Nghiên cứu, xác định thành phần Amino acidtrong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) - 2018

https://twitter.com/daykemquynhon 

plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

https://daykemquynhon.blogspot.com 

http://daykemquynhon.ucoz.com 

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / 

Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định 

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 

KHOA HÓA HỌC 

Nguyễn Minh Lân 

XÁC ĐỊNH AMINO ACID TRONG THỰC 

PHẨM BỔ SUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP 

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 

(HPLC). 

Khóa luận tốt nghiệp đại học hệ chính quy 

Ngành Hóa Dược 

(Chương trình đào tạo chuẩn) 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÝ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM 

HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO) 

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/ 

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

Hà Nội – 2017 

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial








ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 

KHOA HÓA HỌC 


XÁC ĐỊNH AMINO ACID TRONG THỰC 

PHẨM BỔ SUNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP 

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 

(HPLC) 

Báo cáo Khóa luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy 

Ngành Hóa Dược 

(Chương trình đào tạo chuẩn) 

Cán bộ hướng dẫn: TS. Đỗ Thị Việt Hương. 


Hà Nội – 2017 















LỜI CẢM ƠN! 

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị 

Việt Hương đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn em từ những bước đi đầu tiên trong 

khóa luận này. Đặc biệt trong suốt thời gian qua với sự quan tâm và chỉ bảo sâu sắc 

của Cô, em đã thực hiện và hoàn thành tốt bản khóa luận này. 

Qua đây, em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cô, các anh, các chị 

ở Viện Công nghiệp và Thực phẩm đã luôn hướng dẫn, đặc biệt là ThS. Lê Văn Trọng 

và Cử nhân Vũ Thị Thu Trang đã tạo điều kiện và giúp đỡ em thực hiện đề tài này. 

Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo trong bộ môn Hóa hữu cơ và 

trong khoa Hóa học, các anh chị thuộc phòng phân tích hữu cơ, bạn bè khóa K58 

khoa Hóa học và tất cả người thân đã luôn động viên và giúp đỡ em trong thời gian 

qua. 

Trong quá trình làm đề tài, em còn gặp không ít khó khăn trong qua trình tìm 

kiếm tài liệu, thông tin, thiếu thốn thời gian. Do đó trong đề tài này không tránh khỏi 

việc thiếu sót. Kính mong thầy cô và các bạn có ý kiến đóng góp để đề tài của em 

được hoàn thiện hơn. 

Em xin chân thành cảm ơn! 

Hà Nội, ngày tháng 5, năm 2017. 














DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 




Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 

ACN Acetonitrile Acetonitril 

GC/MS 

LC 

LC/MS 

LC/MS/MS 

Gas chromatography– 

mass spectrometry 

High Performance Liquid 

Chromatography 

Liquid chromatography– 

mass spectrometry 

Liquid 

ChromatographTandem 

MassSpectrometer 

Sắc ký khí ghép khối 

phổ 

Sắc ký lỏng hiệu năng 

cao 

Sắc ký lỏng ghép khối 

phổ 

Sắc ký lỏng ghép hai lần 

khối phổ 

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện 

LOQ Limit of Quantitative Giới hạn định lượng 

HPLC 

High pressure liquid 

chromatography 

Sắc ký lỏng 

hiệu năng cao 

CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản 

IS Internal standard Chất nội chuẩn 

RF Fluorescence Detector Đầu dò huỳnh quang 
















MỤC LỤC 

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 2 

1.1 Tổng quan về Amino acid ............................................................................ 2 

1.1.1 Thành phần và cấu tạo của Amino acid..................................................... 2 

1.1.2 Tính chất chung của amino acid ................................................................ 3 

1.1.3 Amino acid trong thực phẩm ..................................................................... 4 

1.2 Các phương pháp phân tích Amino acid trong thực phẩm ....................... 6 

1.2.1 . Phương pháp điện di ................................................................................ 6 

1.2.2 . Phương pháp Sắc ký khí (GC)................................................................. 7 

1.2.3 . Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). ........................................................ 7 

1.3 Phương pháp xác định amino acid bằng HPLC ........................................ 9 

1.3.1 Nguyên tắc chung về phương pháp sắc ký lỏng HPLC. ............................ 9 

1.3.2 Pha tĩnh trong HPLC. .............................................................................. 10 

1.3.3 Pha động trong HPLC. ............................................................................ 11 

1.3.4 Detector trong HPLC. .............................................................................. 11 

1.4 Xác nhận giá trị đặc trưng của phương pháp phân tích. ............................ 12 

1.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ).......................... 12 

1.4.2 Độ chính xác của phép đo. ...................................................................... 12 

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM .............................................................................. 20 

2.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu............................................................ 20 

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất. ....................................................................... 20 

2.2.1. Thiết bị..................................................................................................... 20 

2.2.2. Dụng cụ ................................................................................................... 20 

2.2.3. Hóa chất ................................................................................................... 20 

2.2.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. ...................................................................... 21 

2.3. Đánh giá các thông số phân tích ............................................................... 22 

2.3.1. Xây dựng đường chuẩn ........................................................................... 22 

2.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .............................................. 22 

2.3.3. Độ chụm .................................................................................................. 23 

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 24 

3.1. Đánh giá phương pháp phân tích ............................................................. 24 

3.1.1 Điều kiện chạy máy ............................................................................... 24 

3.1.2 Khảo sát đường chuẩn ............................................................................. 24 

3.1.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ).......................... 36 

3.1.4 Độ lặp lại ................................................................................................. 36 

3.2. Phân tích mẫu thực tế ................................................................................ 42 

3.2.1 Quy trình xử lý mẫu ................................................................................ 42 

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 45 

1. Điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC ....................................................... 45 

2. Đánh giá phương pháp phân tích: ............................................................ 45 

3. Phân tích hàm lượng amino acid trong mẫu thực phẩm chức năng ...... 45 

Phụ Lục .................................................................................................................... 46 
















DANH MỤC HÌNH 

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Amino acid 2 

Hình 1.2: Đồng phân lập thể của Alanine 6 

Hình 1.3: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 10 

Hình 3.1: Đường chuẩn của Aspartate 27 

Hình 3.2 Đường chuẩn của Serine 27 

Hình 3.3 Đường chuẩn của Glutamine 28 

Hình 3.4 Đường chuẩn của Glycine 28 

Hình 3.5 Đường chuẩn của Hystidine 29 

Hình 3.6 Đường chuẩn của Arginine 29 

Hình 3.7 Đường chuẩn của Threonine 30 

Hình 3.8 Đường chuẩn của Alanine 30 

Hình 3.9 Đường chuẩn của Proline 31 

Hình 3.10 Đường chuẩn của Cysteine 31 

Hình 3.11 Đường chuẩn của Tyrosine 32 

Hình 3.12 Đường chuẩn của Valine 32 

Hình 3.13 Đường chuẩn của Methionine 33 

Hình 3.14 Đường chuẩn của Lysine 33 

Hình 3.15 Đường chuẩn của Isoleucine 34 

Hình 3.16 Đường chuẩn của Leucine 34 

Hình 3.17 Đường chuẩn của Aspartate 35 

Hình 3.18 Sắc ký đồ chuẩn Amino acid 50µM 35 

Hình 3.19 Sắc ký đồ LOQ của Amino Acid 36 


Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317050) test A 43 

Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317050) test B 43 















DANH MỤC BẢNG 

Bảng 1.1: Các Amino acid thường gặp 2 

Bảng 2.1: Nồng độ Amino acid chuẩn làm việc 21 

Bảng 2.2: Nồng độ chất nội chuẩn 22 

Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa diện tích pic (chất chuẩn : nội chuẩn) và nồng độ (chất 

chuẩn : nội chuẩn) 35 

Bảng 3.2: Độ lặp lại của Aspartate ; Serine ; Glutamine ; Glycine 37 

Bảng 3.3: Độ lặp lại của Hystidine , Arginine , Threonine , Alanine 38 

Bảng 3.4: Độ lặp lại của Proline Cysteine Tyrosine Valine 39 

Bảng 3.5: Độ lặp lại của Methionine Lysine Isoleucine Leucine Phenylalanine .40 

Bảng 3.6: Độ lặp lại của Phenylalanine 41 

Bảng 3.7: Nồng độ các amino acid của mẫu 0317005 44 
















MỞ ĐẦU 

Amino acid là thành phần chính tạo nên giá trị dinh dưỡng riêng biệt của các 

phân tử protein, rất cần thiết cho sự sống. Giá trị dinh dưỡng của protein được quyết 

định bởi mối liên quan về số lượng và chất lượng của các amino acid khác nhau trong 

protein đó. Chúng đóng vai trò quan trọng như là chất trung gian trong quá trình 

chuyển hóa cũng như tổng hợp protein, cũng là những đơn vị cấu trúc cơ bản của 

protein. Amino acid không chỉ “xây dựng các tế bào và phục hồi các mô”, mà còn tạo 

ra kháng thể chống lại virus và vi khuẩn để đảm bảo cho sự sinh tồn của con người. 

Thực phẩm chức năng (TPCN) là các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hoặc là 

sản phẩm trong quá trình chế biến được bổ sung thêm các chất “chức năng”. Ở Việt 

Nam TPCN ngày càng trở nên quen thuộc với người dân Việt Nam và được nhiều 

người tin tưởng sử dụng. Ngày nay, amino acid được bổ sung nhiều vào các sản phẩm 

TPCN giúp tăng cường hiệu quả của thực phẩm. Tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nghiên 

cứu phân tích thành phần amino acid của các sản phẩm TPCN tại Việt Nam. 

Do đó, đề tài “Nghiên cứu, xác định thành phần Amino acid trong thực 

phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” là một 

đề tài nghiên cứu mới có ý nghĩa thực tiễn và cần thiết nhằm góp phần giúp cơ quan 

chức năng đưa ra những đánh giá quy định nhằm bảo vệ sức khỏe, quyền lợi con 

người và môi trường sống. 






1 











1.1. Tổng quan về Amino acid 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 

1.1.1. Thành phần và cấu tạo của Amino acid 

• Amino acid là đơn vị cấu tạo protein. Amino acid là chất hữu cơ, phân tử có 

chứa nhóm: carboxyl (-COOH) và nhóm amino (-NH2) gắn với carbon ở vị 

trí α. 

• Hầu hết amino acid thu nhận được khi thủy phân protein đều ở dạng L-αamino 

acid. Như vậy các protein chỉ khác nhau ở mạch nhánh, hay còn gọi 

là chuỗi bên (thường được ký hiệu: R). 

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Amino acid 

• Dựa vào tính chất của gốc R các amino acid được chia làm 5 nhóm: 

- Nhóm 1: gồm 7 amino acid có R không phân cực, kỵ nước: glycine, 

alanine, proline, valine, leucine, isoleucine và methionine. 

- Nhóm 2: gồm 3 amino acid có gốc R chứa nhân thơm: phenylalanine, 

tyrosinetryptophan. 

- Nhóm 3: gồm 5 amino acid có gốc R phân cực, không tích điện: serine, 

threonine, cystein, aspargine và glutamine. 

- Nhóm 4: gồm 3 amino acid có R tích điện dương: lysine, histidine và 

arginine. 

- Nhóm 5: gồm 2 amino acid có gốc R tích điện âm: aspartate và glutamate 

• Các amino acid thường gặp là những amino acid thường có mặt trong thành 

phần của các loại protein. Chúng có khoảng 20 loại và được thu nhận khi 

thủy phân protein. 






2 











Tên 

Amino acid 

Tên amino acid theo danh pháp 

3 

Tên 

viết tắt 

Ký 

hiệu 

Khối lượng 

mol 

Glycine α-aminoacetic Gly G 75 

Alanine α -aminopropionic Ala A 89 

Proline α -pỉolidincarboxylic Pro P 115 

Valine α -aminoisovaleric Val V 117 

Leucine α -aminoisocaproic Leu L 131 

Isoleucine α -amino-β-metylvaleric Ile I 131 

Methionine α -amino-δ-metyltiobutiric Met M 149 

Phenylalani α -amino-β-phenylpropionic Phe F 165 

Tyrosine 

α -aminoβ-hydrogengenxyphenylpropionic 

Tyr Y 181 

Tryptophan α -amino-β-indolylpropionic Trp W 204 

Serine α -amino-β-hydroxypropionic Ser S 105 

Threonine 

α -aminoβ-hydrogengenxybutiric 

Thr T 119 

Cysteine α -amino-β-tiopropionic Cys C 121 

Aspargine Amid của aspartate Asn B 132 

Glutamine Amid của glutamate Gln Q 146 

Lysine α,ε-diaminocaproic Lys K 146 

Hystidine α -amino-β-imidazolpropionic His H 155 

Arginine α -amino-δ-guanidinvaleric Arg R 174 

Aspartate α -aminosucinic Asp D 133 

Glutamate α -aminoglutarate Glu E 147 

Bảng 1.1: Các Amino acid thường gặp 

1.1.2. Tính chất chung của amino acid 

• Các Amino acid thường không màu, nhiều loại có vị ngọt kiểu đường như 

glyxine, alanine, valine, serine, histidine, triptophan; một số loại có vị đắng 

như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine. Bột ngọt hay còn 

gọi là mì chính là muối của natri với acid glutamic (monosodium 

glutamate). 

• Các amino acid thường dễ tan trong nước và khó tan trong alcohol, ether 

(trừ proline và hydrogenxyproline), chúng cũng dễ hòa tan trong acid và 

kiềm loãng (trừ tyrosine). 


• Các amino acid trong phân tử protein đều có ít nhất một carbon bất đối (trừ 

glycine) vì thế nó đều có biểu hiện hoạt tính quang học, nghĩa là có thể làm 

quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang phải hoặc sang trái. 















• Trong phân tử amino acid có nhóm carboxyl -COOH nên có khả năng 

nhường proton (H+) thể hiện tính acid, mặt khác có nhóm amin -NH2 nên 

có khả năng nhận proton nên thể hiện tính base. Vì vậy amino acid có tính 

chất lưỡng tính.Trong môi trường acid, amino acid ở dạng cation (tích 

điện dương), nếu tăng dần pH amino acid lần lượt nhường proton thứ nhất 

chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà về điện), và tiếp tục tăng pH Amino 

acid sẽ nhường proton thứ hai chuyển thành dạng anion (tích điện âm). 

1.1.3. Amino acid trong thực phẩm 

Hình 1.2: Đồng phân lập thể của alanine 

Có 2 loại amino acid khác nhau trong cơ thể: thiếu yếu và không thiếu yếu. 

Amino acid không thiếu yếu là những loại amino acid có thể tự sản xuất trong quá 

trình tổng hợp các chất khác trong cơ thể. 

Với các amino acid thiếu yếu, cơ thể không tự sản xuất được và do đó cách 

duy nhất để có được chúng là thông qua các thực phẩm mà cơ thể tiêu thụ. Một số 

sản phẩm giàu đạm như các các loại hạt, đậu, đậu nành thể cung cấp cho cơ thể đầy 

đủ tất cả các amino acid thiếu yếu. 

Amino acid cần thiết cho sự chuyển hoá bình thường của các chất dinh dưỡng 

khác, đặc biệt là các vitamin và khoáng chất, bởi nó tham gia cấu trúc trong các 

enzym. Khi thiếu amino acid, nhiều vitamin thì sẽ không phát huy đầy đủ chức năng 


của chúng. Amino acid kích thích sự thèm ăn vì thế nó giữ vai trò chính tiếp nhận các 

chế độ ăn khác nhau. Thiếu protein sẽ gây ra các rối loạn như ngừng sinh trưởng hoặc 

chậm phát triển, mỡ hoá gan, rối loạn hoạt động nhiều tuyến nội tiết (giáp trạng, sinh 

4 















dục), thay đổi thành phần protein máu, giảm khả năng miễn dịch sinh học của cơ thể 

và tăng tính cảm thụ của cơ thể với các bệnh nhiễm khuẩn. 

Trong quá trình tiêu hóa, hệ tiêu hóa phá vỡ tất cả các protein thành các amino 

acid để đưa vào máu, và sau đó các tế bào sử dụng các amino acid như các nguyên 

liệu xây dựng cơ bản. Mức protein khuyến nghị hằng ngày là 0,8 gram cho mỗi kg 

trọng lượng cơ thể. Một hộp cá ngừ chứa khoảng 32 gram protein, một ly sữa chứa 

khoảng 8 gram protein. Nên không phải quá khó khăn để đáp ứng đủ lượng protein 

hằng ngày. 

Hiện nay, các loại TPCN thường được bổ sung thêm một lượng amino acid 

nhất định. Các sản phẩm dành cho trẻ em thường được bổ sụng Lysine . Lysine làm 

tăng cảm giác ngon miệng, gia tăng chuyển hóa, hấp thu tối đa dinh dưỡng, hiệu quả 

cho việc tăng cân. Các sản phẩm sữa dành cho người tăng cân, tập thể hình có chứa 

nhiều Glutamine. Glutamine giúp tăng cường hệ miễn dịch, hỗ trợ các chức năng tiêu 

hóa và đóng góp một phần ba nhu cầu nitơ cần thiết cho cơ thể. Ngoài ra, các sản 

phẩm từ thiên nhiên như tảo biển, linh chi, sữa ong chúa,... các hoại cốm vi sinh cũng 

có chứa các loại amino acid cần thiết để đảm bảo nh cầu của cơ thể cũng như tăng 

hiệu quả của sản phẩm. 

Hình 1.3: Một số thực phẩm chức năng 

Amino acid là thành phần dinh dưỡng quan trọng nhất, chúng có mặt trong 

thành phần của nhân và chất nguyên sinh của các tế bào. Quá trình sống là quá trình 

trao đổi chất thường xuyên của protein. Vì vậy, hằng ngày cần ăn vào một lượng đầy 


đủ Amino acid cho việc duy trì sự sống, sự sinh trưởng, phát triển, sinh sản; cho quá 

trình lao động và học tập. 

5 















1.2. Các phương pháp phân tích Amino acid trong thực phẩm 

1.2.1. . Phương pháp điện di mao quản 

Phương pháp điện di dựa vào tính chất tích điện của các amino acid trong 

môi trường có pH nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các amino acid tích 

điện dương (+) sẽ chạy về phía cực (-), các amino acid tích điện âm (-) sẽ chạy 

về cực (+). Do khả năng tích điện không giống nhau trong điện trường giữa các 

amino acid vì vậy tốc độ di chuyển của các amino acid không giống nhau trong 

điện trường. Kết quả các amino acid phân bố trải ra trên giá thể (giấy hoặc 

polyamide). 

Hình 3.5: phương pháp điện di 

Mei Musa Ali Omar và cộng sự [15] đã phát triển nghiên cứu phương pháp 

điện di mao quản kết hợp với detector UV để xác định amino acid: Proline, Valine, 

Glutamine, Alanine, Asparagine, Serine trong thực phẩm Sudan. Amino acid trong 

các mẫu được dẫn xuất với 4-chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-Cl) trước 

khi phân tích CE-UV. Điều kiện phản ứng: 100mM đệm borat ở pH 8,5; thời gian 60 

phút; nhiệt độ 70 o C và NBD-Cl 40mM và phát hiện ở 475 nm. Phương pháp này đã 

thu được khoảng tuyến tính của tất cả các amino acid trong phạm vi nồng độ 2,5-40 

ppm (R 2 > 0,9981). Giới hạn phát hiện (LOD) trong khoảng 0,32-0,56 ppm. Độ thu 

hồi từ 85% đến 108%, (n = 3). 

Shigeki Akamatsu và cộng sự [17] đã sử dụng phương pháp điện di mao quản 

để phân tích amino acid trong các sản phẩm sữa ong chúa.Việc tách CE sử dụng dung 


dịch acid formic 1M (pH 1.8) như điện. Dung môi pha động là etanol 75%. Kết quả 

thu được là các giới hạn phát hiện (LOD) dao động 0,61-10,5 mg (trọng lượng khô/g 

cho mỗi amino acid). Độ thu hồi từ 88,3-108,6%, và độ lệch chuẩn tương đối RSD 

6 















0,99%. Phương pháp này đã được xác nhận và áp dụng cho một bộ 

74 mẫu mật ong thuộc bốn nguồn gốc thực vật khác nhau: Eucaliptus, hương thảo. 

Ayat H. Bani Rashaid và cộng sự [8] đã nghiên cứu Amino acid trong mẫu tóc 

người. Các bước chuẩn bị mẫu bao gồm thủy phân acid protein bằng acid 

hydrochloric và trimetylsilyl (TMS). Dẫn suất sử dụng N,O-bis (trimetylsilyl) và 

trifluoroacetamide (BSTFA). Các điều kiện dẫn suất tối ưu là: Dung môi phản ứng là 

acetonitrile, nhiệt độ 100 ° C, và thời gian phản ứng là 30 phút. Phương pháp này đã 

thu được kết quả như sau: Giới hạn phát hiện trong khoảng 0,04-0,1 mmol/L, giới 

hạn định lượng trong khoảng từ 0,1-0,5 mmol/L, độ phục hồi từ 80% và 110%, và 

khoảng tuyến tính tốt nhất là 1-300 mmol/L với hệ số tương quan R 2 > 0,99. 

1.2.3. . Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng vai trò vô cùng quan 

trọng trong việc phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc 

tách và phân tích các chất. 

Aoyama và cộng sự [9] sử dụng HPLC phân tích amino acid trong mẫu huyết 


thanh chuột. Phân tích sử dụng NBD-F (4- fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole) như 

là một thuốc thử dẫn xuất huỳnh quang. Quá trình phân tích toàn bộ đã được hoàn 

toàn tự động từ dẫn suất, tiêm để tách HPLC và định lượng. Các điều kiện phản ứng 

7 















dẫn xuất được đánh giá lại và tối ưu hóa. Amino acid được dẫn xuất của NBD-F trong 

40 phút ở nhiệt độ phòng, trong đệm borat (pH 9.5). Các dẫn xuất đã được tách ra 

trong vòng 100 phút và fluorometrically phát hiện ở 540 nm với sự kích thích ở 470 

nm. Giới hạn phát hiện đối với các amino acid là trong khoảng 2,8-20 ppm. Các 

đường cong hiệu chuẩn là tuyến tính trong khoảng 0,2 pmol đến 20 pmol. Hệ số tương 

quan là 0,999. 

Kelly và cộng sự [12] đã xác định 24 amino acid trong rượu vang và rượu nho. 

Phương pháp sử dụng với thuốc thử N-acetyl-L-cysteine, trên cột C18 (3mm x 25cm). 

Detector được đặt ở bức sóng kích thích 330nm và phát hiện ở 440nm. Dung môi sử 

dụng: A: đệm acetat 0.05M( pH 6.5) – methanol ( 95-5). 

B: methanol – acetonitrile (70 - 30) 

Thời gian (phút) %A %B 

0 97 3 

4.5 95 5 

10 81 19 

16 73 27 

20 58 42 

25 52 48 

32 40 60 

35 97 3 

Kết quả thu được khoảng tuyến tính được xác định trong phạm vi 0,25-10 ppm. Hệ 

số tương quan là 97-101%, độ lặp lại RSD








6,5); B: acetonitrile 0,05 mol / L. Điều kiện rửa giải gradient được biểu diễn qua 

bảng sau: 

Thời gian (phút) %A %B 

0~15 97~87 3~13 

15~22 87~83 13~17 

22~25 83~77 17~23 

25~35 77~75 23~25 

35~45 75~70 25~30 

Kết quả nghiên cứu thu được 15 amino acid có trong cây Thiên Nam Tinh. 

Khoảng tuyến tính tốt: Glu trong khoảng 2-100 ppm, Arg trong khoảng 6-300 ppm, 

những amino acid khác trong khoảng 0,8-40 ppm, với hệ số tương quan R2≥ 0,9995. 

Độ thu hồi là 95% -105% và RSD < 3%. 

1.3. Phương pháp xác định amino acid bằng HPLC 

1.3.1. Nguyên tắc chung về phương pháp sắc ký lỏng HPLC. 

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và 

pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách 

dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên 

tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử 

và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha 

tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách 

ra khỏi nhau. Sơ đồ cấu tạo thiết bị HPLC bao gồm: 

1- Bình chứa dung môi pha động 

2- Bộ phận khử khí 

3- Bơm cao áp 

4- Bộ phận tiêm mẫu ( bằng tay hay Autosample) 

5- Cột sắc ký ( Pha tĩnh ) ( để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt ) 

6- Detector ( nhận tín hiệu ) 

7- Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận, tín hiệu và sử lý dữ liệu và điều 


khiển hệ thống HPLC. 

8- In dữ liệu . 

9 















Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có tính đặc thù riêng, 

đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký phân bố lỏng – lỏng và sắc ký trao đổi lỏng – 

rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn,… 

1.3.2. Pha tĩnh trong HPLC. 

Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất 

phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7mm. Tuỳ theo 

bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 

loại: sắc ký pha thường (NP-LC) và sắc ký pha ngược (RP-LC) 

• Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica 

trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm 

chức phân cực: -NH 2 , -CN...), pha động là các dung môi hữu cơ không phân 

cực như: n-hexan, toluene.... Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân 

cực hay ít phân cực. 

• Sắc ký pha ngược: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân 

cực, loại thông dụng nhất là –C 18 H 37 , còn pha động phân cực: nước, methanol, 

axetonitril....Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại 

là nước nên rất kinh tế. Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực 


rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực . 





10 











1.3.3. Pha động trong HPLC. 

Pha động trong HPLC đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các 

chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa 

giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt nhưng nhìn chung phải đáp ứng được 

các điều kiện sau: 

• Pha động phải trơ với pha tĩnh. 

• Pha động phải hòa tan tốt mẫu phân tích, phải bền vững và không bị phân hủy 

trong quá trình chạy sắc ký. 

• Pha động phải có độ tinh khiết cao. 

• Pha động phải nhanh đạt được các cân bằng trong quá trình sắc ký, như cân 

bằng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion tuỳ theo bản chất của từng loại sắc ký. 

• Phải phù hợp với loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích. 

• Pha động phải không quá đắt. 

Có thể chia pha động làm hai loại: 

❖ Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên để 

phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực 

như MeOH, ACN. Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết 

ngược. 

❖ Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như 

xyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua 

(CS 2 ), chlorobutan, CCl 4 , toluene... 

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa 

giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân 

cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động 

theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ. 

1.3.4. Detector trong HPLC. 

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp. Tuỳ 

thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp. 


- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả 

năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS). 

11 















- Detector huỳnh quang RF: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát 

huỳnh quang. Đối với những chất không có khả năng như vậy, cần phải 

dẫn xuất hoá chất phân tích, gắn nó với chất có khả năng phát huỳnh quang 

hoặc chất phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành sản phẩm có khả 

năng phát huỳnh quang. 

- Detector độ dẫn: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: các ion kim 

loại chuyển tiếp.... 

1.4. Xác nhận giá trị đặc trưng của phương pháp phân tích. 

1.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ). 

Giới hạn phát hiện là lượng nhỏ nhất của chất phân tích có thể phát hiện được 

đảm bảo sự khác biệt với mẫu trắng tới 95% ; thông thường LOD được chấp nhận ở 

nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần tín hiệu nhiễu đường nền, thường lấy 

12 

S 

N = 3 

Trong đó: N - Độ nhiễu trung bình đường nền. 

S - Chiều cao píc của chất cần phân tích. 

Giới hạn xác định là lượng nhỏ nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử 

có thể định lượng được trong điều kiện tiến hành phép thử. Thông thường, LOQ được 

lấy từ 3 đến 5 lần LOD. 

Tiến hành xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng bằng cách thêm 

chuẩn trên nền mẫu thực ở mức nồng độ giảm dần. Ở nồng độ chất phân tích có tỉ số 

tín hiệu S/N ≈ 3 được chọn làm nồng độ giới hạn phát hiện và S/N ≈ 10 được chọn 

làm giới hạn nồng độ giới hạn định lượng [6]. 

1.4.2. Độ chính xác của phép đo. 

Độ chính xác của phép đo được đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm 

là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức 

độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực [1]. 

• Độ thu hồi (độ đúng) 


Công thức tính độ thu hồi: 

R% = C tt 

C c 

× 100 















Trong đó: R%: Độ thu hồi (%). 

C c : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) (ppb). 

. C tt : Nồng độ chất phân tích phát hiện được (ppb). 

• Độ lặp lại (độ chụm) của phép đo được xác định theo các đại lượng S 2 và CV. 

RSD% = CV% = SD × 100 

S tb S = √ ∑(S i − S tb ) 2 

n − 1 

Trong đó: 

CV: hệ số biến động của phép đo. 

S: Độ lệch chuẩn. 

S tb : diện tích pic trung bình. 

n: số lần đo. 

RSD: độ lệch chuẩn tương đối 






13 











CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 

2.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu. 

Hiện nay, đánh giá về thành phần amino acid là một vấn đề vẫn đang được 

quan tâm. Như chúng tôi đã đề cập đến trong bản luận văn này, vấn đề thành phần 

amino acid trong thực phẩm chức năng gây ra nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe con 

người. 

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu, xác định thành phần amino acid trong một 

số loại thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC ghép detector huỳnh quang. 

2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất. 

2.2.1. Thiết bị 

• Hệ thống sắc ký lỏng HPLC - RF; cột tách: Waters AccQ.Tag 3.9x150mm 

• Máy lắc vortex (đồng hóa mẫu). 

• Bể rung siêu âm. 

• Lò nung 

• Máy điều nhiệt 

• Cân phân tích (độ đọc 0.1mg) 

• Máy xay Philip Simply Silent 600W 

2.2.2. Dụng cụ 

• Pipet: 1, 2, 5 ml. 

• Vial siêu nhỏ 0,4ml 

• Bình định mức 20ml, 50ml 

• Vial loại 1,5ml; 4ml; 6ml 

• Ống đong, phễu. 

• Pipetman và đầu côn Eppendorf. 

• Catrige lọc với kích thước 0,2 μm; 

• Bể siêu âm; tủ lạnh; tủ sấy 

• Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác. 

2.2.3. Hóa chất 


Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích 

• Chất chuẩn Amino acid được cung cấp bởi Waters ( USA) 

• Chất phản ứng (2A) được cung cấp bởi Waters 





20 











• Chất pha loãng (2B) được cung cấp bởi Waters 

• Đệm Borate được cung cấp bởi Waters 

• Na 2 B 4 O 7 được cung cấp bởi KANTO chemical ( Nhật Bản) 

• HCl 37% được cung cấp bởi Merck 

• Phenol 99% được cung cấp bởi Glentham Life Sciences ( Anh Quốc) 

• Acetonitrile loại tinh khiết được cung cấp bởi Merck 

• Đệm Eluent loại tinh khiết được cung cấp bởi Waters 

• Nước siêu sạch dùng cho máy HPLC 

2.2.4. Chuẩn bị dung dịch chuẩn. 

❖ Pha dung dịch chuẩn 

‣ Chuẩn gốc 2500µM, bảo quản ở -20 o C, sử dụng trong 12 tháng 

‣ Chuẩn làm việc được pha theo bảng sau trong vial 1ml 

STT 

Nồng độ chuẩn 

(µM) 

Thể tích Aminoacid 

(µl) 

Thể tích H2O deion 

(µl) 

1 500 200 µl (2500 µM) 800 

2 200 400 µl (500 µM) 600 

3 100 200 µl (500 µM) 800 

4 50 500 µl (100 µM) 500 

5 20 200 µl (100 µM) 800 

6 10 100 µl (100 µM) 900 

7 5 100 µl (50 µM) 900 

Bảng 2.1 Nồng độ Amino acid chuẩn làm việc 

Chuẩn làm việc được bảo quản ở -20 o C, sử dụng trong 1 tháng. 

❖ Pha nội chuẩn 

Chất nội chuẩn: (trong một số trường hợp còn được gọi là chất đồng hành) là 

chất được thêm vào mẫu ở thời điểm sớm nhất có thể trong quy trình phân tích để 

kiểm soát lượng mẫu mất đi trong quá trình chiết làm sạch và phân tích sắc ký. 






21 








STT 

Nồng độ 

(µM) 

V – IS (ml) 

V–H2O 

(ml) 




1 500 0,2ml (IS-Amino acid 2500 µM) 0,8 

2 100 0,2 ml (IS-Amino acid 500 µM) 0,8 

3 20 0,2 ml (IS-Amino acid 100 µM) 0,8 

2.2.5. Dẫn xuất hóa dung dịch chuẩn 

• Chỉnh máy điều nhiệt về 55 o C 

Bảng 2.2 Nồng độ chất nội chuẩn 

• Hút 10µl chuẩn làm việc vào Vial siêu nhỏ 0,4ml 

• Thêm 10µl chất nội chuẩn (IS- 20 µM) vào ống nghiệm. 

• Thêm 60µl Reagent 1( đệm borate) vào ống nghiệm, lắc đều. 

• Dùng pipet hút 20µl dịch phản ứng vào ống đựng mẫu. 

• Lắc vortex vài giây. Để yên về nhiệt độ phòng. 

• Điều nhiệt ở 55 o C trong 10 phút. 

Dung dịch sử dụng trong 1 tuần, bảo quản ở nhiệt độ phòng. 

2.3. Đánh giá các thông số phân tích 

2.3.1. Xây dựng đường chuẩn 

Để phù hợp với thiết bị sắc ký lỏng HPLC với detector RF chúng tôi đã xây 

dựng đường chuẩn với amino acid từ 5 µM đến 100 µM. 

Thông tin về đường đường chuẩn sẽ được trình bày ở phần kết quả. 

2.3.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 

Giới hạn phát hiện (LOD) 

Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín 

hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu màu trắng hay tín hiệu nền. Đối với các 

quá trình sắc ký, LOD là nồng độ nhỏ nhất mà cho tín hiệu/nhiễu (S/N). 

Giới hạn định lượng (LOQ) 

Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng 


được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu màu trắng hay tín 

hiệu của nền.Thông thường, với các quá trình sắc ký giá trị LOQ bằng 3.33 lần LOD 





22 











2.3.3. Độ chụm 

Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. 

Độ chụm là một khái niệm định tính và được định lượng bởi độ lệch chuẩn tương đối 

RSD% hay hệ số biến thiên CV%. 

Công thức tính độ chụm đã được nêu ở phần 1. 






23 











CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 

3.1. Đánh giá phương pháp phân tích 

3.1.1. Điều kiện chạy máy 

Sau khi tham khảo các tài liệu đã công bố và qua quá trình khảo sát tại phòng 

thí nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện phù hợp để phân tích amino acid 

Điều kiện hệ thống sắc ký lỏng HPLC - FLD (Shimadzu) 

- Cột tách: Waters AccQ.Tag 3.9x150mm 

- Thời gian chạy: 55 phút 

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút 

- Thể tích bơm: 10 µl 

- Nhiệt độ cột: 40 ºC 

- Dung môi: Acetonitrile : H 2 O = 95 : 5 (A), 

- Chương trình Gradient: 

Đệm Eluent A : H 2 O = 10 : 90 (B) 

Thời gian % A %B 

0 1 99 

0,5 2 98 

15 7 93 

19 10 90 

32 - 33 33 67 

34 - 37 100 0 

38 - 50 0 100 

51 - 55 1 99 

3.1.2. Khảo sát đường chuẩn 

Dung dịch dùng để dựng đường chuẩn được pha loãng từ dung dịch gốc và 


dẫn xuất hóa như mục 2.2.4. Đường chuẩn được xây dựng từ nồng độ 5µM đến 

100µM. Các điều kiện đo như ở mục 3.1.1 và kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1. 





24 








Tên chất C STD/IS (µM) S STD/IS (µM) Tên chất C STD/IS (µM) S STD/IS (µM) 

0,25 0,0951 

0,25 0,0452 




ASP 

SER 

GLU 

GLY 

HIS 

0,5 0,2070 0,5 0,1609 

1 0,3459 CYS 2,5 0,8099 

2,5 0,8873 

5 1,6460 

0,25 0,1039 

0,5 0,4618 

0,5 0,2323 1 0,7675 

1 0,3593 TYR 2,5 1,9965 

2,5 0,9099 5,0 3,7105 

5 1,6772 

0,25 0,1131 

0,25 0,3219 

0,5 0,1150 0,5 0,7469 

1 0,2404 VAL 1 1,2985 

5 1,1018 2,5 3,3629 

0,25 0,2359 

5 6,2070 

0,25 0,2684 

0,5 0,5743 0,5 0,6006 

1 1,0073 MET 1 1,0311 

2,5 2,6527 2,5 2,7227 

5 4,9613 5 4,9882 

0,25 1,9207 

0,5 0,3542 

1 2,4068 1 0,7913 

LYS 

5 5,0991 2,5 2,2253 


5 4,1249 





25 








0,25 0,0708 

0,25 0,4663 




ARG 

THR 

ALA 

PRO 

0,5 0,2361 0,5 1,0201 

1 0,5170 ILE 1 1,7791 

2,5 1,3995 2,5 4,6398 

5 2,6546 5 8,5391 

0,25 0,1442 

0,5 1,0014 

0,5 0,3447 1 1,7106 

1 0,5799 LEU 2,5 4,4772 

2,5 1,5693 5 8,5391 

5 2,9505 

0,25 0,1564 

0,5 2,7168 

0,5 0,3447 1 3,4945 

1 0,5799 PHE 2,5 7,3676 

2,5 1,5627 5 12,3983 

5 2,8442 

0,25 0,0743 

0,5 0,1815 

1 0,3375 

2,5 0,8001 

5 1,5067 

Bảng 3.1 Sự phụ thuộc giữa diện tích pic (chất chuẩn : nội chuẩn) và 

nồng độ (chất chuẩn : nội chuẩn) 






26 











Từ kết quả trên, ta xây dựng được đường chuẩn của 17 amino acid. 

‣ Aspartate 

Hình 3.1 Đường chuẩn của Aspartate 

→ phương trình hồi quy của đường chuẩn có dạng: 

y = 0,03024352 + 0,5437032x 

Trong khoảng nồng độ khảo sát từ 5µM đến 100µM , các điểm nồng độ của 

Aspartate phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 >0,9992777. 

‣ Serine 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

Area Ratio 

1 

2 

3 

0.00 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

Area Ratio 

1.75 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

1 

2 

3 

Hình 3.2 Đường chuẩn của Serine 


y = 0,0471286+ 0,3293996x 


Serine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9980937. 

4 

4 

0.00 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 


5 

5 





27 








‣ Glutamine 




1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

Hình 3.3 Đường chuẩn của Glutamine 


y = 0,03235095+ 0,2134659x 


Glutamine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9979994. 

‣ Glycine 

0.00 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

5 

4 

3 

2 

1 

Area Ratio 

1 2 

Area Ratio 

1 

2 

3 

3 

0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

Hình 3.4 Đường chuẩn của Glycine 


y = 0,04907518+ 0,9930881x 



Glycine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9984756. 

4 

5 

5 





28 











‣ Hystidine 

Hình 3.5 Đường chuẩn của Hystidine 


y = 1,74546+ 0,6704363x 


Hystidine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9999755. 

‣ Arginine 

5 

4 

3 

2 

1 

Area Ratio 

1 

3 

0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

Area Ratio 

2 

3 

1 

0.0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

Hình 3.6 Đường chuẩn của Arginine 



y = 1,74546+ 0,6704363x 


Arginine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9983890. 

4 

5 

5 





29 











‣ Threonine 

3.0 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

Hình 3.7 Đường chuẩn của Threonine 


y = 0,02505941+ 0,5906359x 


Threonine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9985107. 

‣ Alanine 

0.0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

Area Ratio 

1 

2 

Area Ratio 

1 

2 

3 

3 

Hình 3.8 Đường chuẩn của Alanine 


y = 0,03432729 + 0,5706511x 


Alanine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9973220. 

4 

4 

0.0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 


5 

5 





30 











‣ Proline 

1.50 

1.25 

1.00 

0.75 

0.50 

0.25 

Hình 3.9 Đường chuẩn của Proline 


y = 0,02740099 + 0,2987303x 


Proline phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9987004. 

‣ Cysteine 

0.00 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

0.8 

0.7 

0.6 

0.5 

0.4 

0.3 

0.2 

0.1 

Area Ratio 

1 

2 

Area Ratio 

2 

3 

3 

Hình 3.10 Đường chuẩn của Cysteine 


y = -0,02312135+ 0,3340067x 


Cystein phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9984475. 

4 

0.0 

0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 Conc. Ratio 


5 

5 





31 











‣ Tyrosine 

3.5 

3.0 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

Hình 3.11 Đường chuẩn của Tyrosine 


y = 0,0928286+ 0,7294305x 


ASP phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9984210. 

‣ Valine 

Area Ratio 

0.0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

2 

Area Ratio 

1 

2 

3 

3 

Hình 3.12 Đường chuẩn của Valine 


y = 0,09913257+ 1,236954x 


Valine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9980992. 

4 

4 

0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 


5 

5 





32 











‣ Methionine 

Hình 3.13 Đường chuẩn của Methionine 


y = 0,08234936 + 0,9945326x 


Methionine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9977379. 

‣ Lysine 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

4.0 

3.5 

3.0 

2.5 

2.0 

1.5 

1.0 

0.5 

Area Ratio 

1 

2 

Area Ratio 

2 

3 

3 

Hình 3.14 Đường chuẩn của Lysine 


y = -0,01627268 + 0,8400862x 


Lysine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9968873. 

4 

4 

0.0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 


5 

5 





33 











‣ Isoleucine 

7.5 

5.0 

2.5 

Hình 3.15 Đường chuẩn của Isoleucine 


y = 0,142289 + 1,700888x 


Isoleucine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9980607. 

‣ Leucine 

0.0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 

8 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

Area Ratio 

1 

2 

Area Ratio 

2 

3 

3 

Hình 3.16 Đường chuẩn của Leucine 


y = 0,2113376 + 1,617361x 


Leucine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9977844. 

4 

4 

0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 


5 

5 





34 











‣ Phenylalanine 

Hình 3.17 Đường chuẩn của phenylalanine 


y = 1,569144 + 2,188964x 


phenylalanine phụ thuộc tuyến tính chặt chẽ, với hệ số tương quan R 2 > 0,9967399. 

Pic chuẩn 

Hình 3.18 Sắc ký đồ chuẩn Amino acid 50µM 

Từ các kết quả trên với khoảng tuyến tính này (từ 5µM đến 100µM ), phương 

pháp hoàn toàn có thể xác định hàm lượng amino acid trong các mẫu bụi cần nghiên 

cứu. 

12.5 

10.0 

7.5 

5.0 

2.5 

Area Ratio 

2 

3 

4 

0.0 

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 Conc. Ratio 


5 





35 











3.1.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 

Giới hạn xác định là lượng nhỏ nhất của chất cần phân tích có trong mẫu thử 

có thể định lượng được trong điều kiện tiến hành phép thử. Thông thường, LOQ được 

lấy từ 3 đến 5 lần LOD. 

Tiến hành xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng bằng cách thêm 

chuẩn trên nền mẫu trắng ở mức nồng độ giảm dần cho đến khi đạt S/N≥ 10. Dựa 

vào cách tính ở mục 2.3.2, chúng tôi tiến hành khảo sát giới hạn phát hiện ở nồng độ 

5µM được lặp lại 3 lần. Kết quả thu được như sau : 

µM). 

Hình 3.19 Sắc ký đồ LOQ của Amino Acid 

Ta có S/N >10 nên các amino acid sẽ có LOQ = 5µM ( riêng Cysteine là 2,5 

Suy ra LOD là 1,5 µM ( riêng Cysteine là 0,75 µM) 

3.1.4. Độ lặp lại 

Để đánh giá độ lặp lại của thiết bị, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại của các 

amino acid ở 200 µM ( riêng cys là 100 µM) được tiến hành với 6 lần bơm mẫu độc 

lập. Kết quả được trình bày ở các bảng 3.1 – 3.5 : 






36 











Tên chất 

ASP 

SER 

GLU 

GLY 

C thu hồi 

(uM) 

180,049 

C thêm 

chuẩn ( µM) 

R% 

90,02 

162,723 81,36 

220,730 110,36 

200 

209,901 104,95 

187,232 93,62 

195,852 97,93 

200,259 

100,13 

196,406 98,20 

190,620 95,31 

200 

219,118 109,56 

189,940 94,97 

207,170 103,59 

170,016 

85,01 

167,901 83,95 

192,699 96,35 

200 

170,997 85,50 

217,547 108,77 

181,231 90,62 

175,690 

87,85 

175,777 87,89 

221,581 110,79 

200 

214,299 107,15 

209,157 104,58 

180,355 90,18 

R% 

trung bình 

RSD% 

96,37 10,83 

100,29 5,54 

91,70 10,43 

98,07 10,76 

Bảng 3.2 Độ lặp lại của Aspartate ; Serine ; Glutamine ; Glycine 






37 











Tên chất 

HIS 

ARG 

THR 

ALA 

C thu hồi 

(uM) 

183,864 

C thêm chuẩn 

( µM) 

R% 

91,93 

173,203 86,60 

215,027 107,51 

200 

229,802 114,90 

219,161 109,58 

206,964 103,48 

181,616 

90,81 

173,951 86,98 

218,87 109,44 

200 

206,119 103,06 

211,102 105,55 

185,451 92,73 

185,012 

92,51 

176,025 88,01 

190,179 95,09 

200 

186,567 93,28 

186,55 93,28 

194,974 97,49 

168,158 

84,08 

167,937 83,97 

186,624 93,31 

200 

196,522 98,26 

187,572 93,79 

172,014 86,01 

R% 

trung bình 

RSD% 

102,33 10,65 

98,09 9,28 

93,28 3,37 

89,90 6,69 


Bảng 3.3: Độ lặp lại của Hystidine , Arginine , Threonine , Alanine 





38 











Tên chất 

PRO 

CYS 

TYR 

VAL 

C thu hồi 

(uM) 

176,001 


( µM) 

R% 

88,00 

157,471 78,74 

191,303 95,65 

200 

196,048 98,02 

185,632 92,82 

187,808 93,90 

87,504 

87,50 

81,174 81,17 

96,101 96,10 

200 

81,674 81,67 

95,456 95,46 

84,342 84,34 

174,539 

87,27 

161,67 80,84 

200,278 100,14 

200 

184,813 92,41 

195,677 97,84 

189,599 94,80 

165,618 

82,81 

183,872 91,94 

217,919 108,96 

200 

210,614 105,31 

212,378 106,19 

199,639 99,82 

R% 

trung bình 

RSD% 

91,19 7,63 

83,85 7,58 

92,21 7,75 

99,17 10,12 


Bảng 3.4 Độ lặp lại của Proline Cysteine Tyrosine Valine 





39 











Tên chất 

MET 

LYS 

ILE 

LEU 

C thu hồi 

(uM) 

187,492 


( µM) 

R% 

93,75 

190,21 95,11 

190,29 95,15 

200 

192,137 96,07 

191,742 95,87 

209,431 104,72 

184,838 

92,42 

250,146 125,07 

220,34 110,17 

200 

216,974 108,49 

220,967 110,48 

187,953 93,98 

192,296 

96,15 

195,943 97,97 

226,218 113,11 

200 

221,846 110,92 

224,722 112,36 

195,639 97,82 

164,848 

82,42 

154,885 77,44 

200,939 100,47 

200 

196,961 98,48 

200,135 100,07 

192,166 96,08 

R% 

trung bình 

RSD% 

96,78 4,11 

106,77 11,34 

104,72 7,84 

92,49 10,79 


Bảng 3.5 Độ lặp lại của Methionine Lysine Isoleucine Leucine Phenylalanine 





40 








Tên chất 

C thu hồi 

(uM) 


(µM) 

R% 

R% 

trung bình 

RSD% 




PHE 

175,457 

87,73 

176,67 88,34 

184,719 92,36 

200 

184,663 92,33 

184,647 92,32 

203,308 101,65 

Bảng 3.1 Độ lặp lại của Phenylalanine 

92,46 5,39 

Ngoài độ lặp lại thì đánh giá hiệu suất thu hồi là một yếu tố để đánh giá phương 

pháp phân tích. Đánh giá độ thu hồi là đánh giá độ tin cậy của phương pháp xử lý 

mẫu. Công thức tính độ thu hồi được nêu ở mục 1.4.2. Kết quả thu được ở bảng 3.1 

– 3.5 với độ thu hồi (R%) của các amino acid khá cao đạt khoảng 85% đến 115 %. 

Từ các bảng cho ta thấy khi đo lặp lại 6 lần ở nồng độ 200 µM thì RSD% < 

12%, độ thu hồi đạt khoảng 80% đến 110%. Theo quy định AOAC, quy trình phân 

tích amino acid bằng HPLC là đáng tin cậy, hoàn toàn có thể áp dụng trên các mẫu 

thực tế. 






41 











3.2. Phân tích mẫu thực tế 

3.2.1. Quy trình xử lý mẫu 

Cân W(g) mẫu 

+ 2ml HCl đặc 37% 

+ 1 tinh thể phenol với acid 

Đậy nắp, thủy phân ở 112-116 o C trong 20-24 giờ 

Làm lạnh, mở vial 

Chỉnh pH=7 bằng NaB 4 O 7 0,25M 

Định mức 20, 50 ml bằng nước 

Lọc qua màng 0,2 µm 

Dẫn xuất hóa: điều nhiệt ở 55 o C, lấy 10 µl dịch trên 

Lắc Vortex trong vài giây 

Để yên 1 phút 

Chuyển sang vial 1,5 ml 

+ 10 µl nội chuẩn (20 µM) 

+ 60 µl đệm borate 

Điều nhiệt 55 o C trong 10 phút 

Chạy HPLC-FD 

+ 20 µl chất phản ứng 






42 











3.2.2. Độ chính xác của phép đo 

Các mẫu được chọn được Viện công nghiệp thực phẩm cung cấp và được mua 

thêm ngoài thị trường (bao gồm 5 mẫu). 5 mẫu sản phẩm được xử lý, phân tích như 

phần 3.2.1. Kết quả thu được sắc ký đồ của các mẫu biểu diễn ở hình 3.19, 3.20 và 

phần phụ lục 1-8. Nồng độ các chất thu được quy đổi theo công thức: 

Co × V × F 

C(µM) = (µM) 

W 

Nồng độ các chất amino acid của mẫu 0317050 được xử lý và biểu diễn ở bảng 

3.6. Các chỉ tiêu amino acid của mẫu dao động trong khoảng 1-5% được cho là phù 

hợp và có tác dụng bổ sung tốt cho cơ thể. 

Hình 3.20 Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317050) test A 


Hình 3.21 Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317050) test B 





43 











Chỉ tiêu 

Acid 

Glutamine 

Tyrosine 

Leucine 

Cysteine 

Lysine 

Glycine 

Alanine 

Proline 

Valine 

Isoleucine 

Methionine 

Test 

W V Co C Ctb Ctb 

F 

(ml/g) (ml) (M) (mg/100g) (mg/100g) (%) 

A 0,1016 50 12,5 59,504 5358,60 

B 0,1013 50 10 74,365 5400,46 

5393,03 5,39 

A 0,1016 50 12,5 13,315 1484,10 

B 0,1013 50 10 16,628 1487,08 

1485,59 1,49 

A 0,1016 50 12,5 24,521 1978,60 

B 0,1013 50 10 30,682 1986,46 

1982,53 1,98 

A 0,1016 50 12,5 17,452 130,06 

B 0,1013 50 10 17,786 106,36 

118,21 0,12 

A 0,1016 50 12,5 15,678 1409,92 

B 0,1013 50 10 18,991 1370,33 

1390,13 1,39 

A 0,1016 50 12,5 24,850 1147,57 

B 0,1013 50 10 32,640 1209,42 

1178,49 1,18 

A 0,1016 50 12,5 17,170 940,99 

B 0,1013 50 10 21,946 965,04 

953,02 0,95 

A 0,1016 50 12,5 15,175 1074,74 

B 0,1013 50 10 19,148 1088,81 

1081,42 1,08 

A 0,1016 50 12,5 26,124 1882,66 

B 0,1013 50 10 32,738 1893,04 

1887,85 1,89 

A 0,1016 50 12,5 18,123 1462,38 

B 0,1013 50 10 23,129 1497,48 

1479,93 1,48 

A 0,1016 50 12,5 23,036 211,44 

B 0,1013 50 10 30,298 223,14 

217,29 0,22 

Phenylalanin A 0,1016 50 12,5 11,078 1125,72 B 0,1013 50 10 12,596 1027,02 

1076,37 1,08 

Serine 

A 0,1016 50 12,5 65,858 425,75 

B 0,1013 50 10 94,893 492,22 

458,98 0,46 

Threonine 

A 0,1016 50 12,5 12,176 892,17 

B 0,1013 50 10 14,191 834,31 

863,24 0,86 

Acid A 0,1016 50 12,5 38,311 3137,04 

Aspartic B 0,1013 50 10 48,493 3186,03 

3161,54 3,16 

Hystidine 

A 0,1016 50 12,5 15,960 1523,29 

B 0,1013 50 10 23,416 1793,24 

1658,27 1,66 

Arginine 

A 0,1016 50 12,5 32,102 3440,06 

B 0,1013 50 10 38,496 3309,97 

3375,02 3,38 

Bảng 3.6 Nồng độ các amino acid của mẫu 0317050 






44 











KẾT LUẬN 

Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương 

pháp sắc ký lỏng HPLC - RF xác định hàm lượng amino acid trong thực phẩm chức 

năng chúng tôi thu được kết quả bao gồm: 

1. Điều kiện tối ưu cho hệ thống HPLC 

Điều kiện hệ thống sắc ký lỏng HPLC - FLD (Agilent); Cột tách: Waters 

AccQ.Tag 3.9x150mm; Thời gian chạy: 55 phút; Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Thể tích 

bơm: 10 µl; Nhiệt độ cột: 40 ºC ; Dung môi: Acetonitrile : H 2 O = 95 : 5 (A), Đệm 

Eluent A : H 2 O = 10 : 90 (B) 

Chương trình Gradient: 

Thời gian % A %B 

0 – 0,5 1 -2 99 -98 

15 -19 7 - 10 93 - 90 

32 - 33 33 67 

34 - 37 100 0 

38 - 50 0 100 

51 - 55 1 99 

2. Đánh giá phương pháp phân tích: 

Xác định giới hạn phát hiện LOD là 1,5 µM ( riêng Cysteine là 0,75 µM). Xây 

dựng đường chuẩn, phương trình hồi quy tuyến tính của các amino acid trong khoảng 

tuyến tính 5–100 µM; hệ số tương quan tuyến tính R 2 ≥ 0,996; hiệu suất thu hồi R% 

trung bình là 80% đến 110%; độ lệch chuẩn tương đối RSD% có giá trị nhỏ hơn 12%. 

3. Phân tích hàm lượng amino acid trong mẫu thực phẩm chức năng 

Tiến hành áp dụng phương pháp phân tích trên 5 đối tượng mẫu trên địa bàn 

Hà Nội. Các mẫu đều có hàm lượng các amino acid dao động khoảng 1-5% . 

Nhận xét: Từ các kết quả thu được chúng tôi nhận thấy có thể áp dụng 


phương pháp sắc ký lỏng HPLC –RF để phân tích hàm lượng Amino acid với độ tin 

cậy cao, phù hợp cho việc phân tích trong các mẫu thực phẩm chức năng. 





45 











Danh sách Phụ Lục 

Phụ Luc 

Phụ lục 1. Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317011) test A 

Phụ lục2 . Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317011) test B 


Phụ lục 4. Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317015) test B 





Phụ lục 9. Sắc ký đồ độ lặp lại mẫu amino acid lần 1 











46 












Phụ lục 2 . Sắc ký đồ mẫu amino acid (0317011) test B 







47 



















48 



















49 



















50 


















51 











TÀI LIỆU THAM KHẢO 

• Tài liệu tiếng Việt 

[1] Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa 

học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản Khoa học 

và Kỹ thuật Hà Nội. 

[2] Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường 

ĐH KHTN - ĐHQG Hà Nội. 

[3] Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH Quốc 

gia Hà Nội. 

[4] Hóa sinh công nghiệp, Lê Ngọc Tú, NXB KHKT HN, 2002. 

[5] Phạm Hùng Việt (2005) Sắc ký khí Cơ sở lí thuyết và khả năng ứng dụng 

Bộ Y Tế, Nhà xuất bản y học. 

[6] Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp 

trong phân tích hóa học & vi sinh vật, NXB Khoa học và Kĩ thuật. 

[7] Thực phẩm chức năng – Sức Khỏe Bền Vững, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật. 

• Tài liệu tiếng Anh 

[7] Abdel-Aal, E.-S. M., & Hucl, P. (2002). Amino acid composition and in vitro 

protein digestibility of selected ancient wheats and their end products. Journal of 

Food Composition and Analysis, 15, 737–747. 

[8] Bani Rashaid, A., Jackson, G., & Harrington, (2014). Quantitation of amino acids 

in human hair by trimethylsilyl derivatization gas chromatography. Mass 

Spectrometry. Enliven: Bio Anal Techniques. 

[9] C. Aoyama, T. Santa, M. Tsunoda, T. Fukushima, C. Kitada, K. Imai, Biomed. 

(2004), A fully automated Amino acidanalyzer using NBD-F as a fluorescent 

derivatization reagent. Chromatogr. 18, 630 

[10] Catherine Cooper, Nicolle Packer, Kate Williams,Humana Press, Amino acid 

protocol, 253 pages. 


[11] E. Takach, T. O’Shea, H. Liu, (2014), High-throughput quantitation of amino 

acids in ratnd mouse biological matrices using stable isotope labeling and UPLC- 

MS/MS analysis, J. Chromatogr. B. 





52 











[12] Kelly, M.T., Blaise, A., Larroque, M., (2010). Rapid automated high 

performance liquid chromatography method for simultaneous determination of 

amino acids and biogenic amines in wine, fruit and honey. Journal of 

Chromatography A 1217. 

[13] M.J. de Paiva, H.C. Menezes, P.P. Christo, R.R. Resende, Z.L. Cardeal, (2013). 

An alternative derivatization method for the analysis of amino acids in cerebrospinal 

fluid by gas chromatography–mass spectrometry, J. Chromatogr. B 931. 

[14] Nozal, M.J., Bernal, J.L., Toribio, M.L., Diego, J.C., Ruiz, A, (2004), Rapid and 

sensitive method for determining free amino acids in honey by gas chromatography 

with flame ionization or mass spectrometric detection. Journal of Chromatography 

A. 

[15] Mei Musa Ali Omar, Abdalla Ahmed Elbashir, Oliver J. Schmitz, (2016). 

Capillary electrophoresis method with UV-detection for analysis of freeamino acids 

concentrations in food. 

[16] R. Y. Yada, (2004), Protein in Food processing, Woodhead Publishing Limited 

and CRC Press LLC. 

[17] Shigeki Akamatsu, Takao Mitsuhashi,(2013), Development of a simple 

analytical method using capillary electrophoresistandem mass spectrometry for 

product identification and simultaneous determination of free amino acids in dietary 

supplements containing royal jelly. Journal of Food Composition and Analysis 30, 

47-51. 

[18] Takano, Y., Kashiyama, Y., Ogawa, N.O., Chikaraishi, Y., Ohkouchi, N, (2010), 

Isolation and desalting with cation-exchange chromatography for compound-specific 

nitrogen isotope analysis of amino acids: application to biogeochemical samples. 

Rapid Commun Mass Spectrom. 24, 2317–2323. 

[19] U. Harder, B. Koletzko, W. Peissner, (2011), Quantification of 22 plasma amino 

acids combining derivatization and ion-pair LC–MS/MS, J. Chromatogr. B 879, 

495-504. 

[20] Wang Xing, Chi Yumei, Kang An, (2014), Qualitative and quantitative analysis 


of the amino acids in Rhizoma Arisaematis by ultra high performance liquid 

chromatography-tandem mass spectrometry and high performance liquid 

chromatography, Nanjing University of Traditional Chinese Medicine. 





53 











[21] Webb, E.C., Honch, N.V., Dunn, P.J.H., Eriksson, G., Lidén, K., Evershed, R.P, 

(2015), Compound-specific amino acid isotopic proxies for detecting freshwater 

resource consumption. J. Archaeol. Sci. 63, 104–114. 

[22] Z.T. How, F. Busetti, K.L. Linge, I. Kristiana,C.A. Joll, J.W.A. Charroi, (2014), 

Analysis of free amino acids in natural waters by liquid chromatography–tandem 

mass spectrometry, J. Chromatogr. A 1370, 135–146. 






54

Nghiên cứu, xác định thành phần Amino acidtrong thực phẩm chức năng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) - 2018

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?