Manual de Hemostasia y Trombosis - Universidad Autónoma de ...

INDICE
Manual de Hemostasia y Trombosis
I.- Introducción
II.-Objetivo
III.-Alcances
IV.-Políticas
V.-Técnicas para la determinación de Pruebas de Hemostasia y Fibrinólisis
• Tiempo de sangrado
• Agregación Plaquetaria
• Tiempo de Protrombina (TP)
• Tiempo de Tromboplastina Parcial activada (TTPa)
• Fibrinógeno
• Tiempo de Trombina (TT)
• Factor VIII
• Factor IX
• Lisis de Euglobulinas
• Sulfato de protamina
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Nota: Para las pruebas de TP, TTPa, TT y Fibrinógeno consultar la Guía rápida del equipo Star Stago
VI.-Documentos de Referencia
VII.-Glosario
VIII.-Control de Revisiones
IX.-Control de Emisión
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1-INTRODUCCIÓN
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La hemostasia es un proceso constituido por mecanismos biológicos interdependientes cuya finalidad es prevenir la
extravasación sanguínea espontánea, evitar la hemorragia excesiva en los vasos lesionados y mantener la fluidez de la
sangre circulante. Los mecanismos de la hemostasia dependen de cuatro factores: a) pared vascular, b) función
plaquetaria, c) coagulación sanguínea y d) fibrinólisis.
El mantenimiento de una hemostasia normal supone el correcto funcionamiento de estos cuatro factores, de forma
que la alteración de uno solo de ellos es siempre causa de patología. La hemostasia representa el cese fisiológico de la
hemorragia por medio de un mecanismo complejo que involucra un cambio de estado físico, de líquido a sólido con la
formación de fibrina y el enlace del coágulo en una malla insoluble. Las superficies celulares (plaquetas, células
endoteliales desempeñan dos papeles básicos en la hemostasia. El primero es proporcionar los factores para la
hemostasia normal que no están presentes en el plasma normal, y el segundo es proveer una superficie para el ensamblaje
de los complejos enzima/cofactor y su interacción con los sustratos para formar el coágulo de fibrina.
Clásicamente se ha dividido en hemostasia primaria y fase de coagulación sanguínea (hemostasia secundaria). En
condiciones fisiológicas la hemostasia primaria funciona en forma equilibrada, entre elementos celulares y protéicos,
manteniendo la sangre fluida dentro de los vasos. Esto se lleva acabo gracias a las importantes funciones que
desempeñan la célula endotelial , la cual se encuentra ubicada en un sitio estratégico, con funciones especificas de
tromborregulación, y las plaquetas pequeñas células discoides, anucleadas procedentes de la fragmentación del

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megacariocito, que están capacitadas para reaccionar ante una lesión del vaso sanguíneo y formar rápidamente un tapón
plaquetario, mediante los procesos de adhesión y agregación plaquetaria, deteniendo así la hemorragia.
Al mismo tiempo se activan en forma intrínseca y extrínseca los llamados factores de la coagulación (fase plasmática
o fluida) que, por mecanismos enzimáticos, en cuestión de segundos transforman al fibrinógeno en fibrina, estableciendo
un coágulo que cierra eficazmente el vaso y facilita su reparación. El coágulo de fibrina es eliminado mediante el sistema
de fibrinólisis fisiológica una vez que la cicatrización del vaso es lo suficientemente estable. Por otra parte y para limitar que
el coágulo se propague por el sistema vascular, entran en juego varios mecanismos fisiológicos que evitan la trombosis
patológica, constituidos por un complejo de proteínas antitromboticas que regulan o controlan la tendencia a la trombosis;
su deficiencia se traduce en un estado hipercoagulable o de trombofilia. (Hemostasia Secundaria).
Modelo de la cascada de coagulación
En la década de 1960, dos grupos propusieron un modelo de coagulación que contemplaba una cascada enzimática
compuesta por una serie de etapas secuenciales, en las que la activación de un factor de coagulación activa al siguiente,
para favorecer la generación del enzima activo trombina, que convierte una proteína soluble del plasma, el fibrinógeno, en
una proteína insoluble, la fibrina, componente estructural del coágulo. Según el modelo clásico, existirán dos vías de
activación, intrinseca y extrínseca, iniciadas por el factor XII y el complejo factor tisular (FT)/factor VII respectivamente, que
convergen en una vía común a nivel del factor X activo (Xa). El complejo protrombinasa, compuesto por el factor Xa, Ca 2+ y
factor Va, a nivel de superficies fosfolipidicas favorecería la generación de trombina y la formación de fibrina. Este esquema

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sigue siendo útil para explicar las pruebas de laboratorio empleadas para monitorizar la hemostasia, como el tiempo de
protrombina (TP) para la vía extrínseca y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPA) para la intrínseca.
Figura 1.-Esquema simplificado de la cascada de la coagulación.
Sin embargo, pronto se comprobó que ambas vías no operan de forma independiente y que el déficit de factores de
la vía intrínseca que prolongan el TTPa no conllevan el mismo riesgo hemorrágico. Por ejemplo, las deficiencias de factor
XII no cursan con hemorragia leve, mientras que las deficiencias de factores VIII y IX conllevan hemorragias graves. Otra
observación clave fue el hecho de que el complejo FT/VII no solo activa el factor X, si no también el factor IX, llegándose a
la conclusión de que la vía extrínseca seria la de mayor relevancia fisiopatológica in vivo.

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Es importante mencionar que no debería hablarse de cascada de coagulación, si no más bien de una serie de
cambios bioquímicos y enzimáticos para la formación de trombina y subsecuentemente la formación de un coágulo de
fibrina. En los años posteriores surgieron nuevos conceptos que se integraron a estén modelo de la cascada de la
coagulación; sin embargo, todos estos nuevos conceptos no lograron explicar el modelo real de la coagulación in vivo.
En estudios más recientes se demostró la importancia del componente celular en el proceso de coagulación. Es
claro que la hemostasia no es posible sin la intervención de las plaquetas. Además el factor tisular es una proteína que
esta presente en la membrana de diversas células, como fibroblastos, y hoy sabemos que diferentes células expresan
proteínas procoagulantes y anticoagulantes, además de receptores para diversos componentes de la hemostasia, lo que ha
supuesto un nuevo paradigma para explicar las reacciones que tienen lugar durante el proceso hemostático.
Las superficies celulares constituyen el ambiente natural donde se desarrollan las reacciones de la coagulación
sanguínea. Para que se produzca una hemostasia eficaz deben cooperar diferentes tipos celulares. Las plaquetas
suministran la superficie más eficiente para la generación de trombina; sin embargo, carecen de FT y por ello no pueden
iniciar la coagulación. Otras células expresan el FT en su superficie y algunas como los monocitos, son capaces de
ensamblar en su superficie al complejo activador del factor X y al complejo protrombinasa, por lo que para generar trombina
de forma eficiente deben participar al menos de dos tipos celulares. El modelo actual de coagulación es dependiente de
superficies celulares y del factor tisular y consiste en una serie de mecanismos que se inician cuando existe una lesión
vascular y se expone el FT de fuentes extravasculares, de células inflamatorias o del endotelio.

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Según la visión actual, la coagulación se produce en tres etapas interrrelacionadas: La fase de iniciación, que tiene
lugar a nivel de células productoras de FT, como fibroblastos o monocitos, y conlleva la generación de factores Xa, IXa y
pequeñas cantidades de trombina, suficientes para iniciar el proceso. La fase de amplificación se traslada a la superficie
de las plaquetas, que son activadas por la trombina generada y acumulan factores y cofactores en su superficie,
permitiendo el ensamblado necesario para que tengan lugar las reacciones enzimáticas.
Durante la fase de propagación el complejo VIIIa, IXa, Ca 2+ y fosfolípidos cataliza la conversión de factor Xa, mientras
que el complejo protrombinasa (Xa,Va,C++) y fosfolípidos cataliza a nivel d superficie plaquetar, la conversión de
protrombina en grandes cantidades de trombina necesarias para la formación de un coágulo estable de fibrina.
Fig. 2 Modelo actual de la coagulación.

Fibrinólisis
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La fibrinólisis es un mecanismo esencial para eliminar los coágulos de fibrina durante el proceso de cicatrización, así
como remover los coágulos intravasculares para impedir la trombosis. El efector final del sistema plasmina, que degrada la
fibrina en productos de degradación (PDF y dímero D). La plasmina es producida a partir de un precursor inactivo, el
plasminógeno, por acción de dos activadores del plasminógeno: activador tisular (t-PA) y activador tipo uricinasa (u-PA). La
regulación de los activadores tienen lugar por la ación de los inhibidores (PAI), de los que el mas relevante es el PAI-1
mientras que la plasmina circulantes es rápidamente inhibida por la α2-antiplasmina, lo que evita una fribinolisis
sistematica. La fibrinólisis se inicia por el t-PA liberado desde el endotelio en respuesta a diversos estímulos (trombina,
oclusión venosa, ejercicio físico, etc). Una vez liberado se une a la fibrina del coágulo.. La trombina puede activar otro
inhibidor fibrinolitico, el TAFI, el cual elimina residuos de lisina de la fibrina, lo que impide la unión del plasminógeno y
ulterior degradación del coágulo.
La exploración de la coagulación sanguínea se basa en la realización de dos pruebas globales, el tiempo de
protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa), que se complementan con una valoración de la
formación del coágulo mediante la determinación funcional del fibrinógeno o la realización del tiempo de trombina (TT).
Sobre la base de los resultados de estas pruebas podemos realizar una aproximación diagnostica cuya confirmación puede
requerir la determinación especifica de factores de la coagulación.
1. OBJETIVO.-
Realizar de una manera adecuada y correcta las técnicas del laboratorio para evaluar la Hemostasia Primaria y/o secundaria

2.- ALCANCE
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Estas pruebas se utilizan como exploración sobre el funcionamiento plaquetario y valorar el déficit de los factores de la coagulación
como el FVIII y FIX, así como la actividad fibrinolitica. Aplica a todas las muestras y/o pacientes que acuden al AADC solicitando
dichas pruebas.
3.-POLITICAS
3.1.- El horario para la toma y/o recepción de las muestras será de 7:00 a 9:00 de la mañana de lunes a viernes.
3.2.- Para hacer efectiva la toma de la muestra el usuario debe cumplir con las condiciones descritas en el instructivo “Requisitos
para toma de muestra” .
3.3.- No usar muestras coaguladas.
5 .- TÉCNICAS PARA LA DETERMINACIÓN DE PRUEBAS DE HEMOSTASIA Y FIBRINOLISIS
PRINCIPIO
TIEMPO DE SANGRADO (MÉTODO DE IVY)
La prueba de Tiempo de sangrado (TS) valora la capacidad hemostática global in vitro y consiste en medir el
tiempo transcurrido desde la realización de una pequeña incisión cutánea hasta que cesa la hemorragia a través de ella.
La prueba mide el tiempo necesario para obtener un tampón hemostático eficaz y, por tanto, representa una valoración
global y simultánea de los procesos de adhesión, agregación y liberación plaquetarias.
El método original del corte en el lóbulo de la oreja, introducido por Duke en 1912, es poco sensible y menos
reproducible, por lo que no es aconsejable seguir utilizándolo hoy en día. En 1941, Ivy introdujo la aplicación de un

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manguito de presión sanguínea en la parte superior del brazo y se mantiene a una presión de 40 mmHg para controlar la
presión intracapilar en el antebrazo. Se elige y prepara un sitio en la superficie anterior del antebrazo para realizar una
pequeña incisión. El tiempo de sangrado se define como el tiempo entre la realización de una pequeña incisión en la piel
que produce sangrado y el momento en que éste se detiene. Aunque esta definición es aparentemente muy simple, el
tiempo de sangrado tiene muchas variables. Es la prueba de hemostasia más difícil de efectuar de forma rutinaria, ya que
es relativamente personal y subjetiva. No obstante, si se realiza con cuidado puede dar resultados reproducibles y
brindar información importante para la evaluación de los pacientes con tendencia al sangrado.
El estudio puede ser afectado por diversas variables, como el tamaño y la profundidad de la herida; la temperatura
de la piel, etc. La técnica de Ivy es considerada mejor, más sensible y reproducible.
Material:
• Esfigmomanómetro
• Lanceta
• Algodón
• Alcohol
• Cronómetro
• Papel filtro Whatman # 42 (110 mm/diámetro)
Técnica
1.-Se coloca el esfigmomanómetro en el brazo del paciente y se regula a 40 mmHg, manteniéndolo a esta presión a lo
largo de toda la prueba.
2.-Desinfectar con el algodón la parte superior de la cara anterior del antebrazo.
3.-Con una lanceta se realiza manualmente un corte aproximado de 1cm de longitud por 1mm de profundidad, en la parte

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superior de la cara anterior del antebrazo, en una zona sin vello y alejada de las venas superficiales, a unos 3 cm por
debajo del pliegue del codo y paralelo al mismo.
4.-Inmediatamente después de realizar la incisión se pone en marcha el cronómetro.
5.-La sangre que brota de forma espontanea se va secando con un papel filtro cada 30 segundos, con la precaución de
que el papel solo contacte con la sangre y no con la herida.
6.- Anotar el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que será el resultado de la prueba.
Interpretación del resultado
Los limites de referencia para el tiempo de sangrado con la metodología descrita, es de 2 hasta 8 minutos, y son
claramente patológicos los tiempos superiores a 10 minutos y se consideran graves los superiores a 20 minutos.
La prueba se alarga por reducción importante del numero de plaquetas o por alteraciones funcionales de estas,
congénitas o adquiridas. Es sensible a las reducciones marcadas del hematocrito. El tiempo de sangrado puede
prolongarse también cuando existe una reducción o una anormalidad en ciertos factores plasmáticos que intervienen en
la adhesividad y agregación de las plaquetas, como el factor von Willebrand, el fibrinógeno, o el factor V.
La ingesta de aspirina en los días que preceden a la prueba suele inducir ligeras alteraciones en los resultados de
sujetos normales, pero magnifica la prolongación secundaria a cualquier defecto hemostático.
Fundamento
PRUEBA DE AGREGACIÓN PLAQUETARIA
El estudio de la agregación plaquetaria se ha hecho técnicamente asequible con el moderno instrumental y la
aparición de reactivos de simple utilización. Las plaquetas se agregan unas con otras en las fases iniciales del proceso

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hemostático, por lo que un defecto grave en esta etapa se asocia con hemorragia potencial, mientras que la
hiperagregación puede producir o facilitar la trombosis. El proceso de agregación se estudia en el laboratorio utilizando
sustancias con capacidad agregante, como ADP, epinefrina, colágena y Ristocetina. El método empleado generalmente
es el turbidimetria, la agregación plaquetaria es un método fundamental para obtener información sobre la hemostasia
primaria. Consiste en disponer de un plasma rico en plaquetas (PRP), obtenido a partir de sangre citratada, en una
cubeta transparente, a una temperatura de 37°C y con agitación continua por medio de una barrita de hierro sometida a
un campo magnético giratorio. La cubeta está atravesada por un haz de luz y cuando, se le adiciona un agente inductor,
se produce la agregación, aumenta la transmisión de luz a través de la cubeta y su intensidad es recogida gráficamente.
La agregación se completa de 6 a 10 minutos.
MATERIAL
• Agregómetro
• Cubetas y barritas de agitación magnética
• Micropipetas
• Puntas de 200 µL y 1 mL
• Plasma Citrato del paciente y testigo
• Agentes Agregantes:
ADP
Adrenalina
Ristocetina

Método.- Óptico
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Técnica
Preparación de la muestra.
1.-Obtencion de plasma rico en plaquetas (PRP)
a.-Obtener sangre con anticoagulante de citrato sódico al 3.2 %, en los tubos habitualmente utilizados para pruebas de coagulación.
(Paciente y Testigo). Tomar la cantidad necesaria para las pruebas a realizar.
b.-Centrifugar la sangre a 900 rpm por 15 minutos para obtener el plasma rico en plaquetas (PRP). Esto se debe hacer después de
tomar la muestra ya que la vida media de las plaquetas es de aproximadamente 3 hrs.
c.-Separar 500 µL del PRP y ponerlo en un tubo de plástico (falcon) rotulado como PRP para el paciente y el mismo procedimiento
se hace con el testigo.
2.-Obtencion de plasma pobre en plaquetas (PPP)
a.-Centrifugar de nuevo el remanente de los tubos de sangre total a 3500 rpm por 15 minutos para obtener el plasma pobre en
plaquetas (PPP).
b.-Se obtiene un plasma claro donde todas las plaquetas por la fuerza centrifuga ya están sedimentadas al igual que los eritrocitos.
3.-Cuantificacion de plaquetas del PRP
El PRP que se separa; realizar un conteo automatizado de plaquetas (SYSMEX KX-21). Una vez obtenida la tira con el resultado de
las plaquetas estas se ajustan a 200 mil si fueran necesarias.
Calculo para ajustar las plaquetas a 200 mil
Fórmula:
C1V1 = C2V2 V1 = C2V2
C1

C1= # de plaquetas automatizadas
V1 = ? (Vol del plasma rico en plaquetas)
C2= 200 (concentración final)
V2= 2 ml (volumen final)
Reactivos.
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Adrenalina.-Del reactivo de epinefrina se toma 100 µL y se mezcla con 1900 µL de solución salina para obtener una dilución 1:10,
de esta dilución se toman 50 µL y se le añade al Plasma Rico en plaquetas ajustadas a 200 mil.
ADP.- Se toman 5 µL de este reactivo para añadirle al PRP ajustadas a 200 mil.
Ristocetina.- Se toman 5 µL de este reactivo para añadirle al PRP ajustadas a 200 mil.
PROGRAMA AGROLINK PARA AGREGACIÓN PLAQUETARIA.
Cuando las muestras ya están listas para el análisis de agregación plaquetaria, se procede a preparar el equipo de la siguiente
manera:
1.- Encender el regulador asignado solo para ese equipo.
2.-Encender el equipo Chrono-Log Aggro/Link que es complementario del equipo de agregación.
3.-Conectar la computadora.
4.-Esperar que el equipo alcance una temperatura de 37°C
5.-Seleccionar el Icono Aggrolink
6.-Seleccionar Run New
7.-En la ventana de Run Test llenar los siguientes datos
Test Identificación: en trace 1 poner los datos del paciente
Test Procedure: seleccionar edit

Define Test Procedure: seleccionar la prueba a realizar
Checar que estén bien los datos y dar 2 veces Ok.
PROCEDIMIENTO
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1.-Disponer de 450 µL de PRP ajustadas a 200 mil plaquetas en tantas cubetas como pruebas se vayan a realizar conteniendo una
barrita de agitación cada una de ella.
2.-En otra cubeta disponer de 450 µL de PPP para usarlo como blanco.
3.-Introducir la cubeta de PPP y una de PRP ya ajustadas a 200 mil en el agregometro en sus posiciones correspondientes.
4.-Presionar en el equipo Chrono-log Lumi-aggregometer los botones de Set baselines aprox. 30 seg. Para obtener el ajuste de la
densidad óptica y para que la agregación empiece en 0%.
5.-Dispensar en el fondo de la cubeta que contiene el PRP ajustadas a 200 mil el agente agregante de la prueba a realizar permitir
que esta se desarrolle durante 5 a 6 min y luego parar la prueba. Observar el % de agregación del Paciente ó Testigo.
6.-Retirar la cubeta de PRP y sustituirla por otra para la segunda prueba, en la que se seguirán los mismos pasos.
7.-Después de terminar de realizar las pruebas se sale del programa y apagar el agregometro, la computadora y reguladores.
INTERPRETACION DEL RESULTADO
Es habitual que los enfermos presenten una agregación de 70% o mayor con los agonistas mencionados. Las enfermedades
de las glicoproteínas plaquetarias, como la tromboastenia de Glazmann, presentan un defecto grave en la agregación con respuesta
a agentes como el ADP o la colágena. En la enfermedad de Von Willebrand, la agregación con Ristocetina resulta anormal en la
forma habitual y más frecuente de la enfermedad, ya que la Ristocetina sólo produce Agregación en presencia del factor de Von
Willebrand. Esta prueba también se puede utilizar para valorar el efecto de los anti-agregantes plaquetarios, como la aspirina,
además de los casos de tendencia a la trombosis, como el llamado síndrome de las “plaquetas pegajosas”.

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DETERMINACION DEL FACTOR VIII
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El FVIII es una glicoproteína con un peso molecular de aproximadamente 280 KDa. Se encuentra en el hígado, el
bazo. El FVIII circula en al plasma formando un complejo no covalente con el factor Von Willebrand (FVIII/FvW). La
trombina y el factor Xa activan el factor VIII para que este desencadene la activación del factor X por el factor IXa en
presencia de fosfolípidos e inones de calcio. La deficiencia congénita del factor VIII se manifiesta como hemofilia A cuya
gravedad depende de la calidad del factor VIII presente:
< 1% Hemofilia severa
1-5% Hemofilia moderada
5-25% Hemofilia leve
Bajo ciertas condiciones, la actividad del factor VIII puede ascender dramáticamente hasta alcanzar el 250% de lo normal
como por ejemplo: en complicaciones trombo embolicas, arteriosclerosis coronaria, trastornos renales y diabetes.
PRINCIPIO
Después de añadir plasma deficiente del factor VIII a una muestra de plasma citratada diluida, el sistema de
coagulación endógeno es activado por un reactivo TTPa apropiado. La adición de iones calcio provoca la coagulación
ulterior hasta la formación de coágulos de fibrina. El incremento del tiempo de coagulación es inversamente proporcional
a la actividad del factor VIII y se indica como % de la actividad normal. La conversión del tiempo en segundos a un valor
porcentual se realiza con una curva de calibración.
MATERIAL

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Reactivo: Plasma Humano deficiente de VIII (liofilizado). Este se disuelve con 1 ml de agua desionizada. Mezclar
suavemente para obtener una solución Homogénea. No agitar para evitar la formación de espuma. Dejar reposar 30
minutos de 18 a 25°C. Después de este tiempo de incubación ya esta listo para su uso.
Sangre obtenida con citrato de sodio del paciente y testigo
Coagulómetro
Reactivo FVIII
Reactivo de TTPa
Agua desionizada
Cloruro de calcio 0.025 M
TECNICA
Hacer una dilución 1:10 del plasma paciente y del plasma testigo hacer dilución 1:10, 1:20, 1:40, 1:80.
1.-Colocar las cubetas en el coagulómetro
2.-Añadir la balinita
3.-Anadir 50 µL del reactivo de FVIII
4.-Añadir 50 µL de la muestra diluida 1:10 del paciente
5.-Añadir 50 µL del reactivo de TTPa
6.-Activar el cronometro (Incubar a 37°C durante 180 segundos)
7.-Añadir 50 µL del Cloruro de calcio.
8.-Observar la formación del coagulo y anotar el tiempo en segundos en que esto ocurrio.

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9.-Hacer lo mismo con las otras diluciones del testigo (1:10, 1:20, 1:40, 1:80) para la obtener la curva de calibración.
10.-Usando un papel antilogaritmico graficar la concentración del tiempo en segundos de las diluciones del testigo y
obtener la concentración del FVIII del paciente.
DETERMINACION DEL FACTOR IX
PRINCIPIO.-El factor IX es una glicoproteína con un peso molecular de aproximadamente 56 kilodalton. Se sintetiza en el
hígado como precursor fisiológicamente indiferente de la coagulación para adquirir su forma definitiva por acción de la
carboxilasa dependiente de la vitamina K.
El factor IX se ve activado por dos factores: el factor XIa en presencia de iones cálcicos; el factor VIIa en presencia de
iones cálcicos fosfolípidos.
Al formar un complejo con el factor VIIIa, el factorIXa transforma el factor X en Xa en presencia de iones calcio y
fosfolípidos. La deficiencia congénita del factor IX se manifiesta como hemofilia B cuya gravedad depende de la cantidad
del fcator IX presente:
< 1% Hemofilia severa
1-5% Hemofilia moderada
5-25% Hemofilia leve
Estados de deficiencia adquirida se producen durante el tratamiento con anticoagulantes orales, en hepatopatías como la
cirrosis o la hepatitis, en caso de absorción trastornada de la vitamina ÑK por ejemplo: en enfermedades hemorrágicas
del recién nacido, en ictericia o en tratamiento con antibióticos.

PRINCIPIO DE LA PRUEBA
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Después de añadir plasma deficiente del factor IX a una muestra de plasma citratado diluido, el sistema de coagulación
endógeno se activa con un reactivo TTPa apropiado. La adición de iones calcio provoca la coagulación ulterior hasta la
formación de coágulos de fibrina. El tiempo de coagulación prolongado es inversamente proporcional a la actividad del
factor IX y se indica como porcentaje de la actividad normal. La conversión del tiempo en segundos a un valor porcentual
se realiza con una curva de calibración.
MATERIAL
Reactivo: Plasma Humano deficiente de IX (liofilizado). Este se disuelve con 1 ml de agua desionizada. Mezclar
suavemente para obtener una solución Homogénea. No agitar para evitar la formación de espuma. Dejar reposar 30
minutos de 18 a 25°C. Después de este tiempo de incubación ya esta listo para su uso.
Sangre obtenida con citrato de sodio del paciente y testigo
Coagulómetro
Reactivo FIX
Reactivo de TTPa
Agua desionizada
Cloruro de calcio 0.025 M
TÉCNICA
Hacer una dilución 1:10 del plasma paciente y del plasma testigo hacer dilución 1:10, 1:20, 1:40, 1:80.
1.-Colocar las cubetitas en el coagulómetro

2.-Anadir la balinita
3.-Anadir 50 µL del reactivo de FIX
4.-Añadir 50 µL de la muestra diluida 1:10
5.-Añadir 50 µL del reactivo de TTPa
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6.-Activar el cronometro (Incubar a 37°C durante 180 segundos)
7.-Añadir 50 µL del Cloruro de calcio.
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8.-Observar la formación del coagulo y anotar el tiempo en segundos en que esto ocurrio.
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9.-Hacer lo mismo con las diluciones del testigo (1:10, 1:20, 1:40, 1:80) para la obtener la curva de calibración.
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10.-Usando un papel antilogaritmico graficar la concentración del tiempo en segundos para obtener la concentración del
FIX del paciente.
LISIS DE EUGLOBULINAS
PRINCIPIO.-La fibrinólisis se estudia mediante la prueba de lisis de Euglobulinas. La fracción de Euglobulinas del plasma es
precipitada por dilución y acidificación a pH 5.3. En el precipitado se encuentran el fibrinógeno y plasminógeno, que en su estado
activo se convierte en plasmina. Esta prueba consiste en precipitar las euglobulinas plasmáticas mediante ácido acético diluido. La
precipitación de las euglobulinas, permite la eliminación de inhibidores de la fibrinólisis en el sobrenadante. Las Euglobulinas
plasmáticas precipitan con el acido al 1% y se vuelven a quedar en suspensión en la solución de buffer de boratos para coagular
más tarde cuando es añadido el CaCl2.
Muestra biológica: Plasma citratado del paciente y testigo
Reactivos:
Cloruro de calcio (CaCl2 ) 0.025 M

Ácido acético al 1%
Buffer de boratos pH 9
TECNICA
Manual de Hemostasia y Trombosis
1.-Marcar dos tubos de 10 ml aprox. uno para el paciente y otro para el testigo
Código: M-CIRB-AADC-01
Fecha de emisión:
1-Octubre-2012
2.-Agregar a cada uno de los tubos 9 ml de agua desionizada, 100 µL de Ac. Acético al 1%.
3.-Al tubo del testigo agregar 500 µL de su plasma
4.-Al tubo paciente agregar 500 µL de su plasma
5.-Mezclar bien y guardar a 4 0 C por 20 min.
Revisión: 01
Página: 20 de 26
6.-Luego repartir en proporciones iguales en 2 tubos de 7 ml el contenido del tubo de 10 ml (dos paciente y dos testigo)
7.- Centrifugar 3 min a 1000 rpm
8.-Después decantar el sobrenadante, escurrir y dejar secar (aprox 10 min)
9.-Añadirle 500 µL de buffer de boratos a cada tubo
10.-Meter los tubos a Baño María a 37 0 C y con un aplicador de manera agitar en el fondo y después añadirle 500 µL de
CaCL2
11.-Mezclar bien y se deja en el Baño María a 37 0 C
12.-Checar la formación del coagulo y empezar a contar el tiempo si no se diluyo el coagulo después de 120 minutos la
prueba es negativa.

SULFATO DE PROTAMINA
Fundamento:
Manual de Hemostasia y Trombosis
Código: M-CIRB-AADC-01
Fecha de emisión:
1-Octubre-2012
Revisión: 01
Página: 21 de 26
La adición de sulfato de protamina al plasma da por resultado la formación de fibras de fibrina o gelificación en
presencia de monómeros de fibrina a productos de degradación primarios de la fibrina (fdp).
Esta prueba aunque parezca fácil de realizar requiere tiempo, debe solicitarse cuando el paciente presenta un
cuadro clínico que sugiera una hemorragia masiva y que la sangre no forme coágulo, además de que cuando las otras
pruebas de coagulación, como el TP, TTPa, TT estén prolongados, debe considerarse como una urgencia cuando se
sospecha la activación del sistema fibrinolítico.
La prueba es insensible para el fibrinógeno y productos de degradación del fibrinógeno (FDP). Es negativa en plasma
normal y fibrinólisis primaria. Es positivo en Coagulación Intravascular diseminada (CID).
Muestra
Sangre Obtenida con Citrato de sodio al 3.8% del paciente y testigo
Solución salina
Ampolleta de Protamina
Técnica:
1.-Centrifugar las muestras 15 minutos a 3500 rpm

Manual de Hemostasia y Trombosis
Código: M-CIRB-AADC-01
Fecha de emisión:
1-Octubre-2012
2.-Realizar diluciones seriadas 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 y 1:80 de la Protamina con Solución salina.
3.-Todas las diluciones se preparan en tubos de 5ml
Revisión: 01
Página: 22 de 26
4.-Marcar 4 tubos con cada una de esas diluciones y agregarle 200 µL de esas diluciones y luego añadirle 200 µL del
plasma del paciente a cada tubo
5.-Realizar lo mismo con la muestra del testigo
6.-Mezclar bien e incubar a 37°C
7.-Observar a los 15, 30, 45 y 60 minutos si hay formación del coagulo.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Se considera positiva si se observa formación del coagulo en la dilución 1:10 del paciente.
Negativa si no hay formación del coagulo.
Esta prueba distingue entre fibrinólisis y una CID. Cuando da positivo a partir de la dilución 1:10 se piensa en un proceso
patológico como el CID.
REFENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1.-Fundamentos de Interpretación Clínica de los Examenes de laboratorio.Ruiz Arguelles G. Ed. Medica panamerica.2005
2.- Williams Hematology.
3.-Manual de tecnicas de Laboratorio de hematologia. Joan Vives
4.-Fundamentos de Hematologia. Ruiz arguelles.
5.-Hematologia Clinica. Sans Sabrafren.

Manual de Hemostasia y Trombosis
6.-Limitations of using PRP in the study of platelet agggregation. Cronolog-Log.
4.-DOCUMENTOS DE REFERENCIA
Código
(cuando aplique)
Código: M-CIRB-AADC-01
Fecha de emisión:
1-Octubre-2012
Revisión: 01
Página: 23 de 26
Nombre del documento Lugar de almacenamiento
N/A Carpeta de Insertos Laboratorio de AADC
N/A
Fundamentos de Interpretación Clínica de los Exámenes de
laboratorio. Ruiz Arguelles G. 2005
Laboratorio de AADC
N/A Williams Hematology. 1995 Laboratorio de AADC
G-CIRB-AADC-02 Guía para el manejo de RPBI Laboratorio de AADC
N/A
Limitations of using PRP in the study of platelet agggregation.
Cronolog-Log
Laboratorio de AADC
N/A Instruction Manual for the whole Blood. Laboratorio de AADC
N/A Manual de técnicas de laboratorio en Hematología Laboratorio de AADC
5.- GLOSARIO
9.1 .- SIGLAS
AADC.- Área de apoyo al Diagnóstico clínico
RPBI.-Residuos Peligrosos Biologicos Infecciosos

7.- CONTROL DE REVISIONES
NIVEL DE
REVISIÓN
01
SECCIÓN
Y/O PÁGINA
Todo el
documento
Elaboró
Manual de Hemostasia y Trombosis
Revisó
Código: M-CIRB-AADC-01
Fecha de emisión:
1-Octubre-2012
Revisión: 01
Página: 24 de 26
Nota: La sección 10 será utilizada a partir de la primera modificación a este documento. La revisión 00, se mantendrá en blanco.
8.-CONTROL DE EMISIÓN
M en C. Irma Quintal Ortiz
Técnico académico
DESCRIPCIÓN DE LA MODIFICACIÓN Y MEJORA
FECHA DE MODIFICACIÓN
Se le elimino el código de CIPLADE que no correspondia a este documento 12 Abril del 2013
Dr. Pedro González Martínez
Responsable del AADC
Aprobó
DR. Jorge Zavala Castro
Director del CIR
Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el documento, revisan su adecuación y aprueban para su
implementación dentro del Sistema de Gestión de la Calidad de la Universidad Autónoma de Yucatán.