Validación de métodos y determinación de la incertidumbre
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<strong>Validación</strong> <strong>de</strong> <strong>métodos</strong><br />
y <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
<strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> medición:<br />
“Aspectos generales sobre <strong>la</strong><br />
validación <strong>de</strong> <strong>métodos</strong>”
• Comité Editor<br />
Boris Duffau<br />
Fabio<strong>la</strong> Rojas<br />
Isabel Guerrero<br />
Luis Roa<br />
Luis Rodríguez<br />
Marcelo Soto<br />
Marisol Aguilera<br />
Soraya Sandoval<br />
“Se agra<strong>de</strong>ce <strong>la</strong> co<strong>la</strong>boración prestada por el Sr. Leonardo Merino <strong>de</strong> <strong>la</strong> National Food<br />
Administration <strong>de</strong> Suecia, para <strong>la</strong> e<strong>la</strong>boración <strong>de</strong> esta Guía”<br />
• Coordinación Edición<br />
Soraya Sandoval<br />
Sección Metrología Ambiental y <strong>de</strong> Alimentos<br />
Departamento <strong>de</strong> Salud Ambiental<br />
• Edición<br />
Año 2010<br />
Santiago, Diciembre <strong>de</strong> 2010.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 1
I: INTRODUCCION<br />
El Instituto <strong>de</strong> Salud Pública <strong>de</strong> Chile, como Laboratorio Nacional y <strong>de</strong> Referencia co<strong>la</strong>bora<br />
continuamente con <strong>la</strong> Red <strong>de</strong> Laboratorios <strong>de</strong>l Ambiente <strong>de</strong> <strong>la</strong>s SEREMIs <strong>de</strong> Salud.<br />
La presente guía tiene como objetivo, entregar recomendaciones a los <strong>la</strong>boratorios para realizar<br />
<strong>la</strong> validación <strong>de</strong> los <strong>métodos</strong> analíticos e introducir a estos en el concepto <strong>de</strong> <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong><br />
<strong>la</strong> medición.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 2
CONTENIDO<br />
I: INTRODUCCION 2<br />
II: TERMINOLOGÍA 4<br />
II: ESTADISTICA BASICA 8<br />
IV: VALIDACION 21<br />
A) establecer p<strong>la</strong>n <strong>de</strong> validación 24<br />
B) Desarrollo <strong>de</strong> pruebas <strong>de</strong> parámetros <strong>de</strong> validación 25<br />
C) Evaluación <strong>de</strong> resultados <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación 25<br />
D) Informe <strong>de</strong> validación 26<br />
SELECTIVIDAD 27<br />
LINEALIDAD 28<br />
SENSIBILIDAD 33<br />
LIMITES 34<br />
EXACTITUD 37<br />
ROBUSTEZ 45<br />
APLICABILIDAD 49<br />
V: INCERTIDUMBRE 50<br />
VI: ANEXOS 54<br />
VII: BIBLIOGRAFÍA 66<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 3
II: TERMINOLOGÍA:<br />
A<strong>de</strong>cuación al propósito: Es el grado en que <strong>la</strong> aplicabilidad <strong>de</strong> un método se ajusta a los criterios o<br />
requerimientos acordados entre el analista y el usuario final (cliente) que hace uso <strong>de</strong> los informes o<br />
datos generados a través <strong>de</strong> un método <strong>de</strong> ensayo. Es <strong>de</strong>cir es <strong>la</strong> adaptación <strong>de</strong> un método para un fin<br />
previsto.<br />
Analito: Sustancia (química, física o biológica) buscada o <strong>de</strong>terminada en una muestra, que <strong>de</strong>be ser<br />
recuperada, <strong>de</strong>tectada o cuantificada por el método.<br />
Aplicabilidad: Los analitos, matrices y concentraciones para los cuales pue<strong>de</strong> utilizarse<br />
satisfactoriamente un método <strong>de</strong> análisis con el fin <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar su conformidad con una norma.<br />
(Referencia: Manual Co<strong>de</strong>x Alimentarius 16º Ed.)<br />
Nota: La <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración <strong>de</strong> aplicabilidad (ámbito o campo <strong>de</strong> aplicación), a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> una <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración<br />
<strong>de</strong>l margen <strong>de</strong> funcionamiento satisfactorio para cada factor, pue<strong>de</strong> incluir también advertencias<br />
acerca <strong>de</strong> <strong>la</strong> interferencia conocida <strong>de</strong> otros analitos, o <strong>de</strong> <strong>la</strong> inaplicabilidad a <strong>de</strong>terminadas<br />
matrices y situaciones. (Referencia: Manual Co<strong>de</strong>x Alimentarius 18º Ed.)<br />
B<strong>la</strong>nco matriz: Matriz que no contiene el analito <strong>de</strong> interés u objetivo para el método seleccionado.<br />
Calibración: Operación que, en condiciones especificadas, establece primero una re<strong>la</strong>ción entre los<br />
valores con <strong>incertidumbre</strong>s <strong>de</strong> medición proporcionados por <strong>la</strong>s normas <strong>de</strong> medición y <strong>la</strong>s indicaciones<br />
correspondientes con <strong>la</strong>s <strong>incertidumbre</strong>s <strong>de</strong> medición asociadas, y utiliza luego esta información para<br />
establecer una re<strong>la</strong>ción a fin <strong>de</strong> obtener un resultado <strong>de</strong> medición a partir <strong>de</strong> una indicación.<br />
(Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
Nota1 : La calibración se pue<strong>de</strong> expresar por medio <strong>de</strong> una <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración, una función, un diagrama,<br />
una curva o una tab<strong>la</strong>. En algunos casos pue<strong>de</strong> consistir en una corrección aditiva o multiplicativa<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> indicación con <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong> medición asociada. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
Nota 2: La calibración no <strong>de</strong>be confundirse con el ajuste <strong>de</strong> un sistema <strong>de</strong> medición que a menudo<br />
se <strong>de</strong>nomina erróneamente “autocalibración”, ni tampoco con <strong>la</strong> verificación <strong>de</strong> <strong>la</strong> calibración.<br />
A menudo se percibe como calibración so<strong>la</strong>mente el primer paso mencionado en <strong>la</strong> <strong>de</strong>finición<br />
anterior. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
Es <strong>de</strong>cir, es un procedimiento <strong>de</strong> comparación entre lo que indica un instrumento y su "valor<br />
verda<strong>de</strong>ro" <strong>de</strong> acuerdo a un patrón <strong>de</strong> referencia con valor conocido.<br />
Componente <strong>de</strong> <strong>la</strong> Incertidumbre: Cada una <strong>de</strong> <strong>la</strong>s contribuciones a <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong>.<br />
Criterios <strong>de</strong> aceptabilidad: Exigencias <strong>de</strong> una característica <strong>de</strong> funcionamiento o comportamiento en<br />
función <strong>de</strong> <strong>la</strong>s cuales se pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar que un método analítico es a<strong>de</strong>cuado para <strong>la</strong> finalidad<br />
perseguida y ofrece resultados confiables.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 4
Ensayo: Operación técnica realizada <strong>de</strong> acuerdo a un procedimiento especifico, que consiste en <strong>la</strong><br />
<strong>de</strong>terminación cualitativa y/o cuantificación <strong>de</strong> una o más características (propieda<strong>de</strong>s o analitos) en un<br />
<strong>de</strong>terminado producto, proceso o servicio.<br />
Error aleatorio: Es aquel error inevitable que se produce por eventos únicos imposibles <strong>de</strong> contro<strong>la</strong>r<br />
durante el proceso <strong>de</strong> medición. Se contrapone al concepto <strong>de</strong> error sistemático. Las fuentes <strong>de</strong> los<br />
errores aleatorios son difíciles <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificar o sus efectos no pue<strong>de</strong>n corregirse <strong>de</strong>l todo. Son<br />
numerosos y pequeños. Este error ocurre o esta dado por el azar. Ejemplo: Errores <strong>de</strong> apreciación, tales<br />
como el para<strong>la</strong>je, que <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong>l observador y su capacidad en cuanto al límite separador <strong>de</strong>l ojo.<br />
Error Sistemático: Es aquel que se produce <strong>de</strong> igual modo en todas <strong>la</strong>s mediciones que se realizan <strong>de</strong><br />
una magnitud. El error sistemático esta condicionado por algún factor distinto al azar. Ejemplo: el error<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong>s masas patrón <strong>de</strong>l <strong>la</strong>boratorio se transfiere sistemáticamente al momento <strong>de</strong> calibrar <strong>la</strong> ba<strong>la</strong>nza.<br />
El VIM, lo <strong>de</strong>fine como componente <strong>de</strong>l error <strong>de</strong> medición que al reiterar <strong>la</strong>s mediciones se mantiene<br />
constante o bien varia <strong>de</strong> manera pre<strong>de</strong>cible.<br />
Idoneidad para el fin previsto: La medida en que los datos obtenidos en un proceso <strong>de</strong> medición<br />
permiten al usuario adoptar <strong>de</strong>cisiones correctas, tanto <strong>de</strong>s<strong>de</strong> el punto <strong>de</strong> vista técnico como<br />
administrativo, para alcanzar un fin establecido.<br />
Incertidumbre: Parámetro asociado al resultado <strong>de</strong> una medición que caracteriza <strong>la</strong> dispersión <strong>de</strong> los<br />
valores que podrían razonablemente ser atribuidos al mensurando.<br />
Incertidumbre <strong>de</strong> <strong>la</strong> medición: Parámetro no negativo que caracteriza <strong>la</strong> dispersión <strong>de</strong> <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong><br />
valores que se atribuyen a una mensurando, basándose en <strong>la</strong> información utilizada. (Referencia: VIM,<br />
JCGM 200:2008)<br />
Nota: La <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong> medición compren<strong>de</strong>, en general, muchos componentes. Algunos <strong>de</strong><br />
estos pue<strong>de</strong>n ser evaluados por tipo <strong>de</strong> una evaluación <strong>de</strong>: <strong>la</strong> distribución estadística <strong>de</strong> <strong>la</strong> cantidad<br />
<strong>de</strong> valores <strong>de</strong> una serie <strong>de</strong> mediciones y se pue<strong>de</strong>n caracterizar por <strong>la</strong>s <strong>de</strong>sviaciones.<br />
Intervalo <strong>de</strong> trabajo: Es el intervalo entre el nivel más bajo y más alto <strong>de</strong> concentración que ha sido<br />
<strong>de</strong>mostrado que pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>terminado con <strong>la</strong> precisión y exactitud requeridas para una <strong>de</strong>terminada<br />
matriz.<br />
Limite máximo permitido (LMP): Nivel máximo o tolerancia establecida para un analito en una<br />
reg<strong>la</strong>mentación.<br />
Limite máximo Residual (LMR): Concentración máxima <strong>de</strong> residuos <strong>de</strong> una sustancia (p<strong>la</strong>guicida o<br />
medicamento) que se permite legalmente su uso en <strong>la</strong> superficie o parte interna <strong>de</strong> un producto<br />
alimenticio.<br />
Matriz: Es el tipo <strong>de</strong> sustancia compuesta (liquida, sólida, gaseosa) que pue<strong>de</strong> o no contener al analito<br />
<strong>de</strong> interés, ejemplo: matriz <strong>de</strong> alimento, matriz ambiental, etc.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 5
Material <strong>de</strong> Referencia Certificado (MRC): Material <strong>de</strong> referencia acompañado <strong>de</strong> documentación,<br />
emitida por un órgano autorizado, en <strong>la</strong> que se indican uno a más valores <strong>de</strong> propieda<strong>de</strong>s especificadas<br />
así como <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> y rastreabilidad asociadas, con el uso <strong>de</strong> procedimientos válidos. (Referencia:<br />
VIM, JCGM 200:2008)<br />
Es <strong>de</strong>cir, es un material <strong>de</strong> referencia, al que se le ha asignado un contenido <strong>de</strong> analito especificado<br />
en un certificado a través <strong>de</strong> un método trazable.<br />
Material <strong>de</strong> Referencia (MR): Material suficientemente homogéneas y estables con propieda<strong>de</strong>s<br />
especificadas, que se ha establecido es idóneo para uso en <strong>la</strong> medición o en el análisis <strong>de</strong> <strong>la</strong>s<br />
propieda<strong>de</strong>s nominales. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
Nota: Material homogéneo que tiene <strong>de</strong>finidas sus propieda<strong>de</strong>s, a través <strong>de</strong> un método validado<br />
que pue<strong>de</strong> usarse para fines analíticas (calibración <strong>de</strong> equipos, comprobación <strong>de</strong> un método, etc.).<br />
Mensurando: Cantidad <strong>de</strong>stinada a <strong>la</strong> medida. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
Método <strong>de</strong> ensayo validado: Método <strong>de</strong> ensayo aceptado para el que se han llevado a cabo estudios<br />
<strong>de</strong> validación (<strong>de</strong>sempeño) con el fin <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar su precisión y fiabilidad para un propósito<br />
específico. (Referencia: ICCVAM Gui<strong>de</strong>lines for the nomination and submission of new, revised and<br />
alternative test methods, 2003).<br />
Método oficial: Es el método especificado por los organismos reg<strong>la</strong>mentarios <strong>de</strong> un país, con fines <strong>de</strong><br />
aplicaciones <strong>de</strong> normas (ejemplo; reg<strong>la</strong>mento sanitario <strong>de</strong> alimentos) o estipu<strong>la</strong>dos por organizaciones<br />
comerciales (Referencia: FAO).<br />
Método normalizado: Método apropiado para el ensayo <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> su alcance, publicado por<br />
organismos <strong>de</strong> normalización internacional, nacional o regional (ISO, EN, NM, ASTM, BS, DIN, IRAM,<br />
etc.) o por organizaciones reconocidas en diferentes ámbitos ( AOAC, FIL-IDF, EPA, USP etc.)<br />
Método cualitativo: Método que permite <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> presencia o ausencia <strong>de</strong> un analito en una<br />
muestra o matriz.<br />
Método cuantitativo: Método que permite <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> un analito presente en una<br />
muestra o matriz.<br />
Metrología: Ciencia <strong>de</strong> <strong>la</strong> medición y su aplicación. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008), es <strong>de</strong>cir, es <strong>la</strong><br />
ciencia <strong>de</strong> <strong>la</strong>s mediciones o campo <strong>de</strong> los conocimientos re<strong>la</strong>tivos a <strong>la</strong>s mediciones. Incluye cualquier<br />
tipo <strong>de</strong> medición <strong>de</strong>l campo científico o tecnológico.<br />
Nivel: Es <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> una sustancia <strong>de</strong> interés en una solución estándar o matriz..<br />
generalmente, se hab<strong>la</strong> en términos <strong>de</strong> nivel <strong>de</strong> concentración.<br />
P<strong>la</strong>n <strong>de</strong> <strong>Validación</strong>: Documento tipo protocolo en el cual se <strong>de</strong>finen <strong>la</strong>s pruebas o parámetros <strong>de</strong><br />
validación necesarios y el diseño experimental a <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r en base a los requerimientos <strong>de</strong>l método.<br />
Requerimiento <strong>de</strong>l método: Correspon<strong>de</strong> a aquel<strong>la</strong>s características <strong>de</strong>l <strong>métodos</strong> que son esenciales<br />
para po<strong>de</strong>r aplicarlo para el fin previsto. Cuando no están establecidas por el cliente o usuario, <strong>de</strong>be<br />
<strong>de</strong>finir<strong>la</strong>s el responsable <strong>de</strong>l ensayo <strong>de</strong> manera confiable y científica.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 6
Resolución: Parámetro cromatográfico que permite <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> capacidad <strong>de</strong> separación entre 2<br />
picos, <strong>de</strong> manera que se puedan diferenciar a<strong>de</strong>cuadamente <strong>de</strong> <strong>la</strong> cromatografía los analitos <strong>de</strong> interés.<br />
Resultado <strong>de</strong> un ensayo (X): El valor final notificado <strong>de</strong> una cantidad medida o calcu<strong>la</strong>da, tras aplicar un<br />
procedimiento <strong>de</strong> medición, incluidos todos los procedimientos secundarios y <strong>la</strong>s evaluaciones.<br />
(Referencia: Manual Co<strong>de</strong>x Alimentarius 16º Ed.)<br />
Sistema Internacional <strong>de</strong> Unida<strong>de</strong>s (SI): Sistema <strong>de</strong> unida<strong>de</strong>s, basado en el Internacional Sistema <strong>de</strong><br />
cantida<strong>de</strong>s, sus nombres y símbolos, incluyendo una serie <strong>de</strong> prefijos y sus nombres y símbolos, así<br />
como <strong>la</strong>s normas para su uso, aprobada por <strong>la</strong> Conferencia General <strong>de</strong> Pesas y Medidas (CGPM).<br />
(Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
Sub-muestra: Porción <strong>de</strong> una muestra para análisis.<br />
Testigo reactivo o b<strong>la</strong>nco: Es <strong>la</strong> solución que contiene todos los reactivos usados en los mismos<br />
volúmenes y concentraciones, que son utilizados en el procesamiento <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra. Este b<strong>la</strong>nco <strong>de</strong>be<br />
seguir todos los pasos indicados en <strong>la</strong> técnica y ayuda a <strong>de</strong>tectar trazas <strong>de</strong> contaminación provenientes<br />
<strong>de</strong>l material o reactivos usados.<br />
Trazabilidad metrológica: Propiedad <strong>de</strong> un resultado <strong>de</strong> medición, mediante el cual el resultado pue<strong>de</strong><br />
estar re<strong>la</strong>cionado con una referencia a través <strong>de</strong> un ca<strong>de</strong>na continua y documentada <strong>de</strong> calibraciones,<br />
cada que contribuyen a <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong> medición. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
Propiedad <strong>de</strong>l resultado <strong>de</strong> una medición o <strong>de</strong>l valor con su <strong>incertidumbre</strong>, que pue<strong>de</strong> a través <strong>de</strong><br />
una ca<strong>de</strong>na ininterrumpida <strong>de</strong> comparación re<strong>la</strong>cionarse a una referencia establecida,<br />
generalmente patrones <strong>de</strong> referencia nacionales o internacionales. (Referencia: IUPAC-<br />
Nomenc<strong>la</strong>ture In Evaluation Of Analytical Methods Including Detection And Quantification<br />
Capabilities).<br />
<strong>Validación</strong>: Verificación <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminados parámetros <strong>de</strong> un método en <strong>la</strong> que los requisitos<br />
especificados para estos, <strong>de</strong>muestran que el método es idóneo para un uso previsto. (Referencia: VIM,<br />
International Vocabu<strong>la</strong>ry for Basic and General Terms in Metrology: 2007)<br />
Valor verda<strong>de</strong>ro: El grado <strong>de</strong> concordancia entre <strong>la</strong> media <strong>de</strong> un número infinito <strong>de</strong> valores reiterados<br />
<strong>de</strong> cantidad y un valor <strong>de</strong> cantidad <strong>de</strong> referencia.<br />
Veracidad: El grado <strong>de</strong> concordancia entre <strong>la</strong> expectativa re<strong>la</strong>tiva al resultado <strong>de</strong> un ensayo o <strong>de</strong> una<br />
medición y el valor verda<strong>de</strong>ro. (Referencia: Manual Co<strong>de</strong>x Alimentarius 18º Ed.)<br />
Valor <strong>de</strong> Referencia: Valor cuantitativo que se utiliza como base para <strong>la</strong> comparación con valores<br />
cuantitativos <strong>de</strong>l mismo tipo. (Referencia: VIM, International Vocabu<strong>la</strong>ry for Basic and General Terms in<br />
Metrology: 2007)<br />
Verificación: Suministro <strong>de</strong> prueba(s) objetiva(s) <strong>de</strong> que un elemento dado satisface el (los) requisito(s)<br />
especificado(s) . (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
Es <strong>de</strong>cir, es <strong>la</strong> comprobación experimental <strong>de</strong> que un método establecido funciona <strong>de</strong> acuerdo con<br />
<strong>la</strong>s especificaciones, en <strong>la</strong>s condiciones disponibles en el <strong>la</strong>boratorio usuario. Se entien<strong>de</strong> como<br />
verificación a <strong>la</strong>s pruebas realizadas por un <strong>la</strong>boratorio en <strong>la</strong> rutina <strong>de</strong> trabajo que permiten<br />
comprobar y documentar <strong>la</strong> aplicabilidad y uso a<strong>de</strong>cuado <strong>de</strong>l método por parte <strong>de</strong>l <strong>la</strong>boratorio.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 7
II: ESTADISTICA BASICA<br />
Para los fines <strong>de</strong> una validación, se utilizan normalmente ciertas mediciones estadísticas, que nos<br />
ayudan a establecer si el método se encuentra <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un parámetro aceptable, normalmente se<br />
<strong>de</strong>terminan <strong>la</strong>s siguientes:<br />
Media: Conocida también como media aritmética o promedio, es <strong>la</strong> cantidad total <strong>de</strong> <strong>la</strong> variable<br />
(muestra o medida) distribuida a partes iguales entre cada observación. En términos matemáticos, es<br />
igual a <strong>la</strong> suma <strong>de</strong> todos sus valores dividida entre el número <strong>de</strong> sumandos<br />
Siendo:<br />
xi = valor <strong>de</strong> una lectura.<br />
n = número <strong>de</strong> lecturas<br />
X = n Σ xi<br />
n<br />
Desviación estándar (σ, S): Es el promedio <strong>de</strong> lejanía <strong>de</strong> los valores obtenidos (lecturas) respecto <strong>de</strong>l<br />
promedio.<br />
Siendo:<br />
xi = valor <strong>de</strong> una lectura.<br />
X= promedio <strong>de</strong> <strong>la</strong> totalidad <strong>de</strong> lecturas.<br />
n = número <strong>de</strong> lecturas<br />
S = √ n Σ i=1 (xi-X) 2<br />
n-1<br />
Coeficiente <strong>de</strong> Variación (CV): Desviación estándar dividida por <strong>la</strong> media. También es conocida como<br />
<strong>de</strong>sviación estándar re<strong>la</strong>tiva (RSD). El coeficiente <strong>de</strong> variación pue<strong>de</strong> ser expresado en porcentaje:<br />
%CV = S x100<br />
X<br />
Siendo:<br />
S = <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> <strong>la</strong>s lecturas.<br />
X = promedio <strong>de</strong> <strong>la</strong> totalidad <strong>de</strong> lecturas.<br />
Varianza: Es una medida <strong>de</strong> dispersión <strong>de</strong>finida como el cuadrado <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>sviación estándar.<br />
Siendo:<br />
xi = valor <strong>de</strong> una lectura.<br />
X= promedio <strong>de</strong> <strong>la</strong> totalidad <strong>de</strong> lecturas.<br />
n = número <strong>de</strong> lecturas<br />
S 2 = n Σ i=1 (xi-X) 2<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 8<br />
n-1
Coeficiente <strong>de</strong> Variación <strong>de</strong> Horwitz (CV h): Es el coeficiente <strong>de</strong> variación <strong>de</strong>finido por W. Horwitz, a<br />
través <strong>de</strong> <strong>la</strong> ecuación obtenida <strong>de</strong> un estudio estadístico. En dicho estudio, Horwitz <strong>de</strong>spués <strong>de</strong> reunir<br />
una serie <strong>de</strong> datos (provenientes <strong>de</strong> 150 ensayos <strong>de</strong> inter<strong>la</strong>boratorios organizados por AOAC), observó<br />
que el coeficiente <strong>de</strong> variación <strong>de</strong> los valores medios dados por los diferentes <strong>la</strong>boratorios aumentaban<br />
a medida que disminuía <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong>l analito. Comportándose como muestra <strong>la</strong> siguiente<br />
gráfica, conocida como <strong>la</strong> trompeta <strong>de</strong> Horwitz.<br />
La ecuación <strong>de</strong> Horwitz, esta <strong>de</strong>finida como:<br />
CVh = 2 (1-0.5.log c) ó σH = 0.02 x c 0,8495<br />
Dón<strong>de</strong>:<br />
CV h= Coeficiente <strong>de</strong> variación <strong>de</strong> Horwitz<br />
σ H = Desviación estándar calcu<strong>la</strong>da conforme al mo<strong>de</strong>lo <strong>de</strong> precisión <strong>de</strong> Horwitz.<br />
C= concentración <strong>de</strong>l analito expresado en potencia <strong>de</strong> 10 (Ver tab<strong>la</strong> Nº 1).<br />
Este coeficiente <strong>de</strong> variación (CVh) esta expresado en potencia <strong>de</strong> 2, y <strong>la</strong> concentración media <strong>de</strong>l<br />
analito expresado como potencia <strong>de</strong> 10, <strong>de</strong> esta forma in<strong>de</strong>pendiente <strong>de</strong>l analito y el método utilizado<br />
se pue<strong>de</strong> estimar el CV esperado para <strong>la</strong> precisión.<br />
Tab<strong>la</strong> Nº 1:<br />
Concentración Razón<br />
(Potencia <strong>de</strong> 10)<br />
Unidad<br />
100 1 100% (100 g/100 g)<br />
> 10 10 -1 > 10 % (10 g/100 g)<br />
> 1 10 -2<br />
> 1 % (1 g/100g)<br />
> 0,1 10 -3<br />
> 0,1 % (1 mg/g ó 0,1 g/100 g)<br />
0,01 10 -4<br />
100 mg/kg<br />
0,001 10 -5<br />
10 mg/Kg<br />
0,0001 10 -6<br />
1 mg/Kg<br />
0,00001 10 -7<br />
100 μg/Kg<br />
0,000001 10 -8<br />
10 μg/Kg<br />
0,0000001 10 -9<br />
1 μg/Kg<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 9
Distribución Normal: Distribución continua conocida también como distribución Gaussiana, <strong>la</strong><br />
distribución <strong>de</strong> una variable normal está completamente <strong>de</strong>terminada por dos parámetros, su media y<br />
su <strong>de</strong>sviación estándar, <strong>de</strong>notadas generalmente por y . La distribución normal se caracteriza por<br />
tener una única moda, que coinci<strong>de</strong> con su media y su mediana. Su expresión grafica es una curva<br />
normal, cuya forma es simi<strong>la</strong>r a los histogramas con forma <strong>de</strong> campana, es conocida como campana <strong>de</strong><br />
gauss que es simétrica respecto a su media y asintótica al eje <strong>de</strong> abscisas, esto hace que cualquier valor<br />
entre y es teóricamente posible. El área total bajo <strong>la</strong> curva es, por tanto, igual a 1. Para este<br />
tipo <strong>de</strong> variables existe una probabilidad <strong>de</strong> un 50% <strong>de</strong> observar un dato mayor que <strong>la</strong> media, y un 50%<br />
<strong>de</strong> observar un dato menor.<br />
- 3σ - 2σ -σ μμμμ +σ +2σ +3σ<br />
• La probabilidad <strong>de</strong> que Xo caiga en el intervalo comprendido entre μ+ σ es aproximadamente 0,687<br />
ó 68,27%.<br />
• La probabilidad <strong>de</strong> que Xo caiga en el intervalo comprendido entre μ + 2σ es aproximadamente<br />
0,9545 ó 95,45%.<br />
• La probabilidad <strong>de</strong> que Xo caiga en el intervalo comprendido entre μ + 3σ es aproximadamente<br />
0,9973 ó 99,73%.<br />
Nivel <strong>de</strong> significancia (Alfa, α): Es el nivel <strong>de</strong> significación utilizado para calcu<strong>la</strong>r el nivel <strong>de</strong> confianza. El<br />
nivel <strong>de</strong> confianza es igual a 100% (1 - α), es <strong>de</strong>cir, un alfa (α) <strong>de</strong> 0,05 indica un nivel <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong><br />
95%.<br />
Factor <strong>de</strong> cobertura: Número mayor que uno por lo que una combinación <strong>de</strong> <strong>incertidumbre</strong> en <strong>la</strong><br />
medición estándar se multiplica a obtener una <strong>incertidumbre</strong> expandida <strong>de</strong> medida. Un factor <strong>de</strong><br />
cobertura suele ser simbolizada k. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 10
Pruebas <strong>de</strong> Significancia<br />
Es frecuente utilizar pruebas <strong>de</strong> significancia estadísticas durante el proceso <strong>de</strong> validación <strong>de</strong> los <strong>métodos</strong><br />
analíticos en este sentido, se aplican comúnmente <strong>la</strong>s siguientes:<br />
1. Prueba t- stu<strong>de</strong>nt para i<strong>de</strong>ntificar errores sistemáticos (sesgo).<br />
2. Prueba F-Fisher para i<strong>de</strong>ntificar errores aleatorios (precisiones).<br />
Al hacer una prueba <strong>de</strong> significancia se comprueba <strong>la</strong> veracidad <strong>de</strong> una hipótesis experimental, l<strong>la</strong>mada<br />
“hipótesis alternativa” (H1, si hay diferencia,) con respecto a <strong>la</strong> hipótesis nu<strong>la</strong> (H0, no hay diferencia).<br />
Es <strong>la</strong> hipótesis alternativa <strong>la</strong> que <strong>de</strong>termina el número <strong>de</strong> co<strong>la</strong>s. Si <strong>la</strong> hipótesis alternativa contiene <strong>la</strong><br />
frase “mayor que” ó “menor que”, <strong>la</strong> prueba es <strong>de</strong> una-co<strong>la</strong>. Si <strong>la</strong> hipótesis alternativa contiene <strong>la</strong> frase<br />
”no es igual que”, <strong>la</strong> prueba es <strong>de</strong> dos-co<strong>la</strong>s. (Fuente: National Food Administration of Swe<strong>de</strong>n)<br />
1. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “<strong>la</strong> media no es igual al valor dado” (H1:μ ≠ x0) dos-co<strong>la</strong>s<br />
2. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “<strong>la</strong> media es menor que el valor dado” (H1:μ < x0) una-co<strong>la</strong><br />
3. “La media es igual al valor dado” (H0: μ = x0) versus “<strong>la</strong> media es mayor que el valor dado” (H1:μ > x0) una-co<strong>la</strong><br />
Una forma practica <strong>de</strong> <strong>de</strong>cidir es respondiendo a dos preguntas:<br />
t-Test<br />
1. Son <strong>la</strong>s medias iguales? Dos-co<strong>la</strong>s<br />
2. Son <strong>la</strong>s medias diferentes (pue<strong>de</strong> una media ser mayor o menor a <strong>la</strong> otra)? Una-co<strong>la</strong><br />
F-Test<br />
1. Son <strong>la</strong>s varianzas diferentes? Dos-co<strong>la</strong>s<br />
2. Es <strong>la</strong> varianza 1 mayor que <strong>la</strong> varianza 2? Una-co<strong>la</strong><br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 11
Prueba t-Stu<strong>de</strong>nt<br />
Esta prueba permite comparar <strong>la</strong>s medias <strong>de</strong> dos grupo <strong>de</strong> datos y <strong>de</strong>terminar si entre estos parámetros<br />
<strong>la</strong>s diferencias son estadísticamente significativas.<br />
En <strong>la</strong> prueba t , se proce<strong>de</strong> a <strong>de</strong>terminar el valor t <strong>de</strong> stu<strong>de</strong>nt calcu<strong>la</strong>do, obtenido <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia<br />
analítica, y este valor posteriormente se compara con el l<strong>la</strong>mado valor crítico, este valor critico se obtiene<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> tab<strong>la</strong> <strong>de</strong> t-stu<strong>de</strong>nt para un <strong>de</strong>terminado porcentaje <strong>de</strong> confiabilidad (normalmente se utiliza el 95%<br />
<strong>de</strong> confianza, es <strong>de</strong>cir, un valor α <strong>de</strong> 0,05). Si no existen diferencias significativas entre 2 grupos, el t<br />
calcu<strong>la</strong>do <strong>de</strong>bería ser inferior al t critico (o conocido también como t <strong>de</strong> tab<strong>la</strong>).<br />
El siguiente ejemplo, trata <strong>de</strong> explicar <strong>la</strong> afirmación realizada anteriormente: Un atleta <strong>de</strong>sea realizar un<br />
salto con garrocha, para lo cual, él realiza un calculo <strong>de</strong> con que velocidad y con que fuerza (t calcu<strong>la</strong>do)<br />
<strong>de</strong>be realizar <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong> atletismo, a fin <strong>de</strong> saltar correctamente <strong>la</strong> altura establecida para <strong>la</strong><br />
competencia (t critico).<br />
Si el t calcu<strong>la</strong>do es inferior al t crítico, entonces, no existirá una diferencias significativa que permita<br />
superar al t critico, y el atleta no podrá realizar el salto.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 12
Si el valor t calcu<strong>la</strong>do es superior al t crítico, entonces, existirá una diferencia significativa que<br />
permitirá superar al t crítico, y el atleta podrá realizar el salto.<br />
Para explicar <strong>de</strong> mejor manera <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong> t-Stu<strong>de</strong>nt, hemos incluido los siguientes ejemplos:<br />
EJEMPLO 1: Prueba t-Stu<strong>de</strong>nt para 2 variables in<strong>de</strong>pendientes<br />
Se realiza el análisis <strong>de</strong> una muestra <strong>de</strong> flúor en agua bajo el método <strong>de</strong> cromatografía iónica en<br />
Laboratorio 1 y por EIS en Laboratorio 2. Los resultados obtenidos en mg/L <strong>de</strong> F - , fueron:<br />
Nivel Grupo/Experiencia<br />
Observaciones 1 2<br />
1 4,5 5,3<br />
2 5,2 6,8<br />
3 5,0 6,9<br />
4 6,4 7,1<br />
5 6,0 7,7<br />
6 7,1 ---<br />
Experiencia 1: n1=6 Media X1=5,70 Desviación estándar S1= 0,9716 grados <strong>de</strong> libertad gl1= 5<br />
Experiencia 2: n2=5 Media X2= 6,76 Desviación estándar S2 = 0,8877 grados <strong>de</strong> libertad gl2= 4<br />
Se <strong>de</strong>termina el valor t calcu<strong>la</strong>do (t calc):<br />
t calc = ⎢ X1 - X2 ⎢ .<br />
S1 2 (n1-1) + S2 2 (n2-1) . 1 + 1<br />
n1+ n2-2 n1 n2<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 13
t calc = ⎢ 5,70 - 6,76 ⎢ .<br />
(0,9716) 2 (6-1) + (0,8877) 2 (5-1) . 1 + 1<br />
6 + 5 - 2 6 5<br />
t calc = ⎢ -1,06 ⎢ .<br />
(0,93524) . (0,1667 + 0,2)<br />
t calc = 1,06 = 3,09.<br />
0,34292<br />
Se <strong>de</strong>sea <strong>de</strong>terminar si son iguales <strong>la</strong>s medias <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia 1 y 2. Para esto se proce<strong>de</strong> luego a<br />
<strong>de</strong>terminar el t critico en <strong>la</strong> tab<strong>la</strong> t-stu<strong>de</strong>nt para α=0,05.<br />
En <strong>la</strong> intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 2,262.<br />
2 co<strong>la</strong>s 80% 90% 95%<br />
αααα/2<br />
v<br />
0.10 0.05 0.025<br />
1 3.078 6.314 12.706<br />
2 1.886 2.920 4.303<br />
3 1.638 2.353 3.182<br />
4 1.533 2.132 2.776<br />
5 1.476 2.015 2.571<br />
6 1.440 1.943 2.447<br />
7 1.415 1.895 2.365<br />
8 1.397 1.860 2.306<br />
9 1.383 1.833 2.262<br />
10 1.372 1.812 2.228<br />
Se proce<strong>de</strong> a comparar el t crítico y el t calcu<strong>la</strong>do, t calc= 3,09.<br />
Se observa. t calc > t crit .Concluimos que existen diferencias significativas. Por lo cual el resultado se<br />
acepta.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 14
EJEMPLO 2: Prueba t-stu<strong>de</strong>nt para 2 variables corre<strong>la</strong>cionadas o pareadas<br />
Se realiza el análisis <strong>de</strong> una muestra <strong>de</strong> turbiedad en agua, el método utilizado es el turbidimétrico, <strong>la</strong><br />
experiencia se realiza en 2 días diferentes:<br />
Nivel Grupo/Experiencia<br />
Observaciones A B<br />
Experiencia : observaciones pareadas n=5<br />
Media X Δ= 2,8<br />
Desviación estándar S = 1,789<br />
grados <strong>de</strong> libertad gl= 4<br />
Se <strong>de</strong>termina el valor t calcu<strong>la</strong>do (t calc):<br />
1 4 3 1<br />
2 5 2 3<br />
3 6 1 5<br />
4 6 2 4<br />
5 4 3 1<br />
X Δ = Σ ( xA –xB) t calc = XΔ .<br />
n (S/√n)<br />
Se calcu<strong>la</strong>: X Δ = 1 +3 +5+ 4+1 = 2,8 y luego se <strong>de</strong>termina el t calcu<strong>la</strong>do;<br />
5<br />
t calc = ⎢2,8 ⎢ .= = 3,48<br />
1,789/ √5<br />
Se <strong>de</strong>sea <strong>de</strong>mostrar si existen diferencias significativas entre <strong>la</strong> experiencia A y B. Entonces, se proce<strong>de</strong><br />
luego a <strong>de</strong>terminar el t critico en <strong>la</strong> tab<strong>la</strong> t-stu<strong>de</strong>nt para α=0,05 para 2 co<strong>la</strong>s.<br />
En <strong>la</strong> intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 2,776.<br />
2 co<strong>la</strong>s 80% 90% 95%<br />
αααα/2<br />
v<br />
0.10 0.05 0.025<br />
1 3.078 6.314 12.706<br />
2 1.886 2.920 4.303<br />
3 1.638 2.353 3.182<br />
4 1.533 2.132 2.776<br />
5 1.476 2.015 2.571<br />
Se proce<strong>de</strong> a comparar el t crítico y el t calcu<strong>la</strong>do, t calc= 3,48. Se observa que t calc > t crit. Concluimos que<br />
existen diferencias significativas. Por lo cual no es aceptable.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 15<br />
x Δ
EJEMPLO 3: Prueba t-stu<strong>de</strong>nt para comparación <strong>de</strong> muestreal versus un valor <strong>de</strong> referencia<br />
Se analiza <strong>de</strong> un material <strong>de</strong> referencia certificado <strong>de</strong> hierro en cereal, se realizan 4 replicas, el método<br />
utilizado es absorción atómica l<strong>la</strong>ma, los resultados obtenidos en mg/Kg son:<br />
Observaciones Valor obtenido<br />
1 5,8<br />
2 6,1<br />
3 6,4<br />
4 6,2<br />
El valor asignado, informado en el certificado <strong>de</strong>l MRC es; μ = 6,3 mg/Kg<br />
Experiencia :<br />
Observaciones pareadas n=4 Media X = 6,05<br />
Desviación estándar S = 0,387 grados <strong>de</strong> libertad (ν o gl)= 3<br />
Se <strong>de</strong>termina el valor t calcu<strong>la</strong>do (t calc):<br />
t calc = X - μ .<br />
(S/√n)<br />
t calc = ⎢6,05 – 6,3 ⎢ .= = 1,292<br />
0,387/ √4<br />
Se proce<strong>de</strong> luego a <strong>de</strong>terminar el t critico en <strong>la</strong> tab<strong>la</strong> t-stu<strong>de</strong>nt para α=0,05.<br />
En <strong>la</strong> intersección se lee: valor crítico para t, que es t crit= 3,182.<br />
2 co<strong>la</strong>s 80% 90% 95%<br />
αααα/2<br />
v<br />
0.10 0.05 0.025<br />
1 3.078 6.314 12.706<br />
2 1.886 2.920 4.303<br />
3 1.638 2.353 3.182<br />
4 1.533 2.132 2.776<br />
Se proce<strong>de</strong> a comparar el t crítico y el t calcu<strong>la</strong>do, t calc= 1,292.<br />
Se observa que: t calc < t crit . Concluimos que no existen diferencias significativas. Por lo cual el<br />
resultado se acepta.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 16
Prueba F (<strong>de</strong> Fisher)<br />
Prueba en <strong>la</strong> que el estadístico utilizado sigue una distribución F si <strong>la</strong> hipótesis nu<strong>la</strong> no pue<strong>de</strong> ser<br />
rechazada. En estadística aplicada se prueban muchas hipótesis mediante el test F, entre el<strong>la</strong>s: La<br />
hipótesis nu<strong>la</strong>=Ho <strong>de</strong> que <strong>la</strong>s medias <strong>de</strong> múltiples pob<strong>la</strong>ciones normalmente distribuidas y con <strong>la</strong> misma<br />
<strong>de</strong>sviación estándar son iguales. Esta es, quizás, <strong>la</strong> más conocida <strong>de</strong> <strong>la</strong>s hipótesis verificada mediante el<br />
test F y el problema más simple <strong>de</strong>l análisis <strong>de</strong> varianza. Y <strong>la</strong> hipótesis <strong>de</strong> que <strong>la</strong>s <strong>de</strong>sviaciones estándar <strong>de</strong><br />
dos pob<strong>la</strong>ciones normalmente distribuidas son iguales.<br />
Para explicar <strong>de</strong> mejor manera <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong> Fischer, hemos incluido el siguiente ejemplo:<br />
Se realiza <strong>la</strong> medición <strong>de</strong> sulfatos en una muestra <strong>de</strong> agua en dos días diferentes.<br />
Nivel Grupo/Experiencia<br />
Observaciones 1 2<br />
1 C1,1 C2,1<br />
2 C1,2 C2,2<br />
3 C1,3 C2,3<br />
4 C1,4 C2,4<br />
5 C1,5 C2,5<br />
6 C1,6 C2,6<br />
7 C1,7 C2,7<br />
8 C1,8 C2,8<br />
9 C1,9 C2,9<br />
10 C1,10 C2,10<br />
11 -- C2,11<br />
12 -- C2,12<br />
13 -- C2,13<br />
14 -- C2,14<br />
Experiencia 1: n1=10 Media 1=14,9 Varianza 1= 26,4<br />
Experiencia 2: n2=14 Media 2= 16,2 Varianza 2 = 12,7<br />
Si se intenta un test <strong>de</strong> t-stu<strong>de</strong>nt con estos valores hay que verificar si <strong>la</strong>s 2 varianzas no son<br />
significativamente diferentes; por que si son diferentes, el test <strong>de</strong> t-stu<strong>de</strong>nt no podrá ser utilizado. ¿Que<br />
se hace?<br />
1) Determinar los grados <strong>de</strong> libertad <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia 1: n-1 = 10-1=9<br />
2) Determinar los grados <strong>de</strong> libertad <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia 1: n-2 = 14-1=13<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 17
3) Dividir <strong>la</strong> varianza más gran<strong>de</strong> por <strong>la</strong> más pequeña:<br />
F= Varianza mayor = Varianza 1 = 26,4 = 2.079<br />
Varianza menor Varianza 2 12,7<br />
4) Para saber si 2,079 indica que <strong>la</strong> varianza obtenida en <strong>la</strong> experiencia 2 es menor que <strong>la</strong> obtenida en <strong>la</strong><br />
experiencia 1, uno va a <strong>la</strong> Tab<strong>la</strong> F (Ver Anexo nº 4) y coloca los grados <strong>de</strong> libertad (gl) <strong>de</strong>l numerador (9)<br />
en <strong>la</strong> fi<strong>la</strong> horizontal, y <strong>de</strong>l <strong>de</strong>nominador (13) en <strong>la</strong> columna, para un valor <strong>de</strong> α = 0,05, 1 co<strong>la</strong>:<br />
gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316<br />
2 18,51 19,00 19,16 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474<br />
3 10,13 9,55 9,28 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232<br />
4 7,71 6,94 6,59 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880<br />
5 6,61 5,79 5,41 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246<br />
6 5,99 5,14 4,76 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901<br />
7 5,59 4,74 4,35 4.12031 3.97152 3.86598 3.78705 3.72572 3.67667<br />
8 5,32 4,46 4,07 3.83785 3.68750 3.58058 3.50046 3.43810 3.38812<br />
9 5,12 4,26 4,07 3.63309 3.48166 3.37376 3.29274 3.22959 3.17890<br />
10 4,96 4,10 3,86 3.47805 3.32584 3.21718 3.13547 3.07166 3.02038<br />
11 4,84 3,98 3,71 3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622<br />
12 4,75 3,89 3,59 3.25916 3.10587 2.99612 2.91335 2.84857 2.79638<br />
13 4,67 3,81 3,49 3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436<br />
En <strong>la</strong> intersección se lee: valor crítico para F, que es F crit= 2,71.<br />
Se proce<strong>de</strong> a comparar el F crítico y el F calcu<strong>la</strong>do, F calc= 2,079,<br />
Se observa. F crit > F calc.<br />
Concluimos que <strong>la</strong>s dos varianzas no son significativamente diferentes. Por lo tanto, hacer el test <strong>de</strong> t<br />
es una <strong>de</strong>cisión legítima.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 18
Análisis <strong>de</strong> Varianza<br />
El análisis <strong>de</strong> varianza, también conocido como ANOVA, es el análisis estadístico en el cual se compara<br />
más <strong>de</strong> dos medias entre sí.<br />
Para ese fin, se <strong>de</strong>be proce<strong>de</strong>r a comparar <strong>la</strong>s diferencias entre cada grupo y <strong>la</strong>s observaciones<br />
realizadas.<br />
Ejemplo:<br />
N= número <strong>de</strong> observaciones totales = 3 x 3 = 9<br />
Experiencia n’<br />
n= Observaciones Método A Método B Método C<br />
1 8,5 9,9 7,4<br />
2 9,2 10,0 8,0<br />
3 7,8 11,1 8,6<br />
Se proce<strong>de</strong> a calcu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> sumatoria <strong>de</strong> <strong>la</strong>s observaciones <strong>de</strong> experiencia (o grupo):<br />
Calculo Método A Método B Método C Σ<br />
Σ xi 25,5 31,0 24,0 Σ Σ xi = 25,5 + 31,0+24,0= 80,5<br />
Σ xi 2 217,73 321,22 192,72 Σ Σ xi2 = 217,73 + 321,22 +192,72= 731,67<br />
Suma total <strong>de</strong> los cuadrados es:<br />
SCT = Σ Σ xi 2 – (Σ Σ x) 2 = 731,67 – (80,5) 2 = 11,642<br />
N 9<br />
Grados <strong>de</strong> libertad totales = gl total= N-1 =9-1 =8<br />
Suma cuadrados entre grupos:<br />
SCB = (Σ xA) 2 + (Σ xB) 2 + (Σ xC) 2 - (Σ Σ x) 2 = (25,5) 2 + (31,0) 2 + (24,0) 2 – (80,5) 2 = 9,0553<br />
nA nB nC N 3 3 3 9<br />
Grados <strong>de</strong> libertad entre grupos (ej.: <strong>métodos</strong>) = gl B = n’-1 = 3-1 = 2<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 19
Suma cuadrados residuales o <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l grupo, es <strong>de</strong>cir , <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los <strong>métodos</strong>:<br />
Se realiza por simple resta, es <strong>de</strong>cir:<br />
SC w = SCT - SDCB = 11,642 – 9,05553 = 2,58647<br />
Grados <strong>de</strong> libertad <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l grupo = gl total - gl B = 8- 2 = 6<br />
Resumiendo obtuvimos:<br />
Origen <strong>de</strong> <strong>la</strong> Varianza Grados <strong>de</strong> libertad (gl) Sumas cuadráticas (SC) Cuadrados medios (CM)<br />
Entre grupos (B) 2 9,0553 4,5278<br />
Dentro <strong>de</strong>l grupo (W) 6 2,58647 0,4311<br />
Total (T) 8 11,642 -----<br />
Aplicando <strong>la</strong> prueba F, se obtiene:<br />
F calc = ( SCB/glB) = ( 9,05553/2) = 4,5278 = 10,5<br />
(SCw/ glw) ( 2,58647/6) 0,4311<br />
Se <strong>de</strong>termina el valor F crítico <strong>de</strong> Tab<strong>la</strong> F (Ver Anexo nº 4) y coloca los grados <strong>de</strong> libertad (gl) <strong>de</strong>l<br />
numerador (2) en <strong>la</strong> fi<strong>la</strong> horizontal, y <strong>de</strong>l <strong>de</strong>nominador (6) en <strong>la</strong> columna, para un valor <strong>de</strong> α = 0,05, 1<br />
co<strong>la</strong>:<br />
gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9<br />
1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316<br />
2 18,51 19,00 19,16 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474<br />
3 10,13 9,55 9,28 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232<br />
4 7,71 6,94 6,59 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880<br />
5 6,61 5,79 5,41 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246<br />
6 5,99 5,14 4,76 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901<br />
En <strong>la</strong> intersección se lee: valor crítico para F, que es F crit= 5,14.<br />
Se proce<strong>de</strong> a comparar el F critico y el F calcu<strong>la</strong>do. F calc = 10,50<br />
Se observa que F calc > F crit . Se concluye que hay diferencias significativas entre los 3 <strong>métodos</strong>.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 20
IV: VALIDACION<br />
La validación <strong>de</strong> un método analítico es un paso fundamental para asegurar que los resultados<br />
entregado por dicho método son confiable. Cuando se realiza <strong>la</strong> validación <strong>de</strong> un método por parte <strong>de</strong>l<br />
<strong>la</strong>boratorio, lo que se busca es po<strong>de</strong>r <strong>de</strong>terminar con fundamento estadístico que el método es<br />
a<strong>de</strong>cuado para los fines previstos.<br />
En este sentido, es importante que para el proceso <strong>de</strong> validación se asigne a un responsable <strong>de</strong> realizar<br />
dicha tarea. De manera que, <strong>la</strong> validación se efectúe en forma metódica, or<strong>de</strong>nada, trazable y<br />
confiable.<br />
Es importante que el <strong>la</strong>boratorio tenga c<strong>la</strong>ridad antes <strong>de</strong> iniciar <strong>la</strong> validación <strong>de</strong> cuales son los<br />
requerimientos <strong>de</strong>l método para establecer el alcance <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación.<br />
Es esencial, entonces conocer el método a validar y su aplicabilidad, es <strong>de</strong>cir, el analito, su<br />
concentración (nivel, LMP, LMR, etc.) y <strong>la</strong> matriz (o matrices) en <strong>la</strong>s cuales se <strong>de</strong>sea utilizar.<br />
En general, se establece que el <strong>la</strong>boratorio DEBE validar:<br />
1. Métodos no normalizados: Correspon<strong>de</strong>n a <strong>métodos</strong> <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>dos por el <strong>la</strong>boratorio o método<br />
nuevos (ejemplo: publicado en revista científica), o bien, a <strong>métodos</strong> que tradicionalmente se<br />
han utilizado en el <strong>la</strong>boratorio pero que no están normalizados.<br />
2. Método normalizado con una modificación significativa.<br />
Cuando se trata <strong>de</strong> un método empleado tradicionalmente por el <strong>la</strong>boratorio que no este normalizado,<br />
se pue<strong>de</strong> realizar una <strong>Validación</strong> Retrospectiva, es <strong>de</strong>cir, en base a los datos experimentales que el<br />
<strong>la</strong>boratorio dispone, para <strong>la</strong> cual se realizará <strong>la</strong> recopi<strong>la</strong>ción <strong>de</strong> <strong>la</strong> mayor cantidad <strong>de</strong> datos históricos<br />
disponibles, para luego realizar un proceso <strong>de</strong> or<strong>de</strong>namiento y selección <strong>de</strong> los datos recopi<strong>la</strong>dos, estos<br />
datos pue<strong>de</strong>n ser: curvas <strong>de</strong> calibración, resultados <strong>de</strong> ensayos, cartas <strong>de</strong> control, ensayos <strong>de</strong> aptitud,<br />
etc. A través <strong>de</strong> estos, se <strong>de</strong>berán <strong>de</strong>terminar los parámetros <strong>de</strong> validación, y evaluar si los resultados<br />
obtenidos para los fines <strong>de</strong> <strong>la</strong> son aceptable.<br />
En caso <strong>de</strong> ser un método nuevo (o uno antiguo <strong>de</strong>l que no se dispongan <strong>de</strong> datos suficientes) se <strong>de</strong>be<br />
realizar una <strong>Validación</strong> Prospectiva, generando a través <strong>de</strong> análisis datos experimentales.<br />
En algunos casos se pue<strong>de</strong> realizar lo que se conoce como validación menor o verificación cuando se<br />
trate <strong>de</strong>:<br />
1. Métodos normalizados.<br />
2. Métodos normalizados usados fuera <strong>de</strong> su alcance propuesto. Ejemplo: uso en otra matriz.<br />
3. Ampliaciones y modificaciones menores <strong>de</strong> <strong>métodos</strong> normalizados. Ejemplo: uso en otros<br />
analitos.<br />
4. Cuando se trate <strong>de</strong> <strong>métodos</strong> previamente validados, que haya sufrido alguna alteración<br />
significativa por lo cual <strong>de</strong>ben volver a evaluarse. Estas variaciones pue<strong>de</strong>n ser; cambio <strong>de</strong><br />
equipo, cambio <strong>de</strong> componentes <strong>de</strong> equipo como columnas, <strong>de</strong>tectores, cambio analista,<br />
cambio <strong>de</strong> <strong>la</strong> matriz que contiene <strong>la</strong> muestra o <strong>de</strong> nivel <strong>de</strong> concentración <strong>de</strong>l analito <strong>de</strong><br />
interés, entre otros.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 21
La verificación, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el <strong>la</strong>boratorio domina el método<br />
<strong>de</strong> ensayo normalizado y lo utiliza correctamente, en caso <strong>de</strong> tratarse <strong>de</strong> un método normalizado<br />
modificado para <strong>la</strong> verificación se requiere solo realizar aquel<strong>la</strong>s pruebas que indiquen que <strong>la</strong> variación<br />
realizada no afecta el ensayo.<br />
En ocasiones, lo que se busca a través <strong>de</strong> una validación es <strong>de</strong>mostrar que un método es equivalente a<br />
otro.<br />
El objetivo <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación y <strong>la</strong> verificación, es <strong>de</strong>mostrar que el método utilizado por un <strong>la</strong>boratorio es<br />
a<strong>de</strong>cuado para <strong>la</strong> aplicación en <strong>la</strong> que se propone utilizar, así, como también <strong>de</strong>mostrar que <strong>la</strong>s<br />
modificaciones que pudieron haberse realizado no afectan su <strong>de</strong>sempeño, ni <strong>la</strong> confiabilidad <strong>de</strong> los<br />
resultados por este entregado.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 22
Definición <strong>de</strong>l método a Validar:<br />
Cuali o Cuantitativo-Analito-matriz-Concentración-Principio<br />
Normalizado Normalizado<br />
Modificado<br />
Verificación<br />
No<br />
Comparar resultados<br />
versus criterios<br />
Tipo <strong>de</strong> Método<br />
Sí No<br />
Se trata <strong>de</strong> un método normalizado?<br />
Tiene una modificación<br />
significativa?<br />
Sí<br />
<strong>Validación</strong> Prospectiva<br />
Establecer Parámetros a Evaluar<br />
No Normalizado:<br />
Nuevo o<br />
Desarrol<strong>la</strong>do por el<br />
<strong>la</strong>boratorio<br />
recientemente<br />
Establecer Pruebas Experimentales<br />
Establecer Criterios <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Desarrol<strong>la</strong>r Pruebas Experimentales<br />
Evaluar resultados<br />
INFORME DE VALIDACIÓN<br />
REVISIÓN DE INFORME<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 23<br />
No Normalizado<br />
Tradicional :<br />
usado por el<br />
Laboratorio hace<br />
años<br />
<strong>Validación</strong><br />
Retrospectiva
En re<strong>la</strong>ción a los parámetros <strong>de</strong> validación o verificación estos <strong>de</strong>berán <strong>de</strong>terminarse <strong>de</strong> acuerdo al tipo<br />
<strong>de</strong> método. Para este fin <strong>la</strong> siguiente tab<strong>la</strong> pue<strong>de</strong> ser utilizada como guía:<br />
Tab<strong>la</strong> Nº 2<br />
PARAMETRO<br />
A EVALUAR<br />
SELECTIVIDAD<br />
LINEALIDAD<br />
SENSIBILIDAD<br />
LIMITES<br />
PRECISION<br />
VERACIDAD<br />
ROBUSTEZ<br />
CARACTERISTICA(S)<br />
I<strong>de</strong>ntificación analito<br />
Interferencia <strong>de</strong><br />
matriz<br />
Rango lineal<br />
Pendiente<br />
Critico (LC)<br />
Detección (LOD)<br />
Cuantificación (LOQ)<br />
Repetibilidad<br />
Reproducibilidad<br />
Sesgo (s)<br />
Recuperación (R)<br />
Test <strong>de</strong> You<strong>de</strong>n y<br />
Steiner<br />
APLICABILIDAD -------------<br />
METODO<br />
METODO CUANTITATIVO<br />
CUALITATIVO NORMALIZADO MODIFICADO NUEVO<br />
Sí No Sí Sí<br />
No Sí Sí Sí<br />
No Sí o No Sí Sí<br />
Sí<br />
Sí o No<br />
Sí Sí<br />
No Sí Sí Sí<br />
No Sí o No<br />
No No<br />
Sí<br />
Sí o No<br />
Sí o No<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 24<br />
Sí<br />
Sí<br />
Sí Sí Sí<br />
De acuerdo a los antece<strong>de</strong>ntes anteriormente mencionados, el responsable <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación o<br />
verificación <strong>de</strong>berá así e<strong>la</strong>borar el P<strong>la</strong>n <strong>de</strong> <strong>Validación</strong> que se va a realizar.<br />
a) ESTABLECER PLAN DE VALIDACIÓN<br />
Se entien<strong>de</strong> como P<strong>la</strong>n <strong>de</strong> <strong>Validación</strong>, a un documento (tipo protocolo) en el cual se <strong>de</strong>finen<br />
previamente a <strong>la</strong> experiencia; <strong>la</strong>s pruebas o parámetros <strong>de</strong> validación necesarios y el diseño<br />
experimental a <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r en base a los requerimientos <strong>de</strong>l método.<br />
El “P<strong>la</strong>n <strong>de</strong> <strong>Validación</strong>” <strong>de</strong>berá contener a lo menos:<br />
• Alcance <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación (método, analito, matrices y requerimientos <strong>de</strong>l método<br />
• Diseño experimental:<br />
Establecer <strong>la</strong>(s) muestra(s) a ser analizada(s): testigos reactivos, b<strong>la</strong>nco matriz, material<br />
certificados, material control, material(es) <strong>de</strong> referencia certificado, matrices <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras,<br />
muestras sin fortificar, muestras fortificadas, etc.<br />
El (los) parámetro(s) y pruebas a <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r, en caso, <strong>de</strong> que <strong>la</strong> prueba no sea una<br />
convencional, sino diseñada por el responsable, también <strong>de</strong>berá indicarse en el documento.<br />
Número <strong>de</strong> análisis requeridos para cada prueba y/o parámetro.<br />
Criterios <strong>de</strong> aceptabilidad para cada parámetro <strong>de</strong> validación.<br />
Analista(s) responsable <strong>de</strong> realizar <strong>la</strong>(s) prueba(s) analítica(s).
• Materiales, insumos y equipos necesarios para <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r <strong>la</strong> validación.<br />
• Responsable <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>Validación</strong>, fecha o tiempo programado para realizar <strong>la</strong> validación y fecha <strong>de</strong><br />
e<strong>la</strong>boración <strong>de</strong>l p<strong>la</strong>n.<br />
Cualquier modificación realizada al p<strong>la</strong>n <strong>de</strong> validación, durante el proceso, <strong>de</strong>be quedar <strong>de</strong>bidamente<br />
documentada.<br />
En anexo Nº 1, Se muestra un formato <strong>de</strong> p<strong>la</strong>n <strong>de</strong> validación. En el anexo Nº 6, se incluye un ejemplo <strong>de</strong><br />
esquema <strong>de</strong> trabajo <strong>de</strong> cómo se <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong> un p<strong>la</strong>n <strong>de</strong> validación para un método normalizado.<br />
b) DESARROLLO DE PRUEBAS DE PARÁMETROS DE VALIDACIÓN<br />
Para el <strong>de</strong>sarrollo <strong>de</strong> <strong>la</strong>s pruebas <strong>de</strong> validación, los analistas a cargo <strong>de</strong>berán conocer el procedimiento<br />
<strong>de</strong> método <strong>de</strong> ensayo y el número <strong>de</strong> ensayos o mediciones a realizar <strong>de</strong> acuerdo a lo establecido en el<br />
p<strong>la</strong>n <strong>de</strong> validación.<br />
(IMPORTANTE: El personal responsable <strong>de</strong> realizar los análisis se encuentre <strong>de</strong>bidamente calificado, y<br />
los equipos asociados al método <strong>de</strong>berían encontrarse calibrados o contro<strong>la</strong>dos antes <strong>de</strong> su uso.)<br />
Los resultados obtenidos en cada prueba <strong>de</strong>ben ser <strong>de</strong>bidamente registrados y almacenados.<br />
Los ensayos o mediciones realizadas serán con el fin <strong>de</strong> po<strong>de</strong>r realizar <strong>la</strong>s siguientes pruebas <strong>de</strong><br />
parámetros <strong>de</strong> validación:<br />
Selectividad<br />
Linealidad<br />
Sensibilidad<br />
Limites<br />
Exactitud<br />
Precisión<br />
Robustez<br />
Aplicabilidad<br />
El analista o responsable <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación <strong>de</strong>berá con los resultados obtenidos <strong>de</strong> cada prueba realizar<br />
los cálculos matemáticos, comparativos y/o estadísticos correspondientes a cada ensayo para lo cual<br />
podrá utilizar para ese fin un software estadístico, calcu<strong>la</strong>dora o una p<strong>la</strong>nil<strong>la</strong> <strong>de</strong> cálculo (ejemplo: Excel).<br />
C) EVALUAR RESULTADOS DE LA VALIDACIÓN<br />
Se <strong>de</strong>berá evaluar para cada parámetro <strong>de</strong> validación, si los resultados <strong>de</strong> <strong>la</strong>s pruebas son<br />
satisfactorios, es <strong>de</strong>cir, si cumplen con los criterios <strong>de</strong> aceptabilidad establecidos en el p<strong>la</strong>n, se<br />
consi<strong>de</strong>ra que el método es aceptable.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 25
D) INFORME DE VALIDACIÓN<br />
El responsable <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación, <strong>de</strong>berá realizar un informe en el cual presentará los resultados<br />
obtenidos y conclusiones. El informe <strong>de</strong>be contener <strong>la</strong> <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración <strong>de</strong> <strong>la</strong> aplicabilidad <strong>de</strong>l método.<br />
En el anexo Nº 2, se entrega un mo<strong>de</strong>lo tipo <strong>de</strong> informe <strong>de</strong> validación.<br />
El <strong>la</strong>boratorio <strong>de</strong>be tener disponible el procedimiento usado para <strong>la</strong> validación, y una <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración<br />
acerca <strong>de</strong> que el método se ajusta para el uso propuesto.<br />
Este informe <strong>de</strong>berá ser revisado por una tercera persona que tenga conocimiento en el área, y que no<br />
haya formado parte <strong>de</strong>l proceso <strong>de</strong> validación. En dicha revisión se <strong>de</strong>berá establecer si los criterios <strong>de</strong><br />
aceptabilidad establecidos en el p<strong>la</strong>n son aceptables, y si el método es idóneo para el fin previsto.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 26
SELECTIVIDAD<br />
La selectividad es el grado en que un método pue<strong>de</strong> cuantificar o cualificar al analito en presencia <strong>de</strong><br />
interferentes. Estos interferentes normal o frecuentemente se encuentran en <strong>la</strong> matriz <strong>de</strong> interés.<br />
La prueba <strong>de</strong> selectividad pue<strong>de</strong> diseñarse <strong>de</strong> acuerdo al método, en el caso <strong>de</strong> cromatografía <strong>la</strong><br />
resolución entrega información sobre <strong>la</strong> selectividad <strong>de</strong>l método, en el caso <strong>de</strong> espectrofotometría el<br />
espectro <strong>de</strong> absorción o un espectro <strong>de</strong> masas entrega información al respecto, en especial cuando es<br />
comparado en presencia <strong>de</strong> una interferencia.<br />
Una prueba <strong>de</strong> Selectividad comúnmente utilizada, consiste en analizar un mínimo <strong>de</strong> tres testigo<br />
reactivos, tres b<strong>la</strong>ncos <strong>de</strong> matriz y tres muestras o estándares <strong>de</strong> concentración conocida <strong>de</strong>l analito <strong>de</strong><br />
interés.<br />
Se <strong>de</strong>ben comparar <strong>la</strong>s lecturas (señales <strong>de</strong> medición) obtenidas para cada caso, y observar si existen<br />
variaciones entre los testigos reactivos, b<strong>la</strong>ncos <strong>de</strong> matrices y estándares o muestras con analito. Si se<br />
encuentran diferencias significativas <strong>de</strong>berán ser i<strong>de</strong>ntificadas y en lo posible eliminadas.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 27
LINEALIDAD<br />
La linealidad es <strong>la</strong> capacidad <strong>de</strong> un método <strong>de</strong> análisis, <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un <strong>de</strong>terminado intervalo, <strong>de</strong> dar una<br />
respuesta o resultados instrumentales que sean proporcionales a <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong>l analito que se habrá<br />
<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar en <strong>la</strong> muestra <strong>de</strong> <strong>la</strong>boratorio.<br />
Con el fin <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar el rango lineal se pue<strong>de</strong> realizar mediante un gráfico <strong>de</strong> concentración versus<br />
respuesta, que se conoce como Función Respuesta (normalmente l<strong>la</strong>mada recta <strong>de</strong> calibrado). Ésta se<br />
establece cada día con una cierta cantidad <strong>de</strong> valores formados por un b<strong>la</strong>nco y los patrones <strong>de</strong><br />
trabajos limpios <strong>de</strong> valor teórico conocido, que cubran el intervalo <strong>de</strong> trabajo. En este sentido se<br />
recomienda abarcar valores <strong>de</strong>s<strong>de</strong> cercano al cero y valores superiores al LMP o al valor <strong>de</strong> interés. El<br />
número <strong>de</strong> puntos a analizar <strong>de</strong>berá ser establecido por el analista (en general, se utiliza un mínimo <strong>de</strong><br />
4 valores).<br />
Luego <strong>de</strong> realizar el grafico se pue<strong>de</strong> observar el comportamiento <strong>de</strong> <strong>la</strong> curva y establecer<br />
cualitativamente el rango lineal (fig.1). Después <strong>de</strong> establecer el comportamiento lineal <strong>de</strong>l método se<br />
<strong>de</strong>berá realizar <strong>la</strong> Curva <strong>de</strong> trabajo o curva <strong>de</strong> calibración (fig.2). Graficar los datos <strong>de</strong> concentración <strong>de</strong><br />
los estándares <strong>de</strong> calibración estimados (X) v/s <strong>la</strong> lectura observada (Y).<br />
Fig. 1 Fig.2<br />
Evaluar los estimadores <strong>de</strong> regresión lineal <strong>de</strong>l gráfico: <strong>la</strong> pendiente (m), el coeficiente <strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción (r<br />
ó ϒ) y el punto <strong>de</strong> corte (intercepto) con el eje <strong>de</strong> <strong>la</strong>s Y (L0).<br />
Y= X x m + Lo<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 28
En general el criterio <strong>de</strong> aceptación cualitativo que se usa para <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> linealidad es el coeficiente<br />
<strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción:<br />
El coeficiente <strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción indica el grado <strong>de</strong> re<strong>la</strong>ción entre <strong>la</strong> variable concentración (X) y <strong>la</strong> variable<br />
respuesta (Y) <strong>de</strong> <strong>la</strong> curva <strong>de</strong> calibración. Los valores máximos que pue<strong>de</strong> alcanzar son –1 y 1. El valor<br />
máximo <strong>de</strong> 1 indica una corre<strong>la</strong>ción positiva perfecta (entre X e Y) con una pendiente positiva. Cuando<br />
r=0, no existe corre<strong>la</strong>ción alguna, in<strong>de</strong>pen<strong>de</strong>ncia total <strong>de</strong> los valores X e Y<br />
En <strong>la</strong> práctica si r tiene un valor cercano a uno (1), esto significa que existe corre<strong>la</strong>ción con una<br />
probabilidad elevada. Para una curva <strong>de</strong> calibración o trabajo, es recomendable que el coeficiente <strong>de</strong><br />
corre<strong>la</strong>ción obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el caso <strong>de</strong> trazas se admite un valor igual<br />
o mayor que 0.99.<br />
r = _Sxy<br />
Sx· S y<br />
S x y= i = 1 Σ n xi · yi - (xpr o m · yprom )<br />
n<br />
S x= √ ((Σ xi 2 /n) - (xpr o m 2 ))<br />
S y= √ ((Σ yi 2 /n) - (yp r o m 2 ))<br />
Coeficiente <strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción (γ o r): r > 0.99<br />
Coeficiente <strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción al cuadrado r 2 > 0.99.<br />
Se pue<strong>de</strong> realizar una evaluación <strong>de</strong> curva <strong>de</strong> calibración global (construida con más <strong>de</strong> una curva <strong>de</strong><br />
calibración <strong>de</strong> <strong>la</strong>s mismas características) en <strong>la</strong> cual se pue<strong>de</strong> realizar una evaluación estadística <strong>de</strong><br />
prueba t-Stu<strong>de</strong>nt, como un mejor indicador <strong>de</strong>l mo<strong>de</strong>lo lineal.<br />
Se calcu<strong>la</strong> un valor <strong>de</strong> t con n-2 grados <strong>de</strong> libertad y se compara con el valor tabu<strong>la</strong>do <strong>de</strong> t para el nivel<br />
<strong>de</strong> confianza requerido (α = 0.05), dos-co<strong>la</strong>s, en este caso para un “n” que <strong>de</strong>pen<strong>de</strong> <strong>de</strong> los niveles <strong>de</strong><br />
calibración.<br />
Se <strong>de</strong>sea probar si existe entonces una corre<strong>la</strong>ción significativa: La hipótesis nu<strong>la</strong> H0 es que no existe<br />
corre<strong>la</strong>ción entre X e Y. Si el valor observado <strong>de</strong> tr es mayor que tcri, se rechaza <strong>la</strong> hipótesis nu<strong>la</strong> H0,<br />
siendo <strong>la</strong> corre<strong>la</strong>ción lineal significativa con <strong>la</strong> probabilidad calcu<strong>la</strong>da.<br />
Don<strong>de</strong>:<br />
tr = | r | √(n-2)<br />
√ (1- r 2 )<br />
tr = Valor <strong>de</strong>l estimador t Stu<strong>de</strong>nt obtenido para el coeficiente <strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción<br />
| r | = Valor absoluto <strong>de</strong>l coeficiente <strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción<br />
n – 2 = Número <strong>de</strong> grados <strong>de</strong> libertad<br />
r 2 = Valor <strong>de</strong>l coeficiente <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminación<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 29
Ejemplo:<br />
Nivel Conc Área Área Área A<br />
Desviación<br />
Estándar CV % Varianza<br />
mg/L 1 2 3 Promedio S<br />
1 13,4 43,8 44,2 44,1 44,0 0,2 0,4 0,0<br />
2 26,6 86,2 86,1 87,6 86,7 0,8 1,0 0,7<br />
3 40,8 131,2 132,7 133,6 132,5 1,2 0,9 1,4<br />
4 54,7 181,7 180,7 178,6 180,3 1,6 0,9 2,5<br />
5 68,6 221,6 224,2 221,8 222,5 1,4 0,6 2,0<br />
n= Nº <strong>de</strong> niveles= 5<br />
r= coeficiente <strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción= 0,99985<br />
r= coeficiente <strong>de</strong> <strong>de</strong>terminación= 0,9997<br />
sustituyendo los valores:<br />
t r = | r | √(n-2) = I 0,99985 I*√(5-2)= I 0,99985 I*√3 = 99.985<br />
√ (1- r 2 ) √ (1-0,9997) √0,0003<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 30
El valor t critico obtenido <strong>de</strong> <strong>la</strong> tab<strong>la</strong> para: 3 grados <strong>de</strong> libertad, un α = 0.05 y 2 co<strong>la</strong>s es:<br />
t crit = 3,182<br />
2 co<strong>la</strong>s 80% 90% 95%<br />
αααα/2<br />
v<br />
0.10 0.05 0.025<br />
1 3.078 6.314 12.706<br />
2 1.886 2.920 4.303<br />
3 1.638 2.353 3.182<br />
4 1.533 2.132 2.776<br />
Se observa que el valor observado <strong>de</strong> tr (es <strong>de</strong>cir el t calcu<strong>la</strong>do) es mayor que tcrit (99,85 > 3,182),<br />
por lo cual se rechaza <strong>la</strong> hipótesis nu<strong>la</strong> Ho, siendo <strong>la</strong> corre<strong>la</strong>ción lineal significativa con <strong>la</strong><br />
probabilidad calcu<strong>la</strong>da.<br />
En cuanto al rango <strong>de</strong> aplicabilidad, el Co<strong>de</strong>x Alimentarius ha establecido que respecto al LMP el<br />
Intervalo mínimo aplicable es:<br />
Respecto <strong>de</strong> un LMP ≥ 0,1 ppm, [LMP - 3 SR , LMP + 3 SR ].<br />
Respecto <strong>de</strong> un LMP < 0,1 ppm, [LMP - 2 SR , LMP + 2 SR ].<br />
Siendo SR <strong>la</strong> <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> <strong>la</strong> reproducibilidad.<br />
Ejemplo:<br />
El LMP para mercurio en sal es <strong>de</strong> 0,1 mg/Kg, por lo cual se aplicaría <strong>la</strong> ecuación <strong>de</strong> Horwitz para<br />
<strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> SR prevista a este nivel que es igual a 10 -7<br />
Al <strong>de</strong>spejar <strong>la</strong> ecuación obtendríamos lo siguiente:<br />
CVR (%) = 100 · SR = 2 C −0,1505<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 31<br />
c<br />
SR = c· 2 C −0,1505<br />
100<br />
c= Es el LMP en mg/Kg es <strong>de</strong>cir; 0,1<br />
C= Es cociente <strong>de</strong> concentración es <strong>de</strong>cir <strong>la</strong> concentración expresada en potencia <strong>de</strong> 10.
Sustituyendo obtendríamos:<br />
Entonces:<br />
SR = 0,1· 2 (0,0000001) −0,1505 = 0,0233<br />
100<br />
Para un LMP ≥ 0,1 ppm se aplica el criterio: [LMP - 3 SR , LMP + 3 SR ].<br />
Es <strong>de</strong>cir: LMP + 3 SR = 0,1 + (3·0,0233) = 0,1 + (0,07)<br />
0,1 + 0,07 = 0,17 mg/Kg<br />
0,1 – 0,07 = 0,03 mg/kg<br />
Entonces el rango que se requería <strong>de</strong>l método para que fuera aceptable <strong>de</strong>bería estar a lo menos entre<br />
0,03 y 0,17 mg/Kg.<br />
Para coeficientes <strong>de</strong> concentración < 10-7, se aplica <strong>la</strong> teoría <strong>de</strong> Thompson, esto es, CVR% = 22 %<br />
por lo tanto, SR = 0,22 · LMP<br />
Ejemplo:<br />
El Co<strong>de</strong>x Alimentarius seña<strong>la</strong> que para un LMP = 0,01 mg/kg , es <strong>de</strong>cir, para una concentración <strong>de</strong> 10 -8 ,<br />
es <strong>de</strong>cir < 10 -7 :<br />
El rango <strong>de</strong> aceptabilidad seria:<br />
LMP + 2 SR= 0,01 ± 2· SR = 0,01 ± 2 · (0,22 · LMP) = 0,01 ± 0,44 · 0,01 = 0,01 ± 0,0044 mg/kg<br />
El rango mínimo aplicable para un LM <strong>de</strong> 0,01 mg/kg es, por lo tanto, 0,006-0,014 mg/kg.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 32
SENSIBILIDAD<br />
La sensibilidad es el cociente entre el cambio en <strong>la</strong> indicación <strong>de</strong> un sistema <strong>de</strong> medición y el cambio<br />
correspondiente en el valor <strong>de</strong> <strong>la</strong> cantidad objeto <strong>de</strong> <strong>la</strong> medición.<br />
En una regresión lineal <strong>la</strong> sensibilidad correspon<strong>de</strong> a <strong>la</strong> pendiente (m) <strong>de</strong> <strong>la</strong> recta <strong>de</strong> calibración.<br />
Se calcu<strong>la</strong> como:<br />
m = ΣXi Yi - (Σ Xi ΣYi/ n)<br />
ΣX 2 i - ((ΣXi) 2 /n)<br />
El valor <strong>de</strong> sensibilidad obtenido [m] <strong>de</strong>be permitir una a<strong>de</strong>cuada discriminación <strong>de</strong> los valores <strong>de</strong><br />
concentración en base a <strong>la</strong> lectura.<br />
En figura Nº 3, se pue<strong>de</strong> observar que mientras más próxima al eje <strong>de</strong> <strong>la</strong>s Y esté <strong>la</strong> recta, significa que a<br />
ligeros cambios en <strong>la</strong>s concentraciones esperadas habrá gran<strong>de</strong>s variaciones en los resultados <strong>de</strong> <strong>la</strong>s<br />
lecturas observadas [m2] En el caso <strong>de</strong> [m3] gran<strong>de</strong>s cambios en <strong>la</strong> concentración no son significativos<br />
para <strong>la</strong> lectura.<br />
Fig. 3<br />
Se dice, que un método es sensible cuando una pequeña variación <strong>de</strong> concentración <strong>de</strong>termina una<br />
gran variación <strong>de</strong> respuesta. La sensibilidad permite observar <strong>la</strong> capacidad <strong>de</strong> respuesta instrumental<br />
frente a una <strong>de</strong>terminada cantidad <strong>de</strong> analito. En el tiempo, visualiza como se comporta el<br />
instrumento.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 33
LIMITES<br />
Se <strong>de</strong>be tener en consi<strong>de</strong>ración los siguientes parámetros: Valor critico, limite <strong>de</strong>tección (LOD) y limite<br />
<strong>de</strong> cuantificación (LOQ).<br />
Valor critico (LC): El valor <strong>de</strong> <strong>la</strong> concentración o cantidad neta que en caso <strong>de</strong> superarse da lugar, para<br />
una probabilidad <strong>de</strong> error dada α, a <strong>la</strong> <strong>de</strong>cisión <strong>de</strong> que <strong>la</strong> concentración o cantidad <strong>de</strong>l analito presente<br />
en el material analizado es superior a <strong>la</strong> contenida en el material testigo (Referencia: Co<strong>de</strong>x<br />
Alimentarius).<br />
Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones <strong>de</strong> b<strong>la</strong>nco matriz o testigo reactivo.<br />
Don<strong>de</strong>:<br />
t = t-Stu<strong>de</strong>nt<br />
1-α= probabilidad b<br />
v= Grados <strong>de</strong> libertad<br />
LC = t (1-α;ν) x So Sí : t ( 0.05,∞) → 1,645 LC = 1,645 x So<br />
So = Desviación estándar <strong>de</strong> <strong>la</strong>s lecturas <strong>de</strong>l b<strong>la</strong>nco matriz o testigo reactivo.<br />
Un resultado inferior al LC que <strong>de</strong>termine <strong>la</strong> <strong>de</strong>cisión “no <strong>de</strong>tectado” no <strong>de</strong>berá interpretarse como<br />
<strong>de</strong>mostración <strong>de</strong> que el analito está ausente. No se recomienda notificar tal resultado como “cero” o<br />
como < LOD. Deberá hacerse constar en todo los casos el valor estimado y su <strong>incertidumbre</strong>.<br />
Límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección (LOD): Concentración o cantidad real <strong>de</strong>l analito presente en el material objeto <strong>de</strong><br />
análisis que llevará, con una probabilidad (1-β), a <strong>la</strong> conclusión <strong>de</strong> que <strong>la</strong> concentración o cantidad <strong>de</strong>l<br />
analito es mayor en el material analizado que en el material testigo (Referencia <strong>de</strong>l Manual <strong>de</strong>l Co<strong>de</strong>x<br />
Alimentarius ).<br />
Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones <strong>de</strong> b<strong>la</strong>nco matriz , testigo reactivo o<br />
concentración estimada cercana al b<strong>la</strong>nco.<br />
LOD = 2 t (1-α;ν) x So Sí : t ( 0.05,∞) → 1,645 LOD = 3,29 x So<br />
LOD = 3,29So, cuando <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong>l valor medio (esperado) <strong>de</strong>l material testigo es insignificante,<br />
α=β = 0,05 y el valor estimado tiene una distribución normal con una varianza constante conocida.<br />
Un criterio <strong>de</strong> aceptación a<strong>de</strong>cuado es LC < LOD < LMP. En general también se sugiere, para un LMP ><br />
0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP
Se recomienda para su cálculo a lo menos seis mediciones <strong>de</strong> b<strong>la</strong>nco matriz , testigo reactivo o<br />
concentración estimada cercana al b<strong>la</strong>nco.<br />
En este caso, el LOQ es exactamente 3,04 veces el límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección, dada <strong>la</strong> normalidad y α= β =<br />
0,05. En el LOQ es posible lograr una i<strong>de</strong>ntificación positiva con un nivel <strong>de</strong> confianza razonable.<br />
Un criterio <strong>de</strong> aceptación a<strong>de</strong>cuado es LC < LOD
Para un LMP <strong>de</strong> 0,5 ppm un LOQ < 1/5 LMP , es <strong>de</strong>cir , se <strong>de</strong>be <strong>de</strong>terminar el (LMP/5) , que es : 0,5/5<br />
<strong>de</strong> 0,1 mg/Kg.<br />
Por lo cual no se estaría cumpliendo el criterio pues 0,13mg/Kg es mayor 0,1 mg/Kg. El LOQ no sería<br />
aceptable para el campo <strong>de</strong> aplicabilidad que le quiere dar al método.<br />
En este sentido se pu<strong>de</strong> tomar <strong>la</strong> <strong>de</strong>cisión <strong>de</strong> buscar otro método que cump<strong>la</strong> con estos requisitos para<br />
este fin previsto o aceptar su aplicabilidad, consi<strong>de</strong>rando en <strong>la</strong> <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración <strong>de</strong> <strong>la</strong> aplicabilidad estas<br />
reservas u observaciones en cuanto a su LOQ.<br />
Es importante realizar posteriormente <strong>la</strong> experiencia analítica <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l analito en el<br />
nivel <strong>de</strong> concentración <strong>de</strong>terminado para el LOD o LOQ, es <strong>de</strong>cir evi<strong>de</strong>nciar resultados experimentales,<br />
que <strong>de</strong>muestren <strong>la</strong> vali<strong>de</strong>z <strong>de</strong>l resultado obtenido.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 36
EXACTITUD<br />
El manual <strong>de</strong>l Co<strong>de</strong>x Alimentarius <strong>de</strong>fine <strong>la</strong> exactitud como el grado <strong>de</strong> concordancia entre el resultado<br />
<strong>de</strong> un ensayo y el valor <strong>de</strong> referencia.<br />
El término “exactitud”, esta aplicado a un conjunto <strong>de</strong> resultados <strong>de</strong> un ensayo, y supone una<br />
combinación <strong>de</strong> componentes aleatorios y un componente común <strong>de</strong> error sistemático o sesgo.<br />
Cuando se aplica a un método <strong>de</strong> ensayo, el término “exactitud” se refiere a una combinación <strong>de</strong><br />
veracidad y precisión. En el siguiente esquema <strong>de</strong> “Tiro al B<strong>la</strong>nco”, ampliamente utilizado para<br />
ejemplificar esto, los punto u orificios equivaldrían a los resultados analíticos y el circulo rojo al centro<br />
el rango en el cual se espera este el valor <strong>de</strong> referencia (o verda<strong>de</strong>ro).<br />
Como se pue<strong>de</strong> observar entre más veraz y preciso sea un resultado analítico, es más exacto.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 37
VERACIDAD: Determina el grado <strong>de</strong> coinci<strong>de</strong>ncia existente entre el valor medio obtenido <strong>de</strong> una serie<br />
<strong>de</strong> resultados y un valor <strong>de</strong> referencia aceptado.<br />
La veracidad pue<strong>de</strong> ser <strong>de</strong>terminada por sesgo o recuperación.<br />
a) Sesgo (s): La diferencia entre <strong>la</strong> expectativa re<strong>la</strong>tiva a los resultados <strong>de</strong> un ensayo o una<br />
medición y el valor verda<strong>de</strong>ro. En <strong>la</strong> práctica el valor convencional <strong>de</strong> cantidad pue<strong>de</strong> sustituir el valor<br />
verda<strong>de</strong>ro. El sesgo es el error sistemático total en contraposición al error aleatorio.<br />
Para <strong>de</strong>terminar el sesgo pue<strong>de</strong> utilizarse material <strong>de</strong> referencia, material fortificado, material control,<br />
material ensayo <strong>de</strong> aptitud: Para este fin, se <strong>de</strong>be medir un analito <strong>de</strong> concentración conocido y se<br />
<strong>de</strong>termina <strong>la</strong> diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y <strong>la</strong> media <strong>de</strong>l valor obtenido. Una<br />
diferencia sistemática importante en re<strong>la</strong>ción al valor <strong>de</strong> referencia aceptado se refleja en un mayor<br />
valor <strong>de</strong>l sesgo, cuanto más pequeño es el sesgo, mayor veracidad indica el método.<br />
s= X -Xa<br />
Don<strong>de</strong>:<br />
s= sesgo<br />
X = lectura obtenida o valor promedio <strong>de</strong> <strong>la</strong>s lecturas obtenidas.<br />
Xa = valor asignado, valor certificado <strong>de</strong>l material <strong>de</strong> referencia o valor esperado.<br />
Para evaluar el sesgo, se <strong>de</strong>be realizar <strong>la</strong> prueba t, en <strong>la</strong> cual el tobs < t crit:<br />
t calc = [ Xa –X]<br />
S x √n<br />
Don<strong>de</strong> :<br />
t calc= t observado o calcu<strong>la</strong>do<br />
Xa = Valor esperado o valor certificado en concentración<br />
X= Promedio <strong>de</strong> valores leídos u observados en concentración<br />
S= Desviación estándar<br />
n= Número <strong>de</strong> lecturas o valores observados.<br />
Buscar t- Stu<strong>de</strong>nt teórico en tab<strong>la</strong> ( Anexo II) para grados <strong>de</strong> libertad (v) y el porcentaje <strong>de</strong> seguridad<br />
<strong>de</strong>seado ( 1-α) para un error α. Usualmente se trabaja con un valor <strong>de</strong> 0,05.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 38
Ejemplo ejercicio <strong>de</strong> sesgo:<br />
Para un valor asignado <strong>de</strong> un material <strong>de</strong> referencia certificado <strong>de</strong> 20,1 mg/L <strong>de</strong> N-NO2, los<br />
valores obtenidos son:<br />
Lectura<br />
Resultado<br />
mg/L<br />
(X-Xa)<br />
Sesgo<br />
s<br />
1 20,4 20,4-20,1 0,3<br />
2 20,8 20,8-20,1 0,7<br />
3 20,6 20,6-20,1 0,5<br />
4 20,0 20,0-20,1 -0,1<br />
5 20,4 20,4-20,1 0,3<br />
6 20,6 20,6-20,1 0,5<br />
7 20,5 20,5-20,1 0,4<br />
8 19,9 19,9-20,1 -0,2<br />
9 20,3 20,3-20,1 0,2<br />
10 20,3 20,3-20,1 0,2<br />
Desviación estándar S = 0,27 Promedio <strong>de</strong> <strong>la</strong>s lecturas X= 20,38<br />
Valor asignado a <strong>la</strong> muestra Xa= 20,1 Número <strong>de</strong> lecturas n= 10 √n = √10 = 3,162<br />
t calc = [ Xa –X] = [20,1-20,38] = 0,32<br />
0,27 x √10<br />
Se <strong>de</strong>sea establecer si existe una diferencia significativa entre el valor obtenido <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia<br />
analítica y el valor <strong>de</strong> referencia. Entonces, para <strong>de</strong>terminar el t teórico o critico para grados <strong>de</strong> libertad<br />
<strong>de</strong> n-1 ( es <strong>de</strong>cir <strong>de</strong> 10-1=9) , un valor α =0,05 y 2 co<strong>la</strong>s, se extrae <strong>de</strong> tab<strong>la</strong> el t critico que es <strong>de</strong> 2,262,<br />
cumpliéndose que tcalc < t crit , ya que 0,32 < 2,262. Es <strong>de</strong>cir; no hay diferencias significativas.<br />
2 co<strong>la</strong>s 80% 90% 95%<br />
αααα/2<br />
v<br />
0.10 0.05 0.025<br />
1 3.078 6.314 12.706<br />
2 1.886 2.920 4.303<br />
3 1.638 2.353 3.182<br />
4 1.533 2.132 2.776<br />
5 1.476 2.015 2.571<br />
6 1.440 1.943 2.447<br />
7 1.415 1.895 2.365<br />
8 1.397 1.860 2.306<br />
9 1.383 1.833 2.262<br />
10 1.372 1.812 2.228<br />
“A través <strong>de</strong>l ejercicio se pue<strong>de</strong> observar que para <strong>la</strong> medición <strong>de</strong> Nitritos en agua el sesgo obtenido<br />
para el método utilizado es aceptable, y por lo tanto su veracidad es aceptable”.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 39
) Recuperación (R): Es <strong>la</strong> fracción <strong>de</strong> <strong>la</strong> sustancia agregada a <strong>la</strong> muestra (muestra fortificada) antes <strong>de</strong>l<br />
análisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar.<br />
La recuperación permite ver el rendimiento <strong>de</strong> un método analítico en cuanto al proceso <strong>de</strong> extracción<br />
y <strong>la</strong> cantidad <strong>de</strong>l analito existente en <strong>la</strong> muestra original. Por lo cual, <strong>la</strong> recuperación esta<br />
intrínsecamente re<strong>la</strong>cionada a <strong>la</strong>s características <strong>de</strong> <strong>la</strong> matriz <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra.<br />
Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones <strong>de</strong> cada uno en lo posible en tres niveles. Se <strong>de</strong>be<br />
consi<strong>de</strong>rar al elegir estos niveles el rango <strong>de</strong> <strong>la</strong> curva <strong>de</strong> calibración <strong>de</strong>l método, el LOD y el LMP<br />
establecido. De manera que los niveles seleccionados permitan entregar <strong>la</strong> mejor información posible<br />
respecto a <strong>la</strong> capacidad <strong>de</strong> recuperación <strong>de</strong>l método, en cuanto a estos valores criticos.<br />
Se calcu<strong>la</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> siguiente manera:<br />
Siendo:<br />
R= Recuperación<br />
R = Ce –Co<br />
Ce = es <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> analito <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra enriquecida.<br />
C0 = es <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> analito medida en <strong>la</strong> muestra sin adicionar.<br />
Ca = es <strong>la</strong> concentración <strong>de</strong> analito adicionado a <strong>la</strong> muestra enriquecida.<br />
Se pue<strong>de</strong> igualmente expresar en porcentaje <strong>de</strong> recuperación (%R): se calcu<strong>la</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> siguiente manera:<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 40<br />
Ca<br />
%R = [ R ] x 100<br />
En caso <strong>de</strong> evaluar <strong>la</strong> recuperación, se <strong>de</strong>berá realizar prueba t , en <strong>la</strong> cual el tcalc tcrit (hay diferencia estadísticamente significativa), los resultados reportados <strong>de</strong>berán ser<br />
corregidos.
Si el tcalc ≤ tcrit (no hay diferencia estadísticamente significativa), no es necesario ninguna corrección.<br />
El Criterio <strong>de</strong> aceptación en base al valor obtenido para el porcentaje <strong>de</strong> recuperación pue<strong>de</strong> utilizarse<br />
los criterios <strong>de</strong> AOAC. En caso <strong>de</strong> utilizar criterio <strong>de</strong> AOAC ( Ver Anexo III), se <strong>de</strong>be buscar en tab<strong>la</strong> <strong>de</strong><br />
acuerdo a <strong>la</strong> concentración esperada <strong>de</strong>l analito y si el % R obtenido <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica, se<br />
encuentra <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l rango <strong>de</strong> %R teóricos esperados.<br />
En caso que se cuente con un MRC utilizar el rango <strong>de</strong> aceptabilidad seña<strong>la</strong>do en el certificado como<br />
criterio <strong>de</strong> aceptabilidad. Es <strong>de</strong>cir, el valor <strong>de</strong>terminado analíticamente <strong>de</strong>berá encontrase <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l<br />
rango <strong>de</strong> tolerancia establecido a través <strong>de</strong> certificado, es <strong>de</strong>cir, <strong>de</strong>l limite superior (LS) o limite inferior<br />
(LI).<br />
Cabe seña<strong>la</strong>r que el Co<strong>de</strong>x Alimentarius seña<strong>la</strong> que existen directrices re<strong>la</strong>tivas a los intervalos previstos<br />
<strong>de</strong> recuperación en áreas específicas <strong>de</strong> análisis, como por ejemplo: Residuos <strong>de</strong> p<strong>la</strong>guicidas (RP) o<br />
residuos <strong>de</strong> medicamentos veterinarios (RMV). En casos en los que se haya <strong>de</strong>mostrado que <strong>la</strong><br />
recuperación es una función <strong>de</strong> <strong>la</strong> matriz, podrán aplicarse otros requisitos especificados.<br />
Ejemplo <strong>de</strong> Ejercicio <strong>de</strong> Recuperación:<br />
Se utilizo fortificó una muestra <strong>de</strong> carne <strong>de</strong> marisco a una concentración 15 mg/100g <strong>de</strong> Cadmio y se<br />
analizo por fotometría <strong>de</strong> absorción atómica.<br />
Lectura C o C a C e R %R<br />
1 0,1 15,0 15,0 0,993 99,3<br />
2 0,0 15,0 14,0 0,933 93,3<br />
3 0,1 15,0 13,0 0,860 86,0<br />
4 0,1 15,0 16,0 1,060 106,0<br />
5 0,0 15,0 14,0 0,933 93,3<br />
6 0,2 15,0 13,0 0,853 85,3<br />
El promedio obtenido <strong>de</strong>l porcentaje <strong>de</strong> recuperación es <strong>de</strong> : %R = 93,9<br />
i) De acuerdo a tab<strong>la</strong> <strong>de</strong> AOAC al nivel <strong>de</strong> 10 ppm el valor aceptable es <strong>de</strong> 80 a 110 %R por lo cual el<br />
valor obtenido en <strong>la</strong> experiencia seria aceptable para el nivel medido en <strong>la</strong> matriz analizada.<br />
ii) En caso <strong>de</strong> utilizar como criterio <strong>de</strong> aceptabilidad <strong>la</strong> prueba t, entonces, <strong>la</strong> <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l valor<br />
<strong>de</strong> t calcu<strong>la</strong>do, sería:<br />
Desviación estándar <strong>de</strong>l % R, S%R = 7,90<br />
Mediciones, n=6<br />
t calc = [ 100 – 93,9] =0,315<br />
7,90 x√6<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 41
Se <strong>de</strong>sea <strong>de</strong>terminar si existe diferencia significativa entre el valor <strong>de</strong> % recuperación <strong>de</strong>terminado y el<br />
10% <strong>de</strong> Recuperación. Para <strong>de</strong>terminar el t critico para grados <strong>de</strong> libertad <strong>de</strong> ν= n-1 ( es <strong>de</strong>cir <strong>de</strong> 6-<br />
1=5), 2 co<strong>la</strong>s y un valor α =0,05 , se extrae <strong>de</strong> tab<strong>la</strong> t-stu<strong>de</strong>nt:<br />
2 co<strong>la</strong>s 80% 90% 95%<br />
αααα/2<br />
v<br />
0.10 0.05 0.025<br />
1 3.078 6.314 12.706<br />
2 1.886 2.920 4.303<br />
3 1.638 2.353 3.182<br />
4 1.533 2.132 2.776<br />
5 1.476 2.015 2.571<br />
6 1.440 1.943 2.447<br />
El t teórico o critico es <strong>de</strong> 2,015, cumpliéndose que tcalc < t crit , ya que 0,315 < 2,571. Es <strong>de</strong>cir no existen<br />
diferencias significativas.<br />
PRECISION: La precisión podrá establecerse en términos <strong>de</strong> repetibilidad y reproducibilidad. El<br />
grado <strong>de</strong> precisión se expresa habitualmente en términos <strong>de</strong> imprecisión y se calcu<strong>la</strong> como<br />
<strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> los resultados (Referencia: Manual Co<strong>de</strong>x Alimentarius 18º Ed.).<br />
a) Repetibilidad: Es <strong>la</strong> precisión bajo <strong>la</strong>s condiciones <strong>de</strong> repetibilidad, es <strong>de</strong>cir, condiciones don<strong>de</strong><br />
los resultados <strong>de</strong> análisis in<strong>de</strong>pendientes se obtienen con el mismo método en ítems <strong>de</strong> análisis<br />
idénticos en el mismo <strong>la</strong>boratorio por el mismo operador utilizando el mismo equipamiento<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> intervalos cortos <strong>de</strong> tiempo.<br />
Se pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar registrando a lo menos 6 mediciones bajo <strong>la</strong>s mismas condiciones (mismo<br />
operador, mismo aparato, mismo <strong>la</strong>boratorio y en corto intervalo <strong>de</strong> tiempo) <strong>de</strong> un analito en un<br />
Material <strong>de</strong> Referencia. Calcu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> Desviación Estándar (Sr) y el porcentaje <strong>de</strong> coeficiente <strong>de</strong><br />
variación (CVr%).<br />
b) Reproducibilidad: Es <strong>la</strong> precisión bajo <strong>la</strong>s condiciones <strong>de</strong> reproducibilidad, es <strong>de</strong>cir, condiciones<br />
don<strong>de</strong> los resultados <strong>de</strong> los análisis se obtienen con el mismo método en ítem idénticos <strong>de</strong><br />
análisis en condiciones diferentes ya sea <strong>de</strong> <strong>la</strong>boratorio, diferentes operadores, usando distintos<br />
equipos, entre otros.<br />
Para <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> precisión <strong>de</strong> <strong>la</strong> reproducibilidad intra<strong>la</strong>boratorio (Ri) ( es <strong>de</strong>cir, <strong>la</strong> precisión<br />
<strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> un <strong>la</strong>boratorio), se sugiere realizar 3 mediciones <strong>de</strong> un Material <strong>de</strong> Referencia (MRC o<br />
material control) una vez por cada semana o el comportamiento <strong>de</strong> <strong>la</strong> curva <strong>de</strong> calibración en 3<br />
días distintos.<br />
También, se pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>terminar registrando a lo menos 10 mediciones en días distintos, o en un<br />
mismo día cambiando a lo menos una condición analítica (ejemplo: operador, aparato, reactivos<br />
y <strong>la</strong>rgo intervalo <strong>de</strong> tiempo) <strong>de</strong> un analito en un Material <strong>de</strong> Referencia. Calcu<strong>la</strong>r <strong>la</strong> <strong>de</strong>sviación<br />
estándar (SRi)y el porcentaje <strong>de</strong> coeficiente <strong>de</strong> variación (CVRi%).<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 42
Cuando se <strong>de</strong>sea <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> reproducibilidad inter<strong>la</strong>boratorios para fines <strong>de</strong> validación <strong>de</strong> un<br />
método, <strong>de</strong>ben participar diferentes <strong>la</strong>boratorios, se <strong>de</strong>be tener en consi<strong>de</strong>ración que estos<br />
utilicen el mismo método y misma muestra, en un intervalo <strong>de</strong> tiempo preferentemente<br />
establecido, se <strong>de</strong>termina <strong>de</strong> este modo <strong>la</strong> <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> los resultados obtenidos por<br />
los diferentes <strong>la</strong>boratorios (SR).<br />
El criterio <strong>de</strong> aceptabilidad para <strong>la</strong> precisión se pue<strong>de</strong> hacer en base a coeficiente <strong>de</strong> variación <strong>de</strong><br />
Horwitz :<br />
CVh% = 2 (1-0.5)log C ó también se expresa como; CVh%= 0,02 x c 0.8495<br />
Don<strong>de</strong>:<br />
C= valor nominal <strong>de</strong>l analito expresado en potencia <strong>de</strong> 10, ejemplo 1ppm = 1mg/L =10 -6<br />
En este sentido se establece para <strong>la</strong> repetibilidad, el CVr% obtenido <strong>de</strong>be ser < (CVh%/2).<br />
En el caso <strong>de</strong> <strong>la</strong> reproducibilidad inter<strong>la</strong>boratorio el CVR%
Si el valor asignado es <strong>de</strong> 1 mg/Kg , para el calculo <strong>de</strong> Coeficiente <strong>de</strong> variación porcentual <strong>de</strong> horwitz ,<br />
el valor nominal <strong>de</strong>l analito es equivalente a 0,00000120, es <strong>de</strong>cir a 1,2 x 10-6. y el CV%hr para<br />
repetibilidad es <strong>la</strong> mitad <strong>de</strong>l valor calcu<strong>la</strong>do <strong>de</strong>l CV%h .<br />
CVh% = 2 (1-0.5)log 0,0000012 = 7,78%<br />
2<br />
De acuerdo a Horwitz el CV% para repetibilidad es <strong>de</strong> 7,78%. Por lo cual se cumple el criterio <strong>de</strong><br />
aceptabilidad establecido.<br />
En caso que se <strong>de</strong>see se pue<strong>de</strong> realizar el estudio <strong>de</strong> reproducibilidad y repetibilidad, a través <strong>de</strong> un<br />
análisis <strong>de</strong> varianza (ver anexo Nº III). El estudio ANOVA (<strong>de</strong> factores totalmente anidados y<br />
homogéneos) consiste en el análisis simple <strong>de</strong> varianza <strong>de</strong> <strong>la</strong>s <strong>de</strong>sviaciones estándar para cada uno <strong>de</strong><br />
los niveles <strong>de</strong> ensayo, para su <strong>de</strong>terminación se podrá utilizar si se dispone <strong>de</strong> un software estadístico o<br />
una p<strong>la</strong>nil<strong>la</strong> Excel.<br />
Ejemplo <strong>de</strong> estudio <strong>de</strong> reproducibilidad:<br />
Se realizó el análisis <strong>de</strong> varianza a 10 muestras <strong>de</strong> sulfatos en aguas 1 mg/L en un total <strong>de</strong> 10<br />
experiencias.<br />
Promedio obtenido X= 0,95 mg/Kg<br />
Lectura Fecha C obtenida mg/L<br />
1 día 1 1,08<br />
2 día 1 1,07<br />
3 día 2 1,00<br />
4 día 3 1,10<br />
5 día 4 0,99<br />
6 día 5 1,00<br />
7 día 6 1,02<br />
8 día 8 1,05<br />
9 día 8 1,06<br />
10 día 8 1,09<br />
La <strong>de</strong>sviación estándar obtenida es <strong>de</strong> SRi = 0,041 mg/Kg<br />
El coeficiente <strong>de</strong> variación porcentual obtenido es CVRi% =3,88%<br />
El coeficiente <strong>de</strong> variación porcentual <strong>de</strong> Horwitz es:<br />
CVhRi% = 2 x 2 (1-0.5)log 0,0000010 = 10,67%<br />
3<br />
De acuerdo a Horwitz el CV% para reproducibilidad es <strong>de</strong> 10,67%. Por lo cual se cumple el criterio <strong>de</strong><br />
aceptabilidad establecido, ya que . CVRi% < CVhRi%<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 44
ROBUSTEZ<br />
La robustez es una medida <strong>de</strong> <strong>la</strong> capacidad <strong>de</strong> un procedimiento analítico <strong>de</strong> no ser afectado por<br />
variaciones pequeñas pero <strong>de</strong>liberadas <strong>de</strong> los parámetros <strong>de</strong>l método; proporciona una indicación <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
fiabilidad <strong>de</strong>l procedimiento en un uso normal. En este sentido el objetivo <strong>de</strong> <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong> robustez es<br />
optimizar el método analítico <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>do o implementado por el <strong>la</strong>boratorio, y <strong>de</strong>scribir bajo que<br />
condiciones analíticas ( incluidas sus tolerancias), se pue<strong>de</strong>n obtener a través <strong>de</strong> este resultados<br />
confiables.<br />
Un método <strong>de</strong> ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una<br />
modificación <strong>de</strong> <strong>la</strong>s condiciones analíticas.<br />
Entre <strong>la</strong>s condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran:<br />
• Analistas<br />
• Equipos<br />
• Reactivos<br />
• pH<br />
• temperatura.<br />
• Tiempo <strong>de</strong> reacción.<br />
• Estabilidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra.<br />
• Otros.<br />
Para esta <strong>de</strong>terminación se aplica el Test <strong>de</strong> You<strong>de</strong>n y Steiner para <strong>la</strong> evaluación <strong>de</strong> <strong>la</strong> robustez <strong>de</strong> un<br />
método químico analítico. Este procedimiento permite evaluar el efecto <strong>de</strong> siete variables con sólo<br />
ocho análisis <strong>de</strong> una muestra.<br />
Para proce<strong>de</strong>r a realizar el estudio <strong>de</strong> robustez se <strong>de</strong>ben i<strong>de</strong>ntificar aquellos factores <strong>de</strong>l método que<br />
posiblemente afectarían los resultados finales obtenidos a través <strong>de</strong> este.<br />
Estas factores están presentes habitualmente en el método (ejemplo: temperatura, composición <strong>de</strong><br />
fase móvil o soluciones reactivas, pH <strong>de</strong> solución, tamaño <strong>de</strong> celda espectrofotométrica, flujo gas<br />
carrier, split, etc.). Para estudiar <strong>la</strong> robustez se proce<strong>de</strong> a exponer a cada factor a un estudio <strong>de</strong><br />
variable, es <strong>de</strong>cir se expone a una variación respecto <strong>de</strong> <strong>la</strong> establecida en el método, es <strong>de</strong>cir, cada<br />
variable se estudia mediante un valor alto (A, B,...,G) y otro bajo (a,b,...,g). Una vez establecidos estos<br />
valores se diseñan ocho pruebas <strong>de</strong> ensayo como, por ejemplo, muestra <strong>la</strong> tab<strong>la</strong> Nº 3.<br />
Los factores a estudiar no <strong>de</strong>ben ser necesariamente siete; pue<strong>de</strong> consi<strong>de</strong>rarse un número menor <strong>de</strong><br />
variables. Esto no afectará el ba<strong>la</strong>nce <strong>de</strong>l diseño <strong>de</strong>l experimento, pero es importante consi<strong>de</strong>rar que<br />
siempre se <strong>de</strong>n llevar a cabo los ocho pruebas <strong>de</strong> ensayo indicado.<br />
Los resultados <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica obtenidos con <strong>la</strong>s variaciones realizadas en estas 8 pruebas se<br />
representan con <strong>la</strong>s letras s hasta <strong>la</strong> z.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 45
A partir <strong>de</strong> los resultados pue<strong>de</strong> calcu<strong>la</strong>rse el efecto <strong>de</strong> cada una <strong>de</strong> <strong>la</strong>s variables haciendo <strong>la</strong> media <strong>de</strong><br />
los cuatro análisis que contienen <strong>la</strong> variable en su valor más alto (mayúscu<strong>la</strong>) y aquel<strong>la</strong>s que<br />
correspon<strong>de</strong>n al valor más bajo (minúscu<strong>la</strong>). Así, para evaluar el efecto <strong>de</strong> <strong>la</strong> primera variable obsérvese<br />
que:<br />
(s + t +u +v) = 4A = A y (w + x + y +z) = 4a = a<br />
4 4 4 4<br />
Es <strong>de</strong>cir, <strong>la</strong> media <strong>de</strong> los resultados (s + t + u + v) equivalen a “A” porque <strong>la</strong>s seis restantes variables<br />
presentes en estos cuatro resultados se anu<strong>la</strong>n entre sí como consecuencia <strong>de</strong> que existen siempre dos<br />
mayúscu<strong>la</strong>s y dos minúscu<strong>la</strong>s <strong>de</strong> cada variable. Análogamente, <strong>la</strong> media <strong>de</strong> los resultados (w + x + y + z)<br />
equivalen a “a”.<br />
Para cualquier otra variable se pue<strong>de</strong> proce<strong>de</strong>r <strong>de</strong> manera simi<strong>la</strong>r, tal como muestra <strong>la</strong> tab<strong>la</strong> siguiente:<br />
Tab<strong>la</strong> Nº 3: Prueba <strong>de</strong> Robustez <strong>de</strong> Youn<strong>de</strong>n y Steiner<br />
Valor <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
ANALISIS<br />
condición<br />
variable<br />
1 2 3 4 5 6 7 8<br />
A,a A A A A a a a a<br />
B,b B B B b B b b b<br />
C,c C c C c C c C c<br />
D.d D D d d d d D D<br />
E,e E e E e e E e E<br />
F,f F f f F F f f F<br />
G,g G g g G g G G g<br />
RESULTADOS s t u v w x y z<br />
Se <strong>de</strong>ben establecer <strong>la</strong>s siete comparaciones posibles, es <strong>de</strong>cir <strong>la</strong>s diferencias entre <strong>la</strong> variable <strong>de</strong> mayor<br />
valor versus <strong>la</strong> <strong>de</strong> menor valor:<br />
(A – a), (B – b), (C – c), (D – d), (E – e), (F – f) y (G – g)<br />
De este modo se pue<strong>de</strong> conocer el efecto <strong>de</strong> cada variable. En este sentido, cuanto mayor sea <strong>la</strong><br />
diferencia <strong>de</strong> los resultados entre el valor mayor y el valor menor (Δ = X-x), mayor influencia tendrá<br />
dicha variable en el método analítico.<br />
Como criterio <strong>de</strong> aceptación para <strong>la</strong> robustez <strong>de</strong>l método se consi<strong>de</strong>ra que <strong>la</strong> diferencia entre el valor<br />
alto y el valor bajo sea superior a √2 <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> <strong>la</strong> precisión <strong>de</strong>l método (S), es <strong>de</strong>cir:<br />
( X-x ) < √2 S.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 46
Una información adicional <strong>de</strong> este test <strong>de</strong> You<strong>de</strong>n es que <strong>la</strong> <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> los resultados s a z<br />
constituye una medida excelente <strong>de</strong> <strong>la</strong> imprecisión previsible <strong>de</strong>l método cuando se utiliza para el<br />
análisis <strong>de</strong> rutina, ya que este procedimiento introduce <strong>de</strong>liberadamente el tipo <strong>de</strong> variación en <strong>la</strong>s<br />
variables que pue<strong>de</strong> esperarse que ocurra durante el empleo normal <strong>de</strong>l método.<br />
Ejemplo: Robustez para turbiedad.<br />
CONDICIÓN VARIABLE ANALISIS<br />
Tipo C<strong>la</strong>ve<br />
Valor<br />
Alto X<br />
Valor<br />
Bajo x 1 2 3 4 5 6 7 8<br />
Temperatura, ºC A,a 22 15 22 22 22 22 15 15 15 15<br />
Cubeta, tipo B,b 1 2 1 1 2 2 1 1 2 2<br />
Tiempo Agitación, seg C,c 60 30 60 30 60 30 60 30 60 30<br />
Tiempo Lectura, seg D,d 30 0 30 30 0 0 0 0 30 30<br />
Siliconado E,e si no si no si no no si no si<br />
Volumen, mL F,f 30 25 30 25 25 30 30 25 25 30<br />
Estabilización equipo, h G,g 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0<br />
s t u v w x y z<br />
RESULTADOS (NTU) 20,1 20,7 22,0 21,3 22,3 22,2 20,6 21,1<br />
Para <strong>la</strong>s variables A y a :<br />
Don<strong>de</strong> el promedio <strong>de</strong> A se calcu<strong>la</strong>: 20,1 + 20,7 + 22,0 + 21,3 = 21,0<br />
4<br />
Don<strong>de</strong> el promedio <strong>de</strong> a se calcu<strong>la</strong>: 22,3 + 22,2 + 20,6 + 21,1 = 21,6<br />
4<br />
Para <strong>la</strong>s variables B y b :<br />
Don<strong>de</strong> el promedio <strong>de</strong> B se calcu<strong>la</strong>: 20,1 + 20,7 + 22,3 + 22,2 = 21,3<br />
4<br />
Don<strong>de</strong> el promedio <strong>de</strong> b se calcu<strong>la</strong>: 22,0 + 21,3 + 20,6 + 21,1 = 21,3<br />
4<br />
Condición Variable Resultados Diferencia Comparación<br />
Valor Alto X Valor Bajo x Promedio X Promedio x ∆(X-x) ∆ < √2 DS<br />
A a 21,0 21,6 0,525 No Sensible a Variable<br />
B b 21,3 21,3 0,075 No Sensible a Variable<br />
C c 21,3 21,3 0,075 No Sensible a Variable<br />
D d 20,6 22,0 1,325 Sensible a Variable<br />
E e 21,4 21,2 0,125 No Sensible a Variable<br />
F f 21,2 21,4 0,175 No Sensible a Variable<br />
G g 21,1 21,5 0,475 No Sensible a Variable<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 47
S: 0,813 √2 S: 1,150<br />
Por lo tanto <strong>la</strong>s variables sensibles, no <strong>de</strong>berán modificarse <strong>la</strong>s variables que se establecieron como<br />
sensibles en el estudio <strong>de</strong> robustez, y se <strong>de</strong>berá mantener el valor nominal establecido en el método,<br />
para dicha condición.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 48
APLICABILIDAD<br />
Se utiliza el término <strong>de</strong> Aplicabilidad, cuando un método <strong>de</strong> análisis pue<strong>de</strong> utilizarse satisfactoriamente<br />
para los analitos, matrices y concentraciones previstas. La <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración <strong>de</strong> aplicabilidad (o ámbito <strong>de</strong><br />
aplicación), a<strong>de</strong>más <strong>de</strong> una <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración <strong>de</strong>l margen <strong>de</strong> funcionamiento satisfactorio para cada factor,<br />
pue<strong>de</strong> incluir también advertencias acerca <strong>de</strong> <strong>la</strong> interferencia conocida <strong>de</strong> otros analitos, o <strong>de</strong> <strong>la</strong><br />
inaplicabilidad a <strong>de</strong>terminadas matrices y situaciones.<br />
Es <strong>de</strong>cir, <strong>la</strong> aplicabilidad consiste en una <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración <strong>de</strong> <strong>la</strong>s especificaciones <strong>de</strong>l rendimiento <strong>de</strong>l<br />
método, que se entrega en el informe <strong>de</strong> validación y que normalmente incluye <strong>la</strong> siguiente<br />
información:<br />
• La i<strong>de</strong>ntidad <strong>de</strong> <strong>la</strong> sustancia analizada, incluyendo en su caso, <strong>de</strong> especiación (por ejemplo, "el<br />
arsénico total",”metil-mercurio”).<br />
• El intervalo <strong>de</strong> concentraciones cubierto por <strong>la</strong> validación (por ejemplo, "0-50 ppm")<br />
• Una especificación <strong>de</strong> <strong>la</strong> gama <strong>de</strong> <strong>la</strong>s matrices <strong>de</strong>l material <strong>de</strong> prueba cubierto por <strong>la</strong> validación (por<br />
ejemplo,"marisco", “productos lácteos”, etc.).<br />
• La aplicación prevista y <strong>de</strong> sus requisitos <strong>de</strong> <strong>incertidumbre</strong> críticos. (ejemplo: análisis <strong>de</strong> residuos <strong>de</strong><br />
p<strong>la</strong>guicidas en frutas cítricas <strong>de</strong> acuerdo al reg<strong>la</strong>mento sanitario <strong>de</strong> alimentos).<br />
En este sentido, <strong>la</strong> prueba <strong>de</strong> aplicabilidad, consiste en el ámbito <strong>de</strong> aplicación <strong>de</strong>l método <strong>de</strong>c<strong>la</strong>rado<br />
por el responsable <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación, una vez concluida esta.<br />
En aquellos casos que se trate <strong>de</strong> un método normalizado u oficializado, esta <strong>de</strong>c<strong>la</strong>ración se realiza <strong>de</strong><br />
acuerdo a los antece<strong>de</strong>ntes bibliográficos o normativos <strong>de</strong>l método.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 49
V: INCERTIDUMBRE<br />
La <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong> una medición es el parámetro asociado al resultado, es <strong>de</strong>cir, caracteriza <strong>la</strong><br />
dispersión <strong>de</strong> los valores que razonablemente pue<strong>de</strong>n ser atribuidos al mesurando.<br />
En este sentido, es importante que para un método validado o verificado por el <strong>la</strong>boratorio, se realice<br />
<strong>la</strong> <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> <strong>la</strong>s diferentes fuentes o componentes <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> medición<br />
presentes:<br />
a) Muestreo<br />
b) Efectos <strong>de</strong> <strong>la</strong> muestra: tipo <strong>de</strong> matriz, almacenamiento, etc.<br />
c) Sesgos Instrumentales: Las <strong>de</strong>bidas a <strong>la</strong>s características <strong>de</strong> los equipos utilizados para realizar <strong>la</strong>s<br />
medidas tales como: <strong>de</strong>riva, resolución, magnitu<strong>de</strong>s <strong>de</strong> influencia. Ejemplo: temperatura<br />
d) Pureza <strong>de</strong> Reactivos: materiales <strong>de</strong> referencia, preparación <strong>de</strong> estándares.<br />
e) Analista: Las <strong>de</strong>bidas a <strong>la</strong> serie <strong>de</strong> mediciones: variaciones en observaciones repetidas bajo<br />
condiciones aparentemente iguales. Ejemplo: parale<strong>la</strong>je<br />
f) Condiciones <strong>de</strong> medición: Las <strong>de</strong>bidas al certificado <strong>de</strong> calibración: en él se establecen <strong>la</strong>s<br />
correcciones y <strong>la</strong>s <strong>incertidumbre</strong>s asociadas a el<strong>la</strong>s, para un valor <strong>de</strong> k <strong>de</strong>terminado, en <strong>la</strong>s condiciones<br />
<strong>de</strong> calibración. Ejemplo: material volumétrico, etc.<br />
g) Condiciones <strong>de</strong> medición: temperatura, humedad, etc.<br />
h) Otras: Método (por ejemplo al interpo<strong>la</strong>r en una recta), tab<strong>la</strong>s (por ejemplo <strong>la</strong>s constantes), pesada,<br />
alícuota, efectos computacionales, etc.<br />
Generalmente para el análisis <strong>de</strong> <strong>la</strong>s fuentes <strong>de</strong> <strong>incertidumbre</strong> se utiliza el diagrama <strong>de</strong> espina <strong>de</strong><br />
pescado u otro tipo <strong>de</strong> diseño esquemático que permita con facilidad i<strong>de</strong>ntificar <strong>la</strong>s fuentes <strong>de</strong><br />
<strong>incertidumbre</strong> presentes durante el proceso analítico. Ejemplo:<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 50
La <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> medición compren<strong>de</strong>, en general, muchos componentes. Algunos <strong>de</strong> estos<br />
pue<strong>de</strong>n ser evaluados por tipo.<br />
Para este fin el <strong>la</strong>boratorio <strong>de</strong>berá realizar una evaluación <strong>de</strong> <strong>la</strong>s <strong>incertidumbre</strong>s tipo A y B que<br />
están presentes en el método:<br />
Evaluación <strong>de</strong> <strong>incertidumbre</strong> tipo A: Evaluación <strong>de</strong> un componente por un análisis estadístico <strong>de</strong> los<br />
valores <strong>de</strong> mediciones obtenidos en condiciones <strong>de</strong> medición <strong>de</strong>finidas. Ejemplo: realizar varias<br />
mediciones en condiciones <strong>de</strong> repetibilidad.<br />
Evaluación <strong>de</strong> <strong>incertidumbre</strong> tipo B: Evaluación <strong>de</strong> un componente <strong>incertidumbre</strong> <strong>de</strong> <strong>la</strong> medición<br />
realizada por otros medios distinto a los <strong>de</strong>l tipo A. Ejemplos: La evaluación basada en <strong>la</strong> información,<br />
obtenidos a partir <strong>de</strong> un certificado <strong>de</strong> calibración, obtenidos a partir <strong>de</strong> los límites <strong>de</strong>ducirse a través<br />
<strong>de</strong> personal <strong>la</strong> experiencia, etc.<br />
En general, <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> esta dada por los errores sistemáticos y aleatorios presentes en el ensayo<br />
analítico.<br />
Fuente: National Food Administration of Swe<strong>de</strong>n.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 51
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> incluye generalmente 4 pasos, el primero como se ha dicho<br />
anteriormente correspon<strong>de</strong> a <strong>la</strong> <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> <strong>la</strong>s fuentes, el segundo en expresar los<br />
componentes en una <strong>incertidumbre</strong> estándar , el tercero combinar <strong>la</strong>s diferentes <strong>incertidumbre</strong>s y el<br />
cuarto paso es <strong>la</strong> <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> expandida es <strong>de</strong>cir, multiplicar <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong><br />
combinada por un factor <strong>de</strong> cobertura <strong>de</strong> k = 2, a fin <strong>de</strong> entregar un 95% <strong>de</strong> confianza, y así establecer<br />
el intervalo entorno al resultado <strong>de</strong> <strong>la</strong> medición en el cual se pue<strong>de</strong> esperar que se incluya <strong>la</strong> mayor<br />
fracción <strong>de</strong> <strong>la</strong> distribución <strong>de</strong> los valores que se pue<strong>de</strong>n atribuir razonablemente al mesurando.<br />
Los resultados obtenido se expresaran como por ejemplo: 178 μg/L + 14 μg/L , que correspon<strong>de</strong> a 178<br />
μg/L + ( 2x7 μg/L), es <strong>de</strong>cir, el resultado entregado, correspon<strong>de</strong> a un intervalo <strong>de</strong> “a ± 2u” que<br />
representa un nivel <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong>l 95 % <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong>l cual se encontraría el valor real.<br />
En algunos casos pue<strong>de</strong>n existir mayores exigencias en cuanto al valor <strong>de</strong>l factor <strong>de</strong> cobertura utilizado<br />
para obtener <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> expandida, pudiéndose solicitar o requerir un k = 3, a fin <strong>de</strong> entregar un<br />
99,7 % <strong>de</strong> confianza, esto generalmente se pue<strong>de</strong> solicitar frente a <strong>de</strong>terminados contaminantes o<br />
residuos.<br />
La <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> <strong>la</strong> <strong>incertidumbre</strong> realizada por el <strong>la</strong>boratorio <strong>de</strong>be estar <strong>de</strong>bidamente<br />
documentada.<br />
Para <strong>de</strong>mostrar que un método analítico es a<strong>de</strong>cuado para el fin previsto, el <strong>la</strong>boratorio <strong>de</strong>berá<br />
<strong>de</strong>mostrar a través <strong>de</strong> una evi<strong>de</strong>ncia objetiva que el método analítico ha sido a<strong>de</strong>cuadamente validado<br />
o verificado.<br />
En este sentido, el <strong>la</strong>boratorio <strong>de</strong>be <strong>de</strong>mostrar que <strong>la</strong>s características <strong>de</strong> <strong>de</strong>sempeño <strong>de</strong>l método<br />
analítico utilizado, son a<strong>de</strong>cuadas para el uso <strong>de</strong>stinado:<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 52
Fuente: National Food Administration of Swe<strong>de</strong>n.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 53
VI: ANEXOS<br />
ANEXO Nº 1: FORMATO TIPO DE PLAN DE VALIDACION<br />
1) Alcance <strong>de</strong> <strong>la</strong> validación:<br />
Método:<br />
Analito:<br />
Matrices:<br />
Requerimientos <strong>de</strong>l método:<br />
PLAN DE VALIDACION<br />
Tipo: <strong>Validación</strong> retrospectiva <strong>Validación</strong> prospectiva Verificación<br />
Procedimiento <strong>de</strong> validación:<br />
2) Diseño experimental:<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 54<br />
Nº:_____<br />
[Seña<strong>la</strong>r Matrices <strong>de</strong> <strong>la</strong>s muestras:, Testigos reactivos, B<strong>la</strong>nco matriz, Material <strong>de</strong><br />
referencia y/o Material <strong>de</strong> referencia certificado, Muestras fortificadas y niveles <strong>de</strong><br />
fortificación.<br />
Indicar <strong>la</strong>s prueba(s) y parámetro(s) <strong>de</strong> validación a evaluar, número <strong>de</strong> análisis<br />
requeridos según prueba(s) y criterios <strong>de</strong> aceptabilidad para cada parámetro <strong>de</strong><br />
validación<br />
Seña<strong>la</strong>r analista(s) responsable <strong>de</strong> realizar <strong>la</strong>(s) prueba(s) analítica(s) y Fecha(s)<br />
programadas]<br />
:<br />
página x <strong>de</strong> y
3) Materiales, insumos y equipos necesarios para <strong>de</strong>sarrol<strong>la</strong>r <strong>la</strong> validación:<br />
P<strong>la</strong>n <strong>de</strong> validación e<strong>la</strong>borado por Firma Fecha E<strong>la</strong>boración<br />
Nombre:<br />
Cargo:<br />
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
Comentarios, observaciones o modificaciones al p<strong>la</strong>n: Fecha Firma<br />
Página x <strong>de</strong> y<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 55
ANEXO Nº 2: FORMATO TIPO DE INFORME DE VALIDACION<br />
Nº <strong>Validación</strong>:__________<br />
IDENTIFICACIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO VALIDADO<br />
Nombre completo <strong>de</strong>l método:<br />
INFORME DE VALIDACION DE MÉTODO DE ENSAYO<br />
Tipo Método: Cualitativo Cuantitativo <br />
Normalizado Normalizado modificado No Normalizado Nuevo <br />
Analito:<br />
Responsable <strong>Validación</strong>:<br />
Unida<strong>de</strong>s:<br />
Matriz (o matrices):<br />
Firma:<br />
Fecha:<br />
IDENTIFICACIÓN DE MATERIALES, INSUMO O EQUIPOS EMPLEADOS<br />
Equipos involucrados: (Nombre, marca, mo<strong>de</strong>lo, número <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación, tipo <strong>de</strong> columnas, tipo <strong>de</strong> <strong>de</strong>tectores, etc.)<br />
Soluciones estándares y/o patrones involucrados: (Nombre, marca, mo<strong>de</strong>lo, número <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación,<br />
concentraciones, etc.)<br />
Material <strong>de</strong> Referencia: (Nombre, marca, código <strong>de</strong> i<strong>de</strong>ntificación, valores asignadas, unida<strong>de</strong>s, etc.)<br />
Material <strong>de</strong> Referencia Certificado: (Nombre, marca, Cód. i<strong>de</strong>ntificación, Nº certificado, valores asignadas, unida<strong>de</strong>s,<br />
trazabilidad , etc.)<br />
página x <strong>de</strong> y<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 56
PARÁMETROS DE VALIDACIÓN<br />
Pruebas realizadas:<br />
Selectividad<br />
Linealidad Sensibilidad Límites<br />
Exactitud: Veracidad Precisión<br />
Robustez<br />
Otros:<br />
RESULTADOS DE LAS PRUEBAS EXPERIMENTALES REALIZADAS<br />
Linealidad<br />
Descripción : (Breve <strong>de</strong>scripción <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica).<br />
Tipo <strong>de</strong> calibración:<br />
Calibración externa Calibración en matriz<br />
Calibración externa estándar interno (SI) Calibración en matriz estándar interno (SI)<br />
Ecuación recta: Intervalos <strong>de</strong> confianza :<br />
ICm máx.: min.:<br />
ICLo máx.: min.:<br />
Valor obtenido Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Rango Lineal:<br />
Coeficiente <strong>de</strong> Corre<strong>la</strong>ción (γ):<br />
Comentarios:<br />
Sensibilidad<br />
Descripción : (Breve <strong>de</strong>scripción <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica).<br />
pendiente, m :<br />
Concentración característica:<br />
Comentarios:<br />
Valor obtenido Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
página x <strong>de</strong> y<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 57
Limites:<br />
Descripción<br />
Limite critico, LC:<br />
Limite <strong>de</strong>tección, LOD:<br />
Limite <strong>de</strong> cuantificación, LOQ:<br />
Comentarios:<br />
SELECTIVIDAD<br />
Descripción (Breve <strong>de</strong>scripción <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica).<br />
(Breve <strong>de</strong>scripción <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica).<br />
Valor obtenido (unida<strong>de</strong>s) Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Valor obtenido (unida<strong>de</strong>s) Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Longitud <strong>de</strong> onda (λmáx.)<br />
Longitud <strong>de</strong> onda (λem)/ (λex)<br />
Masa monitoreada<br />
Transicion(es) monitoreda (s)<br />
% Falsos positivos<br />
% Falsos negativos<br />
Interferencia(s) Conocida(s): Corrección(es) a Interferencias:<br />
Comentarios:<br />
EXACTITUD<br />
Precisión<br />
Descripción (Breve <strong>de</strong>scripción <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica).<br />
Precisión en condiciones <strong>de</strong> Repetibilidad<br />
Nivel/concentración (unida<strong>de</strong>s) SD r % CV r Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Comentarios:<br />
página x <strong>de</strong> y<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 58
Precisión en Condiciones <strong>de</strong> Reproducibilidad<br />
Nivel/concentración (unida<strong>de</strong>s) SD Ri % CV Ri Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Comentarios:<br />
Precisión <strong>de</strong>l método %RSD<br />
Horrat<br />
Comentarios:<br />
Veracidad<br />
Descripción (Breve <strong>de</strong>scripción <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica).<br />
Lectura obtenida, X<br />
Sesgo, s:<br />
t-Stu<strong>de</strong>nt, t:<br />
Comentarios:<br />
Valor obtenido (unida<strong>de</strong>s) Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Valor obtenido (unida<strong>de</strong>s) Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Reproducibilidad<br />
Nivel/concentración (unida<strong>de</strong>s) R % R tobs Criterio(s) <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
Comentarios:<br />
página x <strong>de</strong> y<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 59
ROBUSTEZ<br />
Descripción (Breve <strong>de</strong>scripción <strong>de</strong> <strong>la</strong> experiencia analítica).<br />
∆ A,a<br />
∆B,b<br />
∆C,c<br />
∆D.d<br />
∆E,e<br />
∆F,f<br />
∆G,g<br />
Variables<br />
A,a B,b C,c D.d E,e F,f G,g<br />
Resultados<br />
s t u v w x y z S sz<br />
APLICABILIDAD<br />
(X-x) Valor obtenido (unida<strong>de</strong>s) Criterio <strong>de</strong> Aceptabilidad<br />
(Dec<strong>la</strong>ración <strong>de</strong>l campo <strong>de</strong> aplicación <strong>de</strong>l método: analito, rango <strong>de</strong> trabajo, unida<strong>de</strong>s, matrices y advertencias acerca <strong>de</strong> <strong>la</strong> interferencia<br />
conocida en <strong>la</strong>s cuales se ha <strong>de</strong>mostrado <strong>la</strong> validación).<br />
ANEXOS<br />
(Anexar al presente informe los documentos necesarios para respaldar <strong>la</strong> información, los registros o reportes entregados por el equipo y copia<br />
<strong>de</strong> <strong>la</strong> p<strong>la</strong>nil<strong>la</strong>s <strong>de</strong> cálculos generadas en el proceso analítico):<br />
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
Revisado por: <strong>Validación</strong>: Firma Fecha<br />
Nombre:<br />
Cargo:<br />
OBSERVACIONES<br />
Aceptada <br />
Rechazada <br />
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------<br />
página x <strong>de</strong> y<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 60
ANEXO Nº 3: TABLA DE LA DISTRIBUCIÓN t-Stu<strong>de</strong>nt<br />
2 co<strong>la</strong>s<br />
v<br />
1 co<strong>la</strong><br />
v<br />
αααα/2<br />
αααα<br />
80% 90% 95% 98% 99%<br />
0.10 0.05 0.025 0,01 0,0015<br />
90% 95% 97.5% 99% 99,5%<br />
0.10 0.05 0.025 0,01 0,0015<br />
1 3.078 6.314 12.706 31.821 63.657<br />
2 1.886 2.920 4.303 6.965 9.925<br />
3 1.638 2.353 3.182 4.541 5.841<br />
4 1.533 2.132 2.776 3.747 4.604<br />
5 1.476 2.015 2.571 3.365 4.032<br />
6 1.440 1.943 2.447 3.143 3.707<br />
7 1.415 1.895 2.365 2.998 3.499<br />
8 1.397 1.860 2.306 2.896 3.355<br />
9 1.383 1.833 2.262 2.821 3.250<br />
10 1.372 1.812 2.228 2.764 3.169<br />
11 1.363 1.796 2.201 2.718 3.106<br />
12 1.356 1.782 2.179 2.681 3.055<br />
13 1.350 1.771 2.160 2.650 3.012<br />
14 1.345 1.761 2.145 2.624 2.977<br />
15 1.341 1.753 2.131 2.602 2.947<br />
16 1.337 1.746 2.120 2.583 2.921<br />
17 1.333 1.740 2.110 2.567 2.898<br />
18 1.330 1.734 2.101 2.552 2.878<br />
19 1.328 1.729 2.093 2.539 2.861<br />
20 1.325 1.725 2.086 2.528 2.845<br />
21 1.323 1.721 2.080 2.518 2.831<br />
22 1.321 1.717 2.074 2.508 2.819<br />
23 1.319 1.714 2.069 2.500 2.807<br />
24 1.318 1.711 2.064 2.492 2.797<br />
25 1.316 1.708 2.060 2.485 2.787<br />
26 1.315 1.706 2.056 2.479 2.779<br />
27 1.314 1.703 2.052 2.473 2.771<br />
28 1.313 1.701 2.048 2.467 2.763<br />
29 1.311 1.699 2.045 2.462 2.756<br />
30 1.310 1.697 2.042 2.457 2.750<br />
40 1.303 1.684 2.021 2.423 2.704<br />
60 1.296 1.671 2.000 2.390 2.660<br />
120 1.289 1.658 1.980 2.358 2.617<br />
∞ 1.282 1.645 1.960 2.326 2.576<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 61
ANEXO Nº 4: TABLA F<br />
F DISTRIBUCIÓN (α= 0,05)<br />
Grados <strong>de</strong> libertad <strong>de</strong>l numerador<br />
F crítico 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20<br />
Grados <strong>de</strong> libertad <strong>de</strong>l <strong>de</strong>nominador<br />
1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316 241.88193<br />
2 18.51276 19.00003 19.16419 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474 19.39588<br />
3 10.12796 9.55208 9.27662 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232 8.78549<br />
4 7.70865 6.94428 6.59139 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880 5.96435<br />
5 6.60788 5.78615 5.40945 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246 4.73506<br />
6 5.98737 5.14325 4.75706 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901 4.05996<br />
7 5.59146 4.73742 4.34683 4.12031 3.97152 3.86598 3.78705 3.72572 3.67667 3.63653<br />
8 5.31764 4.45897 4.06618 3.83785 3.68750 3.58058 3.50046 3.43810 3.38812 3.34717<br />
9 5.11736 4.25649 3.86254 3.63309 3.48166 3.37376 3.29274 3.22959 3.17890 3.13727<br />
10 4.96459 4.10282 3.70827 3.47805 3.32584 3.21718 3.13547 3.07166 3.02038 2.97824<br />
11 4.84434 3.98231 3.58743 3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622 2.85362<br />
12 4.74722 3.88529 3.49030 3.25916 3.10587 2.99612 2.91335 2.84857 2.79638 2.75339<br />
13 4.66719 3.80557 3.41053 3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436 2.67102<br />
14 4.60011 3.73889 3.34389 3.11225 2.95825 2.84773 2.76420 2.69867 2.64579 2.60216<br />
15 4.54307 3.68232 3.28738 3.05557 2.90130 2.79046 2.70663 2.64080 2.58763 2.54371<br />
16 4.49400 3.63372 3.23887 3.00692 2.85241 2.74131 2.65720 2.59109 2.53767 2.49351<br />
17 4.45132 3.59154 3.19677 2.96471 2.81000 2.69866 2.61430 2.54796 2.49429 2.44992<br />
18 4.41386 3.55456 3.15991 2.92775 2.77285 2.66130 2.57672 2.51016 2.45628 2.41170<br />
19 4.38075 3.52189 3.12735 2.89511 2.74006 2.62832 2.54354 2.47677 2.42270 2.37793<br />
20 4.35125 3.49283 3.09839 2.86608 2.71089 2.59898 2.51401 2.44707 2.39282 2.34787<br />
21 4.32479 3.46679 3.07247 2.84010 2.68478 2.57271 2.48758 2.42046 2.36605 2.32095<br />
22 4.30094 3.44336 3.04912 2.81671 2.66127 2.54906 2.46377 2.39650 2.34193 2.29669<br />
23 4.27934 3.42213 3.02800 2.79554 2.64 2.52766 2.44223 2.37481 2.32011 2.27472<br />
24 4.25968 3.40283 3.00879 2.77629 2.62065 2.50819 2.42263 2.35508 2.30024 2.25474<br />
25 4.24170 3.38520 2.99124 2.75871 2.60299 2.49041 2.40473 2.33706 2.28210 2.23648<br />
26 4.22520 3.36901 2.97516 2.74260 2.58679 2.47411 2.38831 2.32053 2.26545 2.21972<br />
27 4.21001 3.35413 2.96035 2.72777 2.57189 2.45911 2.37321 2.30531 2.25013 2.20430<br />
28 4.19598 3.34039 2.94668 2.71407 2.55812 2.44526 2.35926 2.29127 2.23598 2.19004<br />
29 4.18297 3.32766 2.93403 2.70140 2.54538 2.43244 2.34634 2.27825 2.22288 2.17685<br />
30 4.17089 3.31583 2.92228 2.68963 2.53355 2.42052 2.33435 2.26616 2.21070 2.16458<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 62
ANEXO Nº 4: TABLA DE % DE RECUPERACION<br />
Fuentes: Manual <strong>de</strong>l Co<strong>de</strong>x Alimentarius<br />
ANALITO UNIDAD<br />
100 100%<br />
10 10%<br />
1 1%<br />
0,1 0,10%<br />
0,01 100 ppm<br />
0,001 10 ppm<br />
0,0001 1 ppm<br />
0,00001 100 ppb<br />
0,000001 10 ppb<br />
0,0000001 1 ppb<br />
RECUPERACIÓN ESTIMADO (%)<br />
98 – 102<br />
98 – 102<br />
97 - 103<br />
95 – 105<br />
90 – 107<br />
80 – 110<br />
80 – 110<br />
80 – 110<br />
60 – 115<br />
40 – 120<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 63
ANEXO Nº 5: TABLA DE HORWITZ<br />
1 ppt<br />
10 ppt<br />
100 ppt<br />
1 ppb<br />
10 ppb<br />
100 ppb<br />
1 ppm<br />
10 ppm<br />
100 ppm<br />
1000 ppm<br />
1%<br />
10%<br />
CONCENTRACIÓN REPETIBILIDAD<br />
CV%r<br />
REPRODUCIBILIDAD INTERNA<br />
CV%R<br />
1 / 10 12 1,00E-12 64,0 85,3<br />
10 / 10 12 1,00E-11 45,3 60,3<br />
100 / 10 12 1,00E-10 32,0 42,7<br />
1 / 10 9 1,00E-09 22,6 30,2<br />
10 / 10 9 1,00E-08 16,0 21,3<br />
100 / 10 9 1,00E-07 11,3 15,1<br />
1 / 10 6 1,00E-06 8,00 10,7<br />
10 / 10 6 1,00E-05 5,66 7,54<br />
100 / 10 6 1,00E-04 4,00 5,33<br />
1000 / 10 6 1,00E-03 2,83 3,77<br />
1 / 10 2 1,00E-02 2,00 2,67<br />
10 / 10 2 1,00E-01 1,41 1,89<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 64
ANEXO Nº 6: EJEMPLO DE ESQUEMA GENERAL PARA EL DESARROLLO DE UN PLAN DE<br />
VALIDACION DE UN MÉTODO NORMALIZADO<br />
El siguiente es un esquema que muestra un ejemplo <strong>de</strong> cómo se <strong>de</strong>sarrollo el p<strong>la</strong>n <strong>de</strong> validación <strong>de</strong> un<br />
método y como se establecieron los correspondientes criterios <strong>de</strong> aceptabilidad.<br />
Linealidad: Realizar 3 curvas <strong>de</strong> calibración con 4 estándares incluido el b<strong>la</strong>nco, <strong>de</strong>terminar el valor <strong>de</strong><br />
coeficiente <strong>de</strong> corre<strong>la</strong>ción promedio <strong>de</strong> <strong>la</strong>s 3 curvas.<br />
Criterio <strong>de</strong> aceptabilidad: r > 0,99<br />
Limites: Realizar 10 ensayos <strong>de</strong> medición <strong>de</strong> una matriz <strong>de</strong> muestra en un nivel <strong>de</strong> concentración<br />
cercano al LOD esperado, <strong>de</strong>terminar <strong>la</strong> <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> <strong>la</strong>s concentraciones obtenidas (So) ,<br />
calcu<strong>la</strong>r el valor <strong>de</strong> LOD como LOD= 3,29 x So .<br />
Criterio <strong>de</strong> aceptabilidad: para un LMP > 0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP
VI: BIBLIOGRAFÍA<br />
1. Aguirre L, et al. <strong>Validación</strong> <strong>de</strong> <strong>métodos</strong> analíticos, Asociación Españo<strong>la</strong> <strong>de</strong> Farmacéuticos <strong>de</strong><br />
Industria, Barcelona, 2001, parte II<br />
2. Diseño experimental <strong>de</strong>l Estudio <strong>de</strong> <strong>Validación</strong> <strong>de</strong> Métodos Analíticos. Swedish National<br />
Food Administration. Research & Development Department. Leonardo Merino.<br />
3. Estudio <strong>de</strong> <strong>Validación</strong> <strong>de</strong> Métodos Analíticos (Una guía práctica para <strong>la</strong>boratorios<br />
Químicos). Swedish National Food Administration. 2007.<br />
4. Estadística y Quimiometría para Química Analítica. James N. Miller, Jane C. Miller.<br />
Pearson. 4a Edition. 2002.<br />
5. Gui<strong>de</strong> to Quality in Analytical Chemistry An Aid to Accreditation. CITAC/EURACHEM<br />
GUIDE. 2002.<br />
6. Handbook for calcu<strong>la</strong>tion of measurement uncertainty in environmental <strong>la</strong>boratories.<br />
Edition 2. B. Magnusson et al. NT TECHN REPORT 537.<br />
7. Manual <strong>de</strong> Procedimiento- Comisión <strong>de</strong>l Co<strong>de</strong>x Alimentarius- 19º Edición- OMS/FAO.<br />
8. Lloyd A. Currie, “Nomenc<strong>la</strong>ture In Evaluation Of Analytical Methods Including Detection And<br />
Quantification Capabilities”. IUPAC. Vol. 67, No. 10, pp. 1699-1723, 1995.<br />
9. M. Thompson, S.L.R. Ellison and R. Wood. “Harmonized Gui<strong>de</strong>lines For Single-<br />
Laboratory Validation Of Methods Of Analysis” Pure Appl. Chem., 74, (5) 835 – 855<br />
(2002).<br />
10. Official Methods of Analysis of AOAC International. 18 th Edition, 2005. Appendix E:<br />
Laboratory Quality Assurance.<br />
11. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM/CITAC Gui<strong>de</strong> CG4.<br />
Second Edition. QUAM:2000.1.<br />
12. <strong>Validación</strong> <strong>de</strong> Métodos <strong>de</strong> análisis químicos Procedimiento NMKL No. 4 (1996). Versión<br />
Español 1 , febrero 1997<br />
13. VAM Project 3.2.1 Development and harmonization of measurement Uncertainty<br />
Principles. Part (d): Protocol for uncertainty evaluation from validation data. January<br />
2000. LGC/VAM/1998/088.<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 66
_____________________________________________________________________<br />
GUÍA TÉCNICA N º 1 67
Comité Editor: Boris Duffau, Fabio<strong>la</strong> Rojas, Isabel Guerrero, Luis Roa, Luis Rodríguez, Marcelo Soto, Marisol Aguilera,<br />
Soraya Sandoval.<br />
Coordinación Edición: Soraya Sandoval