PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT SAPONIN TRONG CAO SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis) ĐÃ BẢO QUẢN
https://app.box.com/s/em4g57mpwf2rru7xeo6lgn7x9tmcsxlf
https://app.box.com/s/em4g57mpwf2rru7xeo6lgn7x9tmcsxlf
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO<br />
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH<br />
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP<br />
<strong>PHÂN</strong> <strong>LẬP</strong> <strong>CÁC</strong> <strong>HỢP</strong> <strong>CHẤT</strong> <strong>SAPONIN</strong> <strong>TRONG</strong><br />
<strong>CAO</strong> <strong>SÂM</strong> <strong>NGỌC</strong> <strong>LINH</strong> (<strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong>)<br />
<strong>ĐÃ</strong> <strong>BẢO</strong> <strong>QUẢN</strong><br />
Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY <strong>LINH</strong><br />
Ngành: Công nghệ Hóa học<br />
Niên khóa: 2008 - 2012<br />
Tháng 8/2012
<strong>PHÂN</strong> <strong>LẬP</strong> <strong>CÁC</strong> <strong>HỢP</strong> <strong>CHẤT</strong> <strong>SAPONIN</strong> <strong>TRONG</strong><br />
<strong>CAO</strong> <strong>SÂM</strong> <strong>NGỌC</strong> <strong>LINH</strong> (<strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong>)<br />
<strong>ĐÃ</strong> <strong>BẢO</strong> <strong>QUẢN</strong><br />
Tác giả<br />
PHẠM DUY <strong>LINH</strong><br />
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu<br />
cấp bằng Kỹ sư ngành Công nghệ hóa học<br />
Giảng viên hướng dẫn:<br />
ThS. BÙI THẾ VINH<br />
Tháng 8/2012
LỜI CẢM ƠN<br />
Lời cảm ơn đầu tiên em xin gửi đến Ban Giám Hiệu cùng các thầy cô Bộ môn<br />
Công nghệ Hóa học trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã tạo điều kiện cho em học<br />
tập và thực hành tốt, tạo nền tảng kiến thức vững chắc cho tương lai sau này.<br />
Em xin chân thành cảm ơn thầy PGS.TS Trần Công Luận, giám đốc Trung tâm<br />
Sâm và Dược liệu Tp.HCM đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em được thực hành và<br />
nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn này.<br />
Em vô cùng cảm ơn thầy ThS. Bùi Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn em từ lúc<br />
em bắt đầu đến khi hoàn thành đề tài, thầy luôn theo dõi, quan tâm chỉ dạy em giúp em<br />
giải đáp những thắc mắc, khó khăn trong quá trình thực hiện để hiểu rõ hơn về nhiệm<br />
vụ luận văn của mình và thực hiện nhiệm vụ đó cách tốt nhất có thể.<br />
Em xin cảm ơn các thầy cô khác của Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM,<br />
cùng các anh chị đã giúp đỡ, động viên em hoàn thành tốt đề tài luận văn của mình.<br />
Con xin chân thành gửi đến gia đình lòng biết ơn sâu sắc, gia đình đã tạo cho<br />
con mọi điều kiện tốt nhất về tinh thần và vật chất, làm chỗ dựa vững chắc để con yên<br />
tâm học tập và hoàn thành tốt bài luận văn của mình.<br />
Sau cùng, tôi xin cảm ơn tất cả các bạn lớp DH08HH và tại Trung tâm Sâm và<br />
Dược liệu Tp.HCM đã chia sẻ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện<br />
đề tài.<br />
i
liệu. [27] Dựa trên kĩ thuật sắc kí: sắc kí cột cổ điển, sắc kí bản mỏng, đề tài đã phân lập<br />
TÓM TẮT<br />
Đề tài nghiên cứu “<strong>PHÂN</strong> <strong>LẬP</strong> <strong>CÁC</strong> <strong>HỢP</strong> <strong>CHẤT</strong> <strong>SAPONIN</strong> <strong>TRONG</strong> <strong>CAO</strong><br />
<strong>SÂM</strong> <strong>NGỌC</strong> <strong>LINH</strong> (<strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong>) <strong>ĐÃ</strong> <strong>BẢO</strong> <strong>QUẢN</strong>” được tiến hành tại Trung<br />
tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM, thời gian từ tháng 01/2012 đến tháng 8/2012.<br />
Saponin là một hợp chất chính có hoạt tính sinh học, có nhiều trong các cây<br />
thuộc chi Sâm (<strong>Panax</strong>), họ Nhâm Sâm (Araliaceae). <strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong> (sâm Ngọc<br />
Linh hay sâm Việt Nam, sâm K5,…) là một loài sâm đặc hữu của Việt Nam, ngoài các<br />
thành phần giống như các loài sâm nổi tiếng như sâm Triều Tiên (<strong>Panax</strong> ginseng) hay<br />
sâm Mỹ (<strong>Panax</strong> quinquefolium L) với cấu trúc protopanaxadiol, protopanaxatriol. Sâm<br />
Việt Nam còn có hợp chất saponin dammaran kiểu ocotillol là majonosid R2 (MR2)<br />
chiếm hơn 50% hàm lượng saponin có trong sâm. Thành phần này quyết định những<br />
khác biệt của sâm Việt Nam so với sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc trong trị<br />
và định danh được hai hợp chất saponin là majonoside R2 (MR2) và Ginsenoside<br />
Rb1. Ngoài ra, còn xác định được cấu trúc một phân tử đường là<br />
bằng kĩ thuật phổ học NMR.<br />
-D-Fructo pyranose<br />
ii
ABSTRACT<br />
The thesis "Isolation of the saponin compounds from <strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong><br />
extract preserved" was conducted at HCMC Research Center of Ginseng and<br />
Medicinal Materials from 01/2012 to 8/2012.<br />
Saponin were the major compounds which have biological activity, can be<br />
found in the genus Ginseng (<strong>Panax</strong>), araliaceae. <strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong> (ginseng or<br />
ginseng Vietnam Ngoc Linh, K5 ginseng, ...) is an endemic species of ginseng in<br />
Vietnam, in addition to the ingredients like ginseng species known as Korean ginseng<br />
(<strong>Panax</strong> ginseng) or American ginseng (<strong>Panax</strong> quinquefolium L) with the structure of<br />
protopanaxadiol, protopanaxatriol, the Vietnam ginseng has the saponin compounds<br />
with majonosid dammaran ocotillol type (majonosid R2, MR2) over 50%<br />
concentration of saponin in ginseng. This component was the remarkable differences<br />
compared with Korean ginseng and Chinese ginseng[27].<br />
Basing on the chromatographic techniques: column chromatography, thin layer<br />
chromatography. This study has isolated and identified two compounds are saponins<br />
majonoside R2 (MR2) and ginsenoside Rb1. In addition, a sugar was also isolated and<br />
elucidared,it’s structure was determited that α-D-fructo-pyranose by NMR<br />
spectroscopy techniques.<br />
iii
MỤC LỤC<br />
iv<br />
Trang<br />
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. i<br />
TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii<br />
ABSTRACT ................................................................................................................. iii<br />
MỤC LỤC .....................................................................................................................iv<br />
Chương 1 ........................................................................................................................ 1<br />
GIỚI THIỆU .................................................................................................................. 1<br />
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1<br />
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI CỦA ĐỀ TÀI ........................................................... 2<br />
1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI ....................................................................................... 2<br />
Chương 2 ........................................................................................................................ 3<br />
TỔNG QUAN ................................................................................................................. 3<br />
2.1 HỌ NHÂN <strong>SÂM</strong> (ARALIACEAE) ...................................................................... 3<br />
2.2 CHI <strong>SÂM</strong> (PANAX) ............................................................................................. 3<br />
2.3 <strong>PHÂN</strong> BỐ ............................................................................................................. 4<br />
2.4 GIỚI THIỆU VỀ <strong>SÂM</strong> <strong>NGỌC</strong> <strong>LINH</strong> .................................................................. 4<br />
2.4.1 Nguồn gốc và lịch sử phát hiện ..................................................................... 4<br />
2.4.2 Danh pháp khoa học ...................................................................................... 5<br />
2.4.3 Hình thái thực vật ........................................................................................... 5<br />
2.4.4 Dược tính ....................................................................................................... 8<br />
2.4.5 Quá trình nghiên cứu TPHH của sâm Ngọc Linh ........................................ 10<br />
2.5 TỔNG QUAN VỀ <strong>HỢP</strong> <strong>CHẤT</strong> <strong>SAPONIN</strong> ....................................................... 11<br />
2.5.1 Định nghĩa .................................................................................................... 11<br />
2.5.2 Tính chất của saponin .................................................................................. 12<br />
2.5.3 Phân loại saponin (theo thành phần hóa học) .............................................. 13<br />
2.5.4 Sự phân bố trong thực vật ............................................................................ 15<br />
2.6 KỸ THUẬT SẮC KÍ .......................................................................................... 16<br />
2.6.1 Sắc kí nhanh ................................................................................................. 17<br />
2.6.2 Sắc kí cột cổ điển ......................................................................................... 17<br />
2.6.3 Sắc kí lớp mỏng ........................................................................................... 18<br />
Chương 3 ...................................................................................................................... 20<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 20
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .................................................... 20<br />
3.1.1 Thời gian ...................................................................................................... 20<br />
3.1.2 Địa điểm ....................................................................................................... 20<br />
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 20<br />
3.3 VẬT LIỆU ........................................................................................................... 20<br />
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 20<br />
3.3.2 Dụng cụ ........................................................................................................ 20<br />
3.3.3 Hoá chất ....................................................................................................... 21<br />
3.4.1 Sắc kí cột nhanh ........................................................................................... 23<br />
3.4.2 Sắc ký cột cổ điển ........................................................................................ 24<br />
3.4.2.1 Sắc ký cột T2 ........................................................................................ 24<br />
3.4.2.2 Sắc kí cột T4 ......................................................................................... 25<br />
Chương 4 ...................................................................................................................... 26<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................... 26<br />
4.1 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT NHANH ................................................................... 26<br />
4.2 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT CỔ ĐIỂN .................................................................. 27<br />
4.2.1 Kết quả cột T2 .............................................................................................. 27<br />
4.2.2 Kết quả sắc kí cột tổng kết các phân đoạn cột T4 ....................................... 31<br />
4.2.3 Tổng kết toàn bộ kết quả .............................................................................. 34<br />
4.3 THẢO LUẬN ...................................................................................................... 34<br />
Chương 5 ...................................................................................................................... 35<br />
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................................... 35<br />
5.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 35<br />
5.2 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................ 35<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 36<br />
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 39<br />
v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT<br />
CTPT<br />
H 2 O<br />
H 2 SO 4<br />
MeOH<br />
CHCl 3<br />
EtOH<br />
TPHH<br />
SKLM<br />
SNL<br />
SVN<br />
Tp.HCM<br />
NXB<br />
công thức phân tử<br />
nước<br />
acid sulfuric<br />
methanol<br />
chloroform<br />
ethanol<br />
thành phần hóa học<br />
sắc kí lớp mỏng<br />
sâm Ngọc Linh<br />
sâm Việt Nam<br />
thành phố Hồ Chí Minh<br />
nhà xuất bản<br />
vi
DANH MỤC BẢNG<br />
Trang<br />
Bảng 2.1 Kết quả khảo sát hạt thu hái trong tự nhiên ..................................................... 7<br />
Bảng 3.1 Thông số cột sắc kí cao áp (sắc kí cột nhanh) ............................................... 24<br />
Bảng 3.2 Thông số cột sắc kí của các phân đoạn cột thường ...................................... 24<br />
Bảng 3.3 Các phân đoạn của cột T2 .............................................................................. 24<br />
Bảng 3.4 Các phân đoạn của cột T2-3 .......................................................................... 25<br />
Bảng 3.5 Các phân đoạn của cột T4 .............................................................................. 25<br />
Bảng 4.1 Kết quả sắc ký cột nhanh ............................................................................... 26<br />
Bảng 4.2 Kết quả sắc ký cột T2 .................................................................................... 27<br />
Bảng 4.3 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn cột T2-3 ........................... 28<br />
Bảng 4.4 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn cột T4 ................................ 31<br />
vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH<br />
Trang<br />
Hình 2.1 Cây sâm Ngọc Linh ......................................................................................... 5<br />
Hình 2.2 Rễ sâm Ngọc Linh trong tự nhiên .................................................................... 8<br />
Hình 2.3 Rễ sâm Ngọc Linh trồng .................................................................................. 8<br />
Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của saponin MR2 ............................................................... 11<br />
Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của saponin Rb1 ................................................................ 11<br />
Hình 2.6 Cấu trúc hóa học của saponin Rd .................................................................. 11<br />
Hình 2.7 Cấu trúc hóa học của saponin Rg1 ................................................................ 11<br />
Hình 2.8 Phân loại saponin theo cấu trúc hóa học ........................................................ 13<br />
Hình 2.9 Một số khung triterpen (tt)............................................................................. 15<br />
Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách, tinh sạch và xác định cấu trúc một chất ...................... 22<br />
Hình 3.2 Sơ đồ tóm tắt các kết quả thu được ................................................................ 23<br />
Hình 4.1 Bản SKLM các phân đoạn cột nhanh ............................................................ 26<br />
Hình 4.2 Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn T2 ....................................... 27<br />
Hình 4.3 Bản SKLM tất cả các phân đoạn cột T2-3 ..................................................... 30<br />
Hình 4.4 Kết quả SKLM của phân đoạn T2-3-6 so với chuẩn MR2 ............................ 30<br />
Hình 4.5 Cấu trúc hóa học của Saponin MR2 .............................................................. 31<br />
Hình 4.6 Bản SKLM tất cả các phân đoạn cột T4 ........................................................ 32<br />
Hình 4.7 T4-6 chấm so với các chuẩn .......................................................................... 33<br />
Hình 4.8 Cấu trúc Ginsenoside Rb1 ............................................................................. 33<br />
viii
Chương 1<br />
GIỚI THIỆU<br />
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Sâm Ngọc Linh là loài sâm đặc hữu ở Việt Nam đã được chứng minh có nhiều<br />
tác dụng dược lý như tăng cường miễn dịch, tăng sức đề kháng cho cơ thể, bảo vệ tế<br />
bào gan, cải thiện trí nhớ, giúp chống viêm, phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho<br />
tình trạng của cơ thể trở lại bình thường, kháng các độc tố gây hại tế bào, ngăn ngừa sự<br />
lão hóa, giúp kéo dài sự sống của tế bào và tăng các tế bào mới. Đặc biệt, sâm Ngọc<br />
Linh còn có những tính năng mà sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc không có là tính<br />
kháng khuẩn, chống trầm cảm, giảm lo âu, chống oxy hóa, và hiệp lực tốt với thuốc<br />
kháng sinh, thuốc trị bệnh tiểu đường. [12,24,30]<br />
Sâm Ngọc Linh ngoài thành phần ginsenoside như các sâm khác, còn chứa hợp<br />
chất majonoside R2 (MR2), đây là điểm khác biệt mà các loài sâm khác không có. [15]<br />
Do vậy, việc đánh giá định tính, định lượng ginsenoside, đặc biệt là majornoside R2<br />
(MR2) góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, đánh giá chất lượng sâm Việt Nam, cũng<br />
như để so sánh, phân biệt với các loài sâm khác hay các mẫu dược liệu có hình dạng<br />
giống sâm là rất quan trọng.<br />
Hiện nay, nguồn dược liệu sâm rất phong phú và đa dạng, tuy nhiên nguồn sâm<br />
Ngọc Linh là loại sâm quý hiếm được xếp đầu bảng trong sách đỏ thực vật Việt Nam<br />
năm 1994 và có giá trị kinh tế rất cao, [11,16] chính vì giá trị này mà không ít các nhà<br />
kinh doanh vô tình hay cố ý khẳng định nguồn sâm của mình là sâm Ngọc Linh mặc<br />
dù chưa có đánh giá một cách chính xác về mặt khoa học: đặc điểm hình thái, thành<br />
phần hoá học,... Đứng trước thực trạng này, về mặt hoá phân loại, cần có các chất<br />
chuẩn được tinh sạch từ nguyên liệu sâm Ngọc Linh rõ nguồn gốc như các ginsenoside<br />
, đặc biệt là hợp chất majonoside R2 (MR2), dùng làm chuẩn đánh giá tiêu chuẩn<br />
nguyên liệu sâm Việt Nam. Với mong muốn tiếp tục tìm kiếm các thành phần hoá học<br />
tồn tại trong sâm Ngọc Linh có nguồn gốc rõ ràng để làm các chuẩn đánh giá, kiểm<br />
1
định sâm mà tôi thực hiện đề tài: “Phân lập các hợp chất saponin trong cao sâm Ngọc<br />
Linh (<strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong>) đã bảo quản”.<br />
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI CỦA ĐỀ TÀI<br />
Phân lập các hợp chất saponin từ cao chiết methanol của cây sâm Ngọc Linh<br />
(<strong>Panax</strong> Vietnamensis).<br />
1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI<br />
Cung cấp chất chuẩn đánh dấu (marker compound) phục vụ công tác đánh giá,<br />
kiểm tra chất lượng nguyên liệu cây sâm Ngọc Linh.<br />
Làm tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về thành phần, hoạt tính sinh học<br />
của những hợp chất saponin đã tách được.<br />
2
Chương 2<br />
TỔNG QUAN<br />
2.1 HỌ NHÂN <strong>SÂM</strong> (ARALIACEAE)<br />
Theo thống kê năm 1985 (Grushvitsky, Hà Thị Dung), họ Araliaceae ở Việt<br />
Nam có 110 loài, thuộc 18 chi. Trong đó, có 46 loài và 11 thứ là đặc hữu trong hệ thực<br />
vật Việt Nam, đã có 40 loài được sử dụng làm thuốc. Đến nay, số loài chưa được cập<br />
nhật và thống kê đầy đủ nhưng trên thực tế số loài trong họ đã tăng lên trên 130 loài<br />
(Shang, 1983, 1997) với trên 60 loài đặc hữu. [15]<br />
2.2 CHI <strong>SÂM</strong> (PANAX)<br />
Chi <strong>Panax</strong> thuộc giới Thực vật (Plantae), ngành Thực vật có hoa<br />
(Magnoliophyta), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), bộ Hoa tán (Apiales), họ Cam<br />
Tùng (Araliaceae) theo hệ thống phân loại mới nhất của Jun Wen thống kê lại 11 loài<br />
và 1 thứ loài của chi <strong>Panax</strong>. [22]<br />
Ở Việt Nam, ghi nhận có sự hiện diện của 4 loài thuộc chi sâm: <strong>Panax</strong><br />
pseudoginseng Wall, <strong>Panax</strong> bipinnatifidus Seem, <strong>Panax</strong> stipuleanatus H. T. Tsaiet K.<br />
M. Feng và <strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong> Ha et Grushv. Đây là loài thứ 11 được phát hiện trong<br />
vòng 30 năm gần đây, là loài mới đối với khoa học và là loài đặc hữu trong hệ thực vật<br />
Việt Nam. [22]<br />
<strong>Panax</strong> là cây thảo mộc, sống nhiều năm, cao 0,4-0,8 m. Thân rễ (củ) nạc gồm<br />
nhiều đốt, phân nhánh, nằm ngang, đường kính 1,5-2,5 cm, phần đầu có nhiều vết sẹo<br />
do thân khi sinh tàn lụi, người ta dựa vào sẹo trên thân rễ để tính tuổi của sâm, chiều<br />
dài rễ tùy theo số năm sinh trưởng. Lá kép chân vịt, gồm 2-3 cái, mọc vòng, lá chét<br />
thuôn, dài 10-14 cm, rộng 3-5 cm, gốc nhọn, đầu vuốt nhọn, mép khía răng cưa, cuống<br />
lá chét ngắn dưới 1 cm. [22]<br />
Cụm hoa tán, mọc ở ngọn, thường gồm 1 tán, cá biệt có tán phụ, cuống cụm hoa<br />
dài 15-30 cm. Hoa nhỏ, màu trắng ngà, cuống hoa 1-1,5 cm, đài 5, hợp ở gốc, hình tam<br />
3
giới. [5] Tên khác: Sâm Việt Nam, sâm khu Năm (K5), sâm Đốt Trúc (Trúc Tiết Nhân<br />
giác, 5 cánh hoa hình tam giác rộng, nhị 5, chỉ nhị mảnh, bầu 2 ô, cá biệt 1 ô, bầu nhụy<br />
có 2-3 lá noãn, đầu nhụy chẻ đôi. [22]<br />
Quả hình cầu hoặc hình cầu hơi dẹt, đường kính 0,6-1,0 cm, khi chín màu đỏ<br />
hoặc cam, có chấm đen. Hạt 1-2, gần tròn, đường kính 2-3 mm, dài 3-4 mm, màu trắng<br />
xám. [22]<br />
2.3 <strong>PHÂN</strong> BỐ<br />
Vùng phân bố của chi này ở Bắc Bán Cầu, từ Himalaya đến Đông Bắc Trung<br />
Quốc, vùng Viễn Đông nước Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Sâm có tác dụng<br />
tốt và được nhiều người ưa dùng, cho nên một số loài như Nhân sâm đã được trồng<br />
hàng nghìn hecta tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Bắc Mỹ. [22]<br />
2.4 GIỚI THIỆU VỀ <strong>SÂM</strong> <strong>NGỌC</strong> <strong>LINH</strong><br />
2.4.1 Nguồn gốc và lịch sử phát hiện<br />
Sâm Ngọc Linh cũng là một loại nhân sâm thứ 20 được phát hiện trên thế<br />
Sâm), củ Ngải Rọm Con (Xê Đăng), hay cây Thuốc Giấu, Vietnam ginseng (Anh). [3]<br />
Năm 1973, lúc 16 giờ ngày 19 tháng 3, đoàn điều tra Dược Liệu ban Dân Y khu<br />
5 do dược sĩ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn, đã phát hiện được một<br />
loài <strong>Panax</strong> mọc thành quần thể ở độ cao 1800 m tại vùng Ngọc Lây, huyện Đắc Tô,<br />
tỉnh Kon Tum, và đặt tên là “sâm Đốt Trúc” với tên khoa học sơ bộ xác định là <strong>Panax</strong><br />
articulates L., họ Araliaceae. [3] Theo đánh giá của Tiến sĩ Trần Chí Liêm, Thứ trưởng<br />
Bộ Y tế Việt Nam: đây là cống hiến quan trọng cho khoa học, bổ sung tri thức mới về<br />
vùng phân bố chi <strong>Panax</strong> xuống tới vĩ tuyến 15 và bổ sung cho chi <strong>Panax</strong> họ<br />
Araliaceae một loài mới. Sau khi sâm được phát hiện, khu uỷ Khu 5 đã bí mật bảo vệ<br />
và khai thác, giao cho xưởng Dược Trung Trung Bộ chế biến làm thuốc phục vụ cán<br />
bộ, chiến sĩ và nhân dân, đồng thời gửi mẫu ra Bộ Y tế, Viện Dược Liệu Hà Nội<br />
nghiên cứu. [6]<br />
Trải qua hơn 30 năm, sâm Ngọc Linh, một loài sâm đặc hữu của nước ta đã<br />
được thế giới biết đến với tên khoa học là <strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong> Ha et Grushv. [5]<br />
4
2.4.2 Danh pháp khoa học<br />
Dược sĩ Đào Kim Long đã đặt tên khoa học của cây sâm Ngọc Linh này là<br />
<strong>Panax</strong> articulatus KL Dao, hay <strong>Panax</strong> articulatus Kim Long Đào theo tên người phát<br />
hiện. [3] 12 năm sau, tên Nhân Sâm Việt Nam và tên khoa học là <strong>Panax</strong> vietnamesis Ha<br />
et Grushy, họ Cam Tùng Araliaceae, được công bố tại Viện Thực Vật Kamarov (Liên<br />
Xô cũ) năm 1985, do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt tên. [5] Áp dụng quy tắc<br />
quốc tế về danh pháp thực vật công bố năm 1994 (ICBN - Tokyo code), điều 1, mục 3,<br />
phần C, danh pháp khoa học của sâm Ngọc Linh có<br />
thể được nối tên của người thứ hai công bố với tên người thứ nhất qua chữ ex,<br />
và khi đó tên<br />
khoa học của cây nhân sâm Ngọc Linh được viết hợp pháp theo luật quốc tế<br />
hiện nay sẽ phải là<br />
<strong>Panax</strong> articulatus KL Dao (1973) ex Ha et Gruskv (1985). [5]<br />
Giới (regnum):<br />
(không phân hạng):<br />
(không phân hạng):<br />
(không phân hạng):<br />
Bộ (ordo):<br />
Họ (familia):<br />
Phân họ (subfamilia):<br />
Chi (genus):<br />
Plantae<br />
Angiospermae<br />
Eudicots<br />
Asterids<br />
Apiales<br />
Araliaceae<br />
Aralioideae<br />
<strong>Panax</strong><br />
Phân chi (subgenus): <strong>Panax</strong> Hình 2.1: Cây sâm Ngọc Linh<br />
Đoạn (section):<br />
Loài (species):<br />
<strong>Panax</strong><br />
P. <strong>vietnamensis</strong><br />
2.4.3 Hình thái thực vật<br />
Sâm Ngọc Linh thuộc dạng cây thân thảo, sống nhiều năm nhờ thân rễ, cao<br />
khoảng 40-60 cm, đôi khi trên 1 m. Thân rễ nạc, đường kính 1-3,5 cm, chiều dài tùy<br />
5
xuân. [8] Lá kép hình chân vịt, mọc ở đỉnh thân. Cuống lá kép dài 2-12 cm, mỗi lá kép<br />
theo số năm sinh trưởng, màu vàng nhạt hay màu vàng đất, có nhiều đốt, mang nhiều<br />
vết sẹo, mỗi vết sẹo tương đương với 1 năm tuổi. Thân rễ mang nhiều rễ con và những<br />
vết nhăn dọc, dễ bẻ gãy, mùi thơm nhẹ, vị đắng hơi ngọt. Ở cuối thân rễ có rễ củ<br />
thường ít phát triển, có dạng con quay, hình trụ, đôi khi có dạng hình người, màu vàng<br />
nhạt, mang nhiều rễ con và có vân ngang. Thân rễ to nhất được phát hiện năm 1978 dài<br />
90 cm, có 62 vết sẹo và nặng 710 g. [8]<br />
Thân mọc thẳng đứng, màu xanh hoặc hơi tím, đường kính 5-8 mm, thường<br />
rụng hằng năm sau mùa sinh trưởng. Tuy vậy, đôi khi có 2-3 thân vẫn tồn tại vài năm.<br />
Thân rễ có thể phân nhánh nhiều lần và hình thành một bụi sâm, nhưng rất hiếm. Cây<br />
sâm thường héo chết vào mỗi mùa đông, để rồi mọc trở lại từ củ sâm vào đầu mùa<br />
thường có 5 lá chét hình trứng ngược, hình mác hoặc bầu dục, mép khía răng cưa, đầu<br />
lá nhọn, đôi khi có mũi nhọn, gốc lá hình nêm. Lá chét ở giữa lớn nhất, dài 15 cm,<br />
rộng 3-5 cm. Gân lá hình lông chim, thường có 10 cặp, gân phụ hình mạng. Phiến lá<br />
màu xanh lục, mảnh, dễ rách, có nhiều lông cứng dài 1-2 mm, mặt dưới ít hơn. [18]<br />
Cây nảy mầm từ hạt chỉ có 1 lá kép với 5 lá chét, năm thứ 3 đa số 2 lá kép, năm<br />
thứ 4 đa số 3 lá kép, năm thứ 5 và 6 đa số 4-5 lá kép, rất hiếm gặp cây 6 lá kép. [18]<br />
Cụm hoa thường xuất hiện ở cây có 3 lá kép trở lên. Cuống cụm hoa dài 10-12<br />
cm mang 1 tán đơn ở tận cùng, đôi khi có thêm 1-4 tán phụ hay 1 hoa đơn ở phía dưới<br />
tán chính. Mỗi cụm hoa có 50-120 hoa, cuống dài 1-1,5 cm. [19]<br />
Hoa màu vàng lục nhạt, đường kính 3-4 mm, gồm 5 lá dài hợp thành hình<br />
chuông, trên chia thành 5 răng nhỏ, hình tam giác, dài 1-1,5 mm, 5 cánh hoa, 5 nhị<br />
màu trắng, dài 1,5-2 mm. Bao phấn hình xoan, đính lưng, đĩa hoa hơi lồi. Bầu cao 1-<br />
1,5 mm, có 2 lá noãn, nhưng thường chỉ có 1 lá noãn phát triển. Hoa thường nở vào<br />
buổi sáng từ 9 giờ đến 11 giờ, lúc này nhiệt độ không khí khoảng 18-20°C và độ ẩm<br />
85-90%. Hoa nở dần từ ngoài vào và từ dưới lên. Đài hoa rụng 1-2 ngày sau khi nở và<br />
tán bắt đầu kết quả. Mùa hoa thay đổi tùy theo vùng nhưng thường bắt đầu từ tháng 4<br />
đến tháng 6. [19]<br />
6
Quả mọng, khi chín màu đỏ tươi, có chấm đen không đều ở đỉnh. Quả chủ yếu<br />
có 1 hạt hình thận, một số ít quả hình cầu dẹt chứa 2 hạt và số quả trên cây bình quân<br />
khoảng 10 đến 30 quả. Quả có chứa 3 hạt hay hơn đến nay chưa tìm thấy. [19]<br />
Trọng lượng trung bình 1 quả là 275mg (ghi nhận trên quả). Thỉnh thoảng gặp<br />
quả khi chín không có chấm đen giống như quả của nhân sâm. Hạt màu trắng hay vàng<br />
nhạt, dài 6-8 mm, rộng 5-6 mm, dày 2 mm, bề mặt có nhiều chỗ lồi lõm. Trọng lượng<br />
trung bình của 1 quả là 275 mg và 1 hạt là 75 mg. Số quả chín tối đa trên 1 tán có thể<br />
đến 40 nhưng thường số hạt thu được đáp ứng yêu cầu gieo trồng chỉ từ 10- 15 hạt.<br />
Quả chín rải rác trong tháng 5-tháng 6, chín rộ vào tháng 8 và giảm dần vào các tháng<br />
cuối năm. Ở triền phía đông Ngọc Linh thuộc tỉnh Quảng Nam, mùa ra hoa kết trái có<br />
thể chậm hơn 1 tháng so với vùng sâm thuộc triền phía tây thuộc tỉnh Kon Tum. [17]<br />
Cây sâm Ngọc Linh đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, thường mọc rải rác hoặc thành<br />
đám nhỏ dưới tán rừng kín xanh ẩm, độ cao 1900-2300 m. Nhiệt độ trung bình ở vùng<br />
có sâm mọc tự nhiên từ 15-18 o C, độ ẩm 90%, lượng mưa khoảng 3000 mm/năm, đất<br />
nhiều mùn, giàu chất dinh dưỡng.<br />
Bảng 2.1: Kết quả khảo sát hạt thu hái trong tự nhiên. [14]<br />
Khảo sát trên 4910 quả thu hái tự nhiên %<br />
Tỷ lệ quả 1 hạt 85,3<br />
Tỷ lệ quả 2 hạt 14,7<br />
Tỷ lệ quả có chấm đen 98,8<br />
Tỷ lệ quả không chấm đen 1,2<br />
7
Hình 2.2: Rễ sâm Ngọc Linh trong tự nhiên<br />
Hình 2.3: Rễ sâm Ngọc Linh trồng<br />
2.4.4 Dược tính<br />
Trong hai năm 1974 và 1975, Viện Dược Liệu thuộc Bộ Y tế nghiên cứu thấy<br />
thành phần saponin triterpen của Tam Thất, Nhân Sâm và sâm Ngọc Linh có 9 hoặc 11<br />
chất có Rf ngang nhau, màu giống nhau ở hai hệ dung môi khác nhau. Theo đánh giá<br />
của Nguyễn Minh Đức, Võ Duy Huấn trong nǎm 1994 thì từ sâm Ngọc Linh đã chiết<br />
được 50 hợp chất, xác định cấu trúc hóa học cho thấy 26 hợp chất có cấu trúc đã biết<br />
(thường thấy ở sâm Triều Tiên, sâm Mỹ, sâm Nhật) và 24 saponin dammaran có cấu<br />
trúc mới không bắt gặp tại các loại sâm khác trên thế giới. Sâm Ngọc Linh chứa chủ<br />
yếu các saponin triterpen, nhưng cũng là một trong những cây sâm có hàm lượng<br />
saponin khung dammaran cao nhất (khoảng 12-15%) và số lượng saponin nhiều nhất<br />
so với các loài khác của chi <strong>Panax</strong>. Ngoài ra trong sâm Ngọc Linh còn có 14 acid béo,<br />
8
16 acid amin (trong đó có 8 acid amin không thay thế được) và 18 nguyên tố đa lượng,<br />
vi lượng. [27]<br />
Những kết quả nghiên cứu, phân lập thành phần hóa học mới nhất được công bố<br />
còn kéo dài danh sách saponin của sâm Ngọc Linh hơn nữa, lên tổng cộng 52 loại. [22]<br />
Những kết quả nghiên cứu mới nhất bổ sung thêm danh sách saponin và acid amin dài<br />
hơn nữa. Theo tiến sĩ Nguyễn Bá Hoạt, cán bộ Viện Dược liệu thì về mặt hoá học, thân<br />
rễ và rễ củ sâm Ngọc Linh hiện nay (2007) đã phân lập được 52 saponin. Trong lá và<br />
cọng đã phân lập được 19 saponin dammaran, trong đó có 8 saponin có cấu trúc mới.<br />
Đã xác định được trong sâm Ngọc Linh 17 acid amin, 20 chất khoáng vi lượng và hàm<br />
lượng tinh dầu là 0,1%. [8]<br />
Sâm Triều Tiên và sâm Trung Quốc mọc ở vùng ôn đới và hàn đới. Chỉ riêng<br />
sâm Việt Nam mọc ở vùng khí hậu nhiệt đới. Khác biệt chính ở các loài sâm này là<br />
đều có hoạt chất chính là saponin nhưng thành phần các nhóm chất khác nhau. Sâm<br />
Việt Nam được xếp cùng nhóm với sâm Triều Tiên là nhóm có hầu hết hoạt chất<br />
saponin thuộc khung dammaran với số lượng và hàm lượng ginsenosid cao, chỉ có 1-2<br />
saponin olean có hàm lượng không đáng kể. Riêng sâm Trung Quốc chỉ có nhóm<br />
saponin dammaran, không có saponin olean. Cả ba được xem là những loài sâm quý<br />
hiện nay. Tuy nhiên chỉ có sâm Việt Nam mới có hợp chất saponin dammaran kiểu<br />
ocotillol với majonosid R2 (MR2) chiếm hơn 50% hàm lượng saponin có trong sâm<br />
Việt Nam. Thành phần này quyết định những khác biệt của sâm Việt Nam so với sâm<br />
Triều Tiên và sâm Trung Quốc trong trị liệu. [25] Đặc biệt MR2 chiếm gần 50% hàm<br />
lượng saponin toàn phần từ phần dưới mặt đất của SVN và trở thành 1 hợp chất chủ<br />
yếu của SVN so với thành phần saponin trong các loài sâm khác trên thế giới và gấp<br />
48 lần hiệu suất chiết được từ Đại Diệp Tam Thất (<strong>Panax</strong> japonicum C.A. Mey. Var.<br />
major (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng). [31] Hoạt chất majonoside R2 (MR2) có tác động<br />
ức chế cả giai đoạn bắt đầu và giai đoạn tiến triển của tế bào ung thư biểu mô da chuột<br />
được gây bằng nitric oxide phối hợp với 12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate (TPA)<br />
hay bằng peroxynitrite phối hợp với TPA. [25]<br />
Như vậy, sâm Việt Nam là một trong những loại sâm có hàm lượng saponin<br />
nhiều nhất, tương tự một số cây sâm quý đã từng được nghiên cứu sử dụng từ lâu trên<br />
thế giới. Hợp chất hóa học đa dạng và tác dụng thực tiễn đối với sức khỏe của con<br />
9
người khiến sâm Ngọc Linh hiện nay được bán trên thị trường với giá càng ngày càng<br />
cao, thậm chí còn cao hơn sâm Triều Tiên nhiều lần. [13]<br />
2.4.5 Quá trình nghiên cứu TPHH của sâm Ngọc Linh<br />
1973: Nguyễn Thới Nhâm, Nguyễn Văn Bàn (Viện Dược Liệu). Sơ bộ phân<br />
tích trên SKLM so sánh sâm Việt Nam với Hồng Sâm Triều Tiên và Sâm Tam Thất.<br />
1976: Nguyễn Thới Nhâm, Lutomski, J ( Viện cây thuốc Poznan-Balan). Phân<br />
lập 13 hợp chất saponin đặt tên K5VN <strong>Panax</strong> osid 1-13 tương tự như saponosid có<br />
trong Sâm Triều Tiên.<br />
1978- 1981: Nguyễn Thới Nhâm và các cộng sự (Đơn vị nghiên cứu chuyên đề<br />
SK5). Nghiên cứu thành phần hóa học cơ bản và hợp chất saponin SVN: Xác định các<br />
acid béo, acid amin, các yếu tố vi đa lượng v.v... Phân lập được các saponin G.Rb1,<br />
G.Rg1 và MR2.<br />
1987: Nguyễn Thới Nhâm, Trần Công Luận, Lutomski, J (Viện cây thuốc<br />
Poznan- Balan). Phân lập và xác định cấu trúc 5 hợp chất saponin (MR2, PG.RT4,<br />
G.Rg1, G.Rd, G.Rb1).<br />
1987-1990: Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự (Trung tâm Sâm VN). Nghiên cứu<br />
thành phần hoá học trong callus SVN nuôi cấy mô. Phân lập được 5 saponin và xác<br />
định được cấu trúc của PG-F11 và VG-R1. Các thành phần khác như acid béo, acid<br />
amin, b- sitosterol, daucosterin và các yếu tố vi đa lượng cũng được xác định.<br />
1987-1990: Trần Công Luận, Lutomski, J (Viện cây thuốc Poznan-Ba lan).<br />
Phân lập và xác định cấu trúc 7 polyacetylen trong sâm VN.<br />
1990: Nguyễn Minh Đức, Yamasaki K (Viện nghiên cứu khoa học Dược,<br />
Trường đại học Y Hiroshima - Nhật). Phân lập và xác định cấu trúc 49 saponin trong<br />
SVN, phát hiện 24 saponin mới, đặt tên VG.R1-R24.<br />
1999-2001: Võ Duy Huấn, Yamasaki, K (Viện nghiên cứu khoa học Dược,<br />
Trường đại học Y Hiroshima – Nhật). Phân lập và xác định cấu trúc 19 saponin trong<br />
lá SVN, phát hiện 8 saponin mới đặt tên VG.L1-L8.<br />
1999-2001: Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM và Sở Y tế Quảng Nam.<br />
Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu: phần thân rễ và rễ củ (đã đưa vào Dược điển Việt Nam<br />
tập 3) và phần lá (dự thảo).<br />
10
2001-2002: Trần Lê Quan, Kadota, S (Viện nghiên cứu Y học Phương Đông,<br />
trường Đại học Y Dược Toyama, Nhật bản). Phát hiên thêm 3 saponin và 1 genin<br />
trong SVN, 2 saponin mới là 20-O-Me-G.Rh1 và VG-R25.<br />
Một vài cấu trúc các hợp chất saponin<br />
Hình 2.4: Hình 2.5:<br />
Cấu trúc hóa học của saponin MR2<br />
Cấu trúc hóa học của saponin Rb1<br />
Hình 2.6: Hình 2.7:<br />
Cấu trúc hóa học của saponin Rd<br />
Cấu trúc hóa học của saponin Rg1<br />
2.5 TỔNG QUAN VỀ <strong>HỢP</strong> <strong>CHẤT</strong> <strong>SAPONIN</strong><br />
2.5.1 Định nghĩa<br />
11
Saponin là một nhóm glycosid lớn mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần<br />
đường và phần không đường thường gọi là aglycon, gặp rộng rãi trong thực vật, có<br />
tính chất đặc trưng. Saponin còn gọi là saponosid do chữ latinh “sapo” nghĩa là “xà<br />
phòng” (vì tạo bọt như xà phòng). Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một<br />
vài saponin.Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức<br />
với cholesterol. [9]<br />
Saponin cũng có trong một số động vật như hải sâm, cá sao. [1]<br />
Một số dược liệu chứa saponin: Atisô, Bạch Thược, Cam Thảo, Cát Cánh, Cỏ<br />
Nhọ Nồi, Dâm Dương Hoắc, Dứa Bà, Đại, Hoa Hoè, Hoàng Kỳ, Kim Ngân, Mạch<br />
Môn, Ngưu Tất, Nhân Sâm, Phục Linh, Rau Má, Râu Mèo, Ngũ Gia Bì Chân Chim,<br />
Sài Đất, Sài Hồ, Sài Hồ Nam Sơn Thù, Tam Thất, Táo Nhân, Thất Diệp Đởm, Thiên<br />
Môn, Trạch Tả, Trinh Nữ Hoàng Cung, Viễn Chí, Vối. [2]<br />
2.5.2 Tính chất của saponin<br />
Saponin thường kết tinh ở dạng vô định hình , vị đắng, khó tinh chế, điểm nóng<br />
chảy từ 200°C trở lên . Bị tủa bởi acetat chì , sulfat amonium, hydroxid barium...Phần<br />
genin tức là sapogenin và dẫn chất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin. [9]<br />
Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có<br />
loại trung tính và loại kiềm. [9]<br />
Tan trong nước, cồn, rất ít tan trong aceton, eter, hexan. [9]<br />
Tạo bọt nhiều và bền khi lắc với nước vì có hoạt tính bề mặt cao. Có thể giải<br />
thích là do phân tử saponin có phần ưa nước và phần kị nước. Tính chất này làm cho<br />
saponin giống với xà phòng: có tính nhũ hóa và tẩy sạch. [9]<br />
Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng . Saponin làm vỡ tế bào hồng<br />
cầu còn gọi là tính phá huyết . Tính phá huyết có liên quan đến sự tạo phức giữa<br />
saponin với cholesterol và các ester của cholesterol trong màng hồng cầu, nhưng lại<br />
thấy có nhiều trường hợp chỉ số phá huyết và khả năng phá huyết không tỉ lệ thuận với<br />
nhau nên phải xét đến ảnh hưởng của saponin trên các thành phần khác của màng hồng<br />
cầu. Qua việc theo dõi tính phá huyết, người ta thấy rằng cấu trúc của phần aglycon có<br />
tác dụng trực tiếp đến tính phá huyết còn phần đường ảnh hưởng đến mức độ phá<br />
12
huyết. Hồng cầu của các động vật khác nhau cũng bị ảnh hưởng khác nhau đối với một<br />
loại saponin. [1]<br />
Ðộc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm<br />
mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun,<br />
sán, ốc sên. [1]<br />
Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu, liều cao<br />
gây nôn mửa, đi lỏng. [4]<br />
Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-b-hydroxysteroid khác. [9]<br />
Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axit loãng,<br />
saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm sapogenin và phần đường gồm một hoặc<br />
nhiều phân tử đường. Các đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose ...<br />
Phần sapogenin có thể là sapogenin steroid hoặc sapogenin triterpenoid. [4]<br />
2.5.3 Phân loại saponin (theo thành phần hóa học)<br />
Saponin được phân loại thành hai nhóm lớn dựa vào phần aglycon là: saponin<br />
steroid và saponin triterpen. Trong đó, saponin triterpen còn được chia thành<br />
pentacyclic (khung oleanan, ursan, hopan, lupan…) và tetracyclic (khung dammaran,<br />
nostan, cucurbitan…), còn saponin steroid thì có các nhóm như spirostan, furostan… [7]<br />
Saponin<br />
Saponin triterpenoid (30C)<br />
Saponin steroid (27C)<br />
Pentacyclic<br />
(5vòng 6 cạnh)<br />
1. Olean<br />
2. Ursan<br />
Tetracyclic<br />
5. Dammaran<br />
6. Lanostan<br />
7. Cucurbitan<br />
1. Spirostan<br />
2. Furostan<br />
3. Aminofurostan<br />
4. Spirosolan<br />
5. Solanidan<br />
6. Cấu trúc khác<br />
(4 vòng 6 cạnh,<br />
1 vòng 5 cạnh)<br />
3. Lupan<br />
4. Hopan<br />
Hình 2.8: Phân loại saponin theo cấu trúc hóa học. [7]<br />
13
30 29<br />
29<br />
19 20<br />
12 18<br />
11 13 17<br />
25 26<br />
2<br />
1 9 14<br />
15<br />
10 8<br />
16<br />
5<br />
3 4<br />
7<br />
27<br />
6<br />
24 23<br />
Oleanan<br />
21<br />
22<br />
28<br />
30 20<br />
19<br />
12 18<br />
11 13 17<br />
25 26<br />
2<br />
1 9 14<br />
15<br />
10 7<br />
16<br />
5<br />
3 4<br />
7<br />
27<br />
6<br />
24 23 Ursan<br />
29<br />
21<br />
22<br />
28<br />
28<br />
19 20<br />
12<br />
21<br />
11 13<br />
25 26<br />
18<br />
17<br />
2<br />
1 9 14<br />
15<br />
10 8<br />
16<br />
5<br />
3 4<br />
7<br />
27<br />
6<br />
24 23<br />
Hopan<br />
22<br />
29<br />
30<br />
2<br />
1<br />
3 4<br />
24<br />
23<br />
10<br />
5<br />
6<br />
30<br />
12<br />
11<br />
25 26<br />
9 14<br />
15 16<br />
8<br />
7<br />
20<br />
19<br />
18<br />
13<br />
Lupan<br />
27<br />
17<br />
21<br />
22<br />
28<br />
14
Hình 2.9: Một số khung triterpen [7]<br />
2.5.4 Sự phân bố trong thực vật<br />
Saponin steroid thường gặp trong những cây một lá mầm. Các họ hay gặp là:<br />
Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae. Ðáng chú ý nhất là một số<br />
loài thuộc chi Dioscorea L. Agave L.Yucca L. [22]<br />
Saponin triterpenoid thường gặp trong những cây hai lá mầm thuộc các họ như:<br />
Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campanulaceae, Caryophyllaceae,<br />
Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae. [22]<br />
Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả như Bồ<br />
Kết, Bồ Hòn, rễ như Cam Thảo, Viễn Chí, Cát Cánh, lá như Dứa Mỹ. [2]<br />
2.5.5 Hoạt tính của saponin<br />
Kháng khuẩn và kháng nấm: Do có khả năng tạo phức với sterol của màng tế<br />
bào nấm làm màng nấm tan rã. [12,15]<br />
Kháng viêm. [30]<br />
15
Ngăn ngừa ung thư: Saponin nhóm spirostan có nhiều chất có hoạt tính kháng<br />
ung thư. Các glycosid spirostanol có chứa trên bốn đơn vị đường thì thấy có tác dụng<br />
chống ung thư rõ rệt). Hoạt chất majonoside R2 (MR2) có tác động ức chế cả giai<br />
đoạn bắt đầu và giai đoạn tiến triển của ung thư biểu mô da chuột được gây bằng nitric<br />
oxide phối hợp với 12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate (TPA) hay bằng<br />
peroxynitrite phối hợp với (TPA). [24]<br />
Tác dụng hướng sinh dục. [12]<br />
Tác dụng lên hệ thần kinh. [12]<br />
Tác dụng lên động vật máu lạnh và côn trùng: được ứng dụng để chống mối,<br />
làm liệt giun. [30]<br />
Tổng hợp nội tiết tố: Saponin steroid được dùng để tổng hợp các nội tiết tố<br />
steroid như testosteron, progesteron, cortison. [17]<br />
2.6 KỸ THUẬT SẮC KÍ<br />
Sự sắc kí là một phương pháp vật lí để tách một hỗn hợp gồm nhiều loại hợp<br />
chất ra riêng thành từng chất đơn lẻ, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp<br />
chất đó đối với một hệ thống (hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh). [9]<br />
Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh tách riêng các hợp chất<br />
trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp thu của nó. Pha tĩnh là chất rắn<br />
thường là alumin hoặc silicagel đã được xử lý, nó có thể được nạp nén vào trong một<br />
cột (sắc kí cột hở), hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề mặt một tấm<br />
kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa (sắc kí lớp mỏng). Pha tĩnh là chất lỏng có thể là một<br />
chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang rắn hoặc một chuỗi dây carbon dài được<br />
gắn bằng một nối hóa trị lên trên chất mang rắn. [9]<br />
Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí. Chất khí được sử dụng trong kĩ<br />
thuật sắc kí khí, trường hợp này chất khí được gọi là khí mang hoặc khí vectơ. Chất<br />
lỏng dùng trong sắc kí giấy, sắc kí lớp mỏng, sắc kí cột, lúc này chất lỏng gọi là dung<br />
môi giải ly (eluant). [9]<br />
Có rất nhiều loại hệ sắc kí khác nhau và người ta có thể phân chia chúng dựa<br />
vào bản chất pha, cơ chế tách hay cấu hình của hệ sắc kí như sắc kí phân chia, sắc kí<br />
hấp thu, sắc kí trao đổi ion, sắc kí lọc gel. [9]<br />
16
2.6.1 Sắc kí nhanh<br />
Kĩ thuật sắc kí nhanh - cột khô được triển khai từ năm 1986 bởi hai nhóm nhà<br />
hóa học John C.Coll và S.William Pelletier. Hai ông đề nghị mô hình sắc kí này áp<br />
dụng cho các phòng thí nghiệm còn hạn hẹp trang thiết bị, có thế dễ dàng tìm thấy<br />
trong phòng thí nghiệm các dụng cụ cần thiết.<br />
Sắc kí nhanh cột khô là một biến đổi của sắc kí chớp nhoáng (SKCN), với một<br />
vài khác biệt như sau:<br />
Để gia tăng vận tốc giải ly của pha động, SKCN sử dụng một lực đẩy từ trên<br />
đầu cột xuống, còn sắc kí nhanh - cột khô dùng một lực hút tạo chân không ở đầu ra<br />
của cột nhờ một máy bơm hút loại nhẹ.<br />
SKCN sử dụng pha tĩnh là silicagel loại dùng cho sắc kí cột (hạt có kích cỡ 40-<br />
63 µm) còn sắc kí nhanh - cột khô sử dụng silicagel loại dùng cho sắc kí lớp mỏng<br />
(SKLM) (Merck 60H hoặc 60G; cỡ hạt 15-40 µm) hoặc alumina loại dùng cho SKLM<br />
(10 µm, diện tích bề mặt riêng lớn: 500m 2 .g -1 ).<br />
Trong quá trình giải ly, SKCN vẫn giữ một lớp dung môi ở trên đầu cột (cột<br />
không được khô); còn với sắc kí nhanh, cột sắc kí được rút khô sau mỗi phân đoạn thu<br />
được.<br />
Sắc kí nhanh có các ưu điểm sau:<br />
- Dụng cụ dễ dàng tìm được trong bất kỳ phòng thí nghiệm hóa học nào: phễu lọc<br />
xốp, bình tam giác, vòi nước tạo áp suất kém hoặc máy bơm hút loại yếu…<br />
- Thời gian sắc kí nhanh nhờ lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly.<br />
- Thuận tiện cho người thao tác: quá trình sắc kí có thể bị gián đoạn mà không bị<br />
ảnh hưởng.<br />
- Khi muốn tạm dừng giữa chừng, hút khô cột, che chắn phần đầu cột để tránh<br />
bụi (đậy phễu bằng một tấm kiếng). Silicagel được hút khô, mẫu chất ở trạng thái khô,<br />
nằm nguyên tại vị trí trong cột.<br />
2.6.2 Sắc kí cột cổ điển<br />
Sắc kí cột là tên gọi để chỉ loại sắc kí được tiến hành ở điều kiện áp suất khí<br />
quyển, gồm một ống hình trụ, được đặt dựng đứng với đầu trên có thể hở hoặc kín, đầu<br />
dưới có gắn một khóa. Pha tĩnh là những hạt silicagel được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu<br />
17
chất cần tách được đưa lên đầu cột trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi sẽ<br />
được rót liên tục vào đầu cột. Nhờ trọng lực, dung môi chảy từ trên xuống sẽ kéo theo<br />
những phân tử thích hợp làm chúng tách ra khỏi hỗn hợp. Hợp chất không phân cực<br />
được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Như vậy, yếu tố<br />
quyết định đến hiệu quả của sắc kí cột phụ thuộc vào việc lựa chọn pha động, độ đặc<br />
khít của cột, dung môi sử dụng, tốc độ giải ly… nên cần phải lưu ý chúng. [9]<br />
Ưu điểm của phương pháp này là pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm tương đối rẻ,<br />
dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất. Đây là phương pháp thường<br />
được sử dụng để phân tách các chất ra khỏi hỗn hợp. [9]<br />
2.6.3 Sắc kí lớp mỏng<br />
Trong sắc kí lớp mỏng, pha tĩnh rắn sẽ được tráng thành một lớp mỏng, đều,<br />
phủ lên một nền phẳng như tấm kính, nhôm hay plastic. Chất hấp thụ trên tấm giá đỡ<br />
nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữa cơ. Để đưa mẫu lên<br />
những lớp mỏng đã được tráng này, người ta dùng ống vi quản (còn gọi là ống mao<br />
quản), vi quản là một ống thủy tinh có đường kính trong rất nhỏ, một đầu được vút<br />
nhọn. Sau khi mẫu đã được chấm lên bản, người ta sẽ cho bản vào một cốc chứa sẵn<br />
dung môi (pha động) với lượng thích hợp để giải ly. [9]<br />
- Bình sắc kí: là chậu, hũ, lọ…bằng thủy tinh, nhiều kích cỡ và hình dạng, có nắp đậy.<br />
- Pha tĩnh: là một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thụ như silicagel,<br />
alumin.<br />
- Pha động: là một loại dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chậm dọc theo<br />
tấm sắc kí lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Vận tốc di chuyển dung môi tùy<br />
thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha<br />
tĩnh (hiện tượng hấp thụ của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung<br />
môi.<br />
- Mẫu cần phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác. Sử<br />
dụng khoảng 1 microlit (1µL) dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, nhờ một ống vi<br />
quản để chấm mẫu thành một điểm (vết) gọn trên pha tĩnh, ở vị trí cao hơn một chút so<br />
với mặt thoáng của dung môi đang chứa trong bình.<br />
Để quá trình sắc kí lớp mỏng đạt kết quả tốt, ta thấy cần phải lưu ý một số điểm<br />
như sau: khi chấm mẫu không được để vết chấm loang quá rộng, không chấm quá<br />
18
nhiều mẫu lên bản mỏng, phải sấy khô bản mỏng trước khi giải ly. Bình (hay cốc) giải<br />
ly phải được bão hòa dung môi, phải che kín để dung môi tránh bị bay hơi, làm sai<br />
lệch tỷ lệ, quan sát quá trình giải ly để biết các vết chấm có tách hay không. [9]<br />
Người ta sử dụng sắc kí lớp mỏng để lựa chọn dung môi phù hợp cho việc giải<br />
ly, xác định một cách tương đối độ tinh khiết của chất thu được, biết được số các hợp<br />
chất trong mẫu ban đầu hay để theo dõi quá trình sắc kí cột. [9]<br />
Sắc kí lớp mỏng có nhiều ưu điểm như: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu<br />
chất nghiên cứu, quá trình triển khai sắc kí diễn ra nhanh nên trong một thời gian ngắn<br />
có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có bao nhiêu chất khác nhau. Ngoài ra còn<br />
có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân<br />
tích. Do đó, đây là phương pháp cũng được nhiều nhà nghiên cứu hóa học các hợp chất<br />
thiên nhiên sử dụng nhiều trong phòng thí nghiệm. [9]<br />
19
Chương 3<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU<br />
3.1.1 Thời gian<br />
Đề tài được tiến hành từ tháng 1 năm 2012 đến tháng 8 năm 2012.<br />
3.1.2 Địa điểm<br />
Nơi thực hiện đề tài: Bộ môn Hoá – Chế Phẩm, Trung tâm Sâm và Dược liệu<br />
Tp.HCM..<br />
3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU<br />
Phân lập một (hoặc nhiều hơn có thể) hợp chất saponin từ cao chiết methanol<br />
của cây sâm Ngọc Linh (<strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong>).<br />
Xác định cấu trúc hoá học của hợp chất saponin tách được.<br />
3.3 VẬT LIỆU<br />
3.3.1 Đối tượng nghiên cứu<br />
Cao chiết methanol của cây sâm Ngọc Linh (<strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong>) được cung<br />
cấp từ phòng Hóa - Chế Phẩm, Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp.HCM.<br />
3.3.2 Dụng cụ<br />
Cân điện tử Meltler Toledo AB-204.<br />
Tủ sấy KC-65.<br />
Dụng cụ chứa: hũ thuỷ tinh nhỏ, becher.<br />
Bể điều nhiệt.<br />
Bếp điện.<br />
Bản silicagel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art. 1,05554).<br />
Cột sắc kí nhiều kích cỡ, ống nghiệm.<br />
Bình lắng gạn.<br />
20
Ống đong các loại, pipet các loại, ống bóp cao su.<br />
Bông thuỷ tinh (có thể thay thế bằng bông gòn thông thường).<br />
Máy cô quay BUCHI (Đức).<br />
Bồn siêu âm Elma LC60H (Đức).<br />
Tủ hút chân không VWR S/P.<br />
3.3.3 Hoá chất<br />
Hệ dung môi dùng trong sắc kí<br />
Chloroform: CHCl 3<br />
Methanol: MeOH<br />
Nước cất: H 2 O<br />
Thuốc thử:<br />
Acid sulfuric: H 2 SO 4<br />
Ethanol 96 0 : C 2 H 5 OH<br />
3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
Quy trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau<br />
21
Hình 3.1: Sơ đồ quy trình tách, tinh sạch và xác định cấu trúc một chất<br />
22
Cao tổng<br />
(cao MeOH)<br />
SKCN<br />
T1<br />
SKC thường<br />
SKC thường<br />
T2 T3 T4 T5<br />
T2<br />
-1<br />
T2<br />
-2<br />
T2<br />
-3<br />
T4<br />
-1<br />
T4<br />
-2<br />
T4-<br />
3<br />
T4-<br />
4<br />
T4-<br />
5<br />
T4-<br />
6<br />
T4-<br />
7<br />
T4-<br />
8<br />
SKC thường<br />
KT<br />
Rb1<br />
T2-<br />
3-1<br />
T2-<br />
3-2<br />
T2-<br />
3-3<br />
T2-<br />
3-4<br />
T2-<br />
3-5<br />
T2-<br />
3-6<br />
T2-<br />
3-7<br />
MR2<br />
Hình 3.2: Sơ đồ tóm tắt các kết quả thu được<br />
3.4.1 Sắc kí cột nhanh<br />
Từ cao tổng methanol tiến hành chạy sắc kí cột nhanh thu được 5 phân đoạn lần<br />
lượt là:<br />
• oT1: CHCl 3<br />
• T2: CHCl 3 :MeOH (9:1)<br />
• T3: CHCl 3 :MeOH (8:2)<br />
• T4: CHCl 3 :MeOH (65:35)<br />
• T5: MeOH: 100%<br />
23
3.4.2 Sắc ký cột cổ điển<br />
Bảng 3.1: Thông số cột sắc ký cao áp (Sắc ký cột nhanh)<br />
Thông số cột<br />
Giá trị<br />
Lượng mẫu nạp, g 100<br />
Lượng chất hấp phụ, g 700<br />
Quy cách cột<br />
Đường kính trong, cm<br />
Chiều cao, cm<br />
24<br />
22<br />
15<br />
Dung môi giải ly CHCl 3<br />
CHCl 3 :MeOH<br />
MeOH<br />
Tốc độ chảy, giọt/phút 200<br />
Thể tích hứng, l/phân đoạn 2<br />
Tồng số phân đoạn hứng 5<br />
Bảng 3.2: Thông số cột sắc kí của các phân đoạn cột thường<br />
Thông số cột Cột T2 Cột T2-3 Cột T4<br />
Lượng mẫu nạp, g 15,7 4 15,56<br />
Lượng chất hấp phụ,<br />
200 250<br />
200<br />
g<br />
Quy cách cột<br />
- Đường kính tròn,<br />
3<br />
3,5<br />
3<br />
cm<br />
60<br />
60<br />
60<br />
- Chiều cao, cm<br />
Dung môi giải ly<br />
CHCl<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
3: MeOH:H 2 O<br />
MeOH<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
Tốc độ chảy,<br />
50 50<br />
50<br />
giọt/phút<br />
Thể tích hứng,<br />
50 50<br />
50<br />
ml/ống nghiệm<br />
Tổng số phân đoạn<br />
7 8<br />
3<br />
hứng<br />
3.4.2.1 Sắc ký cột T2<br />
đoạn nhỏ.<br />
Từ phân đoạn T2: CHCl 3 :MeOH (9:1) sau khi chạy sắc kí cột thu được 3 phân<br />
Bảng 3.3: Các phân đoạn của cột T2<br />
Tên phân đoạn Vị trí phân đoạn Ghi chú<br />
T2-1 1-10<br />
T2-2 11-55<br />
T2-3 56-220 Chọn rửa giải tiếp
Sắc kí cột T2-3<br />
Từ phân đoạn T2-3 sau khi chạy sắc ký thu được 7 phân đoạn nhỏ<br />
3.4.2.2 Sắc kí cột T4<br />
Bảng 3.4: Các phân đoạn của cột T2-3<br />
Tên phân đoạn Vị trí phân đoạn Ghi chú<br />
T2-3-1 1-76<br />
T2-3-2 77-100<br />
T2-3-3 101-130<br />
T2-3-4 131-280<br />
T2-3-5 281-520<br />
T2-3-6 521-680 Chất MR2 gần sạch<br />
T2-3-7 680-hết<br />
Từ sắc kí cột nhanh chọn một phân đoạn nữa là phân đoạn T4 CHCl 3 :MeOH<br />
(65:35) để tiến hành giải ly bẳng sắc kí cột cổ điển.<br />
Từ phân đoạn T4 sau khi chạy cột ta thu được 8 phân đoạn nhỏ<br />
Bảng 3.5: Các phân đoạn của cột T4<br />
Tên phân đoạn Vị trí phân đoạn Ghi chú<br />
T4-1 1-8<br />
T4-2 9-70<br />
T4-3 71-150<br />
T4-4 151-226<br />
T4-5 227-353 Kết tinh<br />
T4-6 354-394 Chất gần sạch<br />
T4-7 395-474<br />
T4-8 475-hết<br />
25
4.1 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT NHANH<br />
Chương 4<br />
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br />
Từ 100 g cao chiết tổng, qua 5 hệ dung môi chiết, thu được 5 phân đoạn nhỏ<br />
của các hệ dung môi.<br />
Bảng 4.1: Kết quả sắc kí cột nhanh<br />
Dung môi khai triển Tên phân đoạn Khối lượng cao thu hồi, g<br />
CHCl 3 T1 8,3<br />
90:10 T2 15,7<br />
80:20 T3 17,9<br />
65:35<br />
T4 15,56<br />
MeOH 100% T5 34,24<br />
Hình 4.1: Bản sắc kí các phân đoạn cột nhanh<br />
26
Theo kết quả của sắc kí bản mỏng, nhận thấy ở phân đoạn T2 có chứa nhiều<br />
saponin và có một số vạch riêng biệt, dự đoán dễ tách – tinh sạch. Do đó ta chọn phân<br />
đoạn này để qua sắc kí cột tiếp tục tách tinh sạch saponin.<br />
4.2 KẾT QUẢ SẮC KÝ CỘT CỔ ĐIỂN<br />
4.2.1 Kết quả cột T2<br />
(85:15:10)<br />
T2-1 T2-2 T2-3<br />
Hình 4.2: Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn T2<br />
Bảng 4.2: Kết quả sắc kí cột T2<br />
Dung môi khai triển Tên phân đoạn Khối lượng cao thu hồi, g<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
85:15:10<br />
T2-1 1,462<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
75:25:10<br />
T2-2 4,126<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
65:35:10<br />
T2-3 5,089<br />
Theo sắc k í bản mỏng, ta thấy phân đoạn T 2-3 có vết rỏ ràng , ít tạp nên được<br />
dùng để thực hiện rửa giải tiếp tục.<br />
27
Kết quả sắc kí cột tổng kết các phân đoạn cột T2-3<br />
Bảng 4.3: Kết quả các phân đoạn tách được từ phân đoạn cột T2-3<br />
Dung môi khai<br />
triển<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
85:15:10<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
75:25:10<br />
100% MeOH<br />
Phân<br />
đoạn<br />
T2-<br />
3-1<br />
T2-<br />
3-2<br />
T2-<br />
3-3<br />
T2-<br />
3-4<br />
T2-<br />
3-5<br />
T2-<br />
3-6<br />
T2-<br />
3-7<br />
Phân<br />
đoạn<br />
hứng<br />
Khối<br />
lượng, g<br />
Sắc kí lớp<br />
mỏng<br />
Ghi chú<br />
1-76 0,059 3 vết (a) Nhiều tạp<br />
77-100 0,108<br />
Không rõ vết,<br />
có đường (a)<br />
101-130 0,179 4 vết (b)<br />
131-280 0,474 3 vết (b)<br />
281-520 0,836<br />
3 vết, tạp ít<br />
(b)<br />
521-680 0,275 1 vết (a,b)<br />
681-hết 2,016<br />
1 vết kéo dài<br />
(b)<br />
Ghi chú: (a): hệ dung môi sắc kí lớp mỏng là CHCl 3 :MeOH:H 2 O (70:30:10)<br />
Nhận xét các phân đoạn<br />
(b): hệ dung môi sắc kí lớp mỏng là CHCl 3 :MeOH:H 2 O (65:35:10)<br />
Có tủa<br />
xuất hiện<br />
Có tủa<br />
xuất hiện<br />
Có 1 vết<br />
tạp<br />
Chọn<br />
rửa giải<br />
Tủa trùng<br />
vết MR2<br />
Phân đoạn T2-3-1 (1-76) vết rất mờ, nhận thấy hợp chất saponin chưa phân giải<br />
xuống được cần tiếp tục rửa giải.<br />
Phân đoạn T2-3-2 (77-100) vết kéo dài không tách rời, vết có màu tím nhạt,<br />
đếm được 4 vết chính trong đó vết saponin nằm giữa các vết tạp. Cần tăng hệ giải ly<br />
trên SKLM để vết tách rõ hơn có thể nhận thấy vết saponin chính xác. Xuất hiện tủa<br />
màu trắng.<br />
Phân đoạn T2-3-3 (101-130) có 4 vết trong đó dễ dàng nhận thấy 1 vết saponin<br />
chính rất to màu tím đậm nằm trên cùng, còn 3 vết tạp ở dưới nhỏ hơn, màu nâu nhạt<br />
do có gắn đường.<br />
Phân đoạn T2-3-4 (131-280) còn 3 vết với 1 vết saponin chính nằm trên cùng<br />
nhưng màu nhạt hơn và nhỏ hơn vết saponin trong phân đoạn T2-3-3, 2 vết tạp ở dưới<br />
28
cũng nhỏ và màu nhạt. Cần tăng hệ để giải ly những chất phân cực hơn ra khỏi cột sắc<br />
kí.<br />
Phân đoạn T2-3-5 (281-520) chỉ còn 2 vết không tách rời, vết saponin rất to và<br />
đậm màu, vết dưới trùng vết MR2 và vết trên nằm trên vết MR2, khả năng tách được<br />
vết trên khi giải ly trong cột sắc kí sau.<br />
Phân đoạn T2-3-6 (521-680) vết trên từ phân đoạn T2-3-5 đã giải ly hết ra khỏi<br />
cột,vết dưới đã tinh sạch có Rf trùng với MR2, cần chấm kiểm tra trên hai hệ sắc kí<br />
khác nhau với bản SKLM dài 10 cm, tiến hành đo Rf xem có phải hoàn toàn giống<br />
chuẩn MR2.<br />
Phân đoạn T2-3-7 (681-hết) vết mờ và nhỏ chỉ thấy một vết chính. Tiến hành xả<br />
cột lấy kiệt phần chất còn bị giữ lại trong cột. Chọn phân đoạn dễ tách tiến hành giải ly<br />
trong cột sắc kí sau.<br />
Phân lập các chất đã tách được<br />
Tổng kết cột T2-3 thu được 7 phân đoạn trong đó 2 phân đoạn kết tủa là phân<br />
đoạn hứng T2-3-2 (77-100) và T2-3-3 (101-130). Sau khi cô cắn mẫu trên bếp điều<br />
nhiệt, đem cân lấy số liệu sau đó cho một lượng nhỏ methanol vào để bảo quản mẫu<br />
trong điều kiện thường<br />
Ta tách được MR2 từ phân đoạn T2-3-6 (521-680). Chấm chung T2-3-6 với<br />
MR2 ở 2 hệ SKLM khác nhau là CHCl 3 :MeOH:H 2 O (70:30:10) và CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
(65:35:10) trên bản SKLM dài 10 cm dùng để đo Rf xác định độ tinh sạch và so sánh<br />
sự khác nhau, giống nhau giữa chất tách được với chuẩn MR2.<br />
29
T2-3- 5<br />
chọn rửa<br />
giải<br />
Hình 4.3: Bản SKLM tất cả các phân đoạn từ cột T2-3<br />
Chú thích: các phân đoạn hứng được từ cột T2-3: T2-3-1(1-76), T2-3-2(77-100), T2-3-<br />
3(101-130), T2-3-4(131-280), T2-3-5(281-520), T2-3-6(521-680), T2-3-7(681-hết).<br />
Hình 4.4: Kết quả SKLM của phân đoạn T2-3-6 (521-680) so với chất chuẩn MR2<br />
Theo kết quả so sánh Rf giữa mẫu và chất chuẩn MR2 ở hai hệ dung môi khác<br />
nhau nhưng luôn cho các giá trị giống nhau. Kết luận đã tách được saponin MR2 từ<br />
cao chiết methanol của sâm Ngọc Linh.<br />
Cấu trúc hóa học của saponin tách được chính là cấu trúc của saponin<br />
majonoside R2 (MR2).<br />
30
Hình 4.5: Cấu trúc hóa học của saponin MR2<br />
4.2.2 Kết quả sắc kí cột tổng kết các phân đoạn cột T4<br />
Bảng 4.4: Tổng kết các phân đoạn tách được từ sắc kí cột T4<br />
Dung môi rửa<br />
giải<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
85:15:10<br />
Phân<br />
đoạn<br />
Phân đoạn<br />
hứng<br />
Khối<br />
lượng, g<br />
T4-1 1-8 0,376<br />
T4-2 9-70 1,125<br />
T4-3 71-150 1,317<br />
Sắc kí lớp<br />
mỏng<br />
2 vết kém phân<br />
cực (a)<br />
3 vết kém phân<br />
cực (a)<br />
3 vết, 2 vết đậm<br />
(a)<br />
Ghi chú<br />
Tạp<br />
nhiều<br />
Còn tạp<br />
Còn tạp<br />
T4-4 151-226 3,101 4 vết đậm (b) Tạp mờ<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
75:25:10<br />
CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
65:35:10<br />
T4-5 227-353 2,513 2 vết đậm (b) Kết tinh<br />
T4-6 354-394 2,120<br />
1 vết mờ và 1<br />
vết đậm (b)<br />
T4-7 395-474 3,116 2 vết mờ (b)<br />
Chất gần<br />
sạch<br />
100% MeOH T4-8 Rửa cột 1,692<br />
Nhận xét các phân đoạn<br />
31<br />
1 vết mờ bị kéo<br />
(b)<br />
Phân đoạn T4-1 (1-8) 2 vết mờ kém phân cực, vết bị kéo dài do tạp còn nhiều.<br />
Mới rửa giải do đó chất chưa giải ly.
Phân đoạn T4-2 (9-70) 3 vết kém phân cực, chất bắt đầu giải ly đã thấy 1 vết<br />
saponin mờ ở giữa 2 vết tạp.<br />
Phân đoạn T4-3 (71-150) 3 vết trong đó vết saponin ở giữa to hơn và đậm có<br />
màu tím, 2 vết tạp ở trên vả dưới màu nâu nhạt do có gắn đường.<br />
Phân đoạn T4-4 (151-226) vết bị kéo do chất đang giải ly ra khỏi cột nhiều<br />
nhưng hệ phân cực thấp không tách vết rõ được, thấy được 4 vết chính và nhiều tạp<br />
mờ. Cần tăng hệ giải ly cột và hệ chạy SKLM.<br />
Phân đoạn T4-5 (227-353) tăng hệ giải ly cột từ CHCl 3 :MeOH:H 2 O (85:15:10)<br />
thành CHCl 3 :MeOH:H 2 O (75:25:10) vết tách rõ thấy được 2 vết chính, vết dưới là vết<br />
saponin to và đậm màu, vết trên bị kéo vệt do kém phân cực. Xuất hiện kết tinh ở phân<br />
đoạn này, rửa sạch kết tinh bằng methanol lạnh, hòa tan kết tinh trong dung môi<br />
Chloroform và gửi đi đo phổ.<br />
Phân đoạn T4-6 (354-394) 1 vết saponin to rõ, màu tím đậm, và tạp kéo dài nên<br />
chọn phân đoạn này để tiếp tục giải ly loại tạp để tách được hợp chất saponin tinh<br />
sạch.<br />
Phân đoạn T4-7 (395-474) 1 vết mờ bị kéo dài, chất gần hết nên tiến hành rửa<br />
cột bằng methanol 100% cho sạch và xả cột.<br />
Phân đoạn T4-8: Rửa cột<br />
Chọn rửa<br />
giải tiếp<br />
Hình 4.6: Bản SKLM tất cả các phân đoạn cột T4<br />
32
Chú thích: các phân đoạn hứng từ cột T4 là T4-1(1-8), T4-2(9-70), T4-3(91-150), T4-<br />
4(151-226),T4-5(227-353), T4-6(354-394), T4-7(395-474).<br />
Phân đoạn T4-5 sau khi tinh sạch ta được 1 phân tử đường -D-Fructo pyranose<br />
Phân đoạn T4-6 sau khi chế hóa ta thu được Ginsenoside Rb1<br />
Hình 4.7: T4-6 chấm so với các chất chuẩn<br />
Hình 4.8: Cấu trúc ginsenoside Rb1<br />
33
4.2.3 Tổng kết toàn bộ kết quả<br />
Sắc ký cột chân không thu được 5 phân đoạn trong đó phân đoạn T2 và T4 được<br />
đem đi rửa giải để tách hợp chất tinh sạch.<br />
Sắc kí cột T2 thu được 3 phân đoạn, trong đó phân đoạn T2-3 có triển vọng tách<br />
được hợp chất tinh sạch.<br />
Sắc kí cột T2-3 thu được 7 phân đoạn, tách được hợp chất saponin MR2 với<br />
khối lượng là 60 mg.<br />
Sắc kí cột T4 thu được 8 phân đoạn, phân đoạn T4-5 (227-353) có kết tinh<br />
được đo phồ NMR, kết quả xác định được cấu trúc và định danh được một phân tử<br />
đường là<br />
-D-Fructo pyranose. Phân đoạn T4-6 (354-394) tách ra được 1 hợp chất<br />
tinh khiết là Ginsenoside Rb1 với khối lượng là 18 mg.<br />
4.3 THẢO LUẬN<br />
Lượng cao tổng ban đầu khá ít mà số lượng các saponin trong cao chiết lại<br />
nhiều nên khối lượng của mỗi chất sẽ ít. Qua mỗi cột sắc kí lại xảy ra hao hụt nên<br />
lượng chất mất đi khá đáng kể .Vì vậy cần lấy lượng cao chiết tổng nhiều hơn để khối<br />
lượng mỗi chất tách được nhiều hơn, dễ dàng cho việc xác định cấu trúc hơn.<br />
Ngoài ra, có thể áp dụng các phương pháp tách chất khác như: dùng silicagel<br />
pha đảo, dùng phương pháp chế hóa silicagel,… Càng mở rộng phương thức thì kết<br />
quả thu được sẽ phong phú hơn.<br />
34
Chương 5<br />
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ<br />
5.1. KẾT LUẬN<br />
Từ cao chiết methanol của sâm Ngọc Linh, thông qua các kĩ thuật sắc kí cột<br />
nhanh, sắc kí cột thường , sử dụng các hệ dung môi chạy sắc ký thích hợp và được<br />
kiểm tra độ tinh sạch bằng sắc ký bản mỏng , ta tiến hành phân lập được 2 Saponin là<br />
(majonoside R2) MR2 (60mg) và ginsenoside Rb1(18mg).<br />
Hai Saponin này rất có ý nghĩa trong công tác kiểm nghiệm và đánh giá chất<br />
lượng của sâm Việt Nam.<br />
5.2 KIẾN NGHỊ<br />
Kiến nghị tiếp tục tách và phân lập saponin từ các phân đoạn còn lại trong sắc<br />
kí cột nhanh.<br />
Kiến nghị kết hợp các phương pháp khác như: dùng sắc ký cột pha đảo, phương<br />
pháp chế hóa,…trong việc phân lập và tinh sạch saponin tiếp theo nhất là những phân<br />
đoạn về sau chất đã gần tinh sạch.<br />
Tiến hành thử hoạt tính sinh học của các saponin tách được.<br />
35
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
Tài liệu tiếng Việt<br />
1. Bộ môn Dược Liệu (2007), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Trường Đại Học Y<br />
Dược TPHCM.<br />
2. Đái Duy Ban (2008), Các hợp chất thiên nhiên nhiên có hoạt tính sinh học phòng<br />
chống một số bệnh cho người và vật nuôi, NXB Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ.<br />
3. Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang (1991), Sơ lược quá trình phát hiện cây sâm<br />
Đốt Trúc ở vùng núi Ngọc Linh (Kon Tum), trong: Liên chi hội Dược Học và Sở Y Tế<br />
Quảng Nam – Đà Nẵng, trang 138 – 146.<br />
4. Đỗ Tất Lợi (2006), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học.<br />
5. Hà Thị Dung Grushvitzky I.V (1985), Một loài sâm mới thuộc chi sâm (<strong>Panax</strong> L.), họ<br />
nhân sâm (Araliaceae) ở Việt Nam, tạp chí Sinh học, tập 7(3), 45-48.<br />
6. Liên chi Hội Dược Học – Sở Y Tế QN-ĐN (1991), Tập tài liệu viết về lịch sử ngành<br />
Dược Khu 5 và tỉnh Quảng Nam – Đả Nẵng.<br />
7. Ngô Văn Thu (1990), Hóa học saponin, Trường Đại học Y Dược TPHCM.<br />
8. Nguyễn Bá Hoạt (1999), Những dẫn liệu về hình thái cây sâm mới phát hiện ở Việt<br />
Nam, thông báo Dược Liệu, số 1, 5-9.<br />
9. Nguyễn Kim Phi Phụng (2005). Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ. NXB Đại<br />
Học Quốc Gia TPHCM.<br />
10. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại Học<br />
Quốc Gia TPHCM.<br />
11. Nguyễn Tập (2006), Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam, Tạp chí Dược liệu; số 3 (11);<br />
trang 97 – 105.<br />
12. Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự (2001), Nghiên cứu ứng dụng tác dụng antistress<br />
và tác dụng tăng lực của Sâm Việt Nam và Đinh lăng, Báo cáo tổng kết đề tài nghiên<br />
cứu khoa học Bộ Y Tế ( Mã số đề tài KHYD-0225R ).<br />
13. Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự (1993), Tóm tắt kết qủa nghiên cứu từ năm (1978-<br />
1992), Trung tâm Sâm Việt Nam- Bộ Y Tế.<br />
14. Nguyễn Thới Nhâm và Phan Văn Đệ (1980), Tóm tắt kết quả nghiên cứu đặc tính sinh<br />
học cây sâm K5 hoang dại trong 2 năm (1979-1980), TL.06/TV-89-ĐVSK5, 1-21.<br />
36
15. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm và một<br />
số cây thuốc thuộc họ Nhân Sâm, NXB Khoa học và Kĩ thuật. Hà Nội.<br />
16. Nguyễn Tiến Bân - chủ biên (1996), Sách Đỏ Việt Nam, Tập II- Phần thực vật, NXB<br />
Khoa Học và Kĩ thuật Hà Nội; trang 207 – 208.<br />
17. Phạm Hoàng Hộ (1972), Cây cỏ miền Nam Việt Nam, Bộ Giáo Dục Sài gòn. Q. I, tr.<br />
989, fig. 2492<br />
18. Phan Văn Đệ, Grushvitzky I.V., Skvortsova N.T.(1983), Đặc tính hình thái – giải<br />
phẫu lá của <strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong> (Araliaceae). Leningrad, Tạp chí Thực Vật học, tập<br />
70(4), 512-522.<br />
19. Phan Văn Đệ, Grushvitzky I.V., Skvortsova N.T., 1983, Những hoa tự bất thường của<br />
<strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong> (Araliaceae), Leningrad, Tạp chí Thực Vật học, tập 72(8), 1079-<br />
1082.<br />
Tài liệu tiếng Anh<br />
20. Antan I.S., Slepyan L.I., Minina S.A.; Shikov A.N., Legosteva A B, Vasil'eva<br />
A.L.,(1995), Development of the method of quantitative spectrophotometric<br />
determination of the main active agents in preparations of the ginseng selective strain.<br />
Pharmaceutical Chemistry Journal, Vol. 26, No. 6, 436-439<br />
21. Dan Zhou, Hong Jin, Huan-Bing Lin, Xue-Mei Yang , Yu-Fang Cheng, Feng-Jun<br />
Deng, Jiang-Ping Xu (2010), Antidepressant effect of the extracts from Fructus<br />
Akebiae. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 488–495.<br />
22. Grushvitzky I. V., Skvortsova N. T., Hà Thi Dung (1990), The genus <strong>Panax</strong><br />
(Araliaceae) in the flora of Vietnam. Bot. Jour. 75(6): 884 – 888<br />
23. Hiai S., Oura H., Nakajima T. (1976), Color reaction of some sapogenins and<br />
saponins with vanillin and sulfuric acid. Planta Med. 29(2), 116-122.<br />
24. Kazuo Yamasaki (1999), Bioactive saponins in Vietnamese ginseng, <strong>Panax</strong><br />
<strong>vietnamensis</strong>.<br />
25. Konoshima T., Takasaki M., Ichiishi E., Murakami T., Tokudo H., Nishino H., Duc<br />
N.M., Kasai R., Yamashaki K. (1997), Cancer chemopreventive activity of<br />
Majonoside-R2 from Vietnamese ginseng <strong>Panax</strong> <strong>vietnamensis</strong>. Cancer Lett, 147(1-2),<br />
11-16.<br />
37
26. Liang Z.M., Long M.S., Min S.S., Hua X.Z., Na L.A. (2001), Two New Triterpenoid<br />
Saponins from Aralia subcapitata. Natural Product Research. Volume 4.0 Issue 3.<br />
157-161.<br />
27. Nguyễn Minh Đức và Nguyễn Thới Nhâm (1998), Chemical composition and<br />
pharmacological activities of Vietnamese ginseng, Advances in Ginseng Research,<br />
The Korean Society of Ginseng, 127-137.<br />
28. Nham, K. Yamasaki and O. Tanaka, New on biogenesis of dammarane triterpenoids.<br />
saponins from Vietnamese ginseng: Highlights Srivastava S.K., Jaina D.C., (1989),<br />
Triterpenoid saponins from plants of Araliaceae. Phytochemistry. Volume 28, Issue 2,<br />
644-64<br />
29. Thomas Barclay, Milena Ginic-Markovic, Martin R. Johnston, Peter Cooper , Nikolai<br />
Petrovsky (2012), Observation of the keto tautomer of D-fructose in D 2 O using 1H<br />
NMR spectroscopy. Carbohydrate 136–141<br />
30. Trần Lê Quan (2002), Biologically active saponin constituents from vietnamese<br />
ginseng plants, Ph. D Thesis, Falcuty of Pharmacology, Toyama Medical and<br />
Pharmaceutical University.<br />
31. Xuemei Yang, Guoliang Li, Lingyun Chen, Cong Zhang, Xinxiang Wan, Jiangping Xu<br />
(2010), Quantitative determination of hederagenin in rat plasma and cerebrospinal<br />
fluidby ultra fast liquid chromatography–tandem mass spectrometry method (1973–<br />
1979), Journal of Chromatography B.<br />
32. Yamasaki, Plenum Press, New York and London Yu S., Cai Y.M., Yiao L., Yang L.,<br />
Sheng C.M. (2008), Facile synthesis of oleanolic acid monoglycosides and<br />
diglycosides. Molecules. 13, 1472-1486<br />
38
PHỤ LỤC<br />
• Cách pha thuốc thử H 2 SO 4 10% trong EtOH<br />
Dùng ống đong 100 ml:<br />
- Cho vào ống đong khoảng 70 ml EtOH.<br />
- Cho thêm 7 ml H 2 SO 4 .<br />
- Đong thêm EtOH đến mức 100 ml.<br />
• Cách pha hệ dung môi CHCl 3 :MeOH<br />
- Đong lượng vừa đủ của mỗi chất theo đúng tỷ lệ (ví dụ: 85:25, 65:35)<br />
- Cho hệ dung môi vừa pha vào erlen, lắc đều cho các chất tác dụng với nhau, hoặc<br />
dùng máy siêu âm đánh đều dung môi này trong 15 phút.<br />
- Dùng toàn bộ hệ dung môi đó.<br />
• Cách pha hệ dung môi CHCl 3 :MeOH:H 2 O<br />
- Đong lượng vừa đủ của mỗi chất theo đúng tỷ lệ.(ví dụ: 65:35:10, 70:30:10)<br />
- Chú ý pha lần lượt CHCl 3, sau đó cho MeOH vào và cuối cùng là H 2 O. Không làm<br />
thay đổi vị trí các chất khi pha.<br />
- Cho hệ dung môi vừa pha vào bình lắng, lắc đều cho các chất trộn đều với nhau.<br />
- Để yên bình lắng đến khi toàn bộ dung môi trong suốt (có phân thành 2 lớp), lấy lớp<br />
bên dưới và bỏ lớp ở trên.<br />
• Kết quả đo phổ NMR của mẫu kết tinh phân đoạn T2-3-5 trong sắc kí cột T2-3<br />
[10,20,29]<br />
39
40
41
42
pyranose.<br />
Cấu trúc đường đã xác định được dựa vào phổ NMR là đường<br />
-D-Fructo<br />
Hình cấu trúc hóa học của đường<br />
-D-Fructo pyranose<br />
43