hóa lipid gây ra 

bởi FeSO 4 và t-butylhydroperoxyd (tBHP) và khả năng này tốt hơn EDTA, vitamin 

E, p-benzoquinone [34]. 

b. Tác dụng ức chế tế bào ung thư 

Rubiadin đã được chứng minh có khả năng gây độc đối với tế bào ung thư 

người. Có thể xem <strong>rubiadin</strong> như là một chất độc quang học tự nhiên chống lại tế bào 

ung thư [31]. 

c. Tác dụng trên xương 

Rubiadin được chứng minh là có tác dụng bảo vệ xương khi cắt bỏ buồng 

trứng ở chuột. Chúng làm giảm các lỗ rò do tiêu xương, làm giảm <strong>lượng</strong> tế bào hủy 

xương đa nhân, ức chế tartrate resistant acid phosphates (TRAP), enzym cathepsin 

K, thụ thể calcitonin (CTR) và carbonic anhydrase II (CAII) là những thành phần 

đặc hiệu cho hoạt động của tế bào hủy xương. Ngoài ra, ba hợp chất này còn có tác 

dụng chặn tín hiệu cho tế bào hủy xương của NK- B (nuclear factor kappa B) và 

JNK (c-Jun N-terminal inases) đồng thời điều chỉnh tỉ lệ OPG/RANKL (Osteoprotegerin 

/ receptor activator of NF- B ligand) của tế bào tạo xương [15][30]. 

d. Tác dụng bảo vệ tế bào gan 

Rubiadin có khả năng bảo vệ tế bào gan, làm giảm tỉ lệ phá hủy tế bào gan 

dưới tác nhân CCl 4 ở chuột cống khi dùng 1 lần trên ngày trong 14 ngày liên tiếp 

[37]. 

1.3.3. Sự phân bố<strong>rubiadin</strong> trong chi Morinda 

Rubiadin rất phổ biến trong chi Morinda, đã được tìm thấy trong Morinda 

citrifolia, Morinda jasminoides, Morinda lucida, Morinda umbellata, Morinda 

officinalis, Morinda elliptica[1]. 

14

Riêng trong Morinda officinalis, đã có <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> hàm <strong>lượng</strong> 

<strong>rubiadin</strong> có trong các mẫu Trung Quốc: 0,78 µg/g – 21,53 µg/g. Trong khi đó các 

anthraquinon khác được <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> đồng thời có hàm <strong>lượng</strong> là: 

- 2-hydroxy-3-hydroxymethethyl-anthraquinone: 0,84µg/g-111,15 µg/g 

- 2-hydroxy-1-methoxyanthraquinone: 3,67 µg/g- 211,57 µg/g 

- Rubiadin-1-methyl ether: 1,94 µg/g- 98,56 µg/g 

Nhận xét: Rubiadin là một trong những hoạt chất quan trọng thuộc nhóm 

anthranoid trong dược liệu Ba kích. Rubiadin đã được chúng minh có nhiều tác 

dụng dược lý như chống oxy hóa, bảo vệ xương, bảo vệ tế bào gan, ức chế tế bào 

ung thư. Riêng trong dược liệu Ba kích đã có <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> tiến hành <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

<strong>rubiadin</strong> trên các mẫu Ba kích Trung Quốc và cho kết quả<strong>rubiadin</strong> có tỉ lệ đáng kể 

so với các anthraquinone khác. 

Những <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> hoạt chất của dược liệu Ba kích chưa công bố 

nhiều. Cùng với với sự phổ biến và nhu cầu lớn của dược liệu ba kích trên thị 

trường hiện nay, nên chúng tôi tiến hành đề tài “<strong>Bước</strong> <strong>đầu</strong> <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong> 

<strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> anthranoid trong dược liệu Ba kích bằng HPLC”, với 

mục tiêugóp phần tìm hiểu về dược liệu Ba kích trên thị trường Việt Nam trên tiêu 

chí <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> nhóm anthranoid, nhóm hoạt chất chính trong Ba kích.Trong <strong>nghiên</strong> 

<strong>cứu</strong> này, chúng tôi <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> (như là marker) 

bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC, và đồng thời tiến hành <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần 

theo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đo quang phổ hấp thụ UV-VIS. 

15

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 

2.1. Đối tượng <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> 

Ba kích do hợp tác xã Toàn Dân, xã Thanh Lâm, huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng 

Ninh cung cấp, 2 mẫu Ba kích thu mua tại cơ sở buôn bán dược liệu xã Ninh Hiệp, 

quận Gia Lâm, Hà Nội và 2 mẫu Ba kích thu mua tại các cơ sở buôn bán dược liệu 

phố Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội, 1 mẫu Ba kích Trung Quốc do công ty 

rượu Hà Nội cung cấp. 

Các mẫu được đánh số, dùng để chiết xuất và xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong>anthranoid 

toàn phần và hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong>. 

Mã số 

Mẫu thử 

1 Mẫu Ba kích Trung Quốc do công ty rượu Hà Nội cung cấp 

2 Mẫu Ba kích tại cơ sở 24 Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội 

3 Mẫu Ba kích tại cơ sở 67 Lãn Ông, quận Hoàn Kiếm, Hà Nội 

4 Mẫu Ba kích 2,5 năm tuổi hợp tác xã Toàn Dân, xã Thanh Lâm, huyện Ba 

Chẽ, tỉnh Quảng Ninh. 

5 Mẫu Ba kích tại quầy thuốc YHCT, xóm 9, xã Ninh Hiệp, Gia Lâm, Hà 

Nội 

6 Mẫu Ba kích tại quầy thuốc Liên Khanh, xóm 8, xã Ninh Hiệp, Gia Lâm, 

Hà Nội 

2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất. 

Trang thiết bị và dụng cụ: 

Trong quá trình <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong>, chúng tôi đã sử dụng các thiết bị, dụng cụ gồm: 

Máy HPLC Shimazu (Nhật Bản), cột sắc ký C18 Waters (150mm x 4,6mm, 5µm), 

cân phân tích Sartorius, cân hàm ẩm, máy đo quang Shimazu, tủ sấy, tủ hốt, tủ bảo 

quản lạnh, máy lắc siêu âm, nồi cách thủ, máy cất quay chân không, bộ dụng cụ 

sinh hàn, máy soi huỳnh quang, máy chấm sắc ký tự động, bộ lọc dung môi màng 

lọc 0,45µm, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác. 

16

Dung môi, hóa chất: 

Các hóa chất, thuốc thử dùng trong <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> gồm:<strong>rubiadin</strong> (ChemFaces – 

CFN99270), phycsion (Chengdu Biopurify Phytochemical – 15061509), emodin 

(ChemFaces - CFN98834), tectoquinon (ChemFaces), EtOH 96% (Merk), MeOH 

(Merk-PA), natri hydroxyd (công ty hóa chất Đức Giang), bản mỏng silicagel 

(Merk), ethylacetat (Trung Quốc), toluene (Trung Quốc), acid formic (Sigma-PA), 

acid sulfuric (Trung Quốc), ACN (Sigma-PA), acid phosphoric (Merk-PA), thuốc 

thử Fehling, natri carbonat, amoniac, chloroform, thuốc thử Mayer, thuốc thử 

Dragendoff, thuốc thử Bouchardat, đồng sulfat (Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất), 

acid acetic (Trung Quốc), acid hydrochloric (Trung Quốc), ether (Trung Quốc), 

nước RO, nước cất hai lần… 

2.3. Nội dung <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> 

Áp dụng các <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> tính đã được khảo sát qua các tài liệu, xác 

<strong>định</strong> sự có mặt của một số nhóm nhất trong Ba kích. 

Áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> quang phổ UV-VIS để xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> 

anthranoid toàn phần. 

Khảo sát điều kiện sắc ký với HPLC để phân tích <strong>rubiadin</strong> trong Ba kích 

Thẩm <strong>định</strong> các điều kiện <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong Ba kích Quảng Ninh. 

Áp dụng đểxác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong các mẫu Ba kích.So sánh 

hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> giữa Ba kíchQuảng Ninh với các mẫu Ba kích trên thị 

trường.So sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> với hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần. 

2.4. Phương <strong>pháp</strong> <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> 

2.4.1. Định tính các nhóm chất hóa học. 

a. Chuẩn bị mẫu 

Ba kích tươi rửa sạch, bỏ lõi đem sấy ở nhiệt độ 60 o C đến khô theo tiêu chuẩn 

DĐVN IV, Ba kích khô đem sấy ở 60 o C trong 24 giờ, sau đó kiểm tra dược liệu 

theo các tiêu chuẩn trong chuyên luận Ba kích-DĐVN IV. Xay lấy bột để tiến hành 

phân tích. 

17

. Định tính các nhóm chất bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> hóa học [1] 

Nhóm anthranoid: 

Phản ứng Borntraeger: 

- Định tính anthranoid toàn phần: 

Tiến hành: Lấy 1g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10ml), thêm 5ml 

dung dịch H 2 SO 4 1N, đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi khoảng 15 phút. Lọc 

nóng, thu dịch lọc vào bình gạn, để nguội. Thêm 5ml ether, lắc nhẹ, gạn lấy lớp 

ether. Lấy 1ml dịch chiết ether, thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp nước 

sẽ có màu đỏ sim. 

- Định tính anthranoid tự do: 

Tiến hành: Lấy 1g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn (10ml), thêm 5ml nước 

cất. Đun trực tiếp trên nguồn nhiệt đến sôi. Lọc nóng, thu dịch lọc vào bình gạn. 

Thêm 5ml ether. Lắc nhẹ, gạn lấy lớp ether. Lấy 1ml dịch chiết ether vào ống 

nghiệm nhỏ. Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp nước sẽ có màu đỏ sim. 

Định tính iridoid 

Pha thuốc thử Trim Hill:Hút khoảng 10ml CH 3 COOH vào bình nón, thêm 1ml 

dung dịch CuSO 4 0,2% và 0,5ml HCl đặc, lắc đều. 

Tiến hành:Cân khoảng 1g bột dược liệu, thêm 5ml dung dịch HCl 1%, lắc đều, 

để yên 2 giờ. Lấy 0,1ml dịch chiết, thêm 1ml thuốc thử Trim Hill, đun cách thủy. 

Dung dịch chuyển sang màu xanh dương. 

Định tính đường khử 

Tiến hành: Cân khoảng 2g bột dược liệu, thêm 10ml nước, đun sôi 10 phút, 

lọc lấy dịch chiết. Thêm thuốc thử Fehling, đun cách thủy 5 phút, sẽ có kết tủa đỏ 

gạch. 

Định tính saponin 

Quan sát hiện tượng tạo bọt: 

18

Tiến hành: Cân khoảng 1g bột dược liệu, thêm 10ml nước, đun cách thủy 

trong 10 phút, lọc thu dịch lọc vào một ống nghiệm to. Thêm nước đến khoảng 

10ml. Bịt ống nghiệm bằng ngòn tay, lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 5 

phút. Để yên và quan sát cột bọt, thấy cột bọt bền trong 15 phút thì phản ứng dương 

tính. 

Định tính alcaloid 

Tiến hành: Cân khoảng 3g bột dược liệu, thêm 5ml dung dịch NH 3 , để yên 5 

phút. Thêm 20ml dung dịch CHCl 3 lắc đều, ngâm trong 1 giờ, lọc thu dịch lọc vào 

bình gạn. Lắc 3 lần, mỗi lần với 15ml dung dịch HCl 5%. Thu dịch chiết nước. 

Lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ổng khoảng 1ml dịch chiết. Lần lượt thêm 2-3 giọt 

thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff vào 3 ống nghiệm. 

Các phản ứng <strong>định</strong> tính trên đều được lặp lại 5 lần. 

c. Xác <strong>định</strong> sự có mặt của một số hoạt chất bằng TLC[15] 

Chuẩn bị dung dịch thử: cân khoảng 2g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 

khoảng 10ml EtOH. Đun hồi lưu cách thủy trong khoảng 30 phút. Để nguội thu dịch 

lọc, đem cô đến khi thu được dịch chiết để khai triển sắc ký. 

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn: Chuẩn bị các dung dịch chuẩn emodin, 

<strong>rubiadin</strong>, tectoquinon, phycsion có nồng độ 0,1mg/ml. 

- Bản mỏng Silicagel GF 254 đã hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ. 

- Hệ dung môi khai triển: Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (8:2:0,1). 

- Thuốc thử hiện màu: đèn tử ngoại bước sóng 365nm. 

Tiến hành chấm riêng biệt lên bản mỏng 10µl dung dịch thử và các dung dịch 

chuẩn emodin, <strong>rubiadin</strong>, tectoquinon, phycsion bằng hệ thống chấm sắc ký tự động. 

Sấy nhẹ cho khô, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Saukhi khai triển xong, 

sấy khô. Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm. 

19

2.4.2. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần trong Ba kích bằng <strong>phương</strong> 

<strong>pháp</strong> quang phổ hấp thụ UV-VIS 

a. Nguyên tắc 

Dựa vào tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> anthranoid theo 

nguyên tắc: anthranoid được tạo phức chelat với dung dịch magie acetat 0,5% trong 

MeOH. Xác <strong>định</strong> nồng độ anthranoid toàn phần thông qua nồng độ phức chelat 

bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> quang phổ hấp thụ UV-VIS [44]. 

b. Chuẩn bị dung dịch thử 

Cân chính xác khoảng 1g bột dược liệu. Tiến hành chiết Soxhlet với 150ml 

EtOH 80 o đến kiệt, bốc hơi dung môi, thu cắn. Thêm 10ml hỗn hợp CH 3 COOH 

băng + HCl 25% (10:21), siêu âm trong 5 phút. Thêm 10ml CHCl 3 , đun hồi lưu 

trong 30 phút, để nguội. Gạn lấy lớpCHCl 3 , tiếp tục lắc 3 lần vớiCHCl 3 , mỗi lần 

5ml. Gộp dịch chiết, bốc hơi dung môi thu cắn. Hòa tan cắn trở lại vào bình <strong>định</strong> 

mức 25ml bằng dung dịch Magie acetat 0,5% trong MeOH vừa đủ thu được dung 

dịch thử[44]. 

c. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 

Dung dịch chuẩn <strong>rubiadin</strong>:Cân chính xác khoảng 1mg <strong>rubiadin</strong> vào bình <strong>định</strong> 

mức 10ml, thêm 5ml MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, thêm MeOH đến vừa đủ 

thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1mg/ml. Từ dung dịch chuẩn gốc<strong>rubiadin</strong> 

0,1mg/ml, lấy chính xác một dãy các thể tích: 0,2ml; 0,4ml; 0,6ml; 0,8ml; 1mlvào 

cốc có mỏ nhỏ, cô lấy cắn. Hòa tan cắn trở lại bằng dung dịch Magie acteat 0,5% 

trong MeOH và chuyển sang bình <strong>định</strong> mức 5ml. Bổ sung vừa đủ dung dịch Magie 

acetat 0,5% trong MeOH thu được dãy dung dịch chuẩn [44]. 

d. Xây <strong>dựng</strong> đường chuẩn 

Tiến hành đo độ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn <strong>rubiadin</strong> tại bước sóng 501nm 

(PL 3) với dung dịch magie acetat 0,5% trong MeOH làm mẫu trắng, <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong> 

đường chuẩn. Mỗi dung dịch đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình[44]. 

20

e. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần 

Tiến hành đo độ hấp thụ UV-VIS các dung dịch thử với mẫu trắng là dung 

dịch magie acetat 0,5% trong MeOH tại501nm.Dựa vào đường chuẩn đã <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong>, 

tính toán xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần theo <strong>rubiadin</strong>. Mỗi mẫu thử lặp 

lại 3 lần, lấy kết quả trung bình [44]. 

2.4.3. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC 

a. Chuẩn bị dung dịch thử 

Lựa chọn điều kiện chiết xuất: 

Cân 1,500g bột dược liệu, thêm 50ml EtOH 50 o , 70 o và 96 o ,đun cách thủy ở 

80 o C trong 1 giờ. Thu dịch chiết, xác <strong>định</strong> và so sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong 

dược liệu theo từng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong>. Dung môi cho dịch chiết có hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> 

cao nhất được lựa chọn làm dung môi phân tích. 

Tiến hành cân 1,500g bột dược liệu, thêm 50ml dung môi đã lựa chọn, đung 

cách thủy ở 80 o C trong thời gian 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và 2 giờ. Thu dịch chiết, 

xác <strong>định</strong> và so sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong dược liệu theo từng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong>. 

Điều kiện được lựa chọn là điều kiện cho dịch chiết cóhàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> cao nhất. 

Chuẩn bị dung dịch thử:Cân chính xác 1,500g bột dược liệu, thêm 50ml dung 

môi đã lựa chọn. Cân tổng khối <strong>lượng</strong> bình. Đun cách thủy ở 80 o C trong thời gian 

đã lựa chọn, để nguội.Bổ sung EtOH vào bình <strong>định</strong> mức sao cho tổng khối <strong>lượng</strong> 

bình sau khi bổ sung bằng tổng khối <strong>lượng</strong> bình trước khi chiết, lắc đều.Thu dịch 

chiết làm dung dịch thử, dung dịch thử được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi 

tiêm sắc ký. 

b. Chuẩn bị dung dịch chuẩn 

Dung dịch chuẩn gốc<strong>rubiadin</strong>0,1mg/ml: Cân chính xác 1mg <strong>rubiadin</strong> vào các 

bình <strong>định</strong> mức 10ml, thêm 5ml MeOH, siêu âm đến tan hoàn toàn, bổ sung MeOH 

21

vừa đủ. Pha loãng dung dịch chuẩn gốc thu được dãy dung dịch có nồng độ trong 

khoảng 0,1 µg/ml đến 2µg/ml để tiến hành phân tích và thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong>. 

c. Khảo sát tìm điều kiện sắc ký 

Chọn cột sắc ký 

Vì lý do điều kiện cơ sở vật chất tại nơi làm thực nghiệm chỉ có cột C18 

Waters (150mm x 4,6 mm, 5 µm). Do vậy chúng tôi tiến hành khảo sát các điều 

kiện sắc ký với loại cột này. 

Dung môi pha động 

Chúng tôi tiến hành khảo sát dung môi pha động: 

MeOH (%) ACN (%) H 3 PO 4 0,1% (%) 

Hệ pha động 1 85 15 



Hệ pha động 4 42,5 42,5 15 

Hệ pha động 5 56,7 26,3 15 

Pha động được lựa chọn dựa trên thời gian lưu và độ cân đối của pic <strong>rubiadin</strong> 

trên SKĐ. Độ cân đối được thể hiện qua hệ số bất đối của pic sắc ký và được tính 

theo công thức: W 1/20 . 

= W / 

2 

Trong đó: W 1/20 : Độ rộng của pic sắc ký ở độ cao 1/20, : khoảng cách từ chân 

đường cao hạ từ đỉnh pic sắc ký tới đường cong phía trước của pic ở độ cao 1/20. 

Yêu cầu: Hệ số bất đối phải nằm trong khoảng 0,8-2 [2][10][13]. 

22

Chọn bước sóng phát hiện 

Từ phổ hấp thụ của <strong>rubiadin</strong> (PL4) cho thấybước sóng hấp thụ cực đại của 

<strong>rubiadin</strong> là λ max =245nm, 277nm và 411nm. Trong đó, độ hấp thụ của <strong>rubiadin</strong> tại 

bước sóng 277nm lớn nhất, do đó chúng tôi lựa chọn bước sóng 277nm để phân 

tích. 

d. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trongBa kích Quảng Ninh 

Tiến hành thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> tính, <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> theo AOAC: độ đặc 

hiệu, tính thích hợp của hệ thống, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng, độ chính 

xác, giới hạn phát hiện, giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> [13]. 

Độ đặc hiệu 

Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như 

các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất.... Cụ thể, trong phép 

phân tích <strong>định</strong> tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt 

chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi 

có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích. Trong phép phân tích 

<strong>định</strong> <strong>lượng</strong>, là khả năng xác <strong>định</strong> chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh 

hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác. Tính đặc hiệu 

thường liên quan đến việc xác <strong>định</strong> chỉ một chất phân tích. 

Tiến hành: Tiêm lần lượt mẫu chuẩn và mẫu thử. Tiến hành khai triển theo các 

điều kiện đã khảo sát. Ghi lại sắc ký đồ (SKĐ). 

Yêu cầu: Trên SKĐ của mẫu thử phải cho pic với thời gian lưu tương ứng như 

pic của chất đó trên mẫu chuẩn. Phổ hấp thụ của chất đó trong mẫu thử và mẫu 

chuẩn phải tương ứng nhau. 

Độ thích hợp của hệ thống sắc ký 

Độ thích hợp của hệ thống sắc ký là độ chính xác của thiết bị, được xác <strong>định</strong> 

bằng cách đo lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đã được xử lý xong. 

23

Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần chất chuẩn đang khảo sát có nồng độ thích hợp, 

tiến hành khai triển sắc ký theo các điều kiện sắc ký đã khảo sát. Ghi SKĐ, xác <strong>định</strong> 

thời gian lưu, diện tích pic. Tính RSD% của diện tích pic và thời gian lưu. 

Yêu cầu: RSD thời gian lưu ≤ 1,0%; RSD diện tích pic ≤ 2,0%. 

Độ lặp lại 

Độ lặp lại là mức độ thống nhất giữa các kết quả thử riêng biệt theo quy trình 

thử nghiệm được áp dụng lặp đi lặp lại trên cùng một mẫu, được xác <strong>định</strong> bằng cách 

phân tích lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu thử nhưng các lần lặp lại phải được 

thực hiện từ thao tác <strong>đầu</strong> tiên đến thao tác cuối cùng của quá trình phân tích. 

Tiến hành:Chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình phân tích đã xác <strong>định</strong>. Xác <strong>định</strong> 

hàm <strong>lượng</strong> hoạt chất đang khảo sát trong 6 mẫu thử, xác <strong>định</strong> RSD của kết quả <strong>định</strong> 

<strong>lượng</strong>. 

Yêu cầu: RSD ≤ 2,0%. 

Khoảng tuyến tính 

Khoảng tuyến tính của một <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích là khoảng nồng độ ở đó có 

sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại <strong>lượng</strong> đo được và nồng độ chất phân tích. 

Tiến hành: Chuẩn bị một dãy chất chuẩn gồm 5 nồng độ tăng dần trong 

khoảng tuyến tính. Xác <strong>định</strong> sự phụ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng 

<strong>phương</strong> trình hồi quy tuyến tính. 

Yêu cầu: R>0,995. 

Độ đúng 

Độ đúng là mức độ gần sát của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá 

trị thực. 

Tiến hành: Tiến hành pha 1 dung dịch chuẩn và 5 dung dịch thử riêng biệt 

theo quy trình pha dung dịch thử và dung dịch chuẩn. Thêm vào mỗi mẫu thử một 

<strong>lượng</strong> chất chuẩn. Tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng đã khảo sát. Độ 

24

đúng sẽ được tính bằng tỉ lệ phần trăm giữa <strong>lượng</strong> chất đối chiếu được so với <strong>lượng</strong> 

chất đối chiếu thêm vào. 

Yêu cầu: Tỉ lệ phục hồi từ 98,0-102,0%. 

Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> (LOQ) 

LOD: Là nồng độ tối thiểu của chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 3 lần 

nhiễu đường nền (S/N=3/1). 

LOQ: Là nồng độ tối thiểu chất phân tích tại đó có tín hiệu bằng 10 lần nhiễu 

đường nền (S/N=10/1). 

Tiến hành:Pha loãng dần mẫu chuẩn bằng dung môi pha mẫu. Tiến hành phân 

tích các mẫu pha loãng này. Trên sắc ký đồ thu được, xác <strong>định</strong> đáp ứng pic tương 

ứng với mỗi nồng độ. Thiết lấp tỉ số S/N, từ đó xác <strong>định</strong> LOD và LOQ. 

e. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> 

Tiến hành khai triển sắc ký với dung dịch thử đã chuẩn bị, dựa vào đường 

chuẩn đã <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong>, tính toán xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong>. Mỗi mẫu thử tiến hành 

lặp lại 3 lần. 

2.5. Phương <strong>pháp</strong> xử lý số liệu. 

- Các số liệu được tính toán và xử lý bằng Microsoft excel 2016. 

- Kết quả được biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (µ= ̅ ± 

). 

- Tính RSD bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> thống kê: 

Giá trị trung bình: 

̅ = 1 × 

Độ lệch chuẩn: 

= ∑ ( − ̅) 

− 1 

25

Độ lệch chuẩn tương đối: 

(%) = × 100 ̅ 

Phương trình hồi quy tuyến tính bậc nhất thể hiện mối quan hệ giữa diện tích 

pic sắc ký và nồng độ chất phân tích, và mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ 

chất phân tích: y=ax +b, sử dụng phần mềm Microsoft excel để xử lý và vẽ đồ thị. 

26

CHƯƠNG 3:KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 

3.1. Xác <strong>định</strong> sự có mặt của một số nhóm chất trong Ba kích và một số hoạt 

chất nhóm anthranoid 

3.1.1. Kết quả xác <strong>định</strong> một số nhóm chất bằng phản ứng hóa học 

Tiến hành <strong>định</strong> tính các nhóm chất theo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đã trình bày ở mục 

2.4.1. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1. 

Bảng 3.1: Kết quả <strong>định</strong> tính một số nhóm chất trong Ba kích 

Mẫu thử Anthranoid Iridoid Saponin Alcaloid Đường khử 

1 +++ +++ 0 - ++ 

2 +++ +++ 0 - ++ 

3 +++ +++ 0 - ++ 

4 +++ +++ 0 - ++ 

5 +++ +++ 0 - ++ 

6 +++ +++ 0 - ++ 

Chú thích: (+++): Dương tính rất rõ 

(++): Dương tính rõ 

(0): Chưa rõ ràng (-): Âm tính. 

a. Nhóm anthranoid 

Ở hai thí nghiệm, <strong>định</strong> tính anthranoid tự do và anthranoid toàn phần, phản 

ứng chomàu đỏ sim rõ trên cả 6 mẫu. Kết quả dương tính rất rõ trên cả 6 mẫu.Như 

vậy anthranoid có thể có mặt trong cả 6 mẫu Ba kích. 

27

. Nhóm iridoid. 

Phản ứng với thuốc thử Trim Hill cho màu xanh dương rõ trên cả 6 mẫu. Kết 

quả dương tính trên cả 6 mẫu. Như vậy iridoid có thể có mặt trong cả 6 mẫu Ba 

kích. 

c. Đường khử 

Phản ứng đường khử với thuốc thử Fehling tạo tủa đỏ gạch trên cả 6 mẫu. Kết 

quả dương tính trên cả 6 mẫu. Như vậy đường khử có thể có mặt trong cả 6 mẫu Ba 

kích. 

d. Nhóm saponin 

Có hiện tượng tạo bọt trong phản ứng <strong>định</strong> tính nhóm saponin, tuy nhiên 

<strong>lượng</strong> bọt ít, cột bọt tồn tại trong thời gian 15 phút trên cả 6 mẫu. Kết quả không rõ 

ràng. Do vậy, chưa thể kết luận về sự có mặt của saponin trong các mẫu Ba kích. 

e. Nhóm alkaloid 

Trong cả 3 phản ứng với 3 loại thuốc thử, tất cả các mẫu đều không xuất hiện 

tủa, dung dịch trong suốt. Kết quả âm tính trên cả 6 mẫu. Các mẫu Ba kích không 

chứa alkaloid. 

Kết luận: Từ kết quả <strong>định</strong> tính cho thấy, Ba kích có thể chứa anthranoid, iridoid, 

đường khửvà không chứa alkaloid. Kết quả này phù hợp với các tài liệu tham khảo 

và các công bố trước đó. 

3.1.2. Xác <strong>định</strong> sự có mặt của một số hoạt chất nhóm anthranoid bằng TLC 

Tiến hành khai triển TLC theo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> trình bày ở mục 2.4.2 với các 

điều kiện: 

- Bản mỏng Silicagel F 254 đã hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ. 

- Hệ dung môi khai triển: Toluen – Ethyl acetat – Acid formic (8:2:0,1). 

- Thuốc thử hiện màu: Đem soi dưới đèn tử ngoại bước sóng 365nm. Quan sát 

huỳnh quang. 

28

Kết quả SKĐ được thể hiện ở hình 3.1. 

Hình 3.1: Sắc ký bản mỏng sau khi khai triển. 

Chú thích: Mẫuthử (1-6), <strong>rubiadin</strong> (7), phycsion (8),emodin (9),tectoquinon (10) 

Bảng 3.2: Giá trị R f của các chất chuẩn 

Rubiadin Phycsion Emodin Tectoquinon 

R f 0,78 0,95 0,73 0,93 

Nhận xét:Với thể tích chấm như nhau, trên SKĐ của mẫu 1 và mẫu số 4 có vết 

có màu sắc và giá trị R f tương úng với màu sắc và giá trị R f của <strong>rubiadin</strong> chuẩn. 

Trên SKĐ của cả 6 mẫu, không tìm thấy các vết có màu sắc và giá trị R f tương ứng 

với màu sắc và R f của phycsion, emodin, và tectoquinon.Do vậy có thể sơ bộ kết 

luận <strong>rubiadin</strong>có mặt trong các mẫu 1 và mẫu 4. 

Thêm vào đó từ kết quả <strong>định</strong> tính bằng HPLC (PL 1), trên SKĐ của các mẫu 

thử, đã phát hiện pic tương ứng với pic của <strong>rubiadin</strong>, không tìm thấy pic tương ứng 

29

với pic của emodin và phycsion. Từ đó chúng tôi quyết <strong>định</strong> lựa chọn <strong>rubiadin</strong>làm 

marker để <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> dược liệu Ba kích. 

3.2. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần trong Ba kích 

3.2.1. Chuẩn bị dung dịch sắc ký 

Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được chuẩn bị theo mục 2.4.2 thu 

đượcdung dịch chuẩn <strong>rubiadin</strong>là 0,1mg/ml 

3.2.2. Xây <strong>dựng</strong> đường chuẩn 

Tiến hành quét phổ UV-VIS của dung dịch <strong>rubiadin</strong> chuẩnđã chuẩn bị theo 

mục 2.4.2, trong khoảng bước sóng 400-800nm, với dung dịch Magie acetat 0,5% 

trong MeOH làm mẫu trắng. Dung dịch chuẩn <strong>rubiadin</strong>có đỉnh hấp thụ cực đại ở 

501nm (phụ lục 2). Chọn bước sóng 501nm để đo độ hấp thụ của các mẫu chuẩn 

<strong>rubiadin</strong>. Kết quả độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn emodin được ghi ở bảng 3.3. 

Bảng 3.3: Độ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn <strong>rubiadin</strong> 

Nồng độ (mg/ml) 0,004 0,008 0,012 0,016 0,020 

Độ hấp thụ 0,1203 0,2253 0,3458 0,4319 0,5426 

0.6 

0.5 

ĐỒ THỊ 

y = 25.765x + 0.0178 

R² = 0.9981 

ĐỘ HẤP THỤ 

0.4 

0.3 

0.2 

0.1 

0 

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 

NỒNG ĐỘ 

Hình 3.2.: Đồ thị thể hiện sự phụ thuốc của độ hấp thụ vào nồng độ <strong>rubiadin</strong> 

30

Nhận xét: Đường thẳng biểu thị mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ<strong>rubiadin</strong> 

và độhấp thụ: y = 25,765x + 0,0178, giá trị R = 0,999. 

3.2.3. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần 

Dung dịch thử được chuẩn bị theo mục 2.4.2. Tiến hành đo độ hấp thụ của các 

dung dịch ở bước sóng 501nm với dung dịch magie acetat 0,5% trong MeOH làm 

mẫu trắng. Kết quả được ghi trong bảng 3.4.. 

Bảng 3.4: Hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần của các mẫu thử 

Mẫu thử 1 2 3 4 5 6 

Hàm <strong>lượng</strong> 

anthranoid 

285,86 ± 

223,69 ± 

245,52 ± 

186,33 ± 

98,38± 

204,03 

toàn phần 

5,61 

5,20 

5,35 

3,76 

2,99 

± 4,94 

(µg/g) 

Nhận xét: Hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần trong các mẫu thử tính theo chuẩn 

<strong>rubiadin</strong>dao động từ 98,38 µg/g ÷285,86µg/g. 

3.3. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong Ba kích bằng HPLC 

3.3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và chuẩn bị các dung dịch sắc ký 

a. Khảo sát điều kiện chiết xuất 

Tiến hành khảo sát các điều kiện chiết xuất theo mục 2.4.3, kết quả được ghi ở 

bảng 3.5 và 3.6. 

Bảng 3.5: So sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> khi chiết ở các nồng độ EtOH khác nhau 

Nồng độ EtOH ( o ) 50 70 96 


<strong>rubiadin</strong> (µg/g) 

7,82 15,42 37,72 

31

Nhận xét: Hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> khi chiết với EtOH 96 o là cao nhất. Do đó lựa 

chon EtOH 96 o làm dung môi chiết. 

Bảng 3.6: So sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> khi chiết trong thời gian khác nhau. 

Thời gian (giờ) 0,5 1 1,5 2 


<strong>rubiadin</strong> (µg/g) 

35,12 37,68 37,21 33,85 

Nhận xét: Hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> khi chiết trong thời gian 1 giờ là cao nhất. Do 

vậy, lựa chọn thời gian chiết là 1 giờ. 

Kết luận:Từ kết quả khảo sát chúng tôi quyết <strong>định</strong> lựa chọn điều kiện chiết 

xuất là: dung môi EtOH 96 o , chiết cách thủy ở 80 o C trong 1 giờ. 

b. Chuẩn bị dung dịch sắc ký 

Dung dịch thử và dung dịch chuẩn đươc chuẩn mục 2.4.3. Dung dịch 

<strong>rubiadin</strong>chuẩn gốc có nồng độ 0,0340 mg/ml hay 340 (µ g⁄ ml). Dãy dung dịch 

chuẩn có nồng độ lần lượt là 1,700 µg/ml; 1,360 µg/ml; 0,919 µg/ml; 0,527 µg/ml; 

0,136 µg/ml. 

c. Lựa chọn pha động 

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát các hệ dung môi pha động đã nêu ở mục 2.4.3. 

Các điều kiện khác tương tự nhau: Cột C18 (150mm x 4,6mm; 5µm), tốc độ dòng 

1mL/phút, bước sóng phát hiện: 277nm, thể tích tiêm: 10µl, nhiệt độ cột: 25 o C. Kết 

quả như sau: 

Điều kiện thứ nhất: Pha động: MeOH:H 3 PO 4 0,1% (85:15). Chúng tôi tiến 

hành khảo sát trên mẫu <strong>rubiadin</strong> chuẩn, thu được pic sắc ký của <strong>rubiadin</strong> (hình 3.3), 

thời gian lưu t R =6,418 phút, có hiện tượng kéo đuôi. 

32

Hình 3.3: SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn với pha động MeOH:H 3 PO 4 0,1% (85:15) 

Điều kiện thứ hai:Pha động: MeOH:H 3 PO 4 0,1% (80:20). Tiến hành khảo sát 

trên mẫu <strong>rubiadin</strong> chuẩn, thu được pic sắc ký của <strong>rubiadin</strong> ở t R =8,529 phút (hình 

3.4), có hiện tượng kéo đuôi. 

Hình 3.4: SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn với pha động MeOH:H 3 PO 4 0,1% (80:20). 

Điều kiện thứ 3: 

Pha động: MeOH:H 3 PO 4 0,1% (70:30). Tiến hành khảo sát 

trên mẫu <strong>rubiadin</strong> chuẩn pha loãng trong dịch chiết dược liệu, thu được pic sắc ký 

của <strong>rubiadin</strong> ở t R =20,369 phút (hình 3.5). Pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi và thời 

gian lưu khá dài. 

33

Hình 3.5: SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn pha loãng trong dịch chiết dược liệu với pha 

động MeOH:H 3 PO 4 0,1% (70:30) 

Điều kiện thứ4: Pha động MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% (42,5:42,5:15). Tiến hành 

khảo sát trên mẫu <strong>rubiadin</strong> chuẩn pha loãng trong dịch chiết dược liệu, thu được pic 

sắc ký của <strong>rubiadin</strong> ở t R =4,322 phút (Hình 3.6). Pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi. 

Hình 3.6: SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn pha loãng trong dịch chiết dược liệu với pha động 

MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% (42,5:42,5:15). 

Điều kiện thứ 6: Pha động MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% (56,7:26,3:15). Tiến 

hành khảo sát với <strong>rubiadin</strong> chuẩn, thu được pic<strong>rubiadin</strong> ở t R =4,783 phút (Hình 

3.7),khá cân đối, hiện tượng kéo đuôi ít nhất so vớicác điều kiện đã khảo sát, thời 

gian lưu không quá dài. 

34

Hình 3.7: SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn pha loãng trong dịch chiết dược liệu với pha động 

MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% (56,7:26,3:15). 

Tiếp tục khảo sát trên mẫu thử số 4, chúng tôi thu được pic của <strong>rubiadin</strong> ở 

t R =4,804 phút, cân đối (Hình 3.8). 

Hình 3.8: SKĐ mẫu thử số 4 với pha động MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% 

(56,7:26,3:15). 

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát các hệ pha động 

Điều kiện 1 2 3 4 5 

t R (phút) 6,149 8,529 20,369 4,322 4,783 

Hệ số bất đối 1,25 1,17 1,14 1,17 1,13 

35

Nhận xét: Theo lý thuyết, hệ số bất đối đều đạt yêu cầu nằm trong khoảng 0,8- 

2 Như vậy cả 5 điều kiện đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên, trong 5 điều kiện, điều kiện 

thứ 5 cho AF=1,13 gần với pic lý tưởng nhất và thời gian lưu ngắn (t R =4,783). 

Kết luận: Pha động mà chúng tôi lựa chọn: MeOH:ACN:H3PO4 0,1% 

(56,7:26,3:15). 

d. Lựa chọn tốc độ dòng 

Qua các tài liệu tham khảo chúng tôi nhận thấy, tốc độ dòng 1mL/phút thường 

được sử dụng để phân tích các chất nhóm anthranoid trong nhiều dược liệu. Chúng 

tôi tiến hành khảo sát tốc độ dòng 1mL/phút, thu được pic sắc ký của <strong>rubiadin</strong> cân 

đối, thời gian lưu ngắn (t R-Rubiadin chuẩn = 4,8 phút). Dó đó chúng tôi lựa chọn tốc độ 

dòng 1mL/phút để tiến hành phân tích. 

Kết luận:Điều kiện khai triển HPLC chúng tôi lựa chọn: Cột C18 

Waters(150mm x 4,6 mm, 5µm); pha động: MeOH:ACN:H 3 PO 4 = 56,7:26,3:15; 

detector DAD: 277nm; tốc độ dòng: 1mL/phút; thể tích tiêm: 10 µL, nhiệt độ cột: 

25 o C. 

3.3.2. Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong Ba kích theo AOAC 

Chúng tôitiến hành thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trênmẫu thử 

Ba kíchsố 4 và mẫu chuẩn <strong>rubiadin</strong> ở các nồng độ xác <strong>định</strong>. 

a. Độ đặc hiệu 

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã khảo sáttrên mẫu thử và mẫu chuẩn, kết 

quả SKĐ được thể hiện ở hình 3.9, 3.10, 3.11, thời gian lưu được ghi ở bảng 3.8. 

36

Hình 3.9: Hình ảnh chồng phổ sắc ký mẫu chuẩn và mẫu thử 

Hình 3.10: SKĐ <strong>rubiadin</strong> chuẩn 

Hình 3.11 : SKĐ <strong>rubiadin</strong> mẫu thử 

Bảng 3.8: Thời gian lưu của <strong>rubiadin</strong> trong mẫu chuẩn và mẫu thử số 4 

Mẫu chuẩn 

Mẫu thử 

Thời gian lưu (phút) 4,783 4,804 

Nhận xét:Hình ảnh chồng SKĐ cho thấy pic <strong>rubiadin</strong> ở mẫu thử và mẫu chuẩn 

có độ lệch∆t R =0,021 không đáng kể, phổ hấp thụ của <strong>rubiadin</strong> trong mẫu thử và 

37

mẫu chuẩn tương đồng nhau về hình dạng và đỉnh hấp thụ. Chứng tỏ <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

có độ đặc hiệu cao. 

b. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký 

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn có nồng độ 0,136 µg/ml đã chuẩn 

bị ở mục 2.4.3. Giá trịthời gian lưu, diện tích pic, RSD được ghi lại trong bảng 3.9. 

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ thích hợp hệ thống sắc ký 

STT Diện tích pic (mAU.s) Thời gian lưu (phút) 

1 10559 4,833 

2 10678 4,829 

3 10566 4,832 

4 10394 4,832 

5 10618 4,833 

6 10482 4,842 

Trung bình 10550 4,834 

RSD (%) 0,95 0,08 

Nhận xét:RSD của thời gian lưu và diện tích pic nhỏ hơn 2%, hình ảnh pic 

<strong>rubiadin</strong> trong mẫu chuẩn và mẫu thử tương đồng nhau. Như vậy hệ thống sắc ký 

thích hợp với mẫu phân tích. 

c. Độ lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

Khảo sát trên mẫu thử số 4,tiến hành cân, chiết, pha mẫu thử như đã trình bày 

ở trên, tiêm sắc ký. RSD của hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong mẫu thử được ghi ở bảng 

3.10. 

38

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong>. 

STT 

Khối <strong>lượng</strong> bột 

Diện tích pic 


dược liệu (g) 

(mAU.s) 

(µg/g) 

1 1,4998 70942 36,80 

2 1,4885 72358 37,82 

3 1,5009 73606 38,15 

4 1,4946 72481 37,73 

5 1,4827 70929 37,21 

6 1,5053 73644 38,06 

Trung bình (µg/g) 37,63 

RSD (%) 1,39 

Nhận xét: Qua khảo sát cho thấy, RSD của hàm <strong>lượng</strong><strong>rubiadin</strong> trong mẫu thử 

4 nhỏ hơn 2%, chứng tỏ <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> có độ lặp lại tốt. 

d. Độ tuyến tính 

Tiến hành khảo sát trên một dãy dung dịch chuẩn (pha 5 dung dịch) có nồng 

độ: 1,700 µg/ml; 1,360 µg/ml; 0,919 µg/ml; 0,527 µg/ml; 0,136 µg/ml.Xác <strong>định</strong> sự 

phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng <strong>phương</strong> trình hồi quy tuyến 

tính. Kết quả diện tích pic ở mỗi nồng độ được ghi ở bảng 3.11. 

Bảng 3.11: Diện tích pic của dãy dung dịch chuẩn. 

39

Nồng độ (µg/ml) 

1,700 1,360 0,919 

Diện tích pic (mAU.s) 108873 89725 56298 

0,527 0,136 

33229 10458 

DIỆN TÍCH PIC 

120000 

100000 

80000 

60000 

40000 

20000 

0 

ĐỒ THỊ 

y = 64034x + 267.1 

R² = 0.997 

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 

NỒNG ĐỘ 

Hình 3.12: Đồ thị tương quan giữa diện tích pic và nồng độ 

Nhận xét:Đường 

thẳng biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ<strong>rubiadin</strong> 

và diện tích pic là y = 64034x + 267,18. Như vậy trong khoảng khảo sát diện tích 

pic và nồng độ<strong>rubiadin</strong> 

có mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ với R=0,999. 

e. Độ đúng của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

Dung dịch thử: Chuẩn bị như mục 2.4.3 

Dung dịch thử thêm chuẩn: Cân chính xác 1,5g bột dược liệu vào bình <strong>định</strong> 

mức, thêm 50ml dung dịch gồm: dung dịch chuẩn<strong>rubiadin</strong> sao cho <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> 

thêm vào bằng 30% <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong mẫu thử và EtOH 96 o vừa đủ, tiến hành 

chuẩn bị mẫu theo các bước ở mực 2.4.3, khai triển sắc ký. Kết quả được ghi trong 

bảng 3.12. 

40

Bảng 3.12: Kết quả xác <strong>định</strong> khả năng thu hồi của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

STT 

Lượng 

Lượng 

Lượng 

Lượng 

Độ thu 





hồi (%) 

thêm 

thu được 

của mẫu 

tìm lại 

(µg) 

(µg) 

thử (µg) 

(µg) 

0 0 54,906 54,891 0 0 

1 17 72,722 55,890 16,832 99,01 

2 17 72,183 55,038 17,146 100,96 

3 17 73,197 55,967 17,230 101,35 

4 17 72,397 55,462 16,935 99,62 

5 17 73,662 56,413 17,249 101,46 

Trung bình (%) 100,48 

RSD (%) 1,10 

Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy khả năng tìm lại chất chuẩn nằm trong 

khoảng 98,0% đến 102% đáp ứng yêu cầu độ đúng của <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> phân tích và 

giá trị RSD

Tiến hành pha loãng dung dịch chuẩn gốc từ nồng độ ban <strong>đầu</strong> đến nồng độ 

0,113µg/ml cho đáp ứng S/N = 10 và 0.0425µg/ml cho đáp ứng S/N = 3. Kết luận 

LOQ = 0,113 µg/ml và LOD = 0,0425 µg/ml. 

Bảng 3.13: Kết quả giá trị LOD, LOQ 

LOQ 

LOD 

Giá trị (µg/ml) 0,113 0,0425 

3.3.3. Xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> Rubiadin trong Ba kích 

Từ kết quả thẩm <strong>định</strong> ở trên, chúng tôi cho rằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> 

<strong>rubiadin</strong> trong Ba kích đã trình bày có thể áp dụng để khảo sát hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> 

trong Ba kích. Áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> trên các mẫu thử: cột C18 Waters (150mm x 

4,6 mm, 5 µm); bước sóng phát hiện 277nm, thể tích tiêm mẫu 10µl, tốc độ dòng 

1ml/phút, nhiệt độ cột 25 o C, pha độngMeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% (56,7:26,3:15). Kết 

quả được trình bày ở bảng 3.14. 

Bảng 3.14: Kết quả <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong các mẫu thử. 

Mẫu thử 

Hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong>(µg/g) 

1 11,11 ± 0,21 

2 5,84 ± 0,08 

3 11,36 ± 0,23 

4 37,63 ± 0,53 

5 14,03 ± 0,29 

6 9,93 ± 0,12 

42

Nhận xét: Hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong các mẫu thử dao động từ 5,84 µg/g đến 

37,68 µg/g. Trong đó mẫu Ba kích Quảng Ninh (mẫu số 4) có hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> 

cao nhất. 

Chúng tôi tiếp tục so sánh hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong các mẫu Ba kích so với 

hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần. Kết quả được trình bày ở bảng 3.15. 

Bảng 3.15: Tỉ lệ Rubiadin so với anthranoid toàn phần tính theo <strong>rubiadin</strong> 

Mẫu thử 1 2 3 4 5 6 

Tỉ lệ <strong>rubiadin</strong> so với 

anthranoid toàn phần (%) 

3,47 2,61 4,63 20,19 14,26 5,44 

Nhận xét: Tỉ lệ <strong>rubiadin</strong> so với anthranoid toàn phần tính theo <strong>rubiadin</strong> dao 

động từ 2,61% đến 20,19%. Trong đó mẫu Ba Kích Quảng Ninh có tỉ lệ <strong>rubiadin</strong> so 

với anthranoid toàn phần cao nhất. 

3.4. Bàn luận 

3.4.1. Mẫu <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> 

Lấy mẫu:Với mong muốn tìm hiểu chất <strong>lượng</strong> dược liệu Ba kích trên thị 

trường, do vậy chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu ngẫu nhiên tại một số cửa hàng buôn 

bán dược liệu ở khu vực Ninh Hiệp và phố Lãn Ông bởi đây là hai khu vực buôn 

bán dược liệu lớn trên địa bàn Hà Nội. Ngoài ra chúng tôi cũng được hợp tác xã 

Toàn Dân, xã Thanh Lương, huyện Ba Chẽ, tỉnh Quảng Ninh - khu vực trồng Ba 

kích của tỉnh Quảng Ninh cung cấp mẫu Ba kích ở đây. Đồng thời chúng tôi cũng 

tiến hành <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> trên mẫu Ba kích tươi do công ty rượu Hà Nội nhập trực tiếp 

từ vùng Vân Nam Trung Quốc cung cấp. Sáu mẫu <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> trên được lấy đại diện 

trên thị trường cho phép chúng tôi tìm hiểu được sơ bộ dược liệu Ba kích hiện có 

trên thị trường. 

Từ kết quả cho thấy, các mẫu Ba kích có thành phần tương đối giống nhau 

(phụ lục 4), tuy nhiên hàm <strong>lượng</strong> của các thành phần có sự khác biệt. Riêng 

43

ubiadin có hàm <strong>lượng</strong> trong khoảng 5,84 µg/g đến 37,68 µg/g. Trong đó Ba kích 

Quảng Ninh có hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> cao nhất (37,68 µg/g), cao hơn các <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> 

trên Ba kích Trung Quốc đã công bố trước đó 0,78 µg/g – 21,53 µg/g. 

Xử lý mẫu:Phương <strong>pháp</strong> chiết <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> để chiết <strong>rubiadin</strong> mà chúng tôi sử 

dụng trong bài <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> này cho phép rút ngắn thời gian thực nghiệm, dễ thực 

hiện do vậy có tính ứng dụng cao. 

3.4.2. Phương <strong>pháp</strong> <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> 

Lựa chọn <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> bằng HPLC: 

Bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> HPLC, chúng tôi nhận thấy giới hạn <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> và giới 

hạn phát hiện của <strong>rubiadin</strong> tương tối thấp (LOD=0,0425µg/ml; LOQ=0,113µg/ml). 

Phù hợp cho việc <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong các mẫu dược liệu. Ngoài ra, <strong>phương</strong> 

<strong>pháp</strong> mà chúng tôi tiến hành đã được thẩm <strong>định</strong> và kết quả cho thấy đây là <strong>phương</strong> 

<strong>pháp</strong> có độ nhạy, độ chính xác, độ đặc hiệu cao. Từ những lý do trên, chúng tôi cho 

rằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> mà chúng tôi lựa chọn có khả năng áp dụng rộng rãi trong việc 

xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong dược liệu Ba kích. 

Ngoài ra <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> bằng HPLC mà chúng tôi lựa chọn 

cho thời gian lưu t R ngắn, giúp giảm thời gian <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> hơn so với <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> đã 

công bố trước đó. Do vậy, khả năng áp dụng thực tế tốt hơn. 

Lựa chọn <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần: 

Có nhiều <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần bằng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> 

quang phổ hấp thụ trong các dược liệu khác nhau. Riêng với dược liệu Ba kích, đã 

có <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> tương tự với chất chuẩn emodin trên các mẫu Ba kích Trung Quốc và 

xác <strong>định</strong> được hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần trên các mẫu Ba kích Trung Quốc là 

0,024%, <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này đã được thẩm <strong>định</strong> và cho kết quả tốt. Do đó chúng tôi 

áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> này để xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần trong các 

mẫu Ba kích mà chúng tôi thu được. 

44

Tuy nhiên, do trong thực nghiệm, qua kết quả <strong>định</strong> tính bằng TLC (hình 3.1) 

và HPLC (phụ lục 3), chúng tôi không phát hiện thấy vết emodin trong các mẫu 

khảo sát, trong khi đó <strong>rubiadin</strong> có mặt trong tất cả các mẫu.Bởi vậy chúng tôi quyết 

<strong>định</strong> xác <strong>định</strong> hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần bằng <strong>rubiadin</strong>. 

Kết quả so sánh <strong>rubiadin</strong> với anthranoid toàn phần cho kết quả dao động trong 

khoảng2,61% đến 20,19% tính theo <strong>rubiadin</strong>. Như vậy có thể sơ bộ kết luận 

<strong>rubiadin</strong> là một thành phần chính của nhóm anthranoid trong Ba kích. 

45

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 

KẾT LUẬN: 

Sau khi triển khai và thưc hiện, khóa luận đã đạt được các mục tiêu đề ra và 

thu được kết quả như sau: 

1. Đã khảo sát <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong Ba kích bằng máy 

HPLC Shimazu với các điều kiện cụ thể: Cột C18 Waters(150mm x 4,6 mm, 

5 µm); bước sóng phát hiện: 277nm, thể tích tiêm mẫu: 10µl, tốc độ dòng: 

1ml/phút, nhiệt độ cột: 25 o C, pha động: MeOH:ACN:H 3 PO 4 0,1% = 

56,7:26,3:15. 

2. Phương <strong>pháp</strong> <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong> đã được thẩm <strong>định</strong>, các chỉ tiêu đều đạt yêu cầu, đảm 

bảo <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> có thể áp dụng <strong>định</strong> <strong>lượng</strong> Rubiadin trong Ba kích. 

3. Đã áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> khảo sát hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> trong 6 mẫu Ba kích 

khác nhau. Hàm <strong>lượng</strong> <strong>rubiadin</strong> dao động trong khoảng từ 5,84µg/g ÷ 37,63 

µg/g. 

4. Đã áp dụng <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> đo quang khảo sát hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần 

trong 6 các mẫu Ba kích. Hàm <strong>lượng</strong> anthranoid toàn phần dao động trong 

khoảng 26,18 µg/g ÷ 76,66 µg/g theo chuẩn emodin 98,38 µg/g ÷ 285,86 

µg/g tính theo chuẩn <strong>rubiadin</strong>. 

ĐỀ XUẤT 

1. Hoàn thiện <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> để góp phần vào chuyên luận Ba kích trong dược 

điển Việt Nam và tiêu chuẩn chất <strong>lượng</strong> cho dược liệu Ba kích. 

2. Do thời gian có hạn, chúng tôi mới chỉ tiến hành phân tích trên một mẫu Ba 

kích Quảng Ninh 2,5 năm tuổi. Vì vậy, cần mở rộng <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong>, phân tích 

trên các mẫu Ba kích đã đủ tuổi thu hoạch (3-4 năm). Đồng thời mở rộng 

<strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> trên các mẫu Ba kích Việt Nam khác. 

46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 

TIẾNG VIỆT 

1. Bộ môn dược liệu - Trường đại học Dược Hà Nội (2011), Dược liệu học tập 

1, NXB Y học, Hà Nội, tr.211-230. 

2. Bộ y tế (2010), Đảm bảo chất <strong>lượng</strong> thuốc và một số <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> kiểm 

nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nôi, tr 158-175. 

3. Tào Duy Cần, Trần Sỹ Viên (2007), Cây thuốc vị thuốc bài thuốc Việt Nam, 

NXB Hà Nội. Tr.27. 

4. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. 

Tr.68-69. 

5. Hội đồng dược điển Việt Nam (2009), Dược điển Việt Nam IV, xuất bản lần 

thứ nhất, NXB Y học, Hà Nội. tr.682-683. 

6. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà 

Nội. Tr.303-304. 

7. Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương <strong>pháp</strong> phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu 

năng cao, Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương-Bộ Y tế. 

8. Mai Thị Phượng (2015), Nghiên <strong>cứu</strong> cây Ba kích tím ở ba Chẽ và <strong>xây</strong> <strong>dựng</strong> 

tiêu chuẩn thương phẩm Ba kích, Trường đại học Dược Hà Nội – Khóa luận 

tốt nghiệp Dược sĩ. 

9. Bùi Quốc Thái (2016), Nghiên <strong>cứu</strong> chiết xuất, phân lập và tinh chế 

Monotropein từ Ba kích làm nguyên liệu thiết lập chuẩn, Trường đại học 

Dược Hà Nội – Luận văn thạc sĩ dược học. 

10. Trường đại học Dược Hà Nội, bộ môn hóa Phân Tích (2006), Hóa phân tích 

tập 2. 

11. Viện dược liệu (2013), “Ba kích và cây thuốc có tác dụng chống bệnh tiểu 

đường”, bản tin dược liệu 2. 

12. Viện dược liệu (1972-1986), công trình <strong>nghiên</strong> <strong>cứu</strong> khoa học, NXB Y học, 

Hà Nội. tr.27-29.

13. Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương (2010), Thẩm <strong>định</strong> <strong>phương</strong> <strong>pháp</strong> trong 

phân tích hóa học và vi sinh học, NXB Khoa học và xã hội. 

TIẾNG ANH 

14. Bao, L., et al. (2011), “Anthraquinone compounds from Morinda officinalis 

inhibit osteoclastic bone resorption in vitro”, Chemico-Biological 

Interactions, vol.194(2-3), pp.97-105. 

15. Bao L, Qin L, et al. (2011), "Anthraquinone compounds from Morinda 

officinalis inhibit osteoclastic bone resorption in vitro”, Chemico-Biological 

Interactions, vol.194(2-3), pp.97-105. 

16. China Medical Science and Technology Press (2010), Pharmacopoeia China 

2010, vol.2, pp.284-285. 

17. Choi J, Lee KT, et al. (2005), “Antinociceptive anti-inflammatory effect of 

Monotropein isolated from Morinda oficinalis”, Biol Phảm Bull, vol.28(10), 

pp.1915-1918. 

18. Cui C, Yang M, et al. (1995), “Antipressant active constituents in the roots of 

Morinda oficinalis How”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, vol.20(1). pp.36- 

39,63-63. 

19. Guntupalli M, Chandana V, et al. (2006), “Hepatoprotective effects of 

<strong>rubiadin</strong>, a major constituent of Rubia cordifolia Linn”, Journal of 

Ethnopharmacology, vol.103(3), pp.484-490. 

20. Hu Y, Liu C, et al. (2014), “Application of hight-peed counter-curent 

chromatography mode for rapid isolation of anthraquinone from Morinda 

officinalis How”, Journal of Liquid Chromatography and Related 

technologies, vol.37(8), pp.1187-1198. 

21. Kim IT, Park HJ, et al. (2005), “Invitro and invivo antiflamatory and 

antiociceptive effects of the MeOH extract of the roots Morinda officinalis”, 

J Pharma Pharmacol, vol.57(5), pp.607-615. 

22. Korean Medical Science and Technology Press (2005), Pharmacopoeia 

Korean 2005, pp.1332-1333.

23. Li, N., et al. (2009), “Inhibitory effects of Morinda officinalis extract on 

bone loss in ovariectomized rats”, Molecules, vol.14(6), pp. 2049-2061. 

24. Li YF, Liu YQ, et al. (2004), “The cytoprotective effect of inulin-type 

hexasaccharide extracted from Morinda officinalis on PC12 cells against the 

lesion induced by corticosterone”, Life Sci, vol.75(13), pp.1531-1538. 

25. Li, YF, et al. (2001), “Antistress effect of oligosaccharides extracted from 

Morinda officinalis in mice and rats”, Acta Pharmacologica Sinica, 

vol.22(12), pp.1084-1088. 

26. Li, YF., et al. (2003), “Inhibition of oligosaccharides extracted from Morinda 

officinalis, a Chinese traditional herbal medicine, on the corticsterone 

induced apotosos in PC12 cells”, Life Sciences, vol.72(8), pp.933-942. 

27. Liu Q, Kim SB, et al. (2011), “Anthraquinones from Morinda officinalis 

roots enhance adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells”, Natural Product 

Research, vol.26(18), pp.1750-1754. 

28. Marioni J, da Silva MA, et al. (2016), “The anthraquinones <strong>rubiadin</strong> and its 

1-methyl ether isolated from Heterophyllaea pustulata reduces Candida 

tropicalis biofilms formation”, Phytomedicine, vol.23(12), pp.1321-1328. 

29. MengYong Z., et al. (2008), “Protective effect of polisaccharides from 

Morinda officinalis on bone loss in ovariectomized rats”, International 

Journal of Biological Macromolecules, vol.43(3), pp.276-278. 

30. Qiao ZS, Wu H, et al. (1991), “Comparison with the pharmacological actions 

of Morinda officinalis, Damnacanthus officinarum and Schisandra 

propinqua”, Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi, vol.11(7), pp. 415-417. 

31. Rumie Vittar NB, Comini L (2014), “Photochemotherapy using natural 

anthraquinones: Rubiadin and Soranjidiol sensitize human cancer cell to die 

by apoptosis”, Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, vol.11(2), 

pp.182-192.

32. Soon Y, Tan B (2002), “Evaluation of the hypoglycemic and antioxidant 

activitives of Morinda officinalis in streptozotocin-induced diabetic rats”, 

Singapore medical journal, vol.43(2), pp.77-85. 

33. Susana C, Laura R, et al. (2004), “Natural anthraquinones probed as Type I 

and Type II photosensitizers: singlet oxygen and superoxide anion 

production”, Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 

vol.78(1), pp.77–83. 

34. Tripathi YB, Sharma M, et al. (1997), “Rubiadin, a new antioxidant from 

Rubia cordifolia”, Indian J Biochem Biophys, vol.34(3), pp.302-306. 

35. Wu YB, Wu JG, et al. (2013), “Quantitative and chemical profiles analysis 

of the root of Morinda officinalis based on reversed-phase high performance 

liquid chromatography combined with chemometrics methods”, Journal of 

medicinal Plants Research, vol.7(30), pp.2249-2258. 

36. Wu YB, Zheng CJ, et al.(2009), “Antiosteoporotic Activity of 

Anthraquinones from Morinda officinalis on Osteoblasts and Osteoclasts”, 

Molecules,vol.14(1), pp.573-583. 

37. Wu YJ, Shi J, et al.(2006), “Determaination of antioxidation of the extract 

from Chinese medicine Morinda officinalis How by flow injection 

chemiluminescense and spectroscopy”, College of Public Health, vol.26(9), 

pp.1688-1692. 

38. Yang X, Zhang YH, et al.(2006), “Etract from Morinda officinalisagainst 

oxidative injury of function to human sperm membrane”, Zhejiang Province 

Cooperation of Chinese and Western Medicine Hospital, vol.31(19), 

pp.1614-1617. 

39. Yang Z, Hu J, et al. (2011), “Isolation and quantitative determination of 

inulin-type oligosaccharides in roots of Morinda officinalis”, Elviser, 

vol.83(4), pp.1997-2004.

40. Yang Z, Hu J, et al. (2011), “Isolation and quantitative determination of 

inulin-type oligosaccharides in rootsof Morinda officinalis”, Carbohydrate 

Polymers, vol.83(4), pp.1997–2004. 

41. Zhang ZQ, Yuan L, et al. (2002), “The effect of Morinda officinalis How, a 

Chinese traditional medicinal plant, on the DRL 72-s-schedule in rats and the 

forced swimming test in mie”, Pharmacol Biochem Behav, vol.72(1-2), 

pp.39-43. 

42. Zhou B, Chang J, et al. (2014), “Qualitative and quantitative analysis of 

seven oligosaccharides in Morinda officinalis using double-development 

HPTLC and scanning densitometry”,Bio-Meical Materials and Engineering, 

vol.24(1),pp.953-960. 

43. Zhu, M., et al. (2011), “Extraction of polysaccharides from Morinda 

officinalis by respone surface methodology and effect of the polysaccharides 

on bone-related genes”, Carbohydrat Polymers, vol.85(1), pp.23-28. 

TIẾNG TRUNG QUỐC 

44. Dan WU, Wei KE,et al. (2011), “The Content Determination of Total 

Anthraquinone in Morindae Officinalis”, Journal of Hubei University for 

nationalities, vol.28(2), pp.37.

PHỤ LỤC 

PL1:SKĐ của <strong>rubiadin</strong>, emodin, phycsion chuẩn và các mẫu Ba kích với điều kiện 

phân tích: Cột C18 Waters (150mm x 4,6 mm, 5 µm); bước sóng phát hiện: 277nm, 

thể tích tiêm mẫu: 10µl, tốc độ dòng: 1ml/phút, nhiệt độ cột: 25 o C, pha động: 

MeOH:H3PO4 0,1% = 85:15 

PL2:SKĐ của <strong>rubiadin</strong> chuẩn và các mẫu Ba kích với điều kiện phân tích: Cột C18 

Waters (150mm x 4,6 mm, 5 µm); bước sóng phát hiện: 277nm, thể tích tiêm mẫu: 

10µl, tốc độ dòng: 1ml/phút, nhiệt độ cột: 25 o C, pha động: MeOH:ACN:H3PO4 

0,1% = 56,7:26,3:15.

PL3: Phổ hấp thụ của emodin trong dung dịch Magie acetat 0,5% trong MeOH 

PL4:Phổ hấp thụ của 

Rubiadin trong dung dịch Magie acetat 0,5% trong MeOH

PL5: Phổ hấp thụ của <strong>rubiadin</strong> trong MeOH: A: theo tài liệu [33]; B: thực nghiệm.

Bước đầu nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng rubiadin trong dược liệu ba kích bằng HPLC

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?