Les esponges tenen propietats anticancerígenes - UdG
Les esponges tenen propietats anticancerígenes - UdG
Les esponges tenen propietats anticancerígenes - UdG
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
ÍNDEX<br />
1 Presentació 01<br />
2 Introducció 03<br />
2.1 Esponges 03<br />
2.1.1 Patata de mar (Chondrosia reniformis) 04<br />
2.1.2 Esponja roja (Crambe crambe) 05<br />
2.2 Eriçó comú (paracentrotus lividus) 05<br />
2.3 Desenvolupament embrionari 07<br />
2.4 Cicle cel·lular 10<br />
2.5 Càncer 13<br />
2.6 Fàrmacs anticancerígens 14<br />
2.6.1 Estudi de nous fàrmacs 18<br />
3 Disseny experimental 20<br />
4 Resultats 30<br />
4.1 Resultats del control 30<br />
4.2 Resultats del Vincrisul 32<br />
4.3 Resultats de l’extracte de Chorndrosia reniforis 34<br />
4.4 Resultats de l’extracte de Crambe crambe 36<br />
5 Discussió 38<br />
6 Conclusions 48<br />
7 Bibliografia 50
1 PRESENTACIÓ<br />
El treball de recerca que teniu a les mans és un estudi sobre el comportament de les<br />
substàncies que certes espècies d’<strong>esponges</strong> produeixen com a mètode defensiu. Com<br />
s’explicarà més endavant, entre els animals sèssils (que viuen permanentment fixats a les<br />
roques) com les <strong>esponges</strong>, hi ha una forta competència pel substrat per això les <strong>esponges</strong><br />
segreguen components químics que eviten el desenvolupament d’organismes al seu<br />
voltant.<br />
Concretament el meu objectiu és confirmar o desmentir la hipòtesi que aquests<br />
components <strong>tenen</strong> <strong>propietats</strong> citostàtiques, és a dir, aturen el cicle cel·lular impedint el<br />
creixement i renovació cel·lular dels possibles organismes en competència pel substrat.<br />
Amb aquest propòsit empraré embrions, en continua mitosis que es veuran<br />
clarament afectats si aquestes substàncies són realment antimitòtiques. Utilitzaré<br />
embrions de la garota Paracentrotus lividus degut a la seva fàcil obtenció, fecundació in<br />
vitro, i observació en el microscopi. Així doncs, per tal de validar aquesta hipòtesi, el<br />
mètode seguit ha estat sotmetre gàmetes femenines i masculines de Paracentrotus lividus<br />
als fluids de dues espècies d’<strong>esponges</strong> diferents (la Chondrosia reniformis i la Crambe<br />
crambe) i comparar la evolució de les mateixes en un medi normal i sota l’efecte d’un<br />
fàrmac anticancerígen d’activitat coneguda, concretament el Vincrisul.<br />
D’aquesta manera he treballat amb quatre solucions: una tan sols amb aigua de<br />
mar, una altre amb Vincrisul dissolt en aigua marina i finalment dues més amb els fluids<br />
de les dues <strong>esponges</strong> respectivament. Cal sotmetre cada medi a les mateixes condicions de<br />
temperatura, moviment, etc. per poder-ne contrastar l’evolució posteriorment.<br />
Val a dir que degut als meus coneixements i materials de que puc disposar, els<br />
meus límits han estat considerables. Tot i que m’hauria agradat treballar només amb les<br />
substàncies citades, separar-les és molt difícil i conseqüentment he hagut de treballar amb
tots els fluids corporals d’ambdues <strong>esponges</strong>. No obstant cal dir que els límits més grans<br />
amb què m’he topat han estat de temps ja que un experiment d’aquestes característiques<br />
requereix moltes hores de dedicació. I també de coneixements, degut a que hi ha pocs<br />
escrits sobre aquest tema molt nou, pel que la majoria d’informació l’he buscat a Internet,<br />
on sovint el nivell no es l’adequat o no en conec l’idioma. En la realització de<br />
l’experiment, el primer problema amb que m’he trobat ha estat que les dates del treball no<br />
coincidien amb l’època de fertilitat màxima dels eriçons (els mesos gener i febrer), fet que<br />
m’ha obligat a fer l’experiment el mes de novembre en què els eriçons no estan del tot<br />
madurs. Això ha comportat, a part del evident poc marge de temps per fer l’experiment,<br />
que els resultats de l’experiment no hagin estat en ocasions tan significatius com ho<br />
haurien estat en època de màxima fertilitat. D’altre banda, també ha estat difícil obtenir<br />
el medicament (Vincrisul) ja que degut a les seves <strong>propietats</strong> no s’autoritza la venda en<br />
farmàcies sense recepta. Així com la obtenció d’alguns dels organismes.<br />
En quant a l’estructura del treball, el podem dividir en dues parts; la part<br />
bibliogràfica i l’experimental. La primera part és introductòria i permet adquirir els<br />
coneixements que m’han permès realitzar l’experiment. Consta d’una breu explicació<br />
sobre la reproducció dels eriçons, embriologia, les <strong>esponges</strong>, el càncer a nivell cel·lular,<br />
els principals anticancerígens i la recerca de nous antimitòtics. La segona part és el treball<br />
experimental i el cos principal del treball. Consta primerament del disseny de<br />
l’experiment, seguidament del mètode pas a pas, l’exposició dels resultats, la discussió i<br />
finalment les conclusions.<br />
<strong>Les</strong> fons citades, com ja he explicat, han estat majoritàriament Internet i llibres<br />
molt concrets i especialitzats. També han estat molt importants les persones que m’han<br />
proporcionat informació essencial; m’agradaria agrair en aquest àmbit, l’ajuda d’en<br />
Francesc Camps (de l’Escola de Mar de Badalona) i de la Jus López, la meva tutora.
2 INTRODUCCIÓ<br />
2.1 LES ESPONGES<br />
<strong>Les</strong> <strong>esponges</strong> són un grup molt nombrós d’animals macroinvertebrats de la família dels<br />
porífers. Viuen en hàbitats aquàtics molt variats i, encara que segons les espècies poden<br />
resistir salinitats molt diferents la majoria (més del 97 % de les espècies), viuen al mar<br />
a totes les profunditats i latituds.<br />
Morfològicament parlem d’uns animals molt simples que tot i ser pluricel·lulars,<br />
no <strong>tenen</strong> òrgans ni teixits, sinó que les seves cèl·lules <strong>tenen</strong> un alt grau d’independència,<br />
tan sols estan unides en una matriu 1 gelatinosa que les relaciona entre si. A nivell<br />
d’organisme, les <strong>esponges</strong> presenten una forma i mida molt diferent segons l’espècie.<br />
Tots els organismes adults <strong>tenen</strong> en comú el sistema de filtració que els permet<br />
retenir l’aigua per tal de nodrir-se. Consta de múltiples orificis exteriors microscòpics<br />
que mitjançant llargs conductes de diàmetres reduïts, condueixen l’aigua a cavitats<br />
allargades on té lloc l’absorció de nutrients i que posteriorment conduiran la part no<br />
aprofitable junt amb substàncies de rebuig als òsculs (porus d’excreció) on s’alliberaran<br />
al mar altre cop.<br />
Aquest mètode de nutrició els permet una vida totalment sedentària, fixats al<br />
substrat, sense desenvolupar cap moviment fora de certes contraccions que permeten<br />
propulsar l’aigua, tancar o obrir els porus i algun moviment local. Això determina que<br />
visquin una forta competència, ja que el substrat és imprescindible per un gran nombre<br />
d’organismes marins, i que hagin desenvolupat mètodes defensius.<br />
1 Matriu: nom que prenen les parets cel·lulars de les cèl·lules animals.
<strong>Les</strong> <strong>esponges</strong> es defensen alliberant agents químics que ataquen els organismes<br />
del voltant. Tan aferrissada és la lluita per mantenir l’espai, que sovint les substàncies<br />
alliberades poden, fins i tot, arribar a destruir el substrat calcari.<br />
Els components que alliberen les <strong>esponges</strong> varien segons l’espècie, i tot i que es<br />
creu que alguns són tòxics, se’n desconeixen els components exactes. De fet és aquest<br />
camp que em disposo a estudiar, prenent com a hipòtesi que algunes <strong>esponges</strong> alliberen<br />
substàncies citostàtiques. És a dir, components químics que eviten la multiplicació<br />
cel·lular dels possibles organismes en competència.<br />
Concretament les dues espècies d’<strong>esponges</strong> que tractaré són la patata de mar<br />
(Chondrosia reniformis) i l’esponja roja (Crambe crambe ).<br />
2.1.1 La patata de mar (Chondrosia reniformis)<br />
La patata de mar és una dermosponja de color gris marronós. Habita a la Mediterrània a<br />
profunditats considerables.<br />
Té un gran interès econòmic ja que conté col·lagen. Això provoca la consistència<br />
com de goma que caracteritza aquesta espècie i que molt provablement dificultarà el seu<br />
maneig alhora de fer l’experiment.<br />
En qualsevol cas el què m’ha portat a triar aquesta espècie, és la seva gran<br />
rapidesa expansiva que em<br />
porta a pensar que<br />
probablement conté les substàncies<br />
d’efecte antimitòtic que busco.<br />
En aquesta foto de l’esquerra podem veure<br />
una colònia d’<strong>esponges</strong> d’aquesta espècie on<br />
s’aprecia la seva gran capacitat expansiva per sobre les altres <strong>esponges</strong> del voltant.
2.1.2 L’esponja roja (Crambe crambe)<br />
La Crambe crambe és una esponja incrustant de coloració taronja o vermellosa. És un<br />
dels macroinvertebrats més abundants de les costes d’Espanya, Itàlia i França i pot<br />
arribar a recobrir grans extensions de roques. La trobem entre 1 i 15 metres de<br />
profunditat normalment evitant la llum directe del sol.<br />
Aquesta espècie no té depredadors coneguts, però<br />
sí una gran competència pel substrat. Per això es<br />
sap que té gran activitat bioquímica contra altres<br />
invertebrats bentònics; no obstant, s’ignora el seu<br />
mecanisme d’acció. Degut a que no presenta<br />
En aquesta imatge podem veure un seguit efectes tòxics o irritants en contacte amb la pell<br />
d’<strong>esponges</strong> en competència, destaca per la efectes tòxics o irritants en contacte amb la pell<br />
seva eficiència l’esponja. Roja que ocupa<br />
gran part del substrat. humana dedueixo que els components alliberats<br />
pppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppp<br />
per la Crambe crambe podrien tenir efectes antimitòtics i per això l’estudiaré en aquest<br />
treball.<br />
2.2 L’ERIÇÓ COMÚ (Paracentrotus lividus)<br />
L’eriçó comú (Paracentrotus lividus) ha estat des<br />
de l’època neolítica una espècie coneguda i<br />
apreciada pel seu consum com a aliment altament<br />
nutritiu. Avui en dia encara es consumeix, però<br />
una altre de les seves aplicacions molt més actual<br />
és en el camp de la investigació química i mèdica com a model de la mitosis degut a la<br />
facilitat de reproduir el seu medi natural de fecundació (l’aigua marina) en el laboratori.<br />
És per aquest motiu que l’utilitzaré en el meu treball.
<strong>Les</strong> garotes d’aquesta espècie són normalment herbívores i el seu hàbitat<br />
compren part del mar Mediterrani i l’oceà Atlàntic Nord.<br />
Morfològicament presenten una per una closca sòlida de forma convexa formada<br />
per peces calcàries, longitudinalment aplanada per la part inferior. Mesura des de cinc a<br />
vuit centímetres de diàmetre. Aquesta closca està coberta per un teixit sobre el qual<br />
trobem les espines articulades bastant llargues que donen al eriçó una coloració externa<br />
marronosa més o menys fosca.<br />
En aquesta imatge podem veure<br />
un esquema dels òrgans interns de les garotes.<br />
Reproducció<br />
A nivell de sistemes els eriçons, com la resta dels<br />
equinoderms, són animals poc complexos de sistemes<br />
senzills disposats dins la cavitat celomàtica que engloba la<br />
part central del cos i els diferents apèndix.<br />
Els eriçons són gonocròrics, és a dir, des del seu naixement <strong>tenen</strong> gònades que en<br />
l’època de fertilitat s’ompliran de gàmetes. Conseqüentment <strong>tenen</strong> sexe definit duran<br />
tota la seva vida que no podem determinar exteriorment. <strong>Les</strong> gònades estan situades a<br />
l’interior de la closca en forma de 5 saquets separats entre ells de coloració molt<br />
característica: en l’època de fertilitat gònades femenines són vermell ataronjat, mentre<br />
que les masculines groc ataronjat. Estan situades sobre la cara interna de la closca i<br />
comuniquen amb l’exterior per la part superior per uns conductes anomenats gonaductes<br />
mitjançant els quals expulsen les gàmetes, ja que la fecundació és externa.<br />
L’època de reproducció, en les nostres costes, té lloc, normalment, entre els<br />
mesos de setembre i abril, tot i que els millors mesos són desembre, gener i febrer.
El cicle reproductor s’inicia amb una acumulació de nutrients que permetran la<br />
maduració i multiplicació de les cèl·lules sexuals. Quan les condicions del medi són<br />
favorables es procedeix a l’alliberació, mitjançant la contracció de les capes musculars<br />
de les gònades. <strong>Les</strong> gàmetes s’alliberen directament a l’aigua marina i de manera<br />
independent a cada gònada. D’aquesta manera moltes gàmetes són alliberades i<br />
dispersades per les corrents. Aleshores els espermatozoides són atrets cap als òvuls de la<br />
seva espècie. Finalment es fecunden els òvuls i en unes hores evolucionen les larves.<br />
Imatge d’una larva Pluteus<br />
<strong>Les</strong> larves de garota comuna , s’anomenen Pluteus i<br />
formen part del zooplàncton durant un curt període a partir del<br />
qual iniciaran la metamorfosi. Aquesta que dura un mes<br />
aproximadament, culminarà amb la formació de l’esquelet adult<br />
que té lloc al fons marí.<br />
2.3 DESENVOLUPAMENT EMBRIONÀRI<br />
Un cop les gàmetes són alliberades a l’aigua comença un procés que culminarà amb la<br />
formació d’una larva d’eriçó de mar.<br />
<strong>Les</strong> poblacions de Paracentrotus lividus acostumen a estar formades per<br />
individus d’ambdós sexes, i per tant és imminent que les gàmetes masculines i<br />
femenines es trobin. D’altre banda cal apuntar la capacitat dels espermatozoides per<br />
arribar fins on es troben els òvuls de la seva mateixa espècie.
Al centre, foto de dos espècimens de Paracentrotus lividus alliberant les gàmetes en dos vasos de precipitats amb<br />
aigua de mar; una femella a l’esquerra i un mascle a la dreta. Imatge d’un òvul a l’esquerra i d’espermatozoides a la<br />
dreta.<br />
En qualsevol cas el desenvolupament embrionari s’inicia amb la fecundació d’un<br />
òvul; i immediatament després de l’entrada del primer espermatozoide es crea la<br />
membrana de fecundació que impedeix la polifecundació (fecundació d’un òvul per més<br />
d’un espermatozoide) que duria a un embrió inviable.<br />
En aquesta seqüència d’imatges es pot veure com apareix la membrana de fecundació<br />
A continuació s’inicia la fase de divisió en què el zigot passa a ser una pilota de<br />
cèl·lules anomenat blastòmer. La cèl·lula inicial es divideix verticalment en dues<br />
d’iguals, posteriorment en quatre i finalment en vuit. Cada divisió es realitza<br />
sincrònicament (totes les cèl·lules es divideixen alhora) i simètricament (totes les<br />
cèl·lules són iguals i totipotents, és a dir, a partir de la seva divisió es poden obtenir<br />
totes i cada una de les cèl·lules que després integraran el nou embrió).<br />
En aquesta seqüència d’imatges podem constatar la primera divisió del blastòmer en dues cèl·lules (a la<br />
esquerra), posteriorment el pas de quatre cèl·lules a vuit ( al centre) i finalment l’estadi de vuit cèl·lules<br />
on s’aprecia clarament la diferenciació de la mida de les cèl·lules.
De vuit cèl·lules es passa a setze, no obstant, en aquest pas, tot i mantenir-se la<br />
sincronia, la simetria desapareix. <strong>Les</strong> cèl·lules prenen tres mides diferents segons la<br />
posició i passen a ser pluripotents, en d’altres paraules, cada una d’elles pot donar un<br />
gran ventall de cèl·lules diferents, però no totes les que necessita l’embrió i per tant les<br />
tres classes de cèl·lules són imprescindibles.<br />
Aquesta pilota massissa de cèl·lules compactes en contínua<br />
multiplicació pren el nom de mòrula. Poca estona després la mòrula<br />
entra en un procés de blastulació en què les cèl·lules s’agrupen en<br />
imatge.d’una mòrula forma esfèrica formant un buit interior anomenat blastocel.<br />
Això comporta la desaparició de la membrana de fecundació i l’inici de la<br />
gastrulació en què la blàstula perd la seva forma esfèrica i es replega sobre ella mateixa<br />
de manera que es comença a formar un tub intern (arquènteron) que posteriorment serà<br />
el tub intestinal de l’embrió.<br />
A partir d’aquest punt l’arquènteron s’expandeix fins a ocupar gairebé tot el blastocel.<br />
Un cop s’ha format completament l’arquènteron<br />
esdevenint el tub digestiu de l’embrió; la gàstrula<br />
comença a prendre forma triangular i la simetria<br />
radial, que fins ara mantenia, esdevé bilateral.<br />
En aquesta fotografia podem veure com l’arquènteron està ocupant el blastocel.<br />
A partir d’aquest moment es formen les expansions que permetran el moviment<br />
a la larva i lentament aquesta pren la seva forma definitiva.<br />
En aquesta seqüència d’imatges podem veure l’evolució de l’antiga gàstrula fins a esdevenir la larva Pluteus (dreta).
2.4 CICLE CEL·LULAR<br />
El cicle cel·lular és el conjunt de canvis que experimenta una cèl·lula mare amb<br />
l’objectiu de donar lloc a dues cèl·lules filles idèntiques a la inicial. La durada depèn del<br />
tipus de cèl·lula , però normalment oscil·la entre unes hores i uns quants anys.<br />
Aquest procés és el que permet la renovació de les cèl·lules mortes en els teixits<br />
i el desenvolupament d’un nou ésser a partir d’un zigot; així com la proliferació de les<br />
cèl·lules canceroses. En les cèl·lules eucariotes 22 podem distingir tres fases: la interfase,<br />
la mitosi i la citocinesi.<br />
La interfase: durant aquest període, que ocupa la major part del cicle, hi ha<br />
gran activitat en el metabolisme 33 de la cèl·lula que comporta un augment de la<br />
mida. Es distingeixen tres períodes en la interfase: La fase G1, la fase S i la G2.<br />
Fase G1: En aquest interval són sintetitzades les<br />
proteïnes necessàries per l’augment de mida de la cèl·lula.<br />
Fase S: La informació genètica de la cèl·lula que<br />
està continguda en cromatina es duplica.<br />
Fase G2: Aquesta fase, de curta durada, permet a<br />
la cèl·lula augmentar lleugerament de volum així com<br />
formar les proteïnes necessàries per la posterior divisió<br />
de la cèl·lula i la duplicació dels dos centriols. La fase<br />
esquema de la cèl·lula en la interfase finalitza amb l’inici de la condensació dels<br />
cromosomes.<br />
22 Cèl·lula eucariota: tipus de cèl·lula característica de tots els vegetals, animals i fongs. Es caracteritza<br />
principalment pel fet de tenir el material genètic protegit pel nucli i compartiments intracel·lulars<br />
anomenats òrganuls.<br />
33 Metabolisme: conjunt de reaccions bioquímiques que <strong>tenen</strong> lloc en els ésser vius.
La mitosi: És en aquesta part on succeeix la reproducció del material<br />
genètic. Es divideix en diverses fases: la profase, la metafase, l’anafase i la<br />
telofase. És divideix en diverses fases: la profase, la metafase, l’anafase i la<br />
telofase.<br />
Profase: És en aquesta fase on l’ADN ja<br />
duplicat, s’estructura formant els cromosomes que es<br />
podran distingir amb el microscopi. Cada cromosoma està<br />
format per dues cromàtides, cada una de les quals conté la<br />
mateixa informació, i estan unides pel centròmer.<br />
Els centriòls que s’han duplicat en la fase anterior<br />
Esquema d’una cèl·lula en profase ..................................................................<br />
es col·loquen lentament als pols oposats de la cèl·lula<br />
formant lentament entre ells, a mesura que es separen, els microtúbuls polars que<br />
..............................................................................................…........................................<br />
constitueixen el fus acromàtic.<br />
La membrana nuclear es trenca i desapareix el nucli de manera que els<br />
cromosomes queden dispersos pel citoplasma i els centròmers de cada cromosoma<br />
alliberen els microtúbuls anomenats cinetocòrics.<br />
Metafase: Els cromosomes arriben al màxim grau<br />
de condensació. El fus acromàtic s’acaba de formar i es<br />
disposa entre els dos pols de la cèl·lula. Simultàniament, els<br />
microtúbuls cinetocòrics arrosseguen els cromosomes fins a<br />
situar-los a l’equador de la cèl·lula on s’ha estès el fus<br />
acromàtic. Els centròmers col·loquen els cromosomes<br />
Esquema de la metafase perpendicularment orientant cada cromàtida cap a un pol.
Esquema de l’anafase<br />
Esquema de la telofase i inici de la citocinesi<br />
Anafase: <strong>Les</strong> dues cromàtides de cada cromosoma<br />
es separen pel centròmer i sincrònicament es dirigeixen cap<br />
als pols oposats arrossegades pels microtúbuls polars que<br />
s’allarguen per polarimerització. Degut a que una<br />
cromàtida de cada cromosoma se situa a cada pol; a cada<br />
un hi arriba exactament la mateixa informació genètica.<br />
Telofase: Tornen a construir-se les membranes<br />
nuclears envoltant els cromosomes, reapareixen els nuclis i<br />
els cromosomes es descondensen deixant de ser visibles.<br />
La citocinesi: Aquest procés permet que la cèl·lula que fins ara tan sols<br />
ha duplicat el seu material genètic divideixi també el citoplasma i orgànuls de la<br />
manera més equitativa possible . Aquest procés varia substancialment segons es<br />
tracti d’una cèl·lula vegetal o animal. Degut a que l’experiment que aquest<br />
fonament teòric pretén recolzar és sobre cèl·lules animals explicaré aquest cas<br />
particular. En les cèl·lules animals la citocinesi s’inicia amb l’estrangulació de la<br />
membrana de la cèl·lula mare dividint-se en dues. A l’equador apareix un anell<br />
contràctil format per filaments proteics, que estreny la membrana fins a formar<br />
un solc de segmentació que s’estrenyerà fins a estrangular la cèl·lula totalment;<br />
aconseguint que les cèl·lules filles siguin completament independents.
2.5 CÀNCER<br />
Quan ens referim al càncer hem de tenir en compte que parlem de més d’un centenar de<br />
malalties diferents que afecten teixits diferenciats.<br />
Tot i que les causes de totes elles són sovint diferents i dependents de més d’un factor,<br />
<strong>tenen</strong> en comú el seu origen.<br />
El càncer s’inicia quan una cèl·lula a causa d’una acumulació de mutacions<br />
genètiques (canvis en la informació genètica ) es comença a dividir de manera<br />
incontrolada. Una de les característiques de les cèl·lules canceroses és que perden la<br />
capacitat de reconeixement, fet que provoca el seu creixement desordenat, la formació<br />
de tumors (acumulacions desordenades de cèl·lules), així com el seu avanç envaint els<br />
òrgans i teixits veïns. A mida que la malaltia evoluciona es pot produir la metàstasi en<br />
què les cèl·lules emigren a través dels sistema circulatori o limfàtic afectant altres<br />
òrgans i teixits.<br />
D’aquesta manera el què fa del càncer la segona causa de mort en els països<br />
desenvolupats és la continua divisió de les cèl·lules canceroses. Això implica que molts<br />
dels medicaments anticancerígens continguin un component que eviti la divisió cel·lular<br />
o bé provoqui la apoptosi (suïcidi cel·lular) de les cèl·lules en divisió.<br />
Esquema sobre l’evolució del<br />
Esquema sobre l’evolució del càncer
2.6 FÀRMACS ANTICANCERÍGENS<br />
Com ja s’ha explicat en el punt anterior el càncer s’origina quan un seguit de cèl·lules<br />
anormals comencen a reproduir-se massivament escampant-se per tot el cos envaint i<br />
fent malbé altres teixits i òrgans.<br />
S’utilitzen per aquest propòsit fàrmacs d’efecte citostàtic; és a dir, fàrmacs que<br />
impedeixen la mitosis aturant el cicle o fins provoquen la destrucció de la cèl·lula.<br />
Segons el seu mecanisme d’actuació els podem dividir en els quatre grups següents:<br />
1. Els que afecten factors extracel·lulars: No afecten la reproducció cel·lular<br />
i per tant no els estudiaré en aquest treball.<br />
2. Els que actuen sobre el sistema immunitàri: No afecten la reproducció<br />
cel·lular i per tant tampoc els estudiaré en aquest treball.<br />
3. Els que actuen sobre l’ADN : Intervenen indirectament en la mitosis .<br />
4. Els que actuen directament sobre la mitosis .<br />
Descriuré els fàrmacs d’efecte citostàtic, en d’altres paraules, els que actuen<br />
directe o indirectament sobre la mitosis:<br />
Agents que actuen sobre l’ADN: el fet d’actuar sobre l’ ADN condiciona<br />
directament la mitosis. Tot i que normalment actua sobre la cèl·lula en un moment<br />
qualsevol del seu cicle, els efectes no es fan palesos fins al pas de la fase G1 a la<br />
S, en què les cadenes d’ ADN que s’han unit o bé no es poden separar ni per tant<br />
replicar; o bé són considerades defectuoses i provoquen l’activació del gen p53,<br />
que duu a la destrucció programada de la cèl·lula.<br />
Químicament aquests components acostumen a tenir dos radicals que els<br />
permeten formar enllaços químics amb les bases púriques i piramídiques de les
dues cadenes de doble hèlice de l’ADN simultàniament de manera que resulta<br />
impossible que se separin alhora de replicar-se.<br />
A aquest grup pertanyen els anticancerígens més freqüents. Es divideixen en<br />
grups segons el seu mètode particular d’actuació:<br />
Agents alquilants: Provoquen l'acció citotòxica mitjançant la formació<br />
d'enllaços covalents entre els grups alquil d’aquests components i les<br />
molècules nucleofíliques cel·lulars provocant alteracions irreversibles en<br />
l’ADN i, per tant impedint la reproducció cel·lular. Són alquilants la Ifosfamida<br />
(IFM) i el Cis-diclorodiaminoplatí (CIS-DDP).<br />
Antimetabòlits: són químicament anàlegs de les bases púriques i<br />
piramídiques i, per tan, intervenen en els mecanismes de síntesis del ADN,<br />
degut a la seva gran semblança provocant cadenes que segons els defectes que<br />
pateixin que poden ser reparades o bé comportar la destrucció cel·lular. Cal<br />
apuntar que tot i que sembla ser un mètode eficaç no s’ha estudiat gaire.<br />
Alguns antimetabòlits són la Citarabina i el Fluorourat.<br />
Antibiòtics citostàtics: compostos elaborats per certs bacteris que <strong>tenen</strong><br />
la capacitat d’aturar el creixement cel·lular. S’uneixen a la molècula d’ADN,<br />
bloquejant-ne la elaboració o transcripció d’ARN de manera que la replicació o<br />
síntesi de proteïnes esdevé impossible. Tot i que cal apuntar que actuen de<br />
manera lleugerament diferent entre ells. En formen part la Actinomicina D<br />
(ACD) i la Mitomicina C (Mit. C).<br />
Derivats de la epipodofilotoxina: Aquests components <strong>tenen</strong> la<br />
capacitat de formar un triple complex (molècula formada per tres subunitats)
amb la seva pròpia molècula, la cadena d’ADN i la topoimerasa II (enzim<br />
corrector dels errors d’ADN i restauradora) . Això comporta no només que les<br />
cadenes d’ADN siguin anòmales sinó que no es poden corregir sense la<br />
topoimerasa sinó únicament tallar. Alguns derivats de la epipodofilotoxina són<br />
l’ Etopàsit i el Tenipòsit.<br />
Complexes de platí: Aquests components reaccionen quan entren dins<br />
la cèl·lula de manera que queden lliures dues valències del ió platí això permet<br />
que s’uneixin simultàniament a dues bases de l’ADN amb un enllaç estable.<br />
Normalment s’uneixen a dues molècules de Guanina en la mateixa cadena o<br />
formant ponts entre cadenes diferents.<br />
Això comporta errors de transcripció (en cas que els pons siguin en la<br />
mateixa cadena) o dobles hèlixs impossibles de separar ni conseqüentment<br />
duplicar (en cas que els pons siguin entre cadenes diferents).Alguns fàrmacs<br />
complexes de platí són l’ Oxaliplatí i el Carboplatí.<br />
Campototecines: Derivats de la campotecina. Actuen sobre la<br />
topoisomerassa II (encarregada d’evitar les tensions trencant i reunint les<br />
cadenes, en la duplicació de l’ADN i transcripció de l’ARN) acoblant-se a ella<br />
i estabilitzant-la. D’aquesta manera que quan la topoimerassa s’uneix amb les<br />
cadenes d’ ADN s’hi uneix establement de manera que un cop reparada la<br />
tensió es manté unida a la cadena impedint que la replicació o transcripció<br />
continuï.<br />
El què fa especialment eficaços aquests tipus de fàrmacs és que<br />
actuen sobretot en les cèl·lules canceroses ja que presenten una major quantitat
de topoisomerassa i, per tant, el seu efecte sobre la resta de cèl·lules normals és<br />
menor. Alguns exemples concrets són l’ Irinotecà i el Topotecà.<br />
Els que actuen sobre la mitosis (sense afectar l’ADN): inhibeixen la<br />
mitosis sense pràcticament afectar l’ ADN ni les cèl·lules en la interfase.<br />
Influeixen en els microtúbuls que formen el fus acromàtic i microtúbuls<br />
cinetocòrics indispensables en el repartiment dels cromosomes.<br />
Els microtúbuls es regeixen per un estret equilibri entre la despolimerització i la<br />
polimerització , és a dir, el pas de tubulina a microtúbuls i viceversa. D’aquesta<br />
manera aquests components trenquen l’ equilibri i eviten la divisió cel·lular. Hi ha<br />
bàsicament dos tipus de fàrmacs amb una actuació d’aquesta mena:<br />
Els Alcaloides de la Vinca: són substàncies naturals extretes dels<br />
vegetals; actuen sobre la tubulina i eviten que es polimeritzi en microtúbuls de<br />
manera que el fus acromàtic el fus acromàtic i microtúbuls cinetocòrics no es<br />
poden formar. Això provoca que en la metafase el cicle s’aturi i els<br />
cromosomes es dispersin o agrupin anormalment. Són alcaloides La<br />
Vinblastina i La Vincristina (VCR) : Aquest és el component actiu del fàrmac<br />
que utilitzaré (amb nom comercial Vincrisul).<br />
Taxoides: Aquests components provoquen la formació precipitada de<br />
microtúbuls en unir-se a la B-tubulina. En conseqüència els microtúbuls són<br />
anormals o massa estables i no poden despolimeritzar-se en tubulina i per tan<br />
no són aptes per a la mitosis.<br />
Tot i que gràcies a als anteriors fàrmacs; en el transcurs d’aquests últims anys s’ha<br />
aconseguit guarir algunes malalties malignes i disminuir l’efecte de moltes altres,
augmentant la qualitat de vida dels pacients, cada vegada més persones presenten<br />
resistència a un nombre important de medicaments, cosa que impedeix prosseguir amb<br />
el tractament. També cal tenir en compte que sovint els medicaments citats <strong>tenen</strong> una<br />
actuació tan violenta i poc selectiva que afebleix dràsticament als pacients.<br />
És per això que s’estan investigant encara nous medicaments de diferent mètode<br />
d’actuació que no afectin la resta de cèl·lules no canceroses.<br />
2.6.1 Estudi de nous fàrmacs<br />
Tenint en compte la gran biodiversitat del nostre planeta, ressalta sobretot la diversitat<br />
marina ja que parlem del 70% de la superfície planetària. Alguns d’aquests organismes<br />
han desenvolupat mecanismes biològics de defensa que permeten la seva supervivència<br />
mitjançant la emissió d’agents químics naturals que podrien proporcionar-nos fàrmacs<br />
amb nous mètodes d’acció per tal d’aplicar-los als pacients amb resistència als actuals.<br />
Aquesta riquesa biològica durant molt de temps no ha estat gairebé emprada en<br />
el món de la medicina degut a la dificultat d’obtenir els organismes o compostos i la<br />
inversió tan costosa que comporta. No obstant, les recents innovacions tecnològiques en<br />
el camp de l’anàlisi han permès que s’iniciïn investigacions molt més eficients en la<br />
recerca de components de medicaments. A continuació citaré alguns dels compostos que<br />
s’han obtingut i que encara estan en període d’avaluació:<br />
Yondelis TM (ET-743): deriva d’un tunicat 44 (Ecteinascidia turbinata) dels<br />
mars del Carib i Mediterrani. Actua sobre diversos tipus de sarcoma, càncer de<br />
mama, d’ovari i de pulmó. Està en període d’assaig clínic avançat.<br />
44 Tunicat: Grup d'animals pertanyent als cordats, que es caracteritzen perquè en estat larval presenten un<br />
cordó nerviós dorsal .
ET-743 s’acobla al ADN impedint-ne la replicació, això comporta en la<br />
majoria de casos que la cèl·lula pateixi una apoptosi, és a dir, una autodestrució<br />
programada de la cèl·lula. Aquest mètode d’acció, tot i presentar molts avantatges<br />
afecta les cèl·lules normals en divisió; que es tradueix en importants efectes<br />
secundaris.<br />
Aplidin ® : Deriva d’un altre tunicat (Deshidrodidemnina B). Actua mitjançant<br />
el bloqueig de la mitosis en la fase G1/G2 del cicle de les cèl·lules en divisió<br />
provocant apoptosi cel·lular. També evita la secreció d’una proteïna (VEGF)<br />
imprescindible per la circulació sanguínia i creixement en determinats tumors.<br />
kahalalide F: Aquest component prominent del molusc (Elysia rufescens)<br />
encara està en assaigs clínics inicials. S’ha demostrat la seva eficiència contra el<br />
càncer hepàtic, un dels més freqüents a nivell mundial. Kahalalide F altera la funció<br />
de la membrana dels lisosomes 5 . Es creu que manté una selectivitat pels tumors.<br />
Variolina B: Aquest compost derivat d’una esponja, es presenta prometedor<br />
en diversos tipus de càncer. La seva eficiència rau en què ataca preferentment les<br />
cèl·lules que <strong>tenen</strong> funcional el gen p53; gen que normalment té un paper clau en el<br />
desenvolupament dels tumors. Això permet una actuació selectiva en vers les<br />
cèl·lules cancerígenes.<br />
ES-285: aquest agent anticancerigen que deriva de la cloïssa (Mactromeris<br />
polinyma), està en fase de desenvolupament selectiu en diversos tipus de tumors .<br />
Actua mitjançant l’alteració del citoesquelet 65 de les cèl·lules canceroses.<br />
5 Lisosoma: vesícula situada al citoplasma cel·lular que conté enzims digestius.<br />
65 Citoesquelet cel·lular: Conjunt de filaments proteics situats al citoplasma cel·lular .
3 DISSENY EXPERIMENTAL<br />
Per poder demostrar que els fluids de certes <strong>esponges</strong> <strong>tenen</strong> <strong>propietats</strong> antimitòtiques<br />
sotmetré embrions (les cèl·lules dels quals estan en divisió constant) de Paracentrotus<br />
lividus als fluids de dues <strong>esponges</strong> concretes . D’aquesta manera comparant l’evolució<br />
dels embrions sotmesos a cada un dels fluids, podré determinar si actuen de la mateixa<br />
manera i si cap d’elles té efecte antimitòtic.<br />
Amb aquest propòsit hem d’obtenir gàmetes d’eriçó comú de mar<br />
(Paracentrotus lividus).Els embrions d’aquest tipus d’eriçons són molt utilitzats en<br />
embriologia degut a que poden desenvolupar-se de forma senzilla in vitro (fora del cos),<br />
que la seva mida permet una bona observació en el microscopi i que el seu<br />
desenvolupament no acostuma a durar més de 48 hores.<br />
La primera esponja que estudiarem és la Chondrosia reniformis, perquè com ja<br />
s’ha exposat en la part teòrica, té una gran capacitat extensiva que li permet<br />
desenvolupar-se amb molta rapidesa; cosa que ens indueix a pensar que aquesta esponja<br />
pot contenir les substàncies que busquem.<br />
La segona esponja que estudiarem és la Crambe crambe, que té una gran<br />
activitat química demostrada.<br />
Per obtenir els fluids de les dues <strong>esponges</strong> seria adequat estudiar els líquids que<br />
emana en el seu habitat natural, o bé separar els components citats amb un cromatògraf<br />
de líquids. No obstant degut a que no tenim el temps, els coneixements ni els recursos<br />
suficients per fer-ho, treballarem amb els líquids obtinguts a partir de triturar les dues<br />
<strong>esponges</strong>. Això implica que els components de possible actuació antimitòtica que<br />
estudiem es barregin amb la resta de fluids vitals i que possiblement altres components<br />
com enzims digestius afectin els embrions.
A més a més, per poder assegurar que els resultats obtinguts són només fruit de<br />
l’actuació d’aquests components i no de les manipulacions que comporta l’experiment;<br />
és necessari contrastar l’evolució dels embrions sotmesos als líquids de les <strong>esponges</strong><br />
amb l’evolució dels mateixos en aigua marina (el control) i sota els efectes d’un<br />
anticancerigen demostrat.<br />
D’aquesta manera si realitzem l’experiment en els quatre medis diferents ( un<br />
amb una determinada concentració de fluids de l’esponja Chondrosia reniformis en<br />
aigua de mar, un altre amb fluids de l’esponja Crambe crambe en aigua marina, l’altre<br />
només amb aigua de mar i l’últim amb un anticancerigen dissolt en aigua de mar)<br />
sotmesos a les mateixes condicions, podrem afirmar que les diferències entre l’evolució<br />
dels embrions en el medi d’extracte d’<strong>esponges</strong> i en el control són fruit de l’actuació<br />
dels components de les <strong>esponges</strong>.<br />
I comparant-ne l’evolució amb els embrions del medi amb un anticancerigen<br />
podrem acabar de confirmar si les <strong>esponges</strong> <strong>tenen</strong> o no poder antimitòtic.<br />
Utilitzarem com a antimitòtic el Vincrisul, un anticancerigen comercial amb la<br />
Vincristina com a component actiu, d’origen natural que com ja hem explicat en la<br />
introducció (anticancerígens) afecta al material genètic.<br />
És evident que els embrions han de desenvolupar-se en aigua de mar com a<br />
suport i considerant que s’han de prendre diverses mostres, podem determinar que els<br />
quatre medis siguin de 200 ml d’aigua de mar amb els components que calgui dissolts.<br />
Un cop haguem obtingut el fluid de les dues <strong>esponges</strong>, cal filtrar-lo per evitar<br />
que trossos d’òrgans o esquelet ens dificultin la posterior observació dels embrions amb<br />
el microscopi. Si considerem que les substàncies que busquem actuen en dissolució en<br />
l’aigua marina, és evident que cal dissoldre els fluids de les <strong>esponges</strong> que hem obtingut,<br />
en aigua salada.
Tenint en compte que no podem consultar precedents de cap experiment de les<br />
mateixes característiques és difícil triar-ne la concentració i per tant el volum de fluids<br />
que n’hem de prendre.<br />
No obstant, basant-nos en que la secreció de components químics al seu voltant<br />
és una activitat secundària i només portada a terme per un tipus determinat de cèl·lules<br />
hem de considerar que la proporció d’aquestes substàncies amb possibles<br />
característiques antimitòtiques és ínfima respecte a la resta de fluids corporals de<br />
l’esponja. Però també que actuen en quantitats molt petites afectant organismes<br />
bentònics molt més grans i protegits que els embrions.<br />
Per això hem d’agafar un volum de fluids d’esponja suficientment gran com<br />
perquè aquestes substàncies tinguin efecte i alhora que no produeixin problemes<br />
osmòtics als embrions molt sensibles a concentracions diferents a la marina.<br />
Totes les anteriors consideracions ens porten a dissoldre en aigua marina els<br />
fluids d’esponja a menys del 10% concretament al 7’5 %. És a dir, que per cada<br />
mil·lilitre d’aigua marina hi afegirem 0’075 mil·lilitres dels fluids d’esponja filtrats fins<br />
a obtenir els 200 ml amb que volem treballar.<br />
La concentració de fluids en l’aigua marina ha de ser la mateixa per les dues<br />
<strong>esponges</strong> ja que volem que siguin comparables entre elles de manera que els resultats no<br />
depenguin de la quantitat dels fluids, sinó de la qualitat d’aquests.<br />
També cal determinar la concentració de Vincrisul en els 200 ml amb que<br />
treballem. Per tal de determinar-la tindrem en compte la dosi recomanada per nadons de<br />
menys de 10 kg. La dosi recomanada en aquests casos és de 0’05mg en 10 kg és a dir en<br />
700ml si tenim en compte que en els nadons <strong>tenen</strong> aproximadament un 70% d’aigua. Si<br />
en 700 ml tenim 0’05mg podem deduir que en 200ml n’hi hauran 0’0143 mg<br />
aproximadament.
0’05 mg = X mg<br />
700 ml 200ml X = 0’0143 mg aproximadament.<br />
I considerant que els embrions estan en contacte directe amb la dissolució i que la<br />
quantitat de mitosis és molt superior n’utilitzarem només la meitat: uns 0’007 mg.<br />
Preparem els quatre medis: un amb només aigua de mar, un altre amb el<br />
Vincrisul dissolt, el tercer amb extracte d’esponja Chondrosia reniformis i el quart amb<br />
extracte d’esponja Crambe crambe. Col·loquem els òvuls i espermatozoides de garota a<br />
cada vas de precipitats procurant sotmetre els quatre vasos a les mateixes condicions:<br />
mateixa temperatura (a uns 17ºC amb fortes oscil·lacions tèrmiques), qualitat d’aigua<br />
similar, mateixa fertilitat de les gàmetes, mateixa quantitat de gàmetes, etc.<br />
Així prenent mostres a diferents temps podrem determinar el desenvolupament<br />
normal dels embrions en el control, el desenvolupament sota l’efecte d’un antimitòtic<br />
demostrat i contrastant-los amb el desenvolupament dels mateixos sota l’efecte dels<br />
fluids de les dues espècies diferents d’esponja, podrem acabar determinant si realment<br />
<strong>tenen</strong> substàncies de <strong>propietats</strong> <strong>anticancerígenes</strong>.<br />
MATERIAL NECESSÀRI :<br />
Utensilis:<br />
- Vareta<br />
- Embut<br />
- Paper de filtre<br />
- Batedora<br />
- Proveta (a poder ser de 100 ml per a una major precisió)<br />
- Microscopi ( el més òptim és que pot augmentar la imatge 40 i 100<br />
vegades)<br />
- 2 agulles emmanegades<br />
- 1 safata<br />
- guants gruixuts<br />
- guants de metge<br />
- mascareta<br />
- 4 pipetes petites (jo he utilitzat 3 xeringues per la seva facilitat de<br />
maneig)<br />
- comptagotes
Substàncies:<br />
Organismes:<br />
PROCEDIMENTS<br />
- pipetes<br />
- tisores<br />
- portaobjectes<br />
- 4 vasos de precipitats de 200ml<br />
- 2 pinces<br />
- 2 càpsules de petri<br />
- 28 pots petits de vidre ( o dels carrets de les fotos )<br />
- 2 espàtules<br />
- una pipeta de 10 ml<br />
- una pera<br />
- un retolador permanent<br />
- solució de formol<br />
- Vincrisul<br />
- 6 garotes<br />
- 2 <strong>esponges</strong>( una de l’espècie Chondrosia reniformis i l’altre de<br />
l’espècie Crambe crambe )<br />
Preparació del medi amb esponja1 (Chondrosia reniformis):<br />
1. Agafem la primera esponja (Chondrosia reniformis) i la triturem amb la batedora<br />
afegint-hi si cal unes gotes d’aigua de mar.<br />
2. Quan al fons del recipient tinguem una base líquida, podem deixar de triturar ja que<br />
aquestes <strong>esponges</strong> <strong>tenen</strong> un esquelet de col·lagen que ens impedeix una trituració<br />
completa.<br />
3. Col·loquem l’embut sobre la proveta i retallem el paper de filtre de manera que<br />
encaixi a l’embut. Seguidament hi aboquem la part líquida i esperem que es filtri. Fins<br />
a obtenir-ne 14 ml que conformaran el 7’5 % en volum de la dissolució. Els col·loquem<br />
en un vas de precipitats.<br />
4. Hi afegim aigua de mar fins a obtenir 200 ml.
Preparació del medi amb esponja Crambe2 (Crambe crambe):<br />
5. Repetim el procés amb la següent esponja (Crambe crambe) que també hem de<br />
triturar. Aquesta, degut a la seva constitució no calcària la podem triturar amb molta<br />
més facilitat.<br />
6. Quan tinguem una quantitat considerable de fluid, procedim a filtrar-lo amb l’embut<br />
i un nou paper de filtre fins a obtenir 14 ml que de la mateixa manera aboquem al vas de<br />
precipitats.<br />
7. Acabem d’omplir el vas de precipitats amb aigua de mar.<br />
Preparació del medi amb medicament Vincrisul:<br />
8. Cal considerar la naturalesa antimitòtica d’aquest medicament abans del seva<br />
manipulació, aquesta requereix l’ús de guants i de mascareta.<br />
Com ja s’ha justificat en el disseny de l’experiment hem de dissoldre 0’00745<br />
mg aproximadament de Vincrisul en 200 ml d’aigua salada.<br />
9. Per tal d’evitar la manipulació directa podem dissoldre el medicament per fases. En<br />
primer lloc dissolem la pastilla sencera de 100 mg de Vincrisul en 1 litre d’aigua salada.<br />
10. Un cop totalment dissolta, agafem amb la pipeta graduada amb pera 10 ml i els<br />
tornem a dissoldre en un altre litre d’aigua salada. Això ens permet que agafant 7 ml<br />
d’aquesta segona dissolució obtinguem aproximadament els 0’0143 mg necessaris.<br />
1ª dissolució: 2ª dissolució:<br />
100 mg = X mg 1 mg = 0’007 mg<br />
1000 ml 10 ml X= 1mg 1000ml Y ml Y= 7 ml<br />
11. Col·loquem els 7ml en el tercer vas de precipitats i acabem d’omplir-lo amb aigua de<br />
mar fins als 200 ml.
Preparació del medi del control:<br />
12. Mesurem 200 ml d’aigua de mar i els aboquem a l’últim vas de precipitats.<br />
Preparació de les gàmetes de les garotes:<br />
13. Primerament cal obtenir un mínim de 6 eriçons vius d’aquesta espècie (per tal de<br />
garantir la presència de mascles i femelles fèrtils) i extreure’n les gàmetes. Degut a l’època<br />
de l’any en què ens trobem qualsevol mètode no traumàtic (que no suposi la mort de l’eriçó)<br />
per extreure’n les gàmetes és inviable; ja que la quantitat d’aquestes és limitada i tan el sexe<br />
de l’eriçó com la fertilitat d’aquests no es pot1determinar sense obrir-lo. Conseqüentment<br />
hem d’obrir els eriçons1fins a trobar-ne dos de mascles (amb les gònades grogosses) i dues<br />
femelles (amb les gònades vermelloses). Per evitar punxar-se podem utilitzar els guants<br />
gruixuts tenint molt en compte que cal<br />
obrir-les1amb les tisores no per la meitat<br />
ja que trencaríem les gònades; sinó<br />
1que per les dues terceres parts.<br />
Esquema de com obrir les garotes sense malmetre les gònades<br />
14.1Un cop obertes dues garotes femelles i dos mascles; les netegen en una galleda d’aigua<br />
salada per tal d’extreure’n els òrgans no sexuals. <strong>Les</strong> restes que pugin quedar les podem<br />
treure amb les pinces amb cura1de no trencar les gònades.<br />
15. Comencem amb la manipulació de les femelles, ja que en cas contrari els<br />
espermatozoides activarien el seu moviment en contacte1amb l’aigua de mar i degut al veu<br />
petit volum i conseqüent1escassetat de nutrients en entrar en contacte amb els òvuls la
seva1mobilitat seria reduïda o nul·la amb la disminució de l’índex de fecundació que això<br />
comporta.<br />
A la imatge de la dreta podem veure una garota mascle i a l’esquerra una femella, ambdós fèrtils i ja<br />
netejades.<br />
Amb un moviment de l’exterior cap a l’ interior de l’ espàtula extraiem les<br />
gònades de les femelles sense trencar-les i les col·loquem en un vidre de rellotge.<br />
Seguidament les obrim i n’extraiem les fibres que conformen el sac de manera que<br />
s’alliberen els òvuls. Hi afegim amb el comptagotes aigua de mar i hi dissolem els òvuls<br />
per possibilitar la posterior dosificació en els quatre vasos de precipitats mitjançant el<br />
comptagotes.<br />
16. Repetim el procés amb els mascles, procurant no afegir l’aigua de marina fins ben al<br />
final.<br />
17. Aboquem 5 gotes del contingut vidre de rellotge dels òvuls a cada vas de precipitats<br />
i posteriorment 1 gota d’esperma del contingut vidre de rellotge dels<br />
espermatozoides. Aquest moment és el que considerem t0 . Per tant cal tenir present<br />
l’hora exacte per poder procedir a la presa de mostres posteriors amb exactitud.<br />
Presa de mostres:<br />
18. Prenem els 28 pots de vidre o dels carrets en els quals haurem de col·locar els<br />
embrions de cada vas a cada temps. Per a una òptima fixació de les estructures, és
necessari que les mostres continguin un 4% (en volum) de formol. Així doncs si les<br />
mostres volem que siguin de 2 ml, i el formol que tenim és del 20%, hi ha d’haver-hi<br />
0’5 ml de formol aproximadament i uns 1’5 ml. És a dir:<br />
2 ml de dó formol1 . 4 ml de formol . 120 ml de dó formol2 = 0’46ml 0’46 ml (<br />
0’5 ml 104 ml de dó formol1 20 ml de formol ( uns 0’5 ml)<br />
dó de formol1: és la dissolució del 4% que volem obtenir.<br />
dó de formol2: és la dissolució del 20% que ja tenim.<br />
19. Un cop hem col·locat a cada pot mig ml de formol, és útil marcar amb un retolador<br />
permanent 7 pots com a control (C), 7 com a medicament (M) , 7 més com a<br />
esponja1 (E1), i els restants com a esponja2(E2). D’aquests quatre grups cada un<br />
segons un temps determinat (t1, t2, t3,t4,t5,t6 o t7).<br />
20. Un cop marcats tots els pots i omplerts amb formol hem de començar la presa de<br />
mostres. Per fer-ho podem fer ús de les 4 pipetes petites (en el meu cas 3 xeringues<br />
per la seva facilitat de maneig i la pipeta gran amb pera).<br />
<strong>Les</strong> primeres preses han de tenir lloc 1’5 hores després del temps 0. Cal prendre<br />
1’5 ml de mostra de cada vas de precipitats. Tenint en compte que en aquest<br />
moment els embrions no <strong>tenen</strong> capacitat pròpia de moviment, és convenient prendre<br />
la mostra del fons del recipients fent servir els quatre estris diferents per no barrejar-<br />
les i col·locar-les als seus respectius pots de vidre o de carrets prèviament marcats.<br />
Seguint el mateix mètode s’han de dur a terme les següents preses:<br />
recipients.<br />
- <strong>Les</strong> segones passades 2’5h del temps 0. També cal prendre-les del fons dels<br />
- <strong>Les</strong> terceres passades 4h del temps 0, del fons dels recipients.<br />
- <strong>Les</strong> quartes passades 6h del temps 0, del fons dels recipients.
- <strong>Les</strong> cinquenes passades 10h del temps 0. En aquest moment prenent per<br />
exemple d’altres experiments realitzats sobre embrions de garotes podem suposar que<br />
hauran arribat a larves i per tant adquirit mobilitat pròpia. Això determina que es trobin<br />
disperses per tot el vas i per tant prendrem les mostres de la part central dels vasos de<br />
precipitats.<br />
- <strong>Les</strong> sisenes passades 24h del temps 0, de la part central dels recipients.<br />
- <strong>Les</strong> setenes passades 48h del temps 0, de la part central dels recipients.<br />
Observació de les mostres:<br />
Fotografia de la realització de l’experiment<br />
21. Una vegada hem pres totes les mostres, només queda observar-les amb un<br />
microscopi. Per determinar-ne els resultats, agafem 2 o 3 gotes d’un mateix pot i les<br />
col·loquem en un portaobjectes que observarem amb l’objectiu de 40 augments.<br />
Repetim la operació varies vegades, prenen les mostres del mateix pot i anotant<br />
l’estat dels embrions que veiem fins a trobar-ne un mínim de 10. Pot donar-se el cas<br />
d’observar tota la mostra i no arribar als 10 en aquest cas també cal deixar-ne<br />
constància. Cal repetir l’esmentat procés per cada pot; netejant el comptagotes<br />
emprat, amb aigua de mar per evitar barreges de mostres.
4 RESULTATS<br />
4.1 Resultats del control<br />
CONTROL<br />
Òvuls Fecundat 2 cèl·lules 4 cèl·lules 8 cèl·lules Mòrula Blàstula Gastrula Larva Aberració total<br />
Nº Nº Nº<br />
% Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº<br />
Nº<br />
t1 t1 (1'5 (1'5 h) h) h) 8 57% 5 36% 1 7% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 14<br />
t2 t2 (2'5h) (2'5h) 6 46% 3 23% 3 23% 1 8% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13<br />
t3 t3 (4h) (4h) 2 29% 0 0% 0 0% 1 14% 4 57% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 7<br />
t4 t4 (6h) (6h) 2 40% 1 20% 1 20% 0 0% 0 0% 0 0 % 0 0% 0 0% 0 0% 1 20% 4<br />
t5 t5 (10h) (10h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0<br />
t6 t6 t6 (24h) (24h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 2 100% 0 0% 2<br />
t7 t7 (48h) (48h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 2 100% 0 0% 2
no fecundats<br />
fecundats<br />
2 cèl·lules<br />
4 cèl·lules<br />
8 cèl·lules<br />
mòrula<br />
blàstula<br />
gàstrula<br />
larva<br />
aberracions<br />
100%<br />
90%<br />
80%<br />
70%<br />
60%<br />
50%<br />
40%<br />
30%<br />
20%<br />
10%<br />
0%<br />
Els resultats ens mostren l’evolució dels embrions en el control, és a dir, el seu<br />
desenvolupament sota les condicions concretes de l’experiment sense l’actuació de<br />
substàncies antimitòtiques. Es pot observar que el percentatge d’òvuls que no han estat<br />
fecundats és important des de el primer moment, en què el conjunt de fecundats també<br />
és rellevant en front a una petita porció d’embrions que han cursat fins a dues cèl·lules.<br />
En el segon temps es pot veure que continuen tenint molt de pes els òvuls, però<br />
també destaca una gran part dels fecundats, no tan nombrosos, han cursat fins a l’estadi<br />
de dues cèl·lules i una petita porció fins a dividir-se en quatre cèl·lules. En el tercer<br />
temps veiem que el nombre de no fecundats disminueix i la de fecundats esdevé nul·la.<br />
La quantitat d’embrions de 4 cèl·lules augmenta i sobretot la quantitat d’embrions de 8<br />
cèl·lules que creix espectacularment situant-se a gairebé el 60%.<br />
En el quart temps s’observa un augment dels òvuls no fecundats en detriment<br />
dels altres estadis, ja que solament es pot veure un embrió dividit en dues cèl·lules i un<br />
d’aberrant. En el cinquè temps no es troba cap embrió ni òvul no fecundat; mentre que<br />
en el sisè temps tots els embrions es troben en estat larval, concretament larves inicials.<br />
En l’últim temps també hi ha un 100% de larves, que a diferència de l’anterior la meitat<br />
estan en un estadi més desenvolupat.<br />
Control<br />
t1 (1'5 h) t2 (2'5h) t3 (4h) t4 (6h) t5 (10h) t6 (24h) t7 (48h)
4.2 Resultats del Vincrisul<br />
VINCRISUL<br />
Òvuls Fecundat 2 cèl·lules 4 cèl·lules 8 cèl·lules Mòrula Blàstula Gastrula Larva Aberració total<br />
% Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº<br />
Nº<br />
t1 t1 (1'5 (1'5 h) h) h) 6 46% 7 54% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13<br />
t2 t2 (2'5h) (2'5h) 8 62% 1 8% 3 23% 1 8% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13<br />
t3 t3 (4h) (4h) 2 25% 0 0% 2 25% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 4 50% 8<br />
t4 t4 (6h) (6h) 2 29% 1 14% 1 14% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 3 43% 7<br />
t5 t5 (10h) (10h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0<br />
t6 t6 (24h) (24h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0<br />
t7 t7 (48h) (48h) (48h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
Els resultats mostren l’evolució dels embrions sotmesos a un antimitòtic demostrat: el<br />
Vincrisul, és a dir, si la hipòtesi d’aquest treball és correcta haurien de mostrar el model<br />
de comportament de les <strong>esponges</strong>. Podem veure que el percentatge d’òvuls que no han<br />
estat fecundats és important, però no tant com en el control, ja que en el primer temps la<br />
quantitat de fecundats és lleugerament superior.<br />
En el segon temps, en canvi, s’observa que els no fecundats prenen gran<br />
importància davant d’un gran ventall d’estadis. Una petita porció estan fecundats, un<br />
altre grup més nombrós s’ha dividit en dues cèl·lules i una altra minoria en quatre<br />
cèl·lules.<br />
En el tercer temps es pot veure que la quantitat de no fecundats disminueix i la<br />
de fecundats esdevé nul·la. La quantitat d’embrions de 2 cèl·lules és lleugerament<br />
inferior en front a l’aparició de la meitat d’aberrants.<br />
En el quart temps torna a destacar una petita part de no fecundats i algun de<br />
fecundat, la quantitat d’embrions de dues cèl·lules es pot constatar que s’ha reduït i la<br />
quantitat d’aberracions es manté. En els successius temps, no la presència de cap embrió<br />
ni òvul.
4.3 RESULTATS DE L’EXTRACTE DE L’ ESPONJA1 (Chondrosia reniformis)<br />
Extracte de<br />
òvuls Fecundat 2 cèl·lules 4 cèl·lules 8 cèl·lules Mòrula Blàstula Gastrula Larva Aberració total<br />
l’esponja1 % Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº<br />
Nº<br />
t1 t1 t1 (1'5 (1'5 h) h) 6 46% 7 54% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13<br />
t2 t2 (2'5h) (2'5h) (2'5h) 8 62% 1 8% 3 23% 1 8% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13<br />
t3 t3 (4h (4h) (4h 2 25% 0 0% 2 25% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 4 50% 8<br />
t4 t4 (6h) (6h) 2 29% 1 14% 1 14% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 3 43% 7<br />
t5 t5 (10h) (10h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0<br />
t6 t6 (24h) (24h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0<br />
t7 t7 (48 (48h) (48 (48h)<br />
h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
no fecundats<br />
fecundats<br />
2 cèl·lules<br />
4 cèl·lules<br />
8 cèl·lules<br />
mòrula<br />
blàstula<br />
gàstrula<br />
larva<br />
aberracions<br />
Els resultats ens mostren l’evolució dels embrions sotmesos a la primera esponja,<br />
aquests resultats que seran contrastats amb els del control i medicament són la part més<br />
important d’aquest treball.<br />
100%<br />
90%<br />
80%<br />
70%<br />
60%<br />
50%<br />
40%<br />
30%<br />
20%<br />
10%<br />
En el primer temps podem veure un alt percentatge d’òvuls, molt més gran que<br />
en el control i medicament tan sols podem constatar una petita porció de zigots.<br />
En el segon temps els òvuls disminueixen en front dels zigots i de l’aparició<br />
d’un petit tan per cent d’aberracions.<br />
Esponja 1<br />
En el tercer temps es pot veure que no hi ha presència de cap embrió o gàmeta;<br />
situació que es manté durant tots els temps successius.<br />
0%<br />
t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7
4.4 RESULTATS DE L’EXTRACTE DE L’ ESPONJA2 (Crambe crambe)<br />
Extracte de<br />
òvuls Fecundat 2 cèl·lules 4 cèl·lules 8 cèl·lules Mòrula Blàstula Gàstrula Larva Aberració total<br />
l’esponja2 % Nº Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº Nº % Nº<br />
Nº<br />
t1 t1 (1'5 (1'5 h) h) 3 100% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 3<br />
t2 t2 (2'5h) (2'5h) 13 72% 4 22% 1 6% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 18<br />
t3 t3 (4h) (4h) 9 90% 1 10% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 10<br />
t4 t4 (6h) (6h) 13 100% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13<br />
t5 t5 (10h) (10h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0<br />
t6 t6 (24h) (24h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0<br />
t7 t7 (48h) (48h) (48h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
Els resultats mostren l’evolució dels embrions sotmesos a la segona esponja, resultats<br />
que seran comparats amb els del control i medicament són la part més important<br />
d’aquest treball.<br />
En el primer temps només trobem òvuls.<br />
En el segon temps els no fecundats disminueixen notablement, mentre que<br />
apareixen zigots i embrions en estadi de dues cèl·lules.<br />
En el tercer temps tornen a augmentar els òvuls sense fecundar i trobem una<br />
proporció de zigots molt petita.<br />
En el quart temps es tornen a trobar solament òvuls i a partir d’aquest moment,<br />
en els temps successius no hi ha cap altre embrió o òvul.
5 DISCUSSIÓ<br />
c o ntr o l<br />
e x trac te<br />
d 'e sp o nja 1<br />
e x trac te<br />
d 'e sp o nja 2<br />
vin c r isul<br />
10 0 %<br />
9 0 %<br />
8 0 %<br />
7 0 %<br />
6 0 %<br />
5 0 %<br />
4 0 %<br />
3 0 %<br />
2 0 %<br />
1 0 %<br />
0 %<br />
òvuls<br />
Aquest gràfic mostra l’estat dels embrions en els primer temps(després d’ una hora i<br />
mitja de l’inici de l’experiment).<br />
fecundats<br />
te m p s 1<br />
2 cèl·lules<br />
4 cè·lules<br />
Es pot veure a primera vista una gran quantitat d’òvuls sense fecundar. El fet<br />
que sigui una característica més o menys comuna en tots els medis ens suggereix que<br />
possiblement es deu a condicions externes a l’experiment. Concretament és molt<br />
probable que sigui fruit de l’escassa fertilitat de les garotes atesa l’època de l’any en que<br />
ens trobem, just entrada l’època de reproducció.<br />
8 cè·lules<br />
mòrules<br />
blàstules<br />
gàstrules<br />
larves<br />
aberracions<br />
En aquesta imatge, presa<br />
durant l’experiment, es pot<br />
constatar que de totes les<br />
garotes obertes tan sols<br />
trobem dues femelles (a baix<br />
als extrems) i una d’elles no<br />
està suficientment madura.<br />
En el cas dels mascles també<br />
només un té les gònades del<br />
tot preparades , el de la dreta.<br />
Aquesta escassetat d’eriçons<br />
amb les gònades preparades<br />
fa que depenguem de la<br />
fertilitat de les gàmetes dels<br />
dos únics individus madurs,<br />
els dos de la dreta.
També és rellevant la gran quantitat d’òvuls fecundats en el Vincrisul respecte al<br />
control. Provablement es deu a que la solució del Vincrisul és hipertònica respecte a la<br />
marina, però de naturalesa semblant, això en alguns casos<br />
pot confondre a l’òvul que activa la formació de la<br />
membrana de fecundació prematurament. Per tant és<br />
possible que alguns d’aquests òvuls no siguin<br />
veritablement fecundats i no pugin desenvolupar-se.<br />
En aquesta fotografia, presa durant l’experiment del medi del Vincrisul a 400 augments podem<br />
veure clarament un zigot . Es distingeix la membrana de fecundació amb claredat. No obstant, és<br />
possible que com s’ha explicat anteriorment sigui un fals fecundat i que no pugi passar als<br />
estadis següents.<br />
D’altre banda crida l’atenció l’absència de zigots en el medi amb extracte de la<br />
segona esponja: Crambe crambe. Això que en principi es podria entendre com a un<br />
efecte dràstic sobre els espermatozoides per part de les substàncies tòxiques de<br />
l’extracte de l’esponja (el fet de triturar la totalitat de l’esponja provoca que s’alliberin<br />
substàncies corrosives com ara enzims digestius) queda desmentit per l’aparició de<br />
zigots en la següent etapa.<br />
A més cal destacar que en la mostra sotmesa al extracte d’esponja 2 hi havia<br />
pocs embrions (3) , i per tant, els resultats són molt poc representatius. Veient la poca<br />
mostra obtinguda, de cara a una repetició de l’experiment, seria positiu agafar com a<br />
mínim el doble de mostra (4 ml).<br />
També destaca la reduïda presència de zigots en el filtrat de l’esponja 1 que ens<br />
deixa oberta la hipòtesi, independent de la tractada en aquest treball, de si els fluids de<br />
l’esponja són tòxics i per això dificulten la fecundació.<br />
En aquest cas, tenint en compte que els embrions sotmesos a l’extracte de<br />
Crambe crambe semblen molt més afectats per components tòxics es pot suposar que el
grau de toxicitat no és comuna en les dues <strong>esponges</strong> i que per tant en part no és causada<br />
pels enzims digestius (comuns en totes les <strong>esponges</strong>) i altres substàncies que s’hagin<br />
pogut alliberar quan hem triturat l’esponja, sinó que el seu grau de toxicitat depèn de<br />
l’espècie en concret. I que per tant possiblement els elements químics que estic<br />
estudiant no solament <strong>tenen</strong> <strong>propietats</strong> antimitòtiques sinó també tòxiques en el cas de la<br />
Crambe crambe.<br />
Aquestes dues fotografies<br />
preses durant l’experiment són<br />
òvuls sotmesos als extractes<br />
de les <strong>esponges</strong> a 400<br />
augments. El de més a la dreta<br />
és el sotmès al extracte de<br />
Chondrosia reniformis i l’altre<br />
al de Crambe crambe.<br />
Comparant-les s’aprecia<br />
que la sotmesa a la segona<br />
esponja té una forma molt més<br />
perfecta, per tant sembla que<br />
l’extracte de l’esponja Crambe crambe té <strong>propietats</strong> tòxiques, mentre que l’extracte de la Chordrosia<br />
reniformis no en té, o si més no, són més suaus.<br />
Un altre aspecte que cal comentar és la presència d’un embrió de dues cèl·lules<br />
al control, mentre que en la resta de medis els embrions van més endarrerits i que ens<br />
podria fer plantejar si un augment de la concentració del medi alenteix el procés mitòtic,<br />
però que és fàcilment desestimable tenint en compte que parlem d’un sol embrió i que<br />
per tant pot no ser gaire representatiu del període. A més tampoc succeeix amb el medi<br />
amb Vincrisul en que la concentració és molt similar.
En el segon temps (passades dues hores i mitja de l’inici de l’experiment) destaca la<br />
similitud dels estadis dels embrions en els quatre medis i segueix essent apreciable la<br />
gran quantitat d’òvuls no fecundats.<br />
Es pot apreciar que el medi en què els no fecundats són més abundants és en<br />
l’extracte de la esponja 2 seguida pràcticament per igual de l’extracte de l’esponja 1 i el<br />
Vincrisul, modificant-se poc respecte al gràfic del temps anterior. Crec que això és més<br />
aviat degut a la concentració del medi que a les característiques dels components.<br />
D’altre banda és rellevant el fet que el Vincrisul, de demostrades <strong>propietats</strong><br />
antimitòtiques, tingui tants embrions en estat de dues i quatre cèl·lules; i per tant<br />
descrigui el mateix comportament que el control. Tenint en compte que el Vincrisul<br />
actua sobre la formació dels microtúbuls, és probable que ja en les primeres divisions, el<br />
material genètic es distribueixi de manera anòmala. No obstant en les primeres fases de<br />
la divisió, l’òvul domina el procés sense que una mala distribució del material genètic<br />
aturi la divisió. D’aquesta manera a mida que aquests embrions evolucionin (a partir del<br />
estadi de quatre cèl·lules); el material genètic serà necessari i l’embrió serà aberrant o<br />
bé farà apoptosi directament.<br />
Aquestes dues fotos, també preses durant<br />
l’experiment són embrions de dues<br />
cèl·lules a 400 augments. L’embrió de<br />
l’esquerra és del medi del control mentre<br />
que el de la dreta és del medi del<br />
Vincrisul. Tot i que l’embrió sotmès al<br />
Vincrisul segurament té el material<br />
genètic alterat externament s’hi<br />
distingeix cap diferència.<br />
És també destacat el fet de no trobar en l’extracte de la primera esponja cap<br />
embrió de 2 cèl·lules o estadis més avançats, sinó embrions aberrants; és a dir amb<br />
característiques anormals. Concretament hi ha una asincronia del clivellant que suposa<br />
un creixement desestructurat de l’embrió, en què cada cèl·lula es divideix a deshora.
Aquest comportament recolza la hipòtesi del treball ja que en aquest punt sembla que<br />
l’extracte de l’esponja 1 afecta la divisió cel·lular des de l’inici provocant aberracions<br />
que comportaran la apoptosi cel·lular. No obstant parlem d’una proporció molt petita de<br />
la mostra que podria ser fruit de l’atzar. Conseqüentment per poder rebutjar o reafirmar<br />
la tesi és necessari observar-ne l’evolució.<br />
En quan a l’extracte de la segona esponja es veu que continua havent-hi un alt<br />
índex d’òvuls no fecundats, tot i que la proporció de fecundats s’adiu amb el control i<br />
observem una petita quantitat d’embrions de dues cèl·lules. Això podria significar que<br />
aquesta esponja no té <strong>propietats</strong> antimitòtiques o que l’actuació de les substàncies que<br />
estudiem és semblant a la del Vincrisul i permet les primeres divisions regides per<br />
l’òvul.<br />
En aquest temps ( a les quatre hores de l’inici de l’experiment) és apreciable a<br />
primer cop d’ull una diferenciació important del comportament dels quatre medis. En<br />
primer lloc destaca la disminució progressiva dels òvuls del control, deguda a que en no<br />
ser fecundats durant tant de temps, els òvuls acaben morint. En qualsevol cas la resta<br />
dels embrions segueixen un procés d’evolució normal, en què l’estadi de 4 cèl·lules pren<br />
pes i sobretot destaca un augment important dels embrions de 8 cèl·lules.
El Vincrisul descriu el comportament previst, ja que mantenint una proporció de<br />
no fecundats semblant a la del control i per tant normal, augmenten els embrions de<br />
dues cèl·lules notablement i sobretot cal destacar l’aparició d’un gran nombre<br />
d’embrions aberrants. Aquests responen a l’evolució dels embrions de 4 cèl·lules del<br />
temps anterior que degut a les malformacions en el material genètic que havia provocat<br />
el Vincrisul, no han pogut evolucionar quan les divisions requerien d’aquest i s’ha<br />
produït una asincronia del clivellament com la descrita anteriorment pel medi amb<br />
esponja.<br />
Aquestes dues fotos són<br />
d’embrions aberrants del<br />
experiment, concretament del<br />
medi amb medicament en aquest<br />
temps a 400 augments. Podem<br />
veure que hi ha una asincronia<br />
del clivellament ja que les<br />
cèl·lules es divideixen sense cap<br />
ordre.<br />
El comportament de l’extracte de l’esponja 1 és molt interessant en aquest<br />
moment ja que tot i l’anàlisi minuciós de les mostres no hi apareix cap embrió. Aquest<br />
fet té com explicació que possiblement; les cèl·lules aberrants que en el període anterior<br />
s’havien format han fet apoptosi degut a les malformacions del material genètic<br />
causants de les aberracions. Cal tenir en compte que quan una o un conjunt de cèl·lules<br />
fan apoptosi els lisosomes (enzims digestius de les cèl·lules) s’alliberen al medi cel·lular<br />
digerint tota cèl·lula des de dins comportant el trencament de la membrana. Això<br />
provoca que no les pugui detectar.<br />
D’aquesta mateixa manera es pot considerar que la resta d’embrions<br />
possiblement afectats per l’extracte de l’esponja no s’han pogut dividir comportant<br />
també apoptosi. Si aquesta teoria es vàlida, al llarg dels temps posteriors quedaran<br />
demostrades les <strong>propietats</strong> antimitòtiques extremadament brusques dels components de
l’esponja Chordrosia reniformis ja que, a diferència del Vincrisul, no permet ni les<br />
primeres divisions portades a terme per l’òvul. Això suggeriria un mètode d’actuació<br />
diferent al del Vincrisul.<br />
L’extracte de l’esponja 2 en canvi es manté en la línia d’actuació descrita fins a<br />
aquest moment. Conserva una alta proporció d’òvuls i una ínfima quantitat de zigots<br />
que tampoc evolucionen. El fet de no trobar formes embrionàries més desenvolupades<br />
ens indiquen que provablement els fluids de la segona esponja tampoc permeten la<br />
divisió cel·lular passats el primer estadi de dues cèl·lules. No obstant en aquest cas és<br />
convenient acabar d’observar-ne l’evolució.<br />
En aquest temps (passades sis hores) destaca l’estrany comportament del control, que no<br />
presenta cap mòrula com li correspondria, sinó que deixant a part els òvuls, una part va<br />
enrederida i la resta és aberrant. Amb tot cal apuntar que en aquest cas hi ha una manca<br />
de mostra considerable (només treballem amb 4 embrions ) i per tant els resultats no són<br />
del tot fiables. A més és important reconèixer certa ambigüitat en l’embrió,<br />
possiblement aberrant, que podria haver estat un embrió de 8 cèl·lules d’estadi avançat.<br />
El Vincrisul segueix accentuant la seva activitat antimitòtica i les aberracions<br />
continuen tenint un paper rellevant. Això gairebé permet assegurar que els embrions
sota l’efecte del Vincrisul quan arriben a l’estadi de vuit cèl·lules esdevenen aberrants i<br />
no segueixen el seu curs.<br />
En el cas de l’extracte de la primera esponja no trobem cap embrió el què<br />
confirma la hipòtesi d’apoptosi cel·lular i per tant corrobora la tesi d’aquest treball amb<br />
les demostrades <strong>propietats</strong> citostàtiques.<br />
En el de la segona esponja només trobem òvuls, fet que em porta a intuir que els<br />
embrions, la divisió dels quals s’havia aturat, han fet apoptosi. En aquest cas també<br />
podem afirmar que els fluids de la segona esponja (Crambe crambe) <strong>tenen</strong> <strong>propietats</strong><br />
antimitòtiques; però d’actuació molt més suau (segurament el seu mètode d’actuació és<br />
més semblant al del Vincrisul) que els components de l’altre esponja.<br />
<strong>Les</strong> mostres d’aquest temps ( deu hores després de l’inici de l’experiment) no<br />
con<strong>tenen</strong> cap embrió. Aquesta situació és fàcil d’explicar tenint en compte que són les<br />
primeres mostres que no les he pres del fons dels vasos de precipitats, sinó del mig (ja<br />
que segons els models de desenvolupament dels embrions consultats a partir d’aquest<br />
moment els embrions haurien d’estar en estat larval i tenir mobilitat pròpia) no obstant,<br />
observant les mostres del temps anterior es pot deduir que els embrions encara no han<br />
arribat a l’estat larval i estan a la part inferior dels recipients. Això ens induiria, en una
possible repetició de l’experiment, a prendre dues mostres (una al fons i una altre al<br />
mig) des del temps 5 per tal de poder veure també l’evolució dels altres medis.<br />
Concretament podem suposar que els embrions del control deuen ser mòrules<br />
que no <strong>tenen</strong> mobilitat pròpia i per tant resten al fons. Els del Vincrisul principalment<br />
aberrants també sense mobilitat pròpia o ja destruïdes per l’apoptosi a que porta<br />
l’aberració. Els sotmesos a l’extracte de la primera esponja, com en els punts anteriors<br />
ja he justificat, han fet apoptosi i els que no han fet apoptosi del extracte de la segona<br />
esponja en les fases anteriors eren principalment òvuls que també resten al fons.<br />
Aquest endarreriment en el procés segurament es deu a que els experiments que<br />
empraven embrions d’eriçons de mar comuns, i que he pres com a models alhora de<br />
determinar l’hora de cada presa de mostres, es feien sota una elevada temperatura (més<br />
de 20ºC) mentre que en aquest experiment s’ha treballat a una temperatura de menys de<br />
17ºC amb moments de més fred. Això també suposa que tots els temps s’han vist<br />
desplaçats, de manera que en certs intervals de temps no s’han pres mostres intermitges<br />
que haurien pogut ser interessants d’analitzar.<br />
En aquest gràfic s’adverteix només el control en què la totalitat dels embrions<br />
estan ja en estat larval. En aquest moment (24 hores des de l’inici de l’experiment)<br />
l’escassetat d’embrions és una dada important ja que verifica que s’ha efectuat<br />
correctament l’experiment i el control a seguit el procés adequat. L’estat d’aquestes
larves és molt inicial i segurament si també s’hagués pres una mostra de la part inferior<br />
del recipient del control s’haurien trobat molts més embrions en estats anteriors que no<br />
larves.<br />
També s’observen algunes malformacions esquelètiques segurament degudes a<br />
la poca maduresa de les gàmetes. Evidentment no hi ha cap embrió en els altres estat ja<br />
que degut a les <strong>propietats</strong> dels medis on es desenvolupen, no arribaran a un estadi amb<br />
moviment propi sinó que han patit o patiran apoptosi.<br />
<strong>Les</strong> mostres del temps 7 (48 hores des del inici del experiment) corroboren<br />
l’explicació anterior. Potser l’únic matís a tenir en compte és l’estadi una mica més<br />
avançat d’una de les larves.<br />
Aquesta fotos<br />
són dues larves<br />
del control a 400<br />
augments. La de<br />
l’esquerra és del<br />
temps 6 i l’altre<br />
del 7.<br />
Es pot apreciar<br />
una evolució ja que la segona està molt més desenvolupada, no obstant ambdues presenten algun<br />
problema esquelètic degut a que no <strong>tenen</strong> una simetria lateral completa possiblement fruit de la<br />
poca maduresa de les gàmetes.
6 CONCLUSIONS<br />
El control té una evolució satisfactòria, ja que els embrions arriben fins a l’estat<br />
larval. Això demostra que l’experiment s’ha dut a terme amb èxit i que per tant els<br />
resultats a què s’han arribat són vàlids.<br />
Els resultats del experiment confirmen la nostra hipòtesi; els components<br />
químics alliberats per ambdues <strong>esponges</strong> són de caràcter antimitòtic. Concretament en<br />
les dosis utilitzades, sembla que les dues <strong>esponges</strong> <strong>tenen</strong> substàncies de <strong>propietats</strong><br />
antimitòtiques molt més agressives i contundents que el Vincrisul. Aquest fet suggereix<br />
que provablement les <strong>esponges</strong> <strong>tenen</strong> un mètode d’actuació diferent al del Vincrisul.<br />
Aquest afecta els microtúbuls i, per tant, la repartició del material genètic. Però, sembla<br />
que tot i presentar una distribució anòmala del material genètic, l’embrió pot<br />
evolucionar fins a l’estadi de quatre cèl·lules, ja que, en les primeres divisions l’òvul<br />
domina el procés amb certa independència del material genètic. Tot i això, a partir de<br />
l’estat de quatre cèl·lules el material genètic es fa indispensable i les malformacions<br />
efectuades pel Vincrisul porten a l’aberració i conseqüent apoptosi de les cèl·lules de<br />
l’embrió.<br />
Contràriament l’efecte de les <strong>esponges</strong> és molt més abrupte, els components de<br />
la primera Chondrosia reniformis sembla que no permeten ni la primera divisió, sinó<br />
que directament produeixen aberracions o aturen la divisió portant en ambdós casos a<br />
l’apoptosi cel·lular. L’efecte dels components de l’esponja Crambe crambe és una mica<br />
més suau que l’anterior, tot i que més contundent que el Vincrisul en les dosis<br />
utilitzades. Amb tota probabilitat permet l’estadi de dues cèl·lules a partir del qual els<br />
embrions no cursen sinó que pateixen apoptosi.<br />
A més, també és important esmentar que en els medis amb extracte d’esponja la<br />
fecundació és molt baixa fet que ens indueix a pensar que les substàncies que estem
estudiant <strong>tenen</strong> <strong>propietats</strong> tòxiques a més d’antimitòtiques; sobretot en l’esponja<br />
Crambe crambe.<br />
En el cas d’una repetició de l’experiment, s’hauria de tenir en comte alguns<br />
aspectes: utilitzar eriçons suficientment madurs (això reduiria la gran quantitat d’òvuls<br />
sense fecundar i possiblement evitaria les malformacions esquelètiques de les larves);<br />
prendre dues mostres (una al fons i una altre al mig) a partir de que els embrions del<br />
control tinguin mobilitat pròpia; i tenir en compte per a la presa de mostres, que a una<br />
temperatura inferior als 20ºC l’evolució dels embrions és molt més lenta .<br />
També val a dir, que seguint la línia d’aquest treball seria molt interessant<br />
determinar amb exactitud les molècules que <strong>tenen</strong> les esmentades <strong>propietats</strong><br />
antimitòtiques i sobretot comprovar el seu comportament en cultius cel·lulars. Per tal<br />
que potser en un futur aquestes substàncies poguessin ser utilitzades com a<br />
medicaments anticancerígens. Aquesta possibilitat ens dóna una visió nova del nostre<br />
planeta en què la preservació de la biodiversitat del nostre entorn no només és un deure<br />
moral, sinó una possible garantia de supervivència davant de les malalties actuals i<br />
futures.
7 BIBLIOGRAFIA<br />
Adreces d’Internet:<br />
http://es.geocities.com/paleontofilo/equino6.gif<br />
http://www.chez.com/biologypassion/horia/urchin/paracentrotus.jpg<br />
http://www.farmaciasahumada.cl/stores/fasa/html/Mft/producto/p3554.htm<br />
http://www.infomed.sld.cu/revistas/onc/vol14_2_98/onc07298.htm<br />
http://www.cnio.es./es/cancer/cap105.htm<br />
http://fai.unne.edu.ar/biologia/images/diagrep_1.gif<br />
http://www.scienzemfn.uniroma1.it/uzi/IJZ/64-4.htm<br />
http://enciclopedia-catalana.com<br />
http://www.roche.com/pages/facets/9/onke.htm<br />
http://sigremar.cesga.es/erizodin.html<br />
http://www.nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf?file=/nrc/journal/v3/n9/abs/nrc1168_fs.html<br />
http://www.pharmamar.com/es/about/faq.cfm<br />
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/oursinMDC/index.html<br />
http://www.canal-h.net/webs/sgonzalez002/Biologia/POR%CDFERS.htm<br />
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/oursinMDC/index.html<br />
http://fai.unne.edu.ar/biologia/images/diagrep_1.gif<br />
http://marenostrum.org/vidamarina/animalia/invertebrados/esponjas/ccrambe/<br />
http://www.canal-h.net/webs/sgonzalez002/Biologia/NIVELORG.htm<br />
http://waste.ideal.es/especies48.html<br />
http://reo.nii.ac.jp/journal/HtmlIndicate/Contents<br />
http://www.sre.urv.es/formacio/fmcs/Farmacologia<br />
Llibres:<br />
- Gómez, J.M. et al., Barcelona (1999). Ed. Cruïlla, BIOLOGIA CIÈNCIES DE LA<br />
NATURALESA I SALUT.<br />
- Altaba, C.R. et al., Barcelona (1991). Enciclopèdia Catalana S. A.<br />
INVERTEBRATS NO ARTRÒPODES. HISTÒRIA NATURAL DEL PAÏSOS<br />
CATALANS. VOL. 8.<br />
- Hickman, C.P., Roberts, L.S., Madrid (1994). LLOC, Mc graw-hill Interamericana<br />
de EspaZa S.A, ZOOLOGIA- PRINICIPIOS INTEGRALES<br />
- Media-medicom, Madrid, (1991). Medimedia-medicom S.A. , VADÉMECUM