BÁO CÁO THỰC HÀNH CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI (2018)

https://twitter.com/daykemquynhon 

plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

https://daykemquynhon.blogspot.com 

http://daykemquynhon.ucoz.com 

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / 

Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định 

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP TPHCM 

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM 

---------- 

BÁO CÁO THỰC HÀNH 

CÁC PHƯƠNG PHÁP 

PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI 

GVHD: Nguyễn Thị Ngần 

NHÓM : 1-SÁNG THỨ 2 

LỚP: 

DHTP11D 

1.Huỳnh Lâm Kim Khánh 

2.Lê Hoàng Phúc 

3.Nguyễn Văn Vủ 

4.Nguyễn Thị Hồng Nguyên 

5.Nguyễn Thị Lịch 

6.Dương Thị Bảo Ngọc 

7.Trần Thùy Linh 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÝ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

TP HCM, tháng 11, năm 2018 

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM 

HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO) 

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/ 

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial





BẢNG PHÂN CÔNG 




STT HỌ VÀ TÊN MSSV NHIỆM VỤ 

1 Huỳnh Lâm Kim Khánh 15038201 Tổng hợp word 

2 Lê Hoàng Phúc 15041791 Bài 1: Trích ly dầu hạt thực vật bằng 

thiết bị Soxlet 

Thuyết trình powerpoint bài 4 

3 Nguyễn Văn Vủ 15078011 Bài 2: Sử dụng sắc ký bảng mổng (TLC) 

xác định thành phần chất màu trong rau 

củ 

4 Nguyễn Thị Hồng Nguyên 15040891 Bài 3: Phân lập các hợp chất màu từ rau 

củ bằng phương pháp sắc ký cột 

5 Nguyễn Thị Lịch 15092391 Bài 4: Phương pháp chuẩn độ điện thế 

6 Dương Thị Bảo Ngọc 15044891 Bài 5: Trích ly caffeine bằng phương 

pháp chiết pha rắn (SPE) 

7 Trần Thùy Linh 15043651 Powerpoint bài 4:Phương pháp chuẩn độ 

điện thế 






2 











MỤC LỤC 

BẢNG PHÂN CÔNG .........................................................................................................2 

BÀI 1: TRÍCH LY DẦU HẠT THỰC VẬT BẰNG THIẾT BỊ SOXTEC .......................6 

A. TỔNG QUAN............................................................................................................6 

1. Giới thiệu chung .....................................................................................................6 

2. Hóa chất..................................................................................................................6 

3. Thiết bị ...................................................................................................................6 

B. CÁCH TIẾN HÀNH .................................................................................................8 

1. Nguyên tắc chung ...................................................................................................8 

2. Chuẩn bị mẫu .........................................................................................................8 

3. Quá trình chiết ........................................................................................................9 

C. KẾT QUẢ ................................................................................................................11 

1. Kết quả .................................................................................................................11 

2. Kết luận ................................................................................................................11 

Bài 2: SỬ DỤNG SẮC KÝ BẢNG MỎNG (TLC) XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CHẤT 

MÀU TRONG RAU CỦ ...................................................................................................15 

A. TỔNG QUAN..........................................................................................................15 

1. Giới thiệu chung ...................................................................................................15 

2. Thiết bị và hóa chất ..............................................................................................16 

B. CÁCH TIẾN HÀNH ...............................................................................................17 

1. Nguyên tắc............................................................................................................17 

2. Chuẩn bị dịch chiết ...............................................................................................17 

3. Cách tiến hành ......................................................................................................18 

C. KẾT QUẢ ................................................................................................................25 

BÀI 3: PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT MÀU TỪ RAU CỦ BẰNG PHƯƠNG PHÁP 

SẮC KÝ CỘT ....................................................................................................................26 


A. TỔNG QUAN..........................................................................................................26 






3 











2. Thiết bị: ................................................................................................................27 

3. Hóa chất................................................................................................................27 


1. Nguyên tắc chung .................................................................................................27 

2. Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................28 

3. Tiến hành ..............................................................................................................29 

4. Thuyết minh quy trình ..........................................................................................29 

5. Xử lý sự cố ...........................................................................................................34 

C. KẾT QUẢ ................................................................................................................35 

D. Tài liệu tham khảo ...................................................................................................36 

BÀI 4: PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ ĐIỆN THẾ ..........................................................37 

A. TỔNG QUAN..........................................................................................................37 

1. Định nghĩa: ...........................................................................................................37 

2. Đặc điểm: .............................................................................................................37 

3. Ưu-nhược điểm của phương pháp: .......................................................................37 

4. Hóa chất: ..............................................................................................................37 

5. Thiết bị: ................................................................................................................38 


1. Nguyên tắc chung: ................................................................................................38 

2. Quy trình tiến hành:..............................................................................................39 

3. Quy trình sử dụng thiết bị: ...................................................................................40 

C. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT ....................................................................................44 

1. Kết quả: ...................................................................................................................44 

2. Nhận xét: .................................................................................................................46 

BÀI 5: TRÍCH LY CAFEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN (SPE) ..........47 

A. TỔNG QUAN..........................................................................................................47 



2. Hóa chất................................................................................................................49 

3. Thiết bị .................................................................................................................49 





4 











B. CÁCH TIẾN HÀNH: ..............................................................................................51 

1. Nguyên tắc chung .................................................................................................51 

2. Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................53 

3. Quá trình tiến hành ...............................................................................................55 

C. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT ....................................................................................57 

1. Kết quả .................................................................................................................57 

2. Nhận xét ...............................................................................................................57 






5 








BÀI 1: 




TRÍCH LY DẦU HẠT THỰC VẬT BẰNG THIẾT BỊ SOXTEC 

A. TỔNG QUAN 

1. Giới thiệu chung 

Hệ ly trích SoxtecTM Avanti 2055 – Thế hệ mới của hệ ly trích bằng dung môi thủ 

công để xác định an toàn các chất hòa tan trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, đất, 

polymers, vải, giấy, bột giấy, … 

Chức năng thời trình được tách riêng cho từng bước ly trích làm cho việc lập trình 

và qui trình có khả năng lập lại một cách thuận lợi: chỉ cần một thao tác để di chuyển tất 

cả các mẫu cùng một lúc; có công cụ để phân tích đồng thời nhiều mẫu, làm tăng hiệu 

suất phòng thí nghiệm; dung môi được thêm vào trong một hệ thống kép kín nên hạn chế 

việc phơi nhiễm đối với người điều khiển máy; thể tích thimble lớn 65 ml; được công 

nhận chính thức bởi các tổ chức quốc tế như AOAC 991.36 (thịt), SCAN-CM 49:93 

(giấy/bột giấy), Phương pháp EPA 3541 (PAH trong đất) 

Đây cũng là hệ thống trích ly hiệu quả cho quá trình trích ly chất béo trong thực 

phẩm. Do đó, việc vận dụng hệ thống trích ly này đối với việc trích ly thực phẩm là vô 

cùng cần thiết. 

2. Hóa chất 

- Henxan 

- Mẫu hạt thực vật: đậu phộng. 

- Ống nghiệm 

3. Thiết bị 

• Hệ ly trích SoxtecTM Avanti 2055 

Hệ SoxtecTM Avanti 2055 là thế hệ mới của hệ ly trích Soxhlet bằng thủ công. Hệ 

thống được thiết kế nhằm tạo thuận lợi cho người sử dụng thông qua việc xử lý 6 mẫu 

một lần, cho phép giảm tối đa các thao tác trên hệ thống. 

Hệ thống tự động Soxtec 2055 bao gồm: 






6 











1 Bộ phận chiết 13 Khay đựng cốc 

2 Bộ phận điều khiển 14 Các cốc chiết ( 6 bộ) 

3 Bộ phận xử lý 15 Ống thoát nước 

4 Ống đỡ Thimble (7 bộ) 16 ống bổ sung dung môi 

5 Giá cầm tay giữ thimble 17 Cáp nguồn 

6 Các thimble (25 bộ) 18 Cáp mở rộng 15 pin (D-sub) 

7 Bộ tiếp hợp thimble (bộ 6) 19 Tấm gắn cho bộ phận xử lý 

8 Dụng cụ cầm thimble 20 Vòng kim loại 

9 Dụng cụ lấy cốc 21 Ống 

10 Giá đựng thimble kim loại 22 Cáp 

11 Ống nước làm mát 23 Hướng dẫn sử dụng 


12 Giá đựng cốc 24 Ống dẫn khí 





7 











• Thông số kỹ thuật 

- Hệ thống bao gồm: Bộ phận ly trích, Bộ phận điều khiển. 

- Thể tích thimble tối đa: Approx. 65 ml (33 x 80 mm) 

- Tổng thể tích dung môi: 70-90 ml 

- Số lượng mẫu: 6 mẫu/lần hoặc 36 mẫu/ngày. 

- Tốc độ trích: từ 40 đến 60 phút tùy loại áp dụng 

- Khoảng đo: từ 0.1 đến 100% béo. 

- Độ lặp lại: ± 1% hoặc thấp hơn (5-100%). 

- Thời gian gia nhiệt từ 20 o C đến 280 o C: 7-9 phút (với điện 230V). 

B. CÁCH TIẾN HÀNH 

1. Nguyên tắc chung 

Tinh dầu từ hạt điều được trích ly bằng dung môi hexan với kỹ thuật chiết Soxtec. 

Hàm lượng tinh dầu được tính từ lượng cân sau khi sấy đến khối lượng không đổi. 

2. Chuẩn bị mẫu 

- Mẫu hạt thực vật (đậu phộng, hạt điều..) cần xác định hàm lượng lipid được xay nhuyển 

trước khi tiến hành. Cân khoảng 5 gam mẫu cho vào thimble dùng cho quá trình trích ly. 

- Dung môi sử dụng trong quá trình trích ly là hexan (15 ml) tổng dung môi cần sử dụng 

là 90ml. 

Mẫu hạt thực 

vật 

Xay nhuyễn 

Cân 5gram (m 1 ) 

Cho vào thimble 






8 








3. Quá trình chiết 




Cân cốc trích ly 

(m 2 ) 

Lắp giá đỡ vào các 

ống lọc 

Lắp vào thiết bị 

Cho 15ml hexan vào 

mỗi ống thimble 

Vận hành máy 

Lấy ống chiết 

Sấy 105 0 C trong 30 

phút 

Làm nguội 

Đem cân (m 3 ) 

Khối 

lượng dầu 






9 











Sau khi cho mẫu đã xay vào các thimble thì các thimble này được gắn vòng sắt vào 

đầu và được đặt vào ống đỡ để giữ cân bằng. Sau đó ta tiến hành cân các cốc trích ly 

được đánh dấu từ 1 đến 6 (m 2 ). Mở van nước cho hệ thống nước mát chạy tuần hoàn 

trong máy, sau đó gạt hai tay điều khiển lên mức cao nhất. Lắp ống đỡ vào giá giữ và lắp 

vào máy. Gạt 2 tay điều khiển xuống mức thấp nhất, rồi gạt lên lại vị trí đầu, lấy giá giữ 

ra. Lấy cốc trích ly vào giá giữ cốc và gắn vào máy. Gạt hai tay điều khiển xuống mức 

thấp nhất, đóng tấm kính lại và bơm dung môi vào máy mỗi ống ta bom 15 ml hexan tổng 

dung môi cần sử dụng là 90ml hexan. Mở công tắc nguồn và mở khóa ta cài đặt thông số 

tối đa đối với dung môi hexan là 210 o C sau đó gặt xuống khóa lại. Tiếp tục ta chỉnh các 

thông số sau thời gian đun sôi (20 phút), thời gian trích lý (40 phút), thời gian thu hồi (10 

phút), thời gian làm khô (5 phút). Sau khi cài đặt xong ta bấm nút Start để tiến hành vận 

hành máy. Khi nhiệt độ máy lên đến nhiệt độ cần điểu chỉnh, ta sẽ nhấn nút có biểu tượng 

hình chiếc đồng hồ để thay đổi chế độ lần lượt các thông số trên. Sau khi kết thúc ta tiến 

hành thu các cốc trích ly đem sấy ở 105 0 C trong 30 phút sau đó làm nguột trong bình hút 

ẩm. Khi các cốc đã nguội ta tiến hành cân xác định m 3 , tính toán tìm được khối lượng của 

dầu và phần trăm dầu có trong mẫu ban đầu. 

❖ Khi tiến hành quá trình tách chiết ta cần có những lưu ý sau đây: 

- Cần gắn thật chắc và cố định các vòng sắt vào các thimble, không được phép để 

hở hoặc gắn bị méo. Vì khi trong quá trình tách chiết dầu do thao tác máy thì các thimble 

có thể bị rơi xuống vì gắn không chặt sẽ ảnh hưởng đến quá trình trích củng như sấy và 

làm nguội. Làm cho mẫu đó không còn tính chính xác, và có thể làm lại mẫu đó. 

- Lưu ý đến nhiệt độ trong lúc vận hành. Cần chú ý đến nhiệt độ trong máy và nhiệt 

độ bắt đầu trích dầu. Khi nhiệt độ trong máy sau khi nhấn nút Start thì phải lên đến 160 0 C 

là nhiệt độ bắt đầu trích thì lúc đó ta mới nhấn nút có biểu tượng đồng hồ để chuyển chế 

độ khác theo các theo số trên. 

- Ta gạt cần 2 bên theo đúng chế độ của máy và theo đúng hình được in trên thiết bị. 

Tránh trường hợp máy đang ở chế độ này và gạt cần chế độ khác. Ví dụ khi máy đang ở 

chế độ trích béo thì cần bên trái lúc đầu ở mức dưới cùng thì phải gạt lên một nắt để đúng 

theo chế độ của máy thì hiệu suất trích béo đạt yêu cầu cao nhất, còn nếu làm không gạt 

lên một nứt thì không thể thực hiện quá trình trích béo được. 

- Ta phải luôn phải mở nước khi bắt đầu trích, để cho máy có dòng nước để tuần 

hoàn. 

- Khi ta tiến hành trích béo xong thì ta cần phải thu hồi lượng dung môi lưu trữ 

trong máy. Dung môi đươc lưu trữ ở góc cuối phía trên phải của máy, lưu ý rằng phải để 

cho dung môi nguội thì mới thu hồi được vì vẫn còn nóng do quá trình trích béo. 

- Thiết bị sấy ở phòng F06.08 ta cần phải mở trước 30 phút trước khi sấy để cho 

nhiệt độ trong thiết bị sấy có thể lên được 105 0 C, tiết kiệm được thời gian thực hiện. 


10 















- Các cốc trích ly cần được phải làm nguội trong bình hút ẩm tránh làm nguội ở bên 

ngoài. Vì sẽ khá tốn thời gian khi làm nguội ở bên ngoài và dầu có thể bị oxy hóa vì để 

tiếp xúc với oxi ngay nhiệt độ cao thì sẽ dễ xảy ra phản ứng oxy hóa của dầu. 

- Cốc trích ly sau khi làm nguội ta cần phải thì giấy tiến hành lau xung quanh cốc và 

điều chỉnh lại cân cho đúng trọn tâm hoặc làm vệ sinh cân trước khi cân. Nếu làm như 

vậy thì sẽ gây sai số đến kết quả. 

C. KẾT QUẢ 

1. Kết quả 

Sau khi ta tiến hành trích béo trong mẫu đậu phộng thì ta thu được kết quả sau đây: 

STT m1-gr m2-gr m3-gr Dầu-gr % dầu/mẫu 

1 5.03 44.28 44.52 0.24 4.77 

2 4.97 44.36 44.44 0.08 1.6 

3 5.03 44.23 45.04 0.81 16 

4 5.14 44.18 44.32 0.14 2.73 

5 4.95 44.16 45.3 1.14 23.03 

6 4.97 44.25 45.05 0.79 15.89 

Trong đó: 

m 1 : khối lượng mẫu ban đầu (gram). 

m 2 : khối lượng cốc trích ly (gram). 

m 3 : khối lượng cốc và dầu (gram). 

Công thức tính phần trăm dầu trong mẫu ban đầu như sau: 

X = ( m 3−m 2 

) x 100 (%) 

m 1 

2. Kết luận 

Nhìn một cách tổng thể thì % dầu/mẫu của các mẫu từ 1 đến 2 không có đồng đều 

với nhau, có sự chênh lệch rất lớn giữa các mẫu cho dù cùng làm chung một điều kiện 

nhất định. 






11 











Vì có một số lý do mà dẫn đến kết quả như vậy, gồm có: 

• Do là nhóm thực hiện đầu tiên chưa có kinh nghiệm thực hành trên thiết bị 

Soxtec này, nên quá trình thực hiện còn bỡ ngỡ thao tác không nhanh nhẹn và 

chuẩn xác. Và còn phụ thuộc nhiều vào giảng viên hướng dẫn, không có kinh 

nghiệm xử lý vấn đề khi có trường hợp xấu xảy ra. 

• Tìm hiểu tài liệu chưa kỹ, nên lượng dung môi sử dụng trong quá trình không đủ 

để trích béo với lượng mẫu ban đầu sử dụng là gần 5 gram. Nhưng thực tế không 

sử dụng đúng 5 gram vì dung môi sử dụng chỉ có 15ml trên một mẫu nên cần 

phải tính lại lượng mẫu cần sử dụng để hiệu suất trích là tốt nhất. 

• Ngoài ra số thứ tự bom dung môi vào các mẫu không đồng nhất, tức là những 

mẫu chưa bom và bom 2 lần dung môi. 

• Thao tác thực hiện chậm chạp, vụng về khi gắn các vòng sắt vào thimble không 

khít nên trong quá trình bị rơi xuống làm ảnh hưởng trực tiếp đến mẫu thực 

nghiệm. 

Qua một số lỗi mà nhóm mắc phải, thì nhóm đã rút ra kinh nghiệm cho bản thân 

khi ta thực hiện trên thiết bị Soxtec nói riêng và các thiết bị khác nói chung. Là cần phải 

cẩn thận. chính xác, tỉ mỉ và quan trọng là xem kỹ tài liệu trước khi ta tiến hành một cuộc 

thí nghiệm nào đó. 

Phụ lục 

Sau đây là một số hình ảnh trong quá trình thực hiện trích béo bằng thiết bị Soxtec: 


Hình 1. Các thimble để đựng mẫu trong quá trình trích béo 





12 











Hình 2. Các cốc trích ly và giá đỡ 

Hình 3. Quá trình trích béo bằng thiết bị Soxtec 






13 











Hình 4. Bàn điều khiển thiết bị Soxtec 

Hình 5. Thiết bị bom dung môi thủ công 






14 











Bài 2 

SỬ DỤNG SẮC KÝ BẢNG MỎNG (TLC) 

XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN CHẤT MÀU TRONG RAU CỦ 



Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một trong số các phương pháp sắc ký phổ biến với pha 

tĩnh là một lớp mỏng các hạt hấp phụ (silica gel) được tráng mỏng trên bề mặt một tấm 

rắn (nhựa, nhôm…). Một lượng nhỏ mẫu được triển khai ở gần đáy tấm TLC và tấm 

được đặt trong pha động. Dung môi này được sẽ thấm từ dưới đáy tấm TLC lên phía trên 

đầu nhờ vào hiện tượng mao dẫn. Sự phân tách các hợp chất xảy ra dựa vào sự khác nhau 

về thành phần hóa học và tính chất vật lý, tương tác với các pha tĩnh và pha động với một 

mức độ khác nhau. Yếu tố trì hoãn, giá trị R f , được sử dụng để mô tả và so sánh các thành 

phần của các mẫu khác nhau. 

Các hợp chất màu trong rau quả, hoa và lá có thể được phân tách ra và xác định 

bằng cách sử dụng sắc ký lớp mỏng (TLC). Các sắc tố xanh, được gọi là chất diệp lục, 

đóng vai trò như các phân tử hấp thụ ánh sáng chính của cây. Carotenoid, chất màu vàng, 

hỗ trợ thực vật trong quá trình quang hợp. Ngoài ra, xanthrophyll có trong các lục lạp có 

thể được cô lập và xác định bằng kỹ thuật sắc ký. 






15 











Hợp chất màu Màu sắc Giá trị Rf 

Carotene yellow-orange 0.93 

pheophytin a Grey 0.55 

pheophytin b lt. grey (may not be visible) 0.47-0.54 

chlorophyll a blue-green 0.46 

chlorophyll b Green 0.42 

Xanthophylls Yellow 0.41 



Mục tiêu 

Mục đích của thí nghiệm trong phòng thí nghiệm này là cô lập sắc tố từ vỏ quả 

mãng cầu bằng cách sử dụng sắc ký lớp mỏng. 

2. Thiết bị và hóa chất 

Dụng cụ 

Hóa chất 

Tấm silica gel TLC Hỗn hợp Chloroform : Methanol (90:1) 

Ống mao quản 

Chày và cối 

Pipet 

Ống nghiệm 

An toàn phòng thí nghiệm: 

Hexane 

Acetone 

Dịch chiết vỏ quả mãng cầu 

• Luôn luôn mang áo blouse và kính bảo hộ trong phòng thí nghiệm. 


• Mang bao tay khi xử lý các tấm TLC. 





16 












1. Nguyên tắc 

Sắc ký là phương pháp hóa lý dùng dể tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tác sắc 

ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp 

xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động 

2. Chuẩn bị dịch chiết 

Cồn 96% 

Bột vỏ mãng cầu 

Làm ẩm 

2 giờ 

Cho vào bình chiết 

Ngâm 12 giờ 

Rút dịch chiết tốc độ 10 – 12 

giọt/ phút 

Chiết đến khi dịch chiết nhạt 

màu 

Gộp dịch chiết lại 

Cô quay thu hồi dung 

môi 

Dịch chiết đậm 

đăc 






17 








3. Cách tiến hành 




Dịch chiết vỏ quả 

mãng cầu 

Chuẩn bị bản mỏng 

Chấm bản mỏng 

Đặt vào beaker chứa dung môi 

Chloroform : Methanol (90:1) 

Để yên và theo dỏi việc 

chạy của dung môi 

Kiểm tra phát hiện các 

vết trên bản mỏng 






18 








Thuyết minh 




Chuẩn bị bản mỏng 

Cắt bản mỏng thành các bản nhỏ kích thước khoảng 2.5 cm x 5 cm. Kẻ một đường bút 

chì ở mặt phủ silica, cách cạnh đáy khoảng 0.5cm. ( Không sử dụng bút mực, vì mực sẽ 

hòa tan trong dung môi hữu cơ và tách ra, che lấp hoặc làm nhiễu kết quả ). Từ lề vào 

điểm chấm cách khoảng 0.4-0.5 cm, khoảng cách giữa các điểm chấm khoảng 5cm để 

trách các vệt khi hiện bị dính vào nhau. Ghi đầy đủ thông tin( mẩu gì, số bao nhiêu, hỗn 

hợp dung môi tỉ lệ bao nhiêu). 

Cho các bản mỏng đã khô mặt vào tủ sấy và sấy ở 105 – 110 o C trong 30 phút. Ðể nguội 

rồi bảo quản trong bình hút ẩm. 






19 








Chấm bản mỏng 




Sử dụng ống mao quản hoặc micropipette để chấm mẫu: chấm mẫu rồi chấm nhẹ lên bản 

mỏng và chỉ đủ để mẫu từ ống mao quản chuyển sang bản mỏng. Tốt nhất là chấm 

khoảng 2-3 lần với lượng nhỏ, thời gian mỗi lần >1 giây để giữ mẫu ở trên bản mỏng lâu 

hơn. Đường kính điểm chấm mẫu khoảng 1-2mm. Lượng chất quá lớn làm cho vết sắc ký 

lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp. 

Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được do độ nhạy của thuốc thử không đủ 

(thông thường độ nhạy của các thuốc thử trên 0,005 mg). Lượng mẫu thông thường cần 

đưa lên bản mỏng là 0,1 – 50 mg ở dạng dung dịch. Thể tích dung dịch từ 0,001 ml đến 

0,005 ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng điểm. Ðối với các dung 

dịch có nồng độ rất loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách chấm 

nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm 






20 








Đặt vào beaker chứa dung môi 




Đặt bản mỏng thẳng đứng trong bình triển khai đã chứa dung môi. 

Để yên và theo dỏi 

Đợi và kiểm tra thường xuyên. Không làm dịch chuyển hay chạm vào bản hoặc bình triển 

khai vì có thể gây ra những dao động trong dung môi và làm cho thay đổi quá trình dung 

môi chạy lên bản mỏng. 






21 











Khi dung môi chạy còn cách đỉnh bản mỏng từ 0.5 – 1cm, cẩn thận nhấc bản mỏng ra 

khỏi bình triển khai bằng kẹp. 

Kiểm tra phát hiện các vết trên bản mỏng 

Để các dung môi trên bản mỏng bay hơi. Xác định các hợp chất (Dùng bút chì đánh dấu 

các vị trí đốm có màu mạnh để tránh việc chúng bị mất mầu dần theo thời gian từ đó khó 

có thể đo được giá trị R f của nó) 






22 








Các phương pháp hiện màu: 




- Dùng đèn soi UV sắc ký bản mỏng 






23 











- Nhúng qua dung dịch H 2 SO 4 sau đó đặt trên bếp hồng ngoại nhiệt độ khoảng 

1500-2000 o C đến khi xuất hiện các vết. 






24 












Ta có công thức 

R f = a b 

Kết quả đo: 

a= 3.4 cm 

b= 4 cm 

R f = a = 3.4 

= 0.85 cm 

b 

4 






25 












BÀI 3 

PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT MÀU TỪ RAU CỦ 

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT 


Trong sắc ký cột, chất hấp phụ hay chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong 1 

ống hình trụ được gọi là “cột”. Tùy theo tính chất của chất được được sử dụng làm cột 

mà quá trình tách trong cột sẽ xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ), cơ chế 

phân bố (cột phân bố) hay cơ chế trao đổi ion (cột trao đổi ion).. Ở đây chỉ trình bày sắc 

ký cột hấp phụ. 

Hình 1. Bộ sắc ký cột 






26 








2. Thiết bị: 

Cột sắc ký 

Phễu 




Erlen 50 mL 

Cối và chày sứ 

Becher 100 mL 

Giá đỡ 

Pipette 10 mL 

Becher 400 mL 

Kẹp và vòng 

Mút 


Silicagel 40 Chloroform Methanol 



Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống thủy tinh thẳng đứng gọi là “cột” với 

chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy qua chất 

hấp phụ. 

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa 

tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau. 

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thừơng dùng là oxid nhôm, silicagel, CaCO 3 , than hoạt 

tính, polyamid, …Các chất này phải được tiêu chuẩn hóa. 

Dung môi dùng trong sắc ký cột có thể là từng loại riêng biệt hoặc hỗn hợp 2, 3 loại 

dung môi có tỉ lệ thích hợp. 

Với các chất hấp phụ cổ điển, dung môi sử dụng có độ phân cực tăng dần. Cột là 

những ống làm bằng thủy tinh, đầu dưới có khóa, đầu trên có nút mài để nối với một phễu 

chứa dung môi, loại này thường được bán sẵn trên thị trường với nhiều loại kích cỡ lớn 

nhỏ. Hoặc cột cũng có thể tự lắp bằng một ống thủy tinh thường, đầu dưới nhỏ nối với 

một ống cao su, dùng khóa kim loại để điều chỉnh tốc độ chảy của dung môi 






27 











Việc lựa chọn kích thước cột rất quan trọng. Thông thường cột có đường kính nhỏ và 

chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt. Một vài cột bán sẵn trên thị trường có kích thước 

tương ứng với chiều dài và kích thước cột: 


Hình 2. Lựa chọn đường kính cột sơ bộ 

Cồn 96% 

Bột vỏ 

mãng cầu 

Làm ẩm 

2 giờ 

Cho vào bình 

chiết 

Ngâm 12 giờ 

Rút dịch chiết tốc độ 

10 – 12 giọt/ phút 

Chiết đến khi dịch 

chiết nhạt màu 

Gộp dịch chiết 

lại 






Dịch 

chiết 

đậm đặc 

28 

Cô quay thu hồi 

dung môi 











3. Tiến hành 

4. Thuyết minh quy trình 

• Chuẩn bị cột 

- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô. 

- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). 

- Kẹp cột thẳng đứng trên giá. 

Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn dùng làm cột phải phân tán đồng đều ở mỗi 

điểm trong cột và tạo thành một khối đồng nhất. 

Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột. 

Tỷ lệ = 

Chuẩn bị cột 

Nhồi cột 

Đưa chất phân tích 

vào cột 

Rửa cột 

Trọng lượng chất phân tích 

Trọng lượng chất hấp phụ 

20g 

Silicagel 

Hòa tan 

Tùy thuộc vào khả năng tách của chất hấp phụ mà tỷ lệ này thay đổi, thông thường 

dựa vào việc phân tích trên TLC mà quyết định tỷ lệ này từ 1/20, 1/50, 1/100,… 

Chloroform 

: Methanol 

(90:1) 






29 











Hình 3. Hướng dẫn tỷ lệ silica/mẫu phụ thuộc vào khả năng tách trên bản mỏng. 

• Nhồi cột (Nhồi cột ướt) 

- Chất hấp phụ là silicagel với các cỡ hạt nhỏ 40-60mm (230-400 mesh) được 

ngâm trong dung môi Chloroform : Methanol (90:1) một thời gian trước khi 

cho vào cột để tránh làm nứt cột. Lắc, trộn đều bột hấp phụ với dung môi thành 

một hỗn hợp dịch, rót vào cột, chất hấp phụ sẽ lắng tự nhiên xuống đáy cột. 

Hỗn dịch dung môi và chất hấp phụ không nên quá sệt để tránh bọt khí bị giữ 

trong cột và cũng không nên quá lỏng để rót nhiều lần vào cột. Chú ý trong quá 

trình nhồi cột, dung môi vẫn liên tục chảy đều ra bình hứng, và không được để 

khô dung môi trong cột. Sau khi chất hấp phụ được cho hết vào cột, dung môi 

vẫn tiếp tục được rót và hứng thêm một khoảng thời gian nữa để cột hoàn tòan 

ổn định. 

- Sử dụng dụng cụ chuyên dùng để nhồi cột, gõ nhẹ vào bề mặt cột để loại bỏ 

bọt khí ra khỏi cột, đồng thời giúp lớp silicagel được nén chặt hơn. 

- Cột sau khi nhổi được để ổn định 24 giờ trước khi cho chất phân tích vào. Cần 

giữ một lượng dung môi nhất định( 2- 3 cm )trên bề mặt của silicagel để tạo 

lực nén và giữ cho silicagel không bị khô. 

- Dùng một lớp giấy bạc bọc đầu trên của cột lại để tránh bay hơi dung môi. 

30 
















• Đưa chất phân tích vào cột 

Hình 4. Kỹ thuật nhồi cột ướt 

- Hòa tan mẫu vào lượng dung môi tối thiểu (5-10 giọt) 

- Sử dụng pipet bơm mẫu vào rồi trực tiếp đưa lên cột sắc ký 

- Khi toàn bộ mẫu đã được đưa lên cột, để cột khô để mức dung môi chạm vào bề 

mặt trên của lớp silica. 

- Nhẹ nhàng thêm một lớp bông vào (khoảng 2-5mm). Thêm bông vào sẽ tránh cho 

bề mặt của lớp silicgel bị ảnh hưởng khi có dung môi thêm vào. 

- Sử dụng pipet thêm từ từ dung môi vào cột để mức dung môi đạt khoảng 2/3 chiều 

cao cột. 

- Để dung môi chảy xuống tới khi mức dung môi còn lại khoảng 2 cm trên lớp cát. 

- Lặp lại thêm 1, 2 lần nữa để đảm bảo là toàn bộ mẫu đã được hấp thụ lên silica. 

- Yêu cầu khi đưa chất phân tích vào cột là phải phân tán thành một lớp mỏng đồng 

đều trên mặt thoáng phẳng. 






31 











• Rửa cột (Rửa cột bằng áp suất thường) 

Rửa cột còn được gọi là giải ly chất ra khỏi cột. 

Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà có thể tiến hành giải ly 

cột bằng áp suất thường hoặc áp suất nén. 

Ở bài ta sử dụng phương pháp rửa cột áp suất thường. Dung môi chảy ra nhờ vào 

trọng lực. Cột áp suất thường có nhược điểm là chảy chậm, chỉ dùng cho các chất hấp 

phụ có kích thước hạt lớn. 

Thứ tự tăng dần lực phản hấp phụ của một số dung môi theo Trappe: 

Ether dầu hỏa - cyclohexan - carbon tetraclorur - tricloroetylene - toluen - benzen - 

methylclorur - chloroform - ether ethylic - ethylacetat - pyridin- aceton - n-propanol - 

ethanol - methanol - nước 

Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel loại thường thì hợp chất không hoặc kém 

phân cực được giải ly ra khỏi cột trước. Hợp chất phân cực được rửa giải ra sau. 

Hứng các phân đoạn 

- Để bắt đầu hứng phân đoạn, đặt một bình hứng thích hợp phía dưới cột và mở van 

cột. Mỗi cột đều có một tốc độ dòng tối ưu. Chỉnh van để điều chỉnh tốc độ dung 

môi chảy ra. Với những cột có đường kính nhỏ, tốc độ tối ưu sẽ thấp hơn so với ở 

cột có đường kính thấp hơn. Do đó, cột có đường kính lớn hơn sẽ chạy nhanh hơn 

với tốc độ lớn hơn so với cột nhỏ. 

- Nếu tốc độ quá chậm quá trình khuếch tán sẽ dẫn đến làm rộng dải thu mẫu (Hình 

1, a). 

- Nếu quá nhanh thì không đủ thời gian cân bằng và hợp chất sẽ bị chảy xuống rất 

nhanh, để lại vết dài phía sau (Hình 1, c). 


- . Tốc độ tối ưu đạt được ở (b) 





32 











Hình 5. Sự thay đổi tốc độ dòng có thể thay đổi chất lượng quá trình phân tách. 

- 

- Không được để mức dung môi ở dưới mức silicagel trong cột (hiện tượng “chạy 

khô”). Dung môi nên được bổ sung thường xuyên trước khi điều này xảy ra. Nạp 

dung môi khi mức dung môi trên lớp bông bảo vệ khoảng 2cm. Thêm dung môi 

sớm khi dung môi vẫn còn trong cột sẽ giảm thiểu được việc bề mặt silicagel bị 

xáo trộn và các liên kết ở phía trên đỉnh của cột bị phá vỡ. 

Theo dõi quá trình giải ly cột: 

- Với các chất cần phân tích có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể được 

theo dõi bằng mắt thường. 

- Tuy nhiên, phần lớn các hợp chất thiên nhiên không màu được hứng trong các hủ 

bi có thể tích như nhau và đánh số thứ tự và được kiểm tra bằng phương pháp sắc 

ký lớp mỏng trên cùng 1 bản mỏng. Các lọ nào có sắc ký bảng mỏng giống nhau 

sẽ được gom lại thành một phân đoạn và đuổi dung môi ở áp suất kém và cho ra 

cao. Chỉ ngưng cột khi thu được lượng cao các phân đoạn bằng 70 – 80% trọng 

lượng mẫu đã nạp vào đầu cột. 


- Để kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn ta sử dụng sắc ký bản mỏng : 





33 








+Chất tinh khiết: nếu chất chỉ cho hiện ra một vết duy nhất. 




+Chất tương đối sạch: nếu chất cho hiện trên bản mỏng có một vết chính chiếm 

80%, ngoài ra còn một số vết mờ. 

+ Hỗn hợp nhiều chất: Nếu chất cho hiện trên bản mỏng nhiều vết, các vết có độ 

đậm như nhau. 

5. Xử lý sự cố 

Bảng 1. Vấn đề thường gặp trong quá trình chạy sắc ký cột và giải pháp 






34 









Do thời gian còn hạn hẹp nên nhóm chỉ thu thập được những kết quả sau đây: 




Thời gian của các phân đoạn vào mỗi các lọ bi 






35 











Các lọ bi dùng để hứng đã được đánh số thứ tự khác nhau 

D. Tài liệu tham khảo 

1. http://biomedia.vn/review/kinh-nghiem-lua-chon-sac-ky-cot-xu-ly-su-co-phan-3.html 

2. http://doc.edu.vn/tai-lieu/de-tai-ky-thuat-chiet-xuat-va-phan-lap-flavonoid-tu-caydiep-ca-8673/ 

3. Column Chromatography, Lab Techniques, Colorado University, 2005 

http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/colchrom/colchrom.html 

4. Nichols, M.A, Introduction to Chromatography, 2003 

http://chemistry.jcu.edu./nicholsweb/ch223f01/spinachextraction.pdf 






36 








BÀI 4 





PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ ĐIỆN THẾ 

1. Định nghĩa: 

Phương pháp chuẩn độ điện thế là phương pháp phân tích dựa trên sự biến 

thiên của thế trong quá trình chuẩn độ. 

2. Đặc điểm: 

- Độ biến thiên này đột ngột tại thời điểm sát trước và sát sau điểm tương 

đương nhờ đó mà biết được thể tích chuẩn độ. 

- Cần chọn điện cực thích hợp cho quá trình chuẩn độ. 

3. Ưu-nhược điểm của phương pháp: 

❖ Ưu điểm: 

- Độ nhạy cao có thể lên tới vài ppm. 

- Chuẩn độ được dung dịch có màu. 

- Chuẩn độ những trường hợp không có chất chỉ thị. 

- An toàn 

❖ Nhược điểm: 

- Khá tốn kém. 

4. Hóa chất: 

- Nước cất 

- NaOH 0.1N: cân chính xác 0,4g NaOH hòa tan trong 50ml nước cất và định 

mức đến 100ml. Lắc đều. 

- Pectin citras 1%: cân chính xác 2g pectin citras pha trong 200ml nước cất. 

Đánh siêu âm đến khi tan hoàn toàn trong bể siêu âm. 






Hình ảnh pha pectin citras 1% 

37 








5. Thiết bị: 

Thiết bị để chuẩn độ điện thế: 




Buret 

Bộ phận hút 

dung môi 


1. Nguyên tắc chung: 

- Phải có phản ứng hóa học xảy ra giữa thuốc thử và dung dịch chuẩn độ, yêu cầu 

đòi hỏi: phản ứng xảy ra nhanh, hoàn toàn và đúng tỷ lượng. 

- Phải có phản ứng điện hóa xảy ra trên điện cực chỉ thị. 

- Lượng chất tham gia phản ứng chỉ thị phải nhỏ hơn lượng chất tham gia vào phản 

ứng chính của phép chuẩn độ. 

- Pe → thủy phân một lượng este của pectin. Xác định hoạt tính của PE sau gia 

nhiệt dựa trên sự hình thành acid galacturonic và được xác định bằng phương pháp 

chuẩn độ. 

Điện cực 

Bộ phận load 

mẫu 






38 











2. Quy trình tiến hành: 

2.1 Sơ đồ quy trình: 

50ml dung 

dịch pectin 

citras 1% 

NaOH 0.1N 

2.2 Thuyết minh quy trình 

3ml nước cam 

Lấy 3ml nước cam, thêm 50ml dung dịch pectin citras 1% và 0.2M NaCl. Trong 

suốt quá trình thủy phân ở 30C trong 30 phút, pH được duy trì 7.5 bằng cách 

thêm 0.1N NaOH sử dụng chuẩn độ tự động. Lượng NaOH 0.1N được ghi trong 

suốt 10 phút. Ghi nhận kết quả và tính toán. 

Lắc đều 

Duy trì pH = 7.5 

Chuẩn độ điện thế 

Kết quả 

50ml NaCl 

0.2M 

T o C= 30 0 C 

Thời gian: 30 phút. 

Xác định hoạt tính 

enzyme PE 






39 











3. Quy trình sử dụng thiết bị: 

3.1 Sơ đồ quy trình: 

3.2 Thuyết minh quy trình: 

Thay dung môi 

Tiến hành đo mẫu 

Ghi nhận kết quả 

Rửa điện cực và thay dung môi trong buret 

bằng nước cất 4 lần 

Khởi động máy: cắm dây nguồn và bật nút nguồn của máy 

Chọn administrator 

Khởi động máy 

Login xuất hiện màn hình chính. 

Hình: Mô tả các bước khởi động máy 

50ml 

Mẫu 

chọn User name 

power 






40 











Thay dung môi: Tiến hành thay ống hút dung môi sang bình chứa NaOH 0.1N. Trong 

màn hình chính chọn nút lệnh Manual → chọn Burette → Rinse (rửa) xuất hiện bảng 

chọn. Tại Cycle (số lần bơm dung môi) ở đây ta chọn bơm 2 lần, thể tích bơm mỗi lần là 

40ml (tổng 80ml cho 2 lần bơm). 

Lưu ý: 

- NaOH dùng để chuẩn độ phải là dung dịch tự pha có nồng độ chính xác và phải 

được kiểm tra trước nồng độ bằng cách chuẩn độ với H 2 C 2 O 4 0.1N. 

- Việc bơm 2 lần là để tránh làm pha loãng nồng độ của chất chuẩn trong buret. 


Hình: Mô tả hình ảnh buret đang thay dung môi NaOH 





41 











Chuẩn độ mẫu: 50ml mẫu sẽ được cho vào cốc đựng mẫu trong bộ phận load 

mẫu. Vặn kỹ. Cho điện cực vào bộ phận load mẫu. Về màn hình chính bằng nút 

Home. Sau đó, chọn nút lệnh Methods → chọn chế độ đầu tiên (trong chương 

trình đã được cài đặt sẵn). Chọn Start để bắt đầu chuẩn độ. Trong Start tại vị trí 

Numbers of sample ( số lượng mẫu cần chuẩn độ) nhập số lượng mẫu cần đo (ở 

đây nhóm thực hiện 4 mẫu) cuối cùng chọn OK. Máy sẽ tiến hành chuẩn độ. 

Ngoài ra trong Methods có các nút lệnh như Title để đặt tên; Sample để kí hiệu 

mẫu;;… 

Lưu ý: 

- Cốc phải được trán bằng mẫu để tránh nồng độ bị pha loãng trước các lần 

đo. 

- Lúc lắp cốc vào phải chú ý cánh quạt tránh làm cánh quạt tiếp xúc với đày 

cốc làm gãy cánh gây hư hỏng thiết bị. 






42 











Hình ảnh mẫu được lắp vào vị trí load mẫu 

- Đối với điện cực chuẩn độ phải rửa bằng nước cất và lau nhẹ nhàng bằng 

khăn giấy khô trước khi cho vào mẫu tránh việc lau mạnh làm hỏng điện 

cực của máy. 

- Trong quá trình chuẩn độ máy sẽ chuyển sang màn hình có đồ thị với trục 

tung là pH đầu và cuối của mẫu, trục hoành là thể tích NaOH chuẩn độ. 

- Trong đồ thị trong quá trình chuẩn độ pH của dung dịch tăng đến quá điểm 

tương đương thì kết thúc. Tuy nhiên, nếu dung dịch trong cốc chứa mẫu đã 

đầy mà máy vẫn tiếp tục chuẩn độ thì thao tác thực hiện sai. 

Ghi nhận kết quả: Kết quả được máy ghi nhận và tính toán cho ra các thông số về pH và 

thế tích NaOH chuẩn độ thông qua điểm tương đương. 

Lưu ý: 

- Tại điểm tương đương có một đường thẳng đi qua điểm tương đương và vuông 

góc với trục tung tức trục thể hiện thể tích NaOH tiêu tốn cho quá trình chuẩn độ. 

Rửa điện cực và thay dung môi: Tương tự, sau khi chuẩn độ xong, tiến hành thay dung 

môi trong buret bằng nước cất chọn nút lệnh Manual → chọn Burette → Rinse (rửa) xuất 

hiện bản chọn → Cycle (số lần bơm dung môi) ở đây ta chọn bơm 4 lần. 

- Điện cực được rửa kỹ bằng nước cất lau khô bằng khăn giấy và nhúng trong dung 

dịch bảo quản điện cực. 


Tắt máy rút dây nguồn. 





43 











C. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 

1. Kết quả: 

Hoạt tính enzyme PE được tính theo phương trình sau: 

Bảng kết quả đo: 

PEU = V NaOH ×0.1 

V Mẫu ×10 

× 104 , N/Phút 

Mẫu 1 2 3 4 

V NaOH (ml) 2.520 1.428 2,715 2,365 

pH 5.711 9.060 8.867 8.347 

PEU (N/Phút) 5.04 2.856 5,43 4,73 

Hình ảnh kết quả đo: 

Kết quả mẫu 1 






44 



















45 








2. Nhận xét: 

Hoạt tính enzyme PE của giữa các mẫu là có sự chênh lệch cụ thể như sau: 




• Đối với lần 1: giá trị PEU là 5.04 N/phút, pH tương đương là 5.711 và thể tích 

NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ là 2.520 ml. 







Dựa vào số liệu trên ta có thể thấy đối với lần 1,3 thì hoạt tính PEU khoảng khác biệt 

là không quá lớn, ta có thể chấp nhận được (5.04 và 5.43), thể tích NaOH để chuẩn 

độ 2 lần này có kể quả như nhau. 

Đối với lần 2 và 4 có sự khác biệt như vậy là do trong quá trình ủ ở 30 0 C trong vòng 

30 phút ở bể ổn nhiệt lượng nước bên trong quá cao và làm cho các mẫu này không 

giữ được thăng bằng và đã bị ngã tiếp xúc với một lượng nước khá ít của bể ổn nhiệt. 

Do vấn đề thời gian mà nhóm không thể làm lại 2 lần đó, nên kết quả diễn đạt gây sai 

số như vậy. Và khoảng cách mỗi lần đo giữa các lần mẫu với nhau rửa và lau không 

khô cốc đựng mẫu, vẫn còn ít nước ở các vành cốc nên làm pH thay đổi dẫn đến thể 

tích cần chuẩn độ củng thay đổi. 

Việc nhóm không có pha NaOH 0.1N để tiến hành chuẩn mà sử dụng hóa chất trước 

đó, nên không thể đẩm bảo rằng hóa chất hiện nhóm đang sử dụng có vấn đề hay 

không, đây củng là một sự cố làm cho kết quả bị lệch như vậy 






46 











BÀI 5: 

TRÍCH LY CAFEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN (SPE) 



1.1 Nguyên tắc chung 

Chiết pha rắn cũng là quá trình phân bố của các chất giữa 2 pha, trong đó lúc đầu 

chất mẫu ở dạng lỏng (pha nước, hay hữu cơ), còn chất chiết ở dạng rắn, dạng hạt 

nhỏ và xốp đường kính 25 - 70 μm. Vì thế nên có tên là chiết pha rắn (Solid Phase 

Extraction ), hay chiết rắn-lỏng. 

Chất chiết được gọi là pha tĩnh, và được nhồi vào một cột chiết nhỏ, cột chiết kích 

thước: 6 x 1 cm, hay dung lượng chiết 100-600 mg, hoặc dạng đĩa chiết có kích 

thước dầy 1-2 mm và đường kính 3-4 cm. Chất chiết là các hạt Silica trung tính, 

các hạt ôxit nhôm, hay các Silicagen trung tính đã bị alkyl hoá nhóm -OH bằng 

nhóm mạch carbon thẳng -C2, -C4, -C8, -C18,.. , hay nhân phenyl. Nó được chế 

tạo trong điều kiện giống như pha tĩnh của sắc ký HPLC, và các hạt này có độ xốp 

lớn, với diện tích bề mặt xốp thường từ 50 - 300 m2/gam. 

Khi xử lý mẫu, dung dịch chất mẫu được dội lên cột chiết. Lúc này pha tĩnh sẽ 

tương tác với các chất và giữ một nhóm chất phân tích lại trên cột (trên pha tĩnh), 

còn các nhóm chất khác sẽ đi ra khỏi cột cùng với dung môi hoà tan mẫu. Như thế 

là chúng ta thu được nhóm chất cần phân tích ở trên pha tĩnh (chất chiết rắn) 

Sau đó dùng một dung môi thích hợp hoà tan tốt các chất phân tích để rửa giải 

chúng ra khỏi pha tĩnh (cột chiết), và chúng ta thu được dung dịch có chất phân 

tích để xác định chúng theo một cách đã chọn. 

1.2 Các loại chất chiết pha rắn 

Theo đặc điểm và bản chất của sự chiết, các chất chiết pha rắn được chế tạo và 

phân chia theo các loại chất: 

- Loại hấp phụ pha thường. Đó là các Silica trung tính và ôxit nhôm, 

- Hấp phụ pha ngược. Đó là các Silica thường được alkyl hoá nhóm-OH, 

- Loại chất trao đổi iôn (để tách Cation và Anion), 

- Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thước của phân tử chất, 

- Loại chất hấp phụ khí (purge and trap Extraction), để hấp thụ chất khí. 






47 











1.3 Các kiểu và cơ chế chiết pha rắn 

Chính vì có nhiều loại chất chiết pha rắn, cho nên kỹ thuật chiết pha rắn cũng có 

nhiều cơ chế và quá trình động học khác nhau, theo bản chất của mỗi loại chất 

chiết (pha chiết). Nói chung, các chất chiết pha rắn này cũng tương tự như các pha 

tĩnh trong sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nó có thể là dạng cột chiết (1x6 cm 

có thể tích 4-6 mL) hay dạng đĩa chiết (dầy 1-2 mm và đường kính 3-4 cm). Do đó 

chiết pha rắn cũng có 3 loại cơ chế chính là: 

- Hấp phụ pha thường (loại NP), và Hấp phụ pha ngược (loại RP), 

- Trao đổi ion và cặp ion đối với các chất dạng ion (loại IEx), 

- Rây phân tử theo độ lớn của chất phân tích (Gel). 

1.4 Các điều kiện chiết pha rắn 

Quá trình chiết ở đây thực chất cũng là sự phân bố của chất phân tích giữa 2 pha, 

pha rắn (chất chiết) và pha lỏng (dung dịch chứa chất phân tích) không trộn lẫn 

vào nhau trong những điều kiện nhất định, như pH, dung môi, nhiệt độ, tốc độ 

chảy của mẫu qua cột chiết. Trong đó hệ số phân bố nhiệt động Kb của chất phân 

tích giữa hai pha (rắn và lỏng chứa mẫu) cũng là một yếu tố quyết định hiệu quả 

của sự chiết. Nó cũng tương tự như trong hệ sắc ký cột lỏng-rắn (của các hệ 

HPLC). 

Vì thế muốn thực hiện chiết pha rắn tốt phải có các điều kiện sau đây: 

• Pha rắn hay chất chiết (dạng cột chiết hay đĩa chiết) phải có tính chất hấp thụ hay 

trao đổi chọn lọc với một chất, hay một nhóm chất phân tích nhất định, tức là tính 

chọn lọc của pha tĩnh chiết. 

• Các chất chiết và dung môi rửa giải phải có độ sạch cao theo yêu cầu của cấp 

hàm lượng phân tích. 

• Hệ số phân bố nhiệt động Kfb của cân bằng chiết phải lớn, để có được hiệu suất 

chiết cao. 

• Quá trình chiết phải xẩy ra nhanh và nhanh đạt cân bằng, nhưng không có tương 

tác phản ứng hoá học làm mất hay hỏng pha rắn và chất phân tích. 

• Quá trình chiết phải có tính thuận nghịch, để còn có thể rửa giải được tốt chất 

phân tích ra khỏi pha chiết bằng một pha động phù hợp. 






48 











• Không làm nhiễm bẩn thêm chất phân tích trong quá trình chiết bởi bất kỳ từ 

nguồn nào. 

• Sự chiết phải được thực hiện trong điều kiện nhất định phù hợp, phải lặp lại được 

tốt và tất nhiên là càng đơn giản dễ thực hiện thì càng tốt. 

1.5 Ưu nhược điểm và phạm vi áp dụng 

Chiết pha rắn là một kĩ thuật chiết mới ra đời, đang phát triển và được ứng dụng 

trong khoảng chục năm trở lại đây, nhất là ở các nước tiên tiến và nó mới vào Việt 

nam ta từ năm 1997. Hiện nay đã có một số hãng sản xuất và cung cấp ra thị 

trường nhiều loại chất chiết và dụng cụ chiết khác nhau cho nhiều đối tượng rất 

tiện dụng. Chất chiết thường là các chất Silica được hoạt hoá để chúng có khả 

năng hấp thụ cao và chọn lọc các chất theo từng nhóm. 

Kỹ thuật chiết này có các ưu và nhược chính điểm sau đây: 

• Có tính chọn lọc đối với một nhóm hợp chất phân tích, 

• Cân bằng chiết nhanh đạt được và có tính thuận nghịch, 

• Thích hợp cho mẫu lượng nhỏ và phân tích lượng vết các chất, 

• Thao tác đơn giản và nhanh hơn các kỹ thuật chiết khác, 

• Trong quá trình chiết luôn luôn có cả sự làm giầu chất phân tích, 

• Chất chiết pha rắn không đắt. 

Chính vì thế mà nó đang được sử dụng rất phổ biến trong phân tích, đặc biệt là 

phân tích đối tượng môi trường các chất vi lượng độc hại. 


- Methanol 50% 

- Nước cất 

- Ethyl acetate 

- Bột cà phê 

3. Thiết bị 

- Máy cô quay ( hoặc bếp điện để chưng cách thủy) 

- Bộ dụng cụ chiết pha rắn 

- Cột SPE C18 

- Ống nghiệm 

- Cốc thủy tinh, Pipet 10 ml 


49 















4. Hệ thống chiết pha mẫu chất rắn chân không Model: 12 - Port Vacuum SPE 

Manifolds 

1. Hộp thủy tinh 

2. Nắp nhựa PP 

3. Đồng hồ đo chân không 

4. Van 

5. Giá đựng mẫu 

6. Van điều khiển bơm chân không 

7. Cột sắc ký 

8. Ống nối 

9. Ống nối cấp dung môi 

+ SPE column = cột SPE 

+ Frit = cát 

+ Soild phase = pha rắn 

+ Luer fitting, female = ống nối luer ( 

đực và cái) 

+ Lid of vacuum manifold with bore = 

nắp ống hút chân không 

+ Stainless steel needle = kim thép không 

rỉ 






50 











B. CÁCH TIẾN HÀNH: 

Hệ thống chiết pha rắn chân không 


Trong kỹ thuật SPE ở điều kiện động, các vật liệu pha rắn được nạp trước vào cột 

(cartridge) và được cố định bởi 2 tấm ngăn bằng polyetylen xốp. Có khi vật liệu 

SPE được cố định trong các mạng lưới polytetrafluoroethylene (PTFE) và ép 

thành khối dạng dĩa. 

Kỹ thuật SPE trong điều kiện động gồm 4 bước chính được mô tả trên hình 1.1. 

- Bước 1: Chuyển dạng chất hấp thụ pha rắn (conditioning) 

Đầu tiên, vật liệu hấp thụ được chuyển từ dạng ban đầu (của hãng sản xuất) sang 

dạng thích hợp cho quá trình hấp thụ (dạng H+ hoặc OH-) bằng cách cho dung 

môi chạy qua làm ướt vật liệu, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp thụ và đuổi 

không khí, lấp đầy các khoảng trống bằng dung môi. Sau đó, cột được làm ướt 

bằng dung dịch đệm hoặc nước cất để có hiệu quả hấp thụ tốt đối với các mẫu là 

dung dịch nước (chất hấp thụ phải luôn được ngâm trong dung môi). Trong thực 

tế, nếu để khô cột thì khả năng hấp thụ xảy ra không hoàn toàn và độ thu hồi chất 

phân tích giảm, do vậy phải tiến hành quá trình chuẩn bị cột (pha tĩnh) lại từ đầu. 

Trong quá trình chuyển dạng, nếu cần thiết nên có thêm bước làm sạch cột để loại 

bỏ các tạp chất. 

- Bước 2: Quá trình hấp thụ chất phân tích (sample application) 

Dung dịch mẫu chứa chất phân tích được cho qua cột với tốc độ thích hợp. Chất 

phân tích được giữ lại trên cột còn các chất khác cùng dung môi đi ra khỏi cột. 

Cũng có trường hợp chất gây cản trở bị giữ lại trên cột, còn chất phân tích đi ra 

khỏi cột cùng với dung môi. Sau đó chất phân tích được thu hồi và xác định bằng 






51 











một phương pháp phân tích công cụ thích hợp đã chọn. Ở bước này, điều quan 

trọng nhất là cơ chế lưu giữ chất phân tích trên chất hấp thụ khi cho mẫu chảy qua 

cột. Các cơ chế của quá trình lưu giữ bao gồm tương tác Van der Wall, tương tác 

lưỡng cực - lưỡng cực, liên kết hydro, trao đổi cation, trao đổi anion, tạo phức 

vòng càng,… Quá trình hấp thụ này có thể giữ lại một số thành phần khác trên cột 

cùng với chất phân tích. 

- Bước 3: Rửa cột (washing) 

Đây là bước loại bỏ các chất gây ảnh hưởng và nền mẫu ra khỏi cột chỉ giữ lại chất 

phân tích. Nếu nền của mẫu là dung dịch nước, cần phải sử dụng dung dịch đệm 

hoặc dung môi hữu cơ. Nếu mẫu được hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa 

cột có thể dùng chính dung môi đó. 

- Bước 4: Rửa giải (elution) 

Đây là bước cuối cùng để thu hồi chất phân tích. Dung môi được chọn phải phá vỡ 

dễ dàng tương tác giữa chất phân tích và chất hấp thụ. Thể tích dung môi sử dụng 

rửa giải càng ít càng tốt nhưng phải đảm bảo rửa sạch chất phân tích ra khỏi vật 

liệu hấp thụ, đây chính là ưu điểm của kỹ thuật SPE so với kỹ thuật LLE. 

Kĩ thuật chiết pha rắn ( SPE ) ở điều kiện động 






52 












Thuyết minh quy trình 

10ml nước 

cất 

Mẫu cafe 

Cân 0.1g 

Hòa tan 

Đánh siêu âm 

30ph 

Mẫu nguyên liệu (bột cà phê, cà phê hòa tan thương mại…) có chứa caffeine đem đi 

cân một khối lượng chính xác ~ 0.1g trong một cốc thủy tinh 50mL. Dùng pipet cho 

10 ml nước cất vào cốc 50ml và hòa tan mẫu đo. Đánh siêu âm 30 phút để cafein 

trong mẫu hòa tan vào nước. Lọc hỗn hợp thu được nhiều lần qua bông gòn để loại 

bỏ cặn, sau đó lọc qua đầu lọc 0.45µm. Dung dịch lọc thu được bào quản ở điều kiện 

nhiệt độ phòng để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 

Lọc 

Dịch lọc 






53 











Lọc cặn 






54 











3. Quá trình tiến hành 

6ml 

Methanol 

50% 

Cột C18 

Hoạt hóa cột 

Hấp thu chất 

phân tích 

Rửa cột 

Rửa giải 

Dịch chiết 

Đun cách thủy 

Sấy 

Cafein thô 

1ml Mẫu 

10ml ethy 

acetate 






55 











Thuyết minh quy trình 

- Hoạt hóa cột: Cho 6 ml dung dịch methanol 50% chạy qua thật chậm làm ướt vật 

liệu, solvat hóa các nhóm chức của chất hấp thụ và đuổi không khí, lấp đầy các 

khoảng trống. Tiếp tục cho 3mL nước qua cột; tiếp tục giữ cho chất hấp phụ luôn 

ngập trong dung môi. 

• Lưu ý: Luôn đảm bảo chất hấp phụ trong cột SPE luôn ngập trong dung môi. 

- Hấp thu chất phân tích: Cho vào 1.00mL (micro-pipette) mẫu thí nghiệm vào cột 

SPE đã được hoạt hóa và mở bơm hút chân không. Giữ lại dịch lọc. 

• Lưu ý: Luôn đảm bảo cột ngập trong dung môi. 

- Rửa cột: Tiếp tục cho dịch lọc trên vào lại cột SPE đang tiến hành chiết tách. Lập lại 

quá trình này 3 lần. Để hấp thu hết cafein có trong dịch. Lần cuối cùng sẽ tiến hành 

rút tất cả các chất lỏng ra khỏi cột SPE cho đến khi không khí đi qua cột trong 3-5 

phút cho đến khi chất hấp thụ khô. 

- Rửa giải: Cho 10 mL ethyl acetate vào cột SPE, hút chân không thật chậm, và thu 

mẫu rửa giải vào trong ống nghiệm khô. 

- Đun cách thủy: Chuyển dịch chiết thu được vào cốc đã được sấy khô và cân khối 

lượng m 1 . Đun cách thủy trong tủ hút đến khi vừa khô. 


- Sấy: Cho cốc sau khi đuổi dung môi vào sấy ở 105 0 C trong 30 phút. Sau đó đem cân 

khối lượng cafein thu được m 2 . 





56 


Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Dung Túmôi rửa giải và dịch www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial 

chiết thu được sau rửa giải








C. KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 

1. Kết quả 

m 0 m 1 m 2 

0,1048 47,2787 47,2800 

Phần trăm cafein có trong mẫu là: 

% cafein = m2−m1 

× 100 = 47,2800−47,2787 

× 100 = 1,24 

m0 

0,1048 

2. Nhận xét 

Hàm lượng cafein thô thu được sau quá trình chiết pha rắn ( SPE ) là 1,24%. Có thể trong 

quá trình lọc loại bảo cặn nhiều lần đã làm hao hụt đi lượng cafein có trong mẫu. 






57

BÁO CÁO THỰC HÀNH CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HIỆN ĐẠI (2018)

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?