ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG ENZYME LIPASE, CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME

https://twitter.com/daykemquynhon 

plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn 

www.facebook.com/daykem.quynhon 

https://daykemquynhon.blogspot.com 

http://daykemquynhon.ucoz.com 

Nơi bồi dưỡng kiến thức Toán - Lý - Hóa cho học sinh cấp 2+3 / 

Diễn Đàn Toán - Lý - Hóa Quy Nhơn 1000B Trần Hưng Đạo Tp.Quy Nhơn Tỉnh Bình Định 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC 

~~~~~~*~~~~~~ 

BÁO CÁO CÔNG NGHỆ ENZYME 

ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG ENZYME LIPASE,CÁC 

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME 

GVHD:Th.S Trương Phước 

NHÓM SVTH : 

Nguyễn Thái 

Trần Thị Kim 

Nguyễn Thị Yến 

Bùi Phương 

Đặng Ngọc 

TP. Hồ Chí Minh – 2017 

DIỄN ĐÀN TOÁN - LÝ - HÓA 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

MỌI YÊU CẦU GỬI VỀ HỘP MAIL DAYKEMQUYNHONBUSINESS@GMAIL.COM 

HOTLINE : +84905779594 (MOBILE/ZALO) 

https://daykemquynhonofficial.wordpress.com/blog/ 

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL ST&GT : Đ/C 1000B TRẦN HƯNG ĐẠO TP.QUY NHƠN 

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú 

www.facebook.com/daykemquynhonofficial 

www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial








LỜI NÓI ĐẦU 

Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzyme đã mang lại sự quan tâm 

đáng kể đến việc ứng dụng enzyme lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Các 

phản ứng sử dụng enzyme lipase mang lại nhiều lợi ích hơn các phản ứng hóa học thông 

thường. Lipase có thể sử dụng một cách hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn hòa. Đây 

là đặc điểm quan trọng, bởi vì điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp 

chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu 

loại bỏ các hợp chất màu và sản phẩm phụ bằng phương pháp tốn kém năng lượng. 

Do đó nhóm chúng tôi xin giới thiệu đến các bạn về loại enzyme vẫn được xem 

là “chất xúc tác linh động nhất” này thông qua các phần sau đây: 

1. Tổng quan về lipase 

2. Sản xuất lipase 

3. Phương pháp cố định lipase 

4. Phương pháp xác định hoạt tính 

5. Ứng dụng lipase trong đời sống và sản xuất 
















MỤC LỤC 

I. Tổng quan về Lipase ..................................................................................................... 1 

1. Tên enzyme ............................................................................................................... 1 

2. Cấu trúc enzyme Lipase ........................................................................................... 2 

3. Cơ chế sinh tổng hợp lipase. .................................................................................... 3 

4. Phân loại enzyme ..................................................................................................... 4 

5. Thông số : nhiệt độ, pH, cofactor, coenzyme. .......................................................... 5 

II. Sản xuất enzyme Lipase: ............................................................................................ 8 

1. Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV: ................................ 8 

2. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme từ nguồn động vật,thực vật: ..................... 9 

3. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme lipase ngoại bào từ VSV: ........................... 9 

4. Quy trình sản xuất Lipase ngoại bào từ Cadida rugosa: ................................. 10 

5. . Tinh sạch enzyme bằng sắc kí cột: ...................................................................... 10 

III. Phương pháp cố định enzyme lipase:..................................................................... 11 

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase .................................................... 11 

1. Các phương pháp hoá lý : ................................................................................... 15 

2. Phương pháp đĩa Wilhelmy: .................................................................................. 16 

3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân: ................................... 19 

V. Ứng dụng .................................................................................................................... 21 

1. Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp.............................................................. 21 

2. Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa .......................................................... 22 

3. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy ......................................... 22 

4. Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất ........................................................ 23 

5. Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế ......................................................... 23 

6. Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa .................................. 23 

7. Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel ............................................................. 23 

8. Ứng dụng lipase trong biosensor (cảm biến sinh học)........................................... 24 

VI.Tài liệu tham khảo .................................................................................................... 26 
















I. Tổng quan về Lipase 

1. Tên enzyme 

Lipase (EC 3.1.1.3) còn có tên khác là Triacylglycerol lipase. 

Thuộc nhóm enzyme hydrolase, cắt đặc hiệu các liên kết ester. 

EC 3. Hydrolase 

Nomenclature 

EC 3.1. Acting 

onester bonds 

EC 3.1.1. Carboxylic 

ester hydrolases 

EC 3.1.1.3 

triacylglycerol lipase 

‣ Là enzyme tan trong nước xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol không 

tan trong nước tạo thành các glyceril và các acid béo tương ứng nhờ hoạt động của 

nó trên bề mặt phân pha dầu-nước. 

‣ Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần lượt các liên kết α-ester chứ không 

cắt cùng một lúc 3 liên kết. Quá trình xúc tác thường chậm hơn so với các enzyme 

khác như protease, amylase… 






1 








‣ Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo. Tại bề mặt phân cách 

giữa pha nước với các pha không hòa tan chứa cơ chất. 




Phản ứng thủy phân triacylglycerol thành glycerol và các acid béo 

2. Cấu trúc enzyme Lipase 

Tâm hoạt động của lipase là bộ ba: Serine, Histidine và Aspartate/Glutamate. 

Phía trên trung tâm hoạt động có vùng kỵ nước được hình thành sau khi lipase được 

hoạt hóa. Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ những 

nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ amino acid. Do đó, sự hiện diện của 

serine ở tâm hoạt động được xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong 

chuỗi pentapeptide Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly. 






2 











3. Cơ chế sinh tổng hợp lipase. 

Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá 

trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã. Tất cả các quá trình thực hiện bên trong tb 

chất của VSV. 

Đầu tiên là sự phiên mã. Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên lipase 

phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng. Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA 

polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất 

ức chế đó. Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xsuc tác của lipase. 

Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử 

mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thuỷ phân trong môi trường tế bào chất. Bên cạnh 

đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA) 

được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã hoặc thúc 

đẩy sự phân hủy những phân tử mRNA. Vì vậy số lượng enzyme được tổng hợp sẽ giảm 

đi đáng kể. 

Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng thông tin mã hóa trong mRNA để tạo 

thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác. Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này 

rất dễ bị thủy phân bởi enzyme peptidase. Quá trình này cần một loại protein “chuyển 

giao” để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded protein) 

mà không còn sử dụng được nữa. 

Khi những polypeptide enzyme đã được tổng hơp khá nhiều thì những 

polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho 

khối enzyme trở nên không tan. Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh học. 

Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức năng 

làm gấp khúc các enzyme trong nội bào trước khi những enzyme này được vận chuyển 

qua màng mmebrane. Đối với pro-pro-enzyme ngoại bào, là enzyme tổng hợp trong tế 

bào chất nhưng chưa có cấu trúc hoàn thiện, cấu trúc phân tử không được gấp khúc 

trogn suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane. Do đó, một số protein khác đã hỗ 

trợ enzyme ngoại bào này chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất để không hình thành 

khối protein không tan và chống lại thủy phân nội bào. 

Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại. Sự cung 

cấp không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme. Vì 

vậy phải đảm bảo nồng độ bão hòa của các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ 

các ion đó trong tế bào chất. 

Đối với pro-pro-enzyme, khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt tính cũng như 

sự vận chuyển qua màng membrane thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế bào 

chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme. 

Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị 

phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất. Trong giai đoạn này proenzyme, 

là enzyme ngoại bào trong không gian chu chất chưa có cấu trúc hoàn thiện, 

vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phân ứng thủy phân. 






3 








4. Phân loại enzyme 




Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : lipase từ thực vật, lipase từ 

động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm, đã có một vài lipase thu 

nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại. 

Lipase từ thực vật như ngũ cốc trong giai đoạn nảy mầm. Lipase từ nguồn thu 

nhậnnày hạn chế về hoạt tính lẫn khả năng bền nhiệt, đồng thời nồng độ enzyme là 

không cao. 

Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn. 

Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất và khá 

thông dụng. Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất có mùi và vị 

khó chịu như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng. Bên cạnh đó, nguồn 

lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người nên hiện nay xu hướng 

sử dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa chuộng do đặc tính đa dạng, dễ tách chiết và 

nguyên liệu vô hạn . 

‣ Đặc hiệu vị trí: 


o Những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch 

triglyceride (C.rugosa). 





4 











o Xúc tác đặc hiệu vị trí 1,3 trên phân tử triacylglycerol (A.niger). 

o Chỉ xúc tác đặc hiệu 1 số acid béo nhất định (Geotrichum candidum). 

‣ Đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của 

enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme. (C.rugosa, A.niger, 

M.miehei …) 

5. Thông số : nhiệt độ, pH, cofactor, coenzyme. 

a. Nhiệt độ, pH tối ưu 

Lipase chiết xuất từ tụy tạng bị mất hoạt tính ở 40 0 C, nhưng một số lipase ở 

vi sinh vật lại có tính bền nhiệt. 

b. Cofactor 

Enzyme lipase hoạt động không cần cofactor, tuy nhiên sự hiện diện của một số 

các cation kim loại như Ca2+, Na+ sẽ làm tăng hoạt tính của lipase. Hoạt tính của lipase 

bị bất hoạt bởi Co 2+ , Ni 2+ , Hg 2+ và Sn 2+ , bị kìm hãm nhẹ bởi Zn 2+ và EDTA: 

Đối với Bacillus sp 

• Mg 2+ làm tăng hoạt tính enzyme. 

• Ca 2+ tăng tiết enzyme ngoại bào, tăng hoạt tính enzyme. 

Đối với Geotrichum sp: 

• Ca 2+ 1mM có tác dụng làm tăng 6% hoạt tính enzyme. 

• Hoạt tính lipase mất gần hết với Pb 2+ 10mM. 

• Tween 20 làm tăng 10% hoạt tính lipase. 

• Chất tẩy rửa SDS kiềm hãm lipase hoàn toàn. 


5 















c. Cơ chế xúc tác 

Hoạt tính đạt cực đại khi nó được phân tán vào giữa bề mặt phân pha dầu-nước 

=> quá trình hoạt hóa phân pha. 

Lipase xúc tác cho nhiều phản ứng khác nhau bao gồm: phản ứng thủy phân, 

phản ứng tổng hợp ester, phản ứng chuyển ester và phản ứng amin hóa (aminolysis) 

. 

Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và chiều 

hướng của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng. 

Ví dụ về cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân: 

✓ Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động 

✓ Nhóm chức hoạt động –OH của Serine tấn công vào gốc acyl của cơ chất 

tạo liên kết đồng hóa trị hình thành hợp chất trung gian.Giai đoạn này được hỗ trợ bởi 

hoạt tính xúc tác basơ của His trong bộ ba xúc tác. 

✓ Tạo thành acyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxh của liên kết ester (R 1 OH) 

✓ Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động 

của His, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung gian có cấu trúc 

tứ diện. 

✓ Giải phóng acid carboxylic (R 2 COOH). 

6. 

Do lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai pha dầu – 

nước nên lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính của 

lipase. => đó là hoạt tính bề mặt của enzyme. 


Do đó, cần áp dụng phương pháp nhũ hóa thích hợp để làm tăng 

diện tích tiếp xúc của các tế bào nhũ hóa. 





6 











d. Cơ chất tự nhiên 

Natural Substrates 

Peanut press cake 

Wheat bran 

Coconut oil cake 

Rice bran, wheat bran 

Wheat bran 

Rice bran 

7 

Organisms 

Neurospora sitophita, R.oligosporus 

Several filamentous fungi 

Candida rugosa 

Candida sp. 

A.niger 

C.rugosa 

e. Môi trường nuôi cấy tối ưu sinh tổng hợp Lipase: 

Môi trường nuôi cấy Cadida rugosa 

KH2PO4: 15 g; K2HPO4:5,5 g;(NH4)2SO4:4g; MgSO4:1g; FeCl3:10m g; 

inositon: 

0,004mg; biotin: 0,008mg; Thiamine.HCl: 0,2mg; dầu oliu: 1%; axit palmitic: 1.2 

g;H2O: 1000ml. 

Số tế bào nấm men cấy ban đầu 2,6x10 -6 cfu/ml môi trường nuôi cấy. Thời 

gian nuối cấy 40 giờ. 

Môi trường nuôi cấy Bacillus sp 


Môi trường BMGY với thanh phần: 1% (w/v) cao nấm men, 2% (w/v) bactopeptone, 

100mM kali phosphat, pH 7.0, 4x10 -5 % (w/v) biotin và 1% (v/v) Methanol. 












II. 

Sản xuất enzyme Lipase: 

1. Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV: 

Chủng VSV 




Chuyển sang môi trường đã tiệt trùng 

Môi trường lỏng 

Lên men(1-5 ngày;t°:25-40°C) 

Thêm chất bảo quản,chất trợ lọc 

Gạn,ly tâm hoặc lọc 

Chế phẩm enzyme 

8 

thô 

Môi trường bán rắn 

Lên men(1-7 ngày;t°:25-45°C) 

Tách chiết bằng nước chứa 

chất bảo quản 

Loại cặn bã 

Enzyme đã tách chiết trong nước 

Đưa ra khỏi phòng ủ 

Bổ sung chất bảo quản Bổ sung chất trợ tủa Cô đặc chân không 

Enzyme lỏng 

Bổ sung (NH 4 ) 2 SO 4 

Na 2 SO 4 

Ly tâm(lọc) 

Thu kết tủa 

Sấy khô 

Nghiền,sàng 

Enzyme lỏng 

đậm đặc 

Bổ sung dung môi 

hữu cơ 

Sấy khô 


Enzyme thô 

Enzyme dạng rắn 


Enzyme dạng bột thô 













2. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme từ nguồn động vật,thực vật: 




Nguyên liệu động 

vật,thực vật 

Enzyme 

Nghiền bằng 

phương pháp thích 

hợp 

Tinh sạch enzyme 

theo mục đích sử 

dụng 

Trích ly với dung 

3. Quy trình cơ bản thu nhận enzyme lipase ngoại bào từ VSV: 

Enzyme 

Ly tâm (4000 rpm /15 

min) thu dịch trong 

Lọc thu kết tủa 

môi 

Kết tủa 

Lọc thu tủa 

Tủa protein bằng 

Amonisunfat 






9 











4. Quy trình sản xuất Lipase ngoại bào từ Cadida rugosa: 

Sợi nấm 

Chất nền(sấy 

60°C kích 

thước hạt mịn 

Bảo quản 

trong điều 

kiện chống ẩm 

Nấm sợi 

Tiền xử lí với HCL 2% 

Lên men 

Lọc hoặc ly tâm 

dung dịch trong 

Thu lipase thô 

Tủa với sodium sulfat 

Thẩm tích tách muối 

Lọc gel 

Cô đặc,tinh sạch 

enzyme 

Cadida rugosa 

PDA nghiêng 

Erlen 250 ml 

Thu bào tử nấm 






Enzyme 

10 











5. . Tinh sạch enzyme bằng sắc kí cột: 

Do nguồn thu lipase từ động vật kém bền nhiệt, lại có mùi hôi, sản xuất mất nhiều 

công sức và tốn kém. Hơn nữa, việc lây nhiễm virus động vật là mối lo ngại hàng đầu. 

Nên việc chủ động nuôi cấy và tách chiết lipase từ VSV ngày càng chiếm ưu thế. 

Người ta sử dụng sắc ký ái lực cho độ tinh sạch cao nhất, nhưng phương pháp này tốn kém, do 

cột đắc tiền, lại không bền. Do nguyên nhân cột hoạt động trên nguyễn tắc sự bắt cặp giữa enzyme 

và cơ chất, tạo nên phức hợp E-S. Nhưng bản thân cơ chất của enzyme được nhồi vào cột là 

protein, đó là nguyên nhân mà cơ chất dễ bị biến tính và mất khả năng kết hợp với enzyme. 

Từ đó, các nhà khoa học sử dụng DNA tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli bằng cách 

thiết kế gen mã hóa tổng hợp lipase gắn thêm các trình tự mã hóa 6 gốc His ở đầu C (6His lk đặc 

hiệu với Ni ++ trên cột sắc ký ái lực). Mà việc nhồi cột Ni ++ tương đối dễ dàng, cột bền, sử dụng 

rất lâu. Từ đó mà thành enzyme giảm, tạo điều kiện cho việc ứng dụng lipase rộng rãi hơn. Bên 

cạnh đó, một số nghiên cứu còn dùng phương pháp gây đột biến, làm tăng khả năng biểu hiện 

gen, nâng cao hoạt tính lipase. 

III. 

Phương pháp cố định enzyme lipase: 

Tuy lipase có khả năng xúc tác nhiều phản ứng có giá trị trong thực phẩm, y học, môi 

trường, công nghiệp da… nhưng việc ứng dụng còn hạn chế bởi chi phí cao. Có thể khắc phục 

với pp cố định enzyme với mục đích thu hồi và sử dụng nhiều lần, không tốn chi phí cho quá 

trình tách bỏ enzyme sau khi thu hồi sản phẩm. Có 3 phương pháp được sử dụng: 

❖ PP hấp phụ vật lý: Dẫn xuất enzyme lipase từ C.antarcrica B cố định trên Octadecyl- 

Sepabead giữ được 100% hoạt tính sau khi ủ 200h/50°C/pH=7. Lipase được hấp phụ 

trên chất mang kị nước rất ổn định với nhiệt độ và sự vô hoạt của dung môi hữu cơ. Mặc 

dù phương pháp này đơn giản nhưng dẫn xuất của enzyme này có tính ổn định nhiệt hơn 

các phương pháp khác. 

❖ PP liên kết cộng hóa trị: Lipase đã được cố định thành công nhất trên các chất mang là 

chitosan, agarose, …làm tác nhân hoạt hóa nhóm cacboxyl của chất mang khi cố định 

enzme lipase từ C.Rugosa. Ưu điểm của carbodiimide là khả năng hoạt hóa cao, độc 

tính với enzyme thấp. 

❖ PP nhốt/bao gói: Dùng các polymer dạng hạt: chitosan(hiệu suất 50%), agarose, 

alginate… 

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase 

Mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme dùng để: 

Đánh giá mức độ mạnh hay yếu (cường độ xúc tác) của enzyme: 

Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển hóa một lượng cơ chất nhất định trong thời gian 

nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn (nhiệt độ, áp suất tối ưu). Xác định hoạt độ của enzyme thông 

qua xác định lượng cơ chất mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trước phản ứng. 

Hoạt tính enzyme lipase được xác định dựa trên lượng acid béo tự do được giải phóng. Đối với 

lipase, 1 đơn vị hoạt độ U là lượng enzyme cần thiết để xúc tác tạo thành 1µmol acid béo trong 

1 phút ở điều kiện xác định. 


11 















+Đánh giá mức độ tinh khiết của enzyme. 

Đơn vị của hoạt độ Enzyme 

a. Đơn vị Enzyme quốc tế (UI) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 

được miccromol cơ chất sau một phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 

1 UI = 1mol cơ chất/giây 

b. Katal (kat) là lượng Enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1 mol cơ chất 

sau một giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 

1 Kat = 1 mol cơ chất/giây. 

1 UI = 16,67 nKat (nanoKatal 

‣ Nguyên tắc: 

Khác với trong hóa học phân tích bình thường, trong enzyme học, người ta không định lượng 

enzyme một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thông qua xác định độ hoạt động (còn 

gọi là hoạt độ) của enzyme. Trong phản ứng có enzyme xúc tác, sự hoạt động của emzyme 

được biểu hiện bằng cách làm thay đổi tính chất vật lý, hóa lý cũng như tính chất hóa học của 

hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đó có thể biết được chính xác mức độ hoạt động 

của enzyme thông qua xác định cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong quá 

trình phản ứng. 

Về nguyên tắc có thể chia ra 3 nhóm sau: 

1. Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lương sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất 

định ứng với một nồng độ enzyme xác định. 

2. Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản 

phẩm ứng với một nồng độ enzyme nhất định. 

3. Chọn nồng độ enzyme cần thiết như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự 

biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. 

Ba nhóm phương pháp này được tóm tắt trong bảng sau : 

Nhóm Các thông số cố định Các thông số thay đổi 

1 Thời gian 

Nồng độ enzym 

2 Lượng cơ chất mất đi (hay 

lượng sản phẩm tạo thành). 

Nồng độ [E] 

3 Thời gian 

Lượng S mất đi (hay P tạo 

thành) 

Biến thiên của S hay P 

Thời gian 

Nồng độ E 






Enzym thuỷ phân chất béo có nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các tế bào của những 

cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển của lipit từ cơ quan này sang cơ 

12 











quan khác. Một khía cạnh quan trọng của hệ enzyme thuỷ phân chất béo là chúng chỉ xúc tác cho 

các phản ứng lý hoá tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha béo-nước, nhờ cơ chế hấp phụ bề mặt (kiểu 

xúc tác sensu stricto). 

Hầu hết enzym Lipase là enzyme hoà tan được trong nước hoạt động trên những cơ chất không 

tan trong nước. Đặc tính phức tạp của loại xúc tác này làm cho nó khó định lượng đươc chính 

xác cả về tỷ suất bề mặt cũng như những tham số tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha (như lực căng 

bề mặt, tính nhớt bề mặt, điện thế bề mặt) và liên quan với chất lượng bề mặt của cơ chất mà quá 

trình phân ly chất béo phải phụ thuộc. Sự nhũ hoá giữa nước và các chất không tan trong nước 

sẽ cần đến sự tồn tại của các chất hoạt động bề mặt như: các chất tẩy rửa, các chất béo khác nhau, 

protein… ngay tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha, vì vậy có thể ảnh hưởng một cách mạnh mẽ đến 

phương pháp đo hoạt tính của enzym Lipase mà sự kìm hãm không đặc hiệu của Lipase do sự 

xuất hiện của Protein tại bề mặt tiếp xúc của hai pha dầu-nước là một ví dụ điển hình. 

Các enzym Lipase đã được định nghĩa bằng những thuật ngữ động học, được dựa trên hiện 

tượng “ hoạt động bề mặt giữa các pha “, nghĩa là sự gia tăng hoạt tính xuất hiện khi một 

phần cơ chất tan trong nước trở thành cơ chất không tan trong nước. 

Có nhiều phương pháp để đo hoạt tính thuỷ phân của enzym lipase. Những phương pháp này 

có thể được phân loại như sau : 

1) Phương pháp chuẩn độ ( Titrimetry ) 

2) Phương pháp quang phổ ( Spectroscopy ( photometry,fluorimetry )) 

3) Phương pháp sắc ký ( Chromatography ) 

4) Phương pháp phóng xạ ( Radioactivity ) 

5) Phương pháp sức căng bề mặt ( Interfacial tensionmetry ) 

6) Phương pháp đục kế ( Turbidimetry ) 

7) Phương pháp đo độ dẫn điện ( Conductimetry ) 

8) Phương pháp hoá học miễn dịch ( Immuno-chemistry ) 

9) Phương pháp hiển vi ( microscopy ) 

Những phương pháp thường sử dụng nhất được dựa vào sự chuẩn độ những axit béo tự do được 

giải phóng trong suốt thời gian thuỷ phân. Tuy nhiên, những phương pháp này yêu cầu có sự 

chuẩn bị của những hệ nhũ tương bền của những cơ chất và sự điều khiển pH trong thời gian 

thuỷ phân. Phương pháp đồng vị phóng xạ có độ nhạy lớn hơn, nhưng yêu cầu các cơ chất phải 

được đánh dấu. Phương pháp so màu (colorimetric) dựa trên sự thuỷ phân những ester của p- 

nitrophenol hoặc thioesters có sẵn. Các cơ chất huỳnh quang đã được sử dụng để phân tích 

Protease, phosphatase, glycosidase, sulfatase và những hoạt tính của enzym lipase. Chẳng hạn 

như, rhodamine 6G thì hữu ích để đo hoạt tính của những enzym lipase và những ester của 

C 6 NBD{ [(7-nitro-2,1,3-benzoxandiazol-4-yl)amino]-caproyl } thì thích hợp để đo hoạt tính của 

những enzym phospholipase.Một dẫn xuất coumarin (C 9 H 8 O 2 : anhydrit của axit o- 

cumarin,lacton kết tinh màu trắng, độc tìm thấy ở nhiều loại cây và chế tạo tổng hợp, được dùng 

trong sản xuất nước hoa và xà phòng, còn gọi là 1,2-benzopyrone) cũng đã được sử dụng để phân 

tích hoạt tính lipase. 


13 















Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý một số điểm sau: 

• Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bão 

hoà enzym nhưng không quá cao để đến mức kìm hãm enzyme. 

• Với những enzim cần có chất hoạt hoá hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này 

vào enzyme trước khi 14hoc ơ chất vào hỗn hợp phản ứng. 

• Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố định. Nhưng cần phải chú ý là 

pH thích hợp có thể thay đổi khá nhiều tùy thuộc vào cơ chất và thành phần dung dịch 

đệm, lực iôn của dung dịch đệm ( thường trong phạm vi từ 0,01 – 0,1 ) 

• Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để đề 

phòng tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao 

• Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 đến 30 phút. Trong một số trường hợp có thể 

kéo dài 24 giờ nếu hoạt độ của enzyme quá thấp. Trong trường hợp đó cần phải cho 

thêm vào dung dịch các chất diệt vi sinh vật và tránh dùng những dung dịch đệm thuận 

lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. 

Đối với cơ chất dạng lỏng 

Ví dụ 

đã nhũ hóa bị phản ứng thủy phân do xúc tác của lipase tạo thành các acid béo (ở 

điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian cụ thể cho các thử nghiệm xác định yếu tố cụ thể được 

đo trực tiếp) sau khi bất hoạt enzyme với ethanol 99,5° bằng phương pháp chuẩn độ 

acid-bazơ, sử dụng NaOH 0,1 N; chất chỉ thị là phenolphthalein 0,1%. Khi đó, hoạt tính 

(HT) và hoạt tính riêng (HTR) của lipase được tính theo công thức: 

HT = [(a-b)*1000*0,1] (U/mL) 

Trong đó: a: V NaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu có enzyme (mL); 

b: V NaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu trắng (mL). 

HTR = ∑ ĐVHT/P 

Trong đó: ∑ ĐVHT: Tổng số đợn vi hoạt tính enzyme/g; 

P: Hàm lượng protein (mg/g). 

Đối với cơ chất dạng khô 

Hoạt tính xúc tác của Lipase là số đơn vị hoạt độ có trong 1g chất khô môi trường nuôi cấy vi 

sinh vật để thu nhận enzyme. Môi trường sử dụng là bã dậu nành đã sấy khô, nên công 

thức hoạt tính Lipase được biểu diễn như sau: 

Hoạt tính Lpase ( IU/g) = (∆V * N * 1000 * v 1 )/(v 2 * t *m) 

Trong đó: 

∆V : hiệu số mL dung dịch NaOH chuẩn độ mãu so với mẫu trắng. 

N: nồng độ đương lượng dung dịch NaOH 0.1N trong chuẩn độ. 

1000: Hệ số quy đổi đơn vị. 

v 1 : số mL nước cất dùng để trích ly mẫu canh trường rắn. 

v2: số mL dịch enzyme thô đem phản ứng. 

t: thời gian phản ứng tính bằng phút. 

M: số gram môi trường bả đậu nành đem nuôi cấy. 

Enzyme Lipase bên trong bộ máy tiêu hoá đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong những chu trình 

cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người và những động vật bậc cao. Lipase hiện nay được sử 


14 















dụng rộng rãi như những chất xúc tác chọn lọc trong môi trường có nước ( hoặc ít nước ) và 

nhiều phân tử tổng hợp mà có thể được sử dụng như những cơ chất của Lipase. Trong quá trình 

này, chúng ta chỉ đề cập đến sự phân tích Lipase kéo theo sự thuỷ phân ester Carboxylic. 

Những phản ứng này thường được thực hiện dưới điều kiện hoạt độ của nước thấp. Hơn nữa, 

người đọc được tham chiếu tới những điều lệ phổ biến mà liên quan đến enzyme Lipase trong 

phép phân tích lập thể chọn lọc. 

Phản ứng thuỷ phân triacylglycerol được xúc tác bởi enzym Lipase có thể được viết : 

TAG DAG MAG Glycerol 

FFA FFA FFA 

TAG = triacylglycerols 

DAG = diacylglycerols 

MAG = monoglycerols 

FFA = free fatty acids. 

1. Các phương pháp hoá lý : 

1.1. Sự biến mất của cơ chất : 

1.1.1. Phương pháp đo độ đục : 

a) Trong môi trường rắn : 

Phương pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester carboxylic được 

dùng làm cơ chất , bản chất là xác định đường kính của vùng khuyếch tán sản phẩm. Sự phân 

giải chất béo sẽ làm lan rộng vùng sáng màu trên đĩa thạch. Hiện tượng quang học này chỉ quan 

sát được khi các acid béo được giải phóng ra hoà tan một phần vào nước. Quá trình sáng màu 

này là kết quả của sự giảm kích thước của các hạt nhũ bị thuỷ phân có tác dụng làm giảm ánh 

sáng khuyếch tán. 

b) Trong môi trường lỏng: 

Kỹ thuật này cũng có thể được áp dụng trong quá trình theo dõi sự thuỷ phân của Twees do 

các enzyme Lipase khác nhau xúc tác. 

Phương pháp này theo dõi sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian. Kỹ thuật này rất 

nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối với các hệ nhũ tự nhiên ví dụ như huyết tương chẳng hạn, 

thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác có thể ảnh hưởng đến quá trình. Thêm vào đó, kết quả 

không hoàn toàn tuyệt đối là những giá trị hoạt động của enzym Lipase và thu được dữ liệu 

đáng tin cậy. Vì vậy, enzym Lipase thuần khiết được sử dụng để xây dựng một đường 

chuẩn. Bước chuẩn hoá này đã hạn chế sự khuyếch tán rộng của phương pháp nhạy cảm này. 


Pháp phân tích esterase bằng phương pháp đo độ đục đã được phát triển, sử dụng một dung 

dịch Tween 20 với sự hiện diện của CaCl 2 , và sử dụng esterase từ Lysobacter enzymogenes 

15 















làm nguồn enzyme. Phản ứng được theo dõi bằng việc đo sự gia tăng mật độ quang ở bước 

sóng 500nm vì quá trình thuỷ phân giải phóng ra các acid béo từ Tween 20 và sự kết tủa của 

chúng dưới dạng muối Canxi. 

Phương pháp phân tích đo độ đục này đã được sử dụng để xác định hoạt tính riêng của enzyme 

Lipase từ chủng Chromobacterium ( với liều lượng là 87 IU.mg -1 ) và chủng Candida cylindracea 

( với liều lượng là 0.5 IU.mg -1 ). 

2. Phương pháp đĩa Wilhelmy: 

2.1. Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết: 

Trong số các phương pháp xác định sức căng bề mặt thì kĩ thuật màng film đơn phân tử tại bề 

mặt tiếp xúc của không khí -nước đã được phát triển rộng và được nhóm nghiên cứu của Fréderic 

Beisson, Claude Rivìere cũng như nhóm của Brockman sử dụng. Kỹ thuật này về cơ bản gồm 

một lớp Teflon (lớp chống dính ) phủ trên máng, mà trên đó là một dung dịch. Một bản mỏng Pt 

nhúng trong bề mặt của pha nước được gắn liền với một electromicrobalance để đo áp suất bề 

mặt mà nó trực tiếp liên quan đến sức căng bề mặt. 

Một màng film đơn phân tử của chất béo có thể được phân bố tại bề mặt của pha nước, sử dung 

dung môi dễ bay hơi như chloroform để hoà tan chất béo. Dung dịch chất béo được áp dụng ở 

dạng những giọt nhỏ mà chúng có khả năng bay hơi được. Vùng bị chiếm giữ bởi lớp chất béo 

có thể là hàng rào được điều chỉnh bởi một lớp Teflon quét trên bề mặt của pha nước. Áp suất 

bề mặt có thể được duy trì bề mặt có thể được duy trì không đổi tự động bằng cách sử dụng sự 

thuyên chuyển của Teflon mà được kiểm soát và điều chỉnh phụ thuộc vào đầu ra của 

electromicrobalance. 

Dung dịch chứa enzyme Lipase được tiêm vào bên dưới màng film chất béo, áp suất bề mặt sẽ 

giảm vì sự hoà tan của những sản phẩm phản ứng thuỷ phân chất béo. Khi lớp màng chắn này di 

chuyển có tác dụng duy trì hằng số áp suất bề mặt, động học của phản ứng có thể được theo dõi 

bằng cách ghi lại sự chuyểng động của lớp màng chắn này theo thời gian. 


16 















Với kỹ thuật này, ta có thể đo và điều khiển những tham số bề mặt quan trọng như áp suất bề 

mặt ( năng lượng tự do của bề mặt tiếp xúc giữa các pha) và vùng phân tử của cơ chất. Phương 

pháp màng film đơn phân tử thích hợp để nghiên cứu những phản ứng enzym trên chất béo mà 

được phân bố tại bề nặt tiếp xúc không khí-nước. 

Phương pháp này có độ nhạy cao, và lương chất béo thấp đáp ứng yêu cầu để thực hiện những 

phép đo động học đáng tin cậy. 

2.2. Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất: 

Hầu hết những nghiên cứu động học về hoạt động của enzym thuỷ phân chất béo đã được thực 

hiện invitro, dùng những chất béo thuần khiết làm cơ chất. Thực tế, tất cả các mặt phân cách của 

sinh vật đều là sự pha trộn phức tạp của hỗn hợp gồm lipit và Protein. Kỹ thuật đơn lớp lý tưởng 

thích hợp cho việc nghiên cứu kiểu hoạt động của hệ enzym thuỷ phân chất béo tại mặt phân 

cách, sử dụng hỗn hợp chất béo đã được điều chỉnh. Có 2 phương pháp từ hỗn hợp chất béo tạo 

màng đơn lớp tại bề mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách phân bố hỗn hợp chất béo không 

tan trong nước vào một dung môi hữu cơ dễ bay hơi, hoặc tiêm một dung dịch nhũ tương của 

chất tẩy rửa vào trong pha nước,được bao phủ bởi lớp đơn chất béo không tan. 

Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và Verger [70] cho việc 

nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt không thay đổi và thành 

phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình Fig 1A. 

Màng chắn bằng teflon được đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “ Zero-order “ để ngăn truyền 

thông bề mặt giữa màng chứa ( reservoir ) và bộ phận phản ứng (reaction compartment). Áp suất 

bề mặt được xác định rõ đầu tiên bằng cách đặt bản Pt vào trong bộ phận phản ứng , nơi mà hỗn 

hợp film được phân bố ở áp suất yêu cầu. Áp suất bề mặt được đo sau khi chuyển bản Pt tới 

màng chứa, nơi mà film cơ chất thuần khiết được phân bố tiếp sau.Áp suất bề mặt của màng 

chứa bằng với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng bằng việc di chuyển lớp màng chắn di động. 

Màng chắn giữa 2 bộ phận được chuyển dịch cho phép những bề mặt tiếp xúc với nhau và enzyme 

được tiêm vào trong bộ phận phản ứng. 

2.3. Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp: 

Bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp đơn phân tử, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng giá trị tối ưu 

xảy ra ở mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt. Giá trị chính xác của điểm tối ưu biến 

đổi tuỳ theo sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất được sử dụng. 

Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích hiện tượng này là: 

• Sự định hướng phụ thuộc màng bao của cơ chất có lẽ là một trong những nhân tố điều hoà 

mà quá trình phân giải chất béo phụ thuộc. Sử dụng những enzyme đã được đánh dấu 

phóng xạ, Verger và Pattus đã thiết lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự tương 

quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính hoạt động 

bề mặt của enzyme. 






17 











Sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system) nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và tỉ 

lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỉ lệ này thường là 1 

cm -1 , phụ thuộc vào độ sâu của cái máng. Trong khi đó, ở khối lớn tỉ lệ này có thể cao khoảng 

10 -5 cm -1 , phụ thuộc vào lượng lipit sử dụng và trạng thái của sự phân giải lipit. Kết quả là ở 

trường hợp của khối lớn sự hấp phụ hầu hết các enzyme xuất hiện tại bề mặt giao tiếp, trong khi 

ở lớp đơn chỉ có 1 phân tử enzyme trong hàng trăm các enzyme có thể xuất hiện tại bề mặt giao 

tiếp. Vì ở tình trạng này, một lượng nhỏ không xác định ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ thuỷ 

phân được hấp phụ trên lớp đơn. 

Để khắc phục sự giới hạn này thì nhiều phương pháp đã được đề ra để phục hồi và đo lượng 

enzyme đã được hấp phụ tại bề mặt giao tiếp. 

Sau khi đo tốc độ, Momsen và Brockman [77] đã chuyển lớp đơn đến 1 mẩu giấy kỵ nước và 

những enzyme được hấp phụ sau đó được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ. Sau khi so sánh 

với tốc độ của mẫu trắng và pha mang ( subphase ), số lượng của những enzyme được hấp phụ 

sẽ được tính toán từ vận tốc của mạng lưới và hoạt động của những enzyme đặc hiệu. 

Trong bảng phân tích những enzyme hoạt động phóng xạ, màng film được hút ra bằng cách lồng 

những đáy của ống mao quản thuỷ tinh cong vào trong chất lỏng và nổi lên trên đỉnh của một 

phần thành Teflon. Khi những phân tử enzyme được đánh dấu phóng xạ tan trong pha mang sẽ 

bị hút ra cùng với những thành phần đi kèm với màng film. Kết quả sẽ được kiểm tra dựa trên 

sự hoạt động phóng xạ trong cùng một thể tích của pha mang được hút ra. Sự khác biệt giữa 2 

giá trị thực sự đã phản ánh được hoạt động phóng xạ vượt mức tồn tại ở bề mặt tiếp xúc, được 

quy cho phân tử enzyme có liên kết với màng film. Bởi vì có thể sử dụng kỹ thuật lớp đơn để đo 

tốc độ phản ứng được thể hiện bằng đơn vị mol.cm -2 .min -1 và sự vượt mức của enzym ở bề mặt 

bằng đơn vị mg.cm -2 . Ta dễ dàng đạt được giá trị hoạt động đặc hiệu của enzyme thường được 

đo bằng đơn vị là mol.min -1 .mg -1 ( IU.mg -1 ). 

Bằng cách kết hợp đồng thời 2 kĩ thuật ELISA và kĩ thuật lớp đơn phân tử, ta có thể đo 

được hoạt tính của enzyme Lipase trong đường ruột của người ( HGL-Human gastric 

lipase). Trên lớp màng 1,2 didecanoyl-sn-glycerol (lớp dicaprin) và cũng có thể xác định 

được sự vượt mức của enzyme bề mặt tương ứng. Một lượng HGL luân chuyển sẽ gia 

tăng một cách ổn định với màng bao lipit. Những hoạt tính đặc hiệu được xác định trên 

lớp dicaprin tại 35mN.m -1 đã được tìm thấy ở cùng một mức độ giá trị khi được đo dưới 

điều kiện phân tích khối lớn tối ưu, sử dụng cơ chất là chất nhũ hoá tributyrin (liều lượng 

là 1000IU cho 1mg enzym). Tại một nồng độ lipase cho trước trong pha mang nước, sự 

liên kết bề mặt của các HGL với lớp màng phosphatidylcholine ưa béo của lòng đỏ trứng 

đã được nhận ra rằng chậm hơn 10 lần so với trường hợp của lớp màng dicaprin. 

2.4. Phương pháp hiển vi lực nguyên tử (Atomic force microscopy): 


Để theo dõi động học của sự thuỷ phân của màng phospholipids kép bằng phospholipase A 2 , 

Nielsen đã làm một thí nghiệm sử dụng phương pháp hiển vi lực nguyên tử (AFM) trong môi 

trường chất lỏng. Theo những nghiên cứu này thì sự thuỷ phân enzym của màng 

18 















acylglycerols/phospholipids kép bằng enzyme Humicola lanuginosa lipase (HLL) cũng đã được 

nghiên cứu bằng phương pháp AFM. 

Màng lipit kép củng cố bởi Mica bị thuỷ phân bởi HLL và vì sản phẩm hoà tan trong dung dịch 

đệm, các khu vực bị khoét sâu của màng kép sẽ bị phát hiện ra bởi đỉnh AFM. Chúng ta sẽ có 

được những hình ảnh thời gian thực của sự thuỷ phân xuất hiện ở lớp màng kép và sẽ phân tích 

chúng bằng phần mềm đã được thiết lập sẵn. Những hình ảnh này sẽ chỉ ra được sự xuất hiện 

của vết lõm tại bề mặt ở mức xấp xỉ 10 -9 một cách gia tăng dần. Thêm vào đó, sự gia tăng diện 

tích của lỗ hổng ở lớp màng kép lipit mà được ghi nhận như là chức năng thời gian và hoạt tính 

đặc hiệu của enzyme sẽ được đánh giá với điều kiện một phân tử lipase sẽ hoạt động trong 1 lỗ. 

Kết quả được sử dụng để làm mẫu cho động học của phản ứng enzyme tại bề mặt tiếp xúc giữa 

2 pha béo-nước. Dữ liệu này cung cấp hình ảnh đầu tiên ở tầm Nano của động học quá trình phân 

giải lipit. 

2.5. Quang phổ học hồng ngoại: 

Một phân tích liên tục để đo sự thủy phân của những TAG do Lipase xúc tác micell đảo ngược 

sử dụng Fourier thay đổi quang phổ học hồng ngoại (FTIR – Fourier transform infrared 

spectroscopy), được phát triển bởi Walde và Luisi [80]. Sự phân hủy chất béo có thể được theo 

dõi bằng việc ghi lại phổ FTIR của toàn bộ hỗn hợp phản ứng. Số lượng những ester axit béo và 

FFA s ( mà cực đại đỉnh tương ứng tại 1751cm -1 và tại 1715 cm -1 ) có thể dựa trên cơ sở của 

những hệ số tắt và định luật của Beer. Phương pháp này được ứng dụng để đo sự phân hủy chất 

béo của những cơ chất khác nhau ( như trioctanoyglycerol, các loại dầu thực vật ). 

3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân: 

3.1. Sự giải phóng Proton như một phép phân tích gián tiếp: 

3.1.1. Những chất chỉ thị màu: 

a) Trong môi trường rắn: Khi dung dịch lipase được đặt trên một đĩa agar chứa ester 

carboxylic như một cơ chất, có thể theo dõi độ pH bằng việc quan sát sự thay đổi màu của 

những chất chỉ thị (do những axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân gây ra) 

mà trước đó đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel agar.Ở đây tồn tại một mối 

quan hệ tuyến tính giữa đường kính của đốm ( vị trí ) khuyếch tán axit béo và logarit của 

vùng phân bố enzym. Kỹ thuật này rất tiện lợi trong việc sàng lọc nhanh chóng những vi 

sinh vật phân hủy lipid phát triển trên những đĩa agar. Tuy nhiên một vài sai sót có thể là 

kết quả từ quá trình axit hóa của môi trường, vì sự phát sinh của những chất chuyển hóa 

axit khác với FFA s mà được giải phóng bởi những vi khuẩn lipase. 

b) Trong môi trường chất lỏng: mặc dù đây là một phương pháp định tính, kỹ thuật này cung 

cấp một phương tiện đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần nhỏ cột 

ghi sắc kí tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát những thay 

đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều với những cơ chất ester. 






19 











Một phương pháp định tính đơn giản hơn mà dựa vào sự phát hiện những đặc trưng mạnh 

mẽ về mùi của axit butyric và axit caproic, chúng có mùi của những giọt sữa đã bị thủy 

phân mà được dùng như một cơ chất lipase. 

3.1.2. Phép chuẩn độ: 

Phương pháp pH-stat. Đây là một kỹ thuật tiện lợi để mô tả đặc điểm và sự đặc biệt của Lipase 

cũng như hiện tượng kích hoạt bề mặt tiếp xúc giữa các pha. 

Với phương pháp pH-stat, hoạt động của Lipase được đo trên một máy khuấy trộn hệ nhũ tương 

của những TAG s tự nhiên hay chất tổng hợp bằng việc trung hòa FFA s được giải phóng theo thời 

gian bởi sự thêm vào chất chuẩn độ NaOH để duy trì độ pH tại một giá trị điểm cuối không đổi. 

Thiết bị pH-stat có sẵn đã được sản xuất thương mại như bức xạ kế (Copenhagen,Denmark ) 

hoặc Metrohm Ltd (Herisau, Switzerland ). 

Phương pháp pH-stat được dùng để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực 

vật, có mặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với keo arabic như cơ chất. Kỹ thuật 

pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính Lipase trong huyết thanh, plasma và dịch tá 

tràng. 

Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả khá chính xác (nhạy) trong 

giới hạn 1mol axit béo được giải phóng trong 1 phút. Khi sử dụng NaOH 0.1M làm chất chuẩn 

độ thì phương pháp này không đáng tin cậy trong việc nhận biết được mức độ hoạt động nhỏ hơn 

0.1 mol/phút. 

Nhược điểm: 

Ngoài tính nhạy thấp của nó, nhược điểm của phương pháp pH-stat là vùng phân bố hẹp của 

những giá trị pH mà có thể được nghiên cứu tìm hiểu. Đặc biệt hơn, sự phát hiện những Proton 

được giải phóng trong suốt thời gian phản ứng thủy phân mà được xúc tác bởi những enzyme 

Lipase thì cần có quá trình ion hóa một phần những axit béo được giải phóng. Bởi vậy, những 

giá trị pH của điểm cuối của môi trường phản ứng phải gần bằng nhau, hoặc cao hơn, thích hợp 

hơn giá trị pK a hiển thị của axit béo được giải phóng. Hơn nữa, nên chú ý rằng: khả năng ion 

hóa cũng như sự có mặt của những ion Canxi sẽ làm giảm đáng kể sự chính xác của những giá 

trị pK a hiển thị. Sự có mặt của những ion Ca 2+ có ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả ion hoá của 

những axit béo mạch dài. Hiện tượng kết tủa vi mô này điều khiển cân bằng hóa học bằng định 

luật hoạt động khối lượng. 






20 








V. Ứng dụng 

1. Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp 




Công nghiệp Hoạt tính Sản phẩm/ứng dụng 

Chất tẩy 

Thực phẩm sữa 

Thủy phân chất béo 

Thủy phân chất béo của sữa, 

làm chín phomat, biến đổi chất 

béo của bơ. 

Loại các vết bẩn dầu từ vải 

Tăng cường các chất mùi thơm 

trong sữa, phomat và bơ. 

Các loại bánh Cải thiện mùi thơm Kéo dài thời gian sử dụng 

Nước giải khát Cải tiến mùi hương Các loại nước giải khát 

Bao bì thực 

phẩm 

Thực phẩm 

chức năng 

Thịt và cá 

Các chất béo và 

dầu 

Hóa chất 

Dược phẩm 

Mỹ phẩm 

Cải tiến chất lượng 

Chuyển đổi sự ester hóa 

Tăng cường hương vị 

Chuyển đổi sự ester hóa, thủy 

phân 

Chọn lọc đối kháng, tổng hợp 

Chuyển đổi sự ester hóa, thủy 

phân 

Tổng hợp 

Mayonnaise, các loại bao bì và 

các loại chỉ khâu 

Thực phẩm chức năng 

Các sản phẩm thịt và cá, loại bỏ 

chất béo 

Bơ cocoa, margarine, các acid 

béo, glycerol, các glyceride đơn, 

đôi 

Các khối kết tinh, hóa chất 

Các lipid đặc trưng, các chất trợ 

tiêu hóa 

Chất nhũ tương hóa, chất tạo ẩm 

Da Thủy phân Các sản phẩm da 

Giấy Thủy phân Cải thiện chất lượng giấy 

Chất làm trắng Thủy phân Loại bỏ chất béo 






21 











2. Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa 

Ứng dụng thương mại quan trọng của lipase là làm phụ gia trong công nghiệp chất 

tẩy rửa và bột giặt gia đình. Để tăng khả năng tẩy rửa, các chất tẩy hiện đại đều chứa 

một hoặc nhiều loại enzyme như protease, amylase, cellulose và lipase. 

Việc loại bỏ dầu mỡ bằng lipase có triển vọng rất lớn trong công nghiệp chất tẩy 

rửa. Trong điều kiên bình thường của quá trình giặt tẩy, lipase hoạt động khá tốt. Lipase 

bổ sung vào chất tẩy rửa phải có đặc tính: chịu nhiệt, chịu kiềm (pH khoảng 7.5 đến 11) 

và chịu các tác động của các chất cấu tạo nên chất tẩy rửa (Jäeger và cs, 1994). Lipase 

kiềm chịu nhiêt đã được dùng trong công nghiệp tẩy rửa để loại bỏ các vết triglyceride 

từ người và các loại thức ăn, trước kia, việc loại bỏ các chất này trong điều kiện giặt ủi 

bình thường rất khó khăn. 

Năm 1988, Lipase được cho vào chất tẩy rửa dưới tên thương mại là lipolase 

100T thu từ Humicola lanuginose được sản xuất bởi Novo Nordisk Bioindustry (Jäeger 

và cs, 1994). 

Lipase từ các chủng vi khuẩn P.medocina và Pseudomonas alcaligenes đã đươc 

sản xuất và bổ sung vào chất tầy rửa ở công ty Genecor international USA (Jäeger và 

cs, 1994; Reetz và Jäeger, 1998). 

3. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy 

Quá trình thuộc da là quá trình khá phức tạp gồm loại bỏ chất béo, rủ lông và làm 

mềm. Quá trình thuộc da thường sử dụng môi trường kiềm nên sử dụng các vi khuẩn 

kiềm sẽ đem lại hiệu quả cao. Dòng bacillus sp. có thể phát triển trong môi trường kiềm 

sinh tổng hợp lipase kiềm, vì thế chúng rất thích hợp cho quá trình thuộc da (Haalck và 

cs, 1992; Wang và cs, 1995). 

Lợi thế của việc dùng lipase là màu sắc được giữ nguyên và sạch. Lipase cũng cải 

thiện tính không thấm nước của da và da không bị vết hoan ố như sử dụng dung môi và 

chất hoạt động bề mặt. 

Trong công nghiệp giấy, sáp và triglyceride gây trở ngại cho sản xuất nên loại bỏ 

các chất này là điều cần thiết (Bajpai 1999). Công ty giấy công nghiệp Nippon (Nhật 

Bản) đã dùng lipase từ nấm Canada rugosa để loại 90% các chất này có trong gỗ. 

Một số sản phẩm lipase được thương mại hóa dùng cho công nghệ thuộc da: 

Greasex ® , NovoCor ® ADL, dệt: Novozyme ® 375, giấy: Resinase ® . 


22 















4. Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất 

Chất trung gian trong tổng hợp chất trị liệu, hóa nông và hương liệu thường dùng 

là các chiral. Các chất này khó tổng hợp bằng phương pháp hóa học. chỉ 1 trong 2 đồng 

phân của thuốc có dược tính, việc tổng hợp đồng phân thuần khiết là bước quan trọng 

trong công nghiệp dược. 

Có 2 loại biến đổi sinh học có chọn lọc đồng phân chất hữu cơ được xúc tác bởi 

lipase: phản ứng các cơ chất tiền chiral và động học tan của các racemate (Kazlauskas 

và cs, 1998). Theo truyền thống, các chất tiền chiral hoặc chiral alcohol và ester của acid 

carboxylic được coi là 2 loại chất cơ bản nhưng nhiều năm qua phạm vi của các chất 

nhanh chóng được mở rộng sang cả các diol, các acid α và β, hydroxyl, cyanohydrin, 

chlorohydrin, diester, lactone, amine, diamine, amino-alcohol và dẫn xuất của α và β 

acid amine (Kazlauskas và cs, 1998). Loại lipase xúc tác cho các phản ứng này thu nhận 

từ vi khuẩn P.aeruginosa, P.flourescens và các loài Pseudomonas khác, B.cepacia, 

C.viscosum, B.subtillis (Chunyuan và cs, 2008), Achromobacter sp., Alcaligenes sp.và 

serratia marcescens. 

5. Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế 

Lipase được sử dụng để xúc tác ester hóa tinh bột sắn làm chất mang dược chất và 

làm vật liệu trong điều trị gãy xương (Rajan và cs, 2008). 

Lipase là một chất hoạt hóa yếu tố phá hủy tế bào ung thư, vì vậy có thể sử dụng 

trong điều trị ung thư. Lipase Candida rugosa đang được dùng để tổng hợp thuốc hạ 

cholesteron huyết thanh (Hasan và cs, 2006). Lipase còn được sử dụng là chất kích hoạt 

nhân tố hoại tử khối u và được dùng trong một số liệu pháp chữa trị các khối u ác tính. 

Lipase có thể được cố định trên điện cực pH/oxygen kết hơp với glucose oxidase 

và có chức năng như là một lipid biosensor được dùng trong xác định cholesteron máu 

(Hasan và cs, 2006). 

Lipase được sử dụng khá sớm trong các liệu pháp chữa trị chứng khó tiêu, đầy hơi, 

dị ứng bởi thức ăn,.... lipase từ thực vật được dùng để bào chết các loại thuốc hỗ trợ tiêu 

hóa như Similase, Vitaline Herbal Formulas được sản xuất bởi Health Care 

Professionals, Oregon, Hoa Kỳ. 

Một số sản phẩm enzyme được thương mại hóa dùng xúc tác phản ứng sinh học: 

Novozyme ® 388, Novozyme ® 435, Novozyme ® 525 F. 

6. Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa 

Monoacylglycerol và diacylglycerol là chất được tổng hợp bởi quá trình ester hóa 

glycerol bằng lipase, chúng là chất hoạt động bề mặt hiệu quả được ứng dụng trong mỹ 

phẩm (Pandey và cs, 1999; Kirk và cs, 2002). Việc tổng hợp monoacylglycerol bằng 

enzyme monoacylglycerol lipase lấy từ vi khuẩn Pseudomonas sp. 

Izumi và cs (1997) đã chỉ ra rằng sự chuyển vị trong quá trình ester hóa 3,7- 

dimethyl-4,7-octadien-1-ol bằng lipase từ nhiều chủng vi sinh vật khác nhau là nguồn 

hương hoa hồng nhân tạo rẻ tiền và hiệu quả cho công nghiệp nước hoa. 

Ester của acid béo và các đường (lauryl manose) là những chất hoạt đông bề mặt 

được sử dụng để nhũ hóa trong thực phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp dược (Wenbin và 

cs, 2009). 

Lipase hỗ trợ quá trình tổng hợp hương liệu đã được nghiên cứu đặc biệt là (-) 

menthol. 

7. Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel 

Lipase cố định từ Pseudomonascepacia dùng trong phản ứng chuyển ester hóa 

giữa dầu nành với ethanol và methanol tạo ra alkyl ester (biodiesel).Lipase thương mại 


23 















Novozyme 435 cũng dùng xúc tác phản ứng chuyển ester hóa của dầu nành để sản xuất 

biodiesel trong môi trường không dung môi. 

8. Ứng dụng lipase trong biosensor (cảm biến sinh học) 

Môt lĩnh vực mới đầy tiềm năng trong ứng dụng của lipase vi sinh vật là biosensor. 

Người ta sử dụng mẫu dò là enzyme được đánh dấu để tránh tình trạng không ổn định 

và các chất đồng vị nguy hiểm khi sử dụng mẫu dò là DNA được đánh dấu. 

Phương pháp này cho phép chuẩn đoán nhanh và chính xác một số bệnh lien quan 

đến tim mạch như hàm lượng cholesteron trong máu. Các lipase không đặc hiệu, đặc 

biệt là lipase của Candida rugosa đã được phát triển thành mẫu dò. 

❖ Quy trình ứng dụng của Lipase chuyển hóa Biodiesel từ dầu đậu nành 


Enzym lipase cố định trên nano từ tính ứng dụng cho quá trình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu 

nành 





24 








❖ Quy trình ứng dụng của Lipase trong sản xuất phô mai 









Việc bổ sung lipase có tác dụng tăng vị béo và hương vị đặc trưng của phô mai 

25 











VI. Tài liệu tham khảo 

1. Nguyễn Lê Sỹ Thanh, Quyền Đình Thi, Một số tính chất hóa lý của lipase 

ngoại bào chủng geotrichum sp.DTQ-26.3. tạp chí Công nghệ Sinh học 5 (1): 

31-40, 2007. 

2. Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Biểu hiện gen mã hóa lipase từ chủng 

Bacillus subtilis FS2, tạp chí Công nghệ sinh học 5 (1): 41-46, 2007. 

3. Trần Bích Lam, Cố định enzyme và ứng dụng. 

4. Trần Thanh Trúc, Công nghệ chế biến dầu mỡ thực phẩm. 

5. Lê Văn Việt Mẫn, Giáo trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức 

uống pha chế tập 1, tr273. 

6. Mai Xuân Lương, Phương pháp tách chiết enzyme. 

7. Rohit Shama et.al, Production, purification, characterization and applications 

of lipase, Biotechnology adavances 19 (2001) 627-662. 

8. Trần Bích Lam, phương pháp xác định hoạt tính enzyme. 

9. Phạm Thị Hương, Ứng dụng enzyme ngoại bào trong công nghệ thực phẩm. 

10. Phạm Xuân Núi, tổng hợp và đặc trưng xúc tác lipase cố định nano từ tính ứng 

dụng cho quá trình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu nành. 

11. Trần Thị Bé Lan, so sánh một số tính chất của chế phẩm enzyme lipase từ cadida 

rugosa và porcine pancreas, tạp chí khoa học 2012:22b 210 220. 

12. Trần Thị Bé Lan, nghiên cứu enzyme lipase từ candida rugosa và porcine 

pancreas xúc tác phản ứng transester hóa dầu dừa, tạp chí khoa học 2012: 23b 

105-114. 






26 




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO 

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH 

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC 

Báo cáo 

ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG ENZYME LIPASE,CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 

HOẠT ĐỘ ENZYME 

GVHD:Th.S Trương Phước 

SVTH: 

1/ ĐẶNG NGỌC 

2/BÙI PHƯƠNG 

3/TRẦN THỊ KIM 

4/NGUYỄN THỊ YẾN 

5/NGUYỄN THÁI

I. Tổng quan về enzyme Lipase 

1. Tên enzyme Lipase 

❖ Lipase (EC 3.1.1.3) còn có tên khác là 

Triacylglycerol lipase. 

❖ Thuộc nhóm enzyme hydrolase, cắt đặc hiệu 

các liên kết ester. 

❖ Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần 

lượt các liên kết α-ester chứ không cắt cùng 

một lúc 3 liên kết. Quá trình xúc tác thường 

chậm hơn so với các enzyme khác như 

protease, amylase…


2. Cấu trúc enzyme lipase 

❖ Tâm hoạt động của lipase là bộ 

ba: Serine, Histidine và 

Aspartate/Glutamate. 

❖ Loại gấp cuộn các protein và cơ 

chế xúc tác, hầu hết đều dựa vào 

sự gập cuộn alpha, beta hidrolase.


3. Cơ chế sinh tổng hợp lipase 

❖ Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được 

hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, 

dịch mã và sau dịch mã. Tất cả các quá trình 

thực hiện bên trong tế bào chất của VSV. 

4. Phân loại enzyme:


4. Phân loại enzyme: 

a)Nguồn gốc: 

❖ Lipase từ thực vật như ngũ cốc trong giai đoạn 

nảy mầm. Lipase từ nguồn thu nhận này hạn 

chế về hoạt tính lẫn khả năng bền nhiệt, đồng 

thời nồng độ enzyme là không cao. 

❖ Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ 

tụy tạng của bò, cừu và lợn. 

❖ Bên cạnh đó, nguồn lipase này còn có khả năng 

lây truyền virus từ động vật sang người nên 

hiện nay xu hướng sử dụng lipase từ vi sinh vật 

đang được ưa chuộng do đặc tính đa dạng, dễ 

tách chiết và nguyên liệu vô hạn .



b)Các loại enzyme lipase: 

‣ Lipase có tính đặc hiệu vị trí: 

❑C (cylindracae) rogusa 

❑Corynebacterium 

❑Staphylococus aureus 

‣ Lipase có tính đặc hiệu cơ chất: 

❑C. rugosa (C18:1 cis-9) 

❑A. niger (C10 và C12 hoặc C18:1 cis-9) 

❑M. miehei (C12) 

❑G. Candidum 

‣ Một số lipase từ chủng Pseudomonas như P. cepacia, P. glumae, 

P. flourensence



c)Tính chất: 

❖ Đặc hiệu vị trí: Những enzyme không đặc hiệu 

với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch 

triglyceride (C.rugosa). 

❖ Đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp 

vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị 

chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme. 

(C.rugosa, A.niger, M.miehei …)


5. Thông số:nhiệt độ,pH, cofactor,coenzyme: 

a) Nhiệt độ, pH tối ưu 

❖ Lipase chiết xuất từ tụy tạng bị mất hoạt tính ở 

400°C, nhưng một số lipase ở vi sinh vật lại có 

tính bền nhiệt. 

b) Cofactor 

❖ Enzyme lipase hoạt động không cần cofactor, 

tuy nhiên sự hiện diện của một số các cation 

kim loại như Ca2+, Na+ sẽ làm tăng hoạt tính 

của lipase. Hoạt tính của lipase bị bất hoạt bởi 

Co2+, Ni2+, Hg2+ và Sn2+, bị kìm hãm nhẹ bởi 

Zn2+ và EDTA:


5. Thông số:nhiệt độ,pH, cofactor,coenzyme: 

c) Cơ chế xúc tác: 

Ví dụ về cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân:

II. Sản xuất enzyme Lipase 

1. Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV(MT bán 

rắn)


2. Tinh sạch enzyme bằng sắc kí cột 

❖ Các nhà khoa học sử dụng DNA tái tổ hợp biểu hiện 

trong E.coli bằng cách thiết kế gen mã hóa tổng hợp 

lipase gắn thêm các trình tự mã hóa 6 gốc His ở đầu C 

(6His lk đặc hiệu với Ni ++ trên cột sắc ký ái lực). 

❖ Mà việc nhồi cột Ni ++ tương đối dễ dàng, cột bền, sử 

dụng rất lâu. Từ đó mà thành enzyme giảm, tạo điều 

kiện cho việc ứng dụng lipase rộng rãi hơn. Bên cạnh 

đó, một số nghiên cứu còn dùng phương pháp gây đột 

biến, làm tăng khả năng biểu hiện gen, nâng cao hoạt 

tính lipase.


3. Sản phẩm cuối cùng:

IV. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 

❑ Mức độ hoạt động (hoạt độ) của enzyme dùng 

để: 

❖ Đánh giá mức độ mạnh hay yếu (cường độ xúc 

tác) của enzyme: 

❖ Là lượng enzyme có khả năng xúc tác chuyển 

hóa một lượng cơ chất nhất định trong thời 

gian nhất định ở điều kiện tiêu chuẩn (nhiệt độ, 

áp suất tối ưu). Xác định hoạt độ của enzyme 

thông qua xác định lượng cơ chất mất đi hay 

lượng sản phẩm được tạo thành trước phản 

ứng. 

❖ Đánh giá mức độ tinh khiết của enzyme.


❑ Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý một số 

điểm sau: 

❖ Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong 

một giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hoà 

enzym nhưng không quá cao để đến mức kìm 

hãm enzyme. 

❖ Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp 

và cố định. 

❖ Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp 

hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme để đề phòng 

tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao 

❖ Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 đến 30 

phút.


1 .Các phương pháp hoá lý 

❑ Phương pháp đo độ đục: 

Trong môi trường rắn :Phương pháp này sử dụng 

các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester 

carboxylic được dùng làm cơ chất , bản chất là xác 

định đường kính của vùng khuyếch tán sản phẩm. 

Trong môi trường lỏng:Phương pháp này theo dõi 

sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian. Kỹ 

thuật này rất nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối 

với các hệ nhũ tự nhiên ví dụ như huyết tương 

chẳng hạn, thì sự có mặt của nhiều yếu tố khác có 

thể ảnh hưởng đến quá trình.


2 . Phương pháp đĩa Wilhelmy 

Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất: 

❖ 

❖ 

Có 2 phương pháp từ hỗn hợp chất béo tạo màng đơn lớp tại bề 

mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách phân bố hỗn hợp chất 

béo không tan trong nước vào một dung môi hữu cơ dễ bay hơi, 

hoặc tiêm một dung dịch nhũ tương của chất tẩy rửa vào trong 

pha nước,được bao phủ bởi lớp đơn chất béo không tan. 

Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi 

Píeroni và Verger [70] cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp 

đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt không thay đổi và thành 

phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình


3. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng 

thủy phân: 

a)Sự giải phóng Proton như một phép phân tích gián tiếp: 

❑ Những chất chỉ thị màu: 

❖ Trong môi trường rắn:Khi dung dịch lipase được đặt trên một 

đĩa agar chứa ester carboxylic như một cơ chất, có thể theo dõi độ 

pH bằng việc quan sát sự thay đổi màu của những chất chỉ thị (do 

những axit béo được giải phóng trong phản ứng thủy phân gây ra) 

mà trước đó đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel 

agar. Kỹ thuật này rất tiện lợi trong việc sàng lọc nhanh chóng 

những vi sinh vật phân hủy lipid phát triển trên những đĩa agar 

❖ Trong môi trường chất lỏng:mặc dù đây là một phương pháp 

định tính, kỹ thuật này cung cấp một phương tiện đơn giản để 

phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần nhỏ cột ghi sắc kí 

tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát 

những thay đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều 

với những cơ chất ester.



thủy phân: 

b) Phép chuẩn độ: 

❖ Phương pháp pH-stat được dùng để phát hiện ra hoạt 

tính của lipase trong dịch mô đồng thể thực vật, có mặt 

của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hóa với keo 

arabic như cơ chất. Kỹ thuật pH-stat đã được dùng để 

xác định những hoạt tính Lipase trong huyết thanh, 

plasma và dịch tá tràng.



thủy phân: 

❑ Nhược điểm: 

❖ Vùng phân bố hẹp của những giá trị pH mà có thể được 

nghiên cứu tìm hiểu. Đặc biệt hơn, sự phát hiện những 

Proton được giải phóng trong suốt thời gian phản ứng 

thủy phân mà được xúc tác bởi những enzyme Lipase thì 

cần có quá trình ion hóa một phần những axit béo được 

giải phóng. 

❖ Khả năng ion hóa cũng như sự có mặt của những ion 

Canxi sẽ làm giảm đáng kể sự chính xác của những giá trị 

pK a hiển thị


1. Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp


2. Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa 

- Việc loại bỏ dầu mỡ bằng lipase có triển vọng rất lớn 

trong công nghiệp chất tẩy rửa. Trong điều kiên bình 

thường của quá trình giặt tẩy, lipase hoạt động khá tốt.


3. Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, 

dệt, giấy 

❖ Quá trình thuộc da thường sử dụng môi trường kiềm nên sử dụng 

các vi khuẩn kiềm sẽ đem lại hiệu quả cao. Dòng bacillus sp. có thể 

phát triển trong môi trường kiềm sinh tổng hợp lipase kiềm, vì thế 

chúng rất thích hợp cho quá trình thuộc da. 

❖ Lợi thế của việc dùng lipase là màu sắc được giữ nguyên và sạch. 

Lipase cũng cải thiện tính không thấm nước của da và da không bị 

vết hoan ố như sử dụng dung môi và chất hoạt động bề mặt. 

4. Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất 

5. Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế 

❖ 

❖ 

Lipase được sử dụng để xúc tác ester hóa tinh bột sắn làm chất 

mang dược chất và làm vật liệu trong điều trị gãy xương 

Lipase là một chất hoạt hóa yếu tố phá hủy tế bào ung thư, vì vậy 

có thể sử dụng trong điều trị ung thư


6. Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp 

nước hoa 

❖ Monoacylglycerol và diacylglycerol là chất được tổng hợp bởi quá 

trình ester hóa glycerol bằng lipase, chúng là chất hoạt động bề mặt 

hiệu quả được ứng dụng trong mỹ phẩm. 

❖ Lipase hỗ trợ quá trình tổng hợp hương liệu đã được nghiên cứu 

đặc biệt là menthol. 

7. Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel 

❖ Lipase cố định từ Pseudomonas cepacia dùng trong phản ứng chuyển ester 

hóa giữa dầu nành với ethanol và methanol tạo ra alkyl ester (biodiesel). 

Lipase thương mại.

VI. Tài liệu tham khảo 

1) Nguyễn Lê Sỹ Thanh, Quyền Đình Thi, Một số tính chất hóa lý của lipase ngoại bào 

chủng geotrichum sp.DTQ-26.3. tạp chí Công nghệ Sinh học 5 (1): 31-40, 2007. 

2) Nguyễn Hồng Thanh, Phùng Thu Nguyệt, Biểu hiện gen mã hóa lipase từ chủng 

Bacillus subtilis FS2, tạp chí Công nghệ sinh học 5 (1): 41-46, 2007. 

3) Trần Bích Lam, Cố định enzyme và ứng dụng. 

4) Trần Thanh Trúc, Công nghệ chế biến dầu mỡ thực phẩm. 

5) Lê Văn Việt Mẫn, Giáo trình công nghệ sản xuất các sản phẩm từ sữa và thức uống 

pha chế tập 1, tr273. 

6) Mai Xuân Lương, Phương pháp tách chiết enzyme. 

7) Rohit Shama et.al, Production, purification, characterization and applications of 

lipase, Biotechnology adavances 19 (2001) 627-662. 

8) Trần Bích Lam, phương pháp xác định hoạt tính enzyme. 

9) Phạm Thị Hương, Ứng dụng enzyme ngoại bào trong công nghệ thực phẩm. 

10) Phạm Xuân Núi, tổng hợp và đặc trưng xúc tác lipase cố định nano từ tính ứng dụng 

cho quá trình chuyển hóa biodiesel từ dầu đậu nành. 

11) Trần Thị Bé Lan, so sánh một số tính chất của chế phẩm enzyme lipase từ cadida 

rugosa và porcine pancreas, tạp chí khoa học 2012:22b 210 220. 

12) Trần Thị Bé Lan, nghiên cứu enzyme lipase từ candida rugosa và porcine pancreas 

xúc tác phản ứng transester hóa dầu dừa, tạp chí khoa học 2012: 23b 105-114.

ĐẶC TÍNH VÀ ỨNG DỤNG ENZYME LIPASE, CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?