ANALISIS INSTRUMENTAL Calibración y Límite de Detección en ...
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<strong>ANALISIS</strong> <strong>INSTRUMENTAL</strong><br />
<strong>Calibración</strong> y <strong>Límite</strong> <strong>de</strong> <strong>Detección</strong> <strong>en</strong> Técnicas Instrum<strong>en</strong>tales.<br />
Objetivos<br />
Apr<strong>en</strong><strong>de</strong>r la metodología para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> un analito a partir<br />
<strong>de</strong> los datos obt<strong>en</strong>idos por técnicas instrum<strong>en</strong>tales. Evaluar el error involucrado <strong>en</strong> dicha<br />
<strong>de</strong>terminación. Estimar el límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> técnicas instrum<strong>en</strong>tales. Obt<strong>en</strong>er las<br />
herrami<strong>en</strong>tas para la correcta confección <strong>de</strong> informes.<br />
Conocimi<strong>en</strong>tos previos<br />
Se consi<strong>de</strong>ra que términos como exactitud, precisión, error aleatorio, error sistemático,<br />
población, muestra, media <strong>de</strong> la población (μ), <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> la población (σ), varianza<br />
<strong>de</strong> la población (σ 2 ), media <strong>de</strong> la muestra ( x ), <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> la muestra (s), varianza <strong>de</strong><br />
la muestra (s 2 ), distribución normal <strong>de</strong> error, ANOVA son conocidos por el alumno. Información<br />
sobre su significado pue<strong>de</strong> <strong>en</strong>contrarse <strong>en</strong> D.A. Skoog, J.J. Leary, Análisis Instrum<strong>en</strong>tal, 4ta.<br />
Edición, Apéndice 1.<br />
<strong>Límite</strong>s <strong>de</strong> confianza.<br />
La media <strong>de</strong> la población o media verda<strong>de</strong>ra (μ) <strong>de</strong> una medición es una constante que es<br />
siempre <strong>de</strong>sconocida. Sin embargo, <strong>en</strong> aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> errores sistemáticos, pue<strong>de</strong>n estimarse ciertos<br />
límites <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> los cuales cabe esperar que caiga la media <strong>de</strong> la población con una cierta<br />
probabilidad. Los límites así obt<strong>en</strong>idos se llaman límites <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong> la media muestral.<br />
Los límites <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong>rivan <strong>de</strong> la <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> la muestra, s y <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong>n <strong>de</strong><br />
la certidumbre con que se la conozca. Si ésta <strong>de</strong>sviación estándar se obti<strong>en</strong>e a partir <strong>de</strong> una bu<strong>en</strong>a<br />
cantidad <strong>de</strong> réplicas, será una bu<strong>en</strong>a aproximación <strong>de</strong> la <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> la población, σ,<br />
y <strong>en</strong>tonces los límites <strong>de</strong> confianza serán mas estrechos que si la estimación <strong>de</strong> s se basa <strong>en</strong> sólo<br />
dos o tres mediciones.<br />
La Figura 1 muestra una curva <strong>de</strong> distribución normal <strong>de</strong> error <strong>en</strong> la que la abscisa<br />
repres<strong>en</strong>ta la <strong>de</strong>sviación respecto <strong>de</strong> la media <strong>en</strong> unida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> la población.<br />
La columna <strong>de</strong> números <strong>de</strong>l c<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> la Figura indica el tanto por ci<strong>en</strong>to <strong>de</strong>l área total <strong>de</strong> la<br />
curva incluída <strong>en</strong>tre los valores indicados <strong>de</strong> -z y +z. Por ejemplo, el 80% <strong>de</strong>l área <strong>de</strong> cualquier<br />
curva gaussiana (distribución normal) está <strong>en</strong>tre incluida <strong>en</strong>tre -1,29σ y + 1,29σ. El 80% <strong>de</strong> las<br />
mediciones caerán <strong>en</strong> este intervalo y <strong>en</strong> este caso se dice que el nivel <strong>de</strong> confianza es <strong>de</strong>l 80% y<br />
el intervalo <strong>de</strong> confianza para una nueva señal es ± zσ = ± 1,29σ. El límite <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong> la<br />
media muestral para N mediciones repetidas se calcula como:<br />
μ<br />
= x ±<br />
zσ<br />
N (1)<br />
don<strong>de</strong> x es el valor promedio <strong>de</strong> la muestra y μ la media <strong>de</strong> la población.<br />
Los límites <strong>de</strong> confianza basados <strong>en</strong> la ecuación (1) son válidos <strong>en</strong> aus<strong>en</strong>cia <strong>de</strong><br />
errores sistemáticos, es <strong>de</strong>cir, cuando las mediciones son exactas. La Tabla I da los valores <strong>de</strong><br />
z para distintos niveles <strong>de</strong> confianza.<br />
En la mayoría <strong>de</strong> las situaciones experim<strong>en</strong>tales, se realizan pocas réplicas y por lo tanto,<br />
no es verificable que la distribución <strong>de</strong> probabilidad <strong>de</strong> las señales sea Normal, o pueda<br />
aproximarse a una Normal. Por este motivo, se esta lejos <strong>de</strong> t<strong>en</strong>er una estimación exacta <strong>de</strong> σ y el<br />
valor <strong>de</strong> s calculado a partir <strong>de</strong> un conjunto pequeño <strong>de</strong> datos pue<strong>de</strong> estar sujeto a una<br />
incertumbre consi<strong>de</strong>rable; y el límite <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong>be ampliarse. En este caso no se utiliza el<br />
parámetro estadístico z <strong>de</strong> la distribución Normal sino que se utiliza el parámetro estadístico t<br />
<strong>de</strong>nominado <strong>de</strong> la distribución t <strong>de</strong> Stu<strong>de</strong>nt y la ecuación (1) se transforma <strong>en</strong>:<br />
CALIBRACION 1
μ = x ±<br />
ts<br />
N<br />
El valor <strong>de</strong> t <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> tanto <strong>de</strong>l valor <strong>de</strong> N-1, que se conoce como grados <strong>de</strong> libertad asi como <strong>de</strong>l<br />
nivel <strong>de</strong> confianza requerido. La Tabla II muestra los valores <strong>de</strong> t para varios niveles <strong>de</strong><br />
confianza.<br />
La distribución <strong>de</strong> probabilidad <strong>de</strong> las señales se utiliza <strong>en</strong> la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong>l <strong>Límite</strong> <strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>tección, como veremos luego.<br />
(2)<br />
Figura 1: Distribución Normal <strong>de</strong> Probabilidad.<br />
CALIBRACION 2
<strong>Calibración</strong> <strong>de</strong> Instrum<strong>en</strong>tos utilizados <strong>en</strong> el Análisis Químico Instrum<strong>en</strong>tal.<br />
<strong>Calibración</strong>.<br />
Se <strong>en</strong>ti<strong>en</strong><strong>de</strong> por calibración al conjunto <strong>de</strong> operaciones que establece, bajo condiciones<br />
específicas, la relación <strong>en</strong>tre las señales producidas por un instrum<strong>en</strong>to analítico y los<br />
correspondi<strong>en</strong>tes valores <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>tración o masa <strong>de</strong>l juego <strong>de</strong> patrones <strong>de</strong> calibrado.<br />
Calidad <strong>de</strong> una <strong>Calibración</strong>.<br />
La calidad <strong>de</strong> la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> una conc<strong>en</strong>tración no pue<strong>de</strong> ser mejor que la calidad<br />
intrínseca <strong>de</strong> la calibración. Los factores que <strong>de</strong>terminan la calidad <strong>de</strong> una calibración son:<br />
La precisión <strong>de</strong> las medidas: estimada a través <strong>de</strong> la repetitividad y la reproducibilidad <strong>de</strong> las<br />
medidas. La repetitividad se evalúa a través <strong>de</strong>l cálculo <strong>de</strong> la <strong>de</strong>sviación estándar relativa<br />
(RSD%) <strong>de</strong> la medida <strong>de</strong> los patrones <strong>de</strong> calibrado. En la práctica pue<strong>de</strong> ocurrir que la<br />
repetitividad para los patrones sea más pequeña que para las muestras, por lo que será necesario<br />
fabricar patrones similares a las muestras o agregar el analito a las mismas.<br />
Exactitud <strong>de</strong> los patrones. El valor <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>tración o masa asignado a cada patrón trae<br />
aparejado un error pequeño si es preparado a partir <strong>de</strong> reactivos puros (grado analítico) con<br />
estequiometría bi<strong>en</strong> <strong>de</strong>finida. Este error <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral se <strong>de</strong>sprecia, fr<strong>en</strong>te al error <strong>en</strong> las medidas <strong>de</strong><br />
las señales producidas por el instrum<strong>en</strong>to.<br />
Vali<strong>de</strong>z <strong>de</strong> la calibración. G<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te es el factor más importante. Cuando se calibra un<br />
instrum<strong>en</strong>to se <strong>de</strong>be t<strong>en</strong>er una razonable certeza <strong>de</strong> que éste respon<strong>de</strong>rá <strong>de</strong> igual manera a los<br />
patrones así como a las muestras, aunque estas t<strong>en</strong>gan una matriz relativam<strong>en</strong>te difer<strong>en</strong>te * . Si<br />
estas difer<strong>en</strong>cias son muy gran<strong>de</strong>s, pue<strong>de</strong>n llegar a invalidar el proceso <strong>de</strong> calibración. Es<br />
necesario estar completam<strong>en</strong>te seguro <strong>de</strong> que el calibrado es válido antes <strong>de</strong> utilizarlo para<br />
obt<strong>en</strong>er el valor <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> muestras incógnita. En caso contrario, pue<strong>de</strong>n cometerse<br />
serios errores <strong>en</strong> la <strong>de</strong>terminación.<br />
Mo<strong>de</strong>los <strong>de</strong> calibración.<br />
La forma <strong>de</strong> calibración más s<strong>en</strong>cilla es la que utiliza un solo patrón. Este mo<strong>de</strong>lo es útil<br />
sólo cuando el patrón es absolutam<strong>en</strong>te confiable. A<strong>de</strong>más, se supone que la señal cero <strong>de</strong>l<br />
instrum<strong>en</strong>to correspon<strong>de</strong> al cero <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> la especie que se quiere <strong>de</strong>terminar. Entre el<br />
cero y valor obt<strong>en</strong>ido para el patrón se realiza una interpolación lineal, pero la extrapolación más<br />
allá <strong>de</strong> la conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> patrón no es recom<strong>en</strong>dada. El mo<strong>de</strong>lo correspondi<strong>en</strong>te es:<br />
señal = constante x conc<strong>en</strong>tración<br />
y = m x (3)<br />
La constante m es llamada s<strong>en</strong>sibilidad y correspon<strong>de</strong> a la constante <strong>de</strong> proporcionalidad <strong>en</strong>tre la<br />
señal y la conc<strong>en</strong>tración. Esta proporcionalidad es útil sobre un restringido intervalo <strong>de</strong> valores.<br />
A valores muy bajos <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>tración la señal es <strong>de</strong>masiado pequeña y está sujeta a una gran<br />
incertidumbre. A valores muy altos la proporcionalidad dada <strong>en</strong> ecuación (3) pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>jar <strong>de</strong> ser<br />
válida. Este mo<strong>de</strong>lo es utilizado <strong>en</strong> muy pocos casos.<br />
Si la respuesta a conc<strong>en</strong>tración cero <strong>de</strong> analito no es conocida <strong>de</strong> antemano, es necesaria<br />
una calibración con un mínimo <strong>de</strong> dos puntos. Para esta calibración se utiliza un mo<strong>de</strong>lo lineal<br />
con un término constante:<br />
señal = señal <strong>de</strong>l blanco + constante x conc<strong>en</strong>tración<br />
* Se <strong>en</strong>ti<strong>en</strong><strong>de</strong> por matriz, a todos los compon<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> la muestra que acompañan al analito.<br />
CALIBRACION 3
y = b + m x (4)<br />
El término b indica la magnitud <strong>de</strong> la señal estimada <strong>de</strong>l blanco, mi<strong>en</strong>tras que m es la p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te<br />
<strong>de</strong> la recta <strong>de</strong> calibrado e indica nuevam<strong>en</strong>te la s<strong>en</strong>sibilidad.<br />
Estadísticam<strong>en</strong>te, una calibración realizada a partir <strong>de</strong> dos puntos es muy pobre y<br />
su construcción a partir <strong>de</strong> un número mayor <strong>de</strong> patrones es obligatoria. El procedimi<strong>en</strong>to<br />
estadístico para <strong>de</strong>terminar los coefici<strong>en</strong>tes b y m <strong>de</strong> la ecuación (4) se <strong>de</strong>nomina regresión por<br />
cuadrados mínimos. La regresión por cuadrados mínimos es una herrami<strong>en</strong>ta muy útil, sin<br />
embargo, <strong>de</strong>b<strong>en</strong> conocerse sus limitaciones. A<strong>de</strong>más <strong>de</strong> la regresión por cuadrados mínimos<br />
siempre <strong>de</strong>be hacerse una inspección gráfica <strong>de</strong> los datos obt<strong>en</strong>idos, para <strong>de</strong>tectar puntos<br />
anómalos o fallas <strong>en</strong> la linealidad. Las ecuaciones mediante las que se obti<strong>en</strong><strong>en</strong> los coefici<strong>en</strong>tes<br />
<strong>de</strong> la ecuación (4) se <strong>de</strong>tallan <strong>en</strong> la próxima sección.<br />
Regresión por cuadrados mínimos<br />
Este método es ampliam<strong>en</strong>te utilizado <strong>en</strong> todas las ramas <strong>de</strong> las ci<strong>en</strong>cias, <strong>en</strong>contrándose<br />
incorporado <strong>en</strong> muchas calculadoras y planillas <strong>de</strong> cálculo.<br />
Para el mo<strong>de</strong>lo <strong>de</strong> la ecuación (4) los coefici<strong>en</strong>tes pue<strong>de</strong>n ser calculados <strong>de</strong> la sigui<strong>en</strong>te<br />
manera:<br />
m =<br />
N<br />
∑<br />
( x − x )( y − y )<br />
i=<br />
1<br />
i i<br />
N<br />
∑ ( xi i=<br />
1<br />
2<br />
− x )<br />
(5)<br />
b = y − mx<br />
(6)<br />
don<strong>de</strong> x, y son los promedio aritméticos <strong>de</strong> los valores <strong>de</strong> x (patrones <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>tración) y valores<br />
<strong>de</strong> y (señales). En la ecuación (5), el numerador es simbolizado Sxy y el <strong>de</strong>nominador Sxx . La<br />
N<br />
∑<br />
expresión ( y − y )<br />
i=<br />
1<br />
i<br />
2<br />
se <strong>de</strong>nota con el símbolo Syy.<br />
La calidad <strong>de</strong> la calibración se evalúa predici<strong>en</strong>do el valor <strong>de</strong> la señal, yˆ , para los<br />
distintos patrones a través <strong>de</strong>l mo<strong>de</strong>lo utilizado (ecuación. 4). Las difer<strong>en</strong>cias <strong>en</strong>tre la señales<br />
observadas y las predichas se <strong>de</strong>nominan residuos. A partir <strong>de</strong> estos valores se calcula:<br />
2<br />
2<br />
( − ˆ ) −<br />
= =<br />
− 2<br />
− 2<br />
∑ yi<br />
yi<br />
S yy m S xx<br />
s y (7)<br />
N<br />
N<br />
sy es llamada <strong>de</strong>sviación estándar residual y ti<strong>en</strong>e unida<strong>de</strong>s correpondi<strong>en</strong>tes a la señal<br />
observada. También se la conoce como sy/x <strong>en</strong> el texto <strong>de</strong> Miller o como se <strong>en</strong> otros textos.<br />
Es importante conocer las limitaciones <strong>de</strong>l método <strong>de</strong> cuadrados mínimos. Al <strong>de</strong>ducir las<br />
ecuaciones anteriores fueron realizadas algunas suposiciones. Estas no siempre se cumpl<strong>en</strong> <strong>en</strong> un<br />
problema <strong>de</strong> química analítica, por lo que <strong>de</strong>bemos estar at<strong>en</strong>tos. Las suposiciones que se<br />
realizan son:<br />
a.- La incertidumbre <strong>en</strong> la conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> los patrones es <strong>de</strong>spreciable fr<strong>en</strong>te a la <strong>de</strong>sviación<br />
estándar <strong>de</strong> la señal medida. Para ello los patrones <strong>de</strong> calibrado <strong>de</strong>b<strong>en</strong> ser preparados con una<br />
precisión superior a la <strong>de</strong> la medición <strong>de</strong> la señal.<br />
CALIBRACION 4
.- Todas las medidas son estadísticam<strong>en</strong>te in<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tes unas <strong>de</strong> otras. Cualquier t<strong>en</strong><strong>de</strong>ncia <strong>de</strong><br />
las señales a través <strong>de</strong>l tiempo (<strong>de</strong>rivas <strong>de</strong> la línea <strong>de</strong> base o contaminaciones secu<strong>en</strong>ciales)<br />
invalida el calibrado.<br />
c.- Todas las medidas ti<strong>en</strong><strong>en</strong> igual <strong>de</strong>sviación estándar, la cual no <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong>l valor <strong>de</strong> la señal<br />
observada, por lo tanto las señales altas t<strong>en</strong>drán igual <strong>de</strong>sviación estándar que las pequeñas. Esta<br />
suposición es particularm<strong>en</strong>te discutible si se trabaja <strong>en</strong> un amplio intervalo <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>traciones.<br />
Si no se cumple, es necesario utilizar un método <strong>de</strong> calibración pon<strong>de</strong>rado por las <strong>de</strong>sviaciones<br />
estándar <strong>de</strong> las medidas.<br />
d.- Las medidas están normalm<strong>en</strong>te distribuidas. En g<strong>en</strong>eral, el error <strong>en</strong> una medida analítica es<br />
una suma <strong>de</strong> errores in<strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>tes prov<strong>en</strong>i<strong>en</strong>tes <strong>de</strong> distintas partes <strong>de</strong>l instrum<strong>en</strong>to. Aunque el<br />
error <strong>de</strong> cada fu<strong>en</strong>te individual no sea normalm<strong>en</strong>te distribuido, la suma <strong>de</strong> esas contribuciones,<br />
producirá una distribución normal † .<br />
De todas las suposiciones anteriores, la más débil es la tercera, porque <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral a bajas<br />
conc<strong>en</strong>traciones, la precisión <strong>de</strong> las medidas empeora. Una bu<strong>en</strong>a aproximación pue<strong>de</strong> realizarse<br />
restringi<strong>en</strong>do el intervalo <strong>en</strong> el cual se realiza la curva <strong>de</strong> calibración, <strong>de</strong> manera que la precisión<br />
sea constante. Si no se <strong>de</strong>sea disminuir el rango lineal, se <strong>de</strong>be hacer una regresión pon<strong>de</strong>rada.<br />
La ecuación (4) se usa para calcular la conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> una muestra incógnita:<br />
x =<br />
y − b<br />
(8)<br />
m<br />
Para controlar la calidad <strong>de</strong> la información obt<strong>en</strong>ida se pue<strong>de</strong> establecer el intervalo <strong>de</strong><br />
confianza <strong>de</strong>l mo<strong>de</strong>lo. La <strong>de</strong>sviación estándar (mas correctam<strong>en</strong>te llamada error estándar) <strong>de</strong> la<br />
p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te, sm:<br />
s<br />
m<br />
sy<br />
= (9)<br />
S<br />
La <strong>de</strong>sviación estándar (error estándar) <strong>de</strong> la or<strong>de</strong>nada al orig<strong>en</strong> es:<br />
s b = s y<br />
1<br />
2<br />
( ∑ xi<br />
)<br />
N − 2<br />
x<br />
(10)<br />
xx<br />
∑<br />
i<br />
La curva <strong>de</strong> calibrado se utiliza para pre<strong>de</strong>cir la conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong>l analito <strong>en</strong> muestras incógnita,<br />
midi<strong>en</strong>do la señal para esta muestra (yx) con el método instrum<strong>en</strong>tal <strong>en</strong> cuestión. La <strong>de</strong>sviación<br />
estándar (error estándar) <strong>de</strong> los resultados analíticos sx, predichos por la curva <strong>de</strong> calibración es:<br />
s<br />
x<br />
sy<br />
1 1 ( y x − y )<br />
= + +<br />
m L N 2<br />
m S<br />
La ecuación (11) permite calcular la <strong>de</strong>sviación estándar para la conc<strong>en</strong>tración obt<strong>en</strong>ida a<br />
partir <strong>de</strong> la media y x <strong>de</strong> un conjunto <strong>de</strong> L análisis repetidos cuando es usa una curva <strong>de</strong><br />
calibración <strong>de</strong> N puntos. Recuér<strong>de</strong>se que y es el promedio <strong>de</strong> la señal obt<strong>en</strong>ida para los N datos<br />
<strong>de</strong> la calibración. A medida que el valor <strong>de</strong> la señal y x se acerca al valor promedio y el error <strong>de</strong><br />
† Esta es una ilustración <strong>de</strong>l Teorema C<strong>en</strong>tral <strong>de</strong>l <strong>Límite</strong>.<br />
xx<br />
2<br />
(11)<br />
CALIBRACION 5
la <strong>de</strong>terminación disminuye, por lo que es mejor <strong>de</strong>terminar muestras cuyo valor <strong>de</strong> señal se<br />
<strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tre <strong>en</strong> el c<strong>en</strong>tro <strong>de</strong> la curva <strong>de</strong> calibrado. Cuantas mas veces se repite el análisis <strong>de</strong> la<br />
muestra incógnita, mayor será L y por lo tanto m<strong>en</strong>or será la <strong>de</strong>sviación estándar. El diseño <strong>de</strong> la<br />
curva <strong>de</strong> calibrado también es importante, puesto que Sxx <strong>de</strong>be ser pequeño. Esto se logra<br />
aum<strong>en</strong>tando la cantidad <strong>de</strong> patrones <strong>en</strong> los extremos <strong>de</strong> la curva <strong>de</strong> calibrado.<br />
¿Cómo expresamos la incertidumbre <strong>de</strong>l resultado <strong>de</strong> una muestra incógnita? Esto se hace<br />
<strong>en</strong> base a un intervalo <strong>de</strong> confianza para el promedio <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>traciones obt<strong>en</strong>idos mediante L<br />
análisis repetidos <strong>de</strong> la muestra. Puesto que <strong>en</strong> g<strong>en</strong>eral el número <strong>de</strong> muestras utilizado <strong>en</strong> la<br />
calibración es pequeño se <strong>de</strong>be utilizar el parámetro t para g<strong>en</strong>erar un intervalo <strong>de</strong> confianza.<br />
Este intervalo se calcula mediante la ecuación (12). Los resultados para una muestra incógnita se<br />
expresan como:<br />
y x − b<br />
x x = ± tα<br />
, N −2 ⋅ s x (12)<br />
m<br />
don<strong>de</strong> t <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong>l número <strong>de</strong> muestras realizadas <strong>en</strong> la calibración y <strong>de</strong>l intervalo <strong>de</strong> confianza<br />
<strong>de</strong>seado (ver Tabla II). No <strong>de</strong>bemos olvidar el correcto redon<strong>de</strong>o <strong>de</strong> las cifras <strong>de</strong>cimales, que<br />
<strong>de</strong>berá hacerse cuando se hayan finalizado los cálculos.<br />
Ambito Lineal <strong>de</strong>l calibrado<br />
Una parte importante <strong>de</strong> la tarea <strong>de</strong> calibración <strong>de</strong> un instrum<strong>en</strong>to analítico es <strong>de</strong>terminar el<br />
intervalo <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>traciones para el cuál el mo<strong>de</strong>lo lineal es válido. Hay tres maneras <strong>de</strong> verificar<br />
ésto, ninguna <strong>de</strong> ellas excluye a las otras.<br />
La primera, es la investigación <strong>de</strong>l gráfico <strong>de</strong> residuos ( yi − yˆ<br />
i ) <strong>en</strong> función <strong>de</strong> la conc<strong>en</strong>tración.<br />
Los residuos <strong>de</strong>b<strong>en</strong> ser todos <strong>de</strong> la misma magnitud y <strong>de</strong>b<strong>en</strong> estar distribuidos aleatoriam<strong>en</strong>te <strong>en</strong><br />
su signo (<strong>en</strong> una secu<strong>en</strong>cia <strong>de</strong>l tipo +-+-+- etc.). Si esto no fuese así, <strong>de</strong>be sospecharse una<br />
relación no lineal <strong>en</strong>tre x e y por lo que <strong>de</strong>be disminuirse el rango <strong>de</strong> trabajo, o bi<strong>en</strong> aplicar otro<br />
mo<strong>de</strong>lo, si la teoría así lo permite.<br />
Otra manera <strong>de</strong> verificar la vali<strong>de</strong>z <strong>de</strong>l mo<strong>de</strong>lo lineal es mediante el cálculo <strong>de</strong>l coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong><br />
correlación (r):<br />
r =<br />
S<br />
xx<br />
El coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong> correlación vale 1 o –1 <strong>en</strong> el caso <strong>de</strong> que las variables estén perfectam<strong>en</strong>te<br />
correlacionadas, pero no <strong>de</strong>be mal interpretarse puesto que un coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong> correlación <strong>de</strong> 1, no<br />
necesariam<strong>en</strong>te significa que la linealidad sea bu<strong>en</strong>a, sino que el numerador y el <strong>de</strong>nominador <strong>de</strong><br />
la expresión anterior se cancelan mutuam<strong>en</strong>te. Es común obt<strong>en</strong>er bu<strong>en</strong>os coefici<strong>en</strong>tes <strong>de</strong><br />
correlación con rectas <strong>de</strong> regresión que no respon<strong>de</strong>n a un mo<strong>de</strong>lo lineal. El coefici<strong>en</strong>te <strong>de</strong><br />
correlación sólo es otro indicio adicional que <strong>de</strong>be sumarse al análisis <strong>de</strong> los residuos.<br />
El tercer método es el análisis <strong>de</strong> la varianza <strong>de</strong> la regresión. El análisis <strong>de</strong> la varianza (ANOVA)<br />
pue<strong>de</strong> utilizarse para <strong>de</strong>tectar una falla <strong>de</strong> ajuste <strong>en</strong> la regresión. Muchas planillas <strong>de</strong> cálculo<br />
realizan este cálculo automáticam<strong>en</strong>te. Para realizar este análisis <strong>de</strong> forma completa, se necesitan<br />
datos replicados para cada patrón.<br />
Test F <strong>de</strong> Linealidad<br />
Este Test se basa <strong>en</strong> <strong>de</strong>scomponer la varianza exist<strong>en</strong>te <strong>en</strong>tre las señales experim<strong>en</strong>tales y los<br />
valores predichos <strong>en</strong> dos aportes. Uno <strong>de</strong> ellos es el error experim<strong>en</strong>tal. Para t<strong>en</strong>er una<br />
estimación <strong>de</strong>l error experim<strong>en</strong>tal <strong>en</strong> la medición <strong>de</strong> las señales, <strong>de</strong>bemos medir “i” replicados <strong>de</strong><br />
cada patrón, por lo que para cada punto x habrá varios valores <strong>de</strong> señal (yi). Para estimar la<br />
S<br />
xy<br />
⋅ S<br />
yy<br />
CALIBRACION 6
varianza <strong>de</strong>bida al error puram<strong>en</strong>te experim<strong>en</strong>tal, calculamos la media <strong>de</strong> los cuadrados <strong>de</strong>bida a<br />
esta contribución (MSPE, Mean Squares Pure Error):<br />
k<br />
i<br />
ni<br />
∑∑<br />
MS PE =<br />
n − k<br />
Don<strong>de</strong> n es el número total <strong>de</strong> mediciones, k es el número total <strong>de</strong> patrones, i son las repeticiones<br />
<strong>de</strong> cada patrón y los yij son las señales <strong>de</strong> todos los experim<strong>en</strong>tos.<br />
Para estimar el posible error <strong>de</strong>bido a una falla <strong>de</strong> ajuste <strong>de</strong>bida a la elección <strong>de</strong> un mo<strong>de</strong>lo<br />
incorrecto, calculamos la media <strong>de</strong> los cuadrados <strong>de</strong>bida a la “falta <strong>de</strong> ajuste” (MSLOF, Mean<br />
Squares Lack of Fit):<br />
MS<br />
LOF<br />
=<br />
k<br />
∑<br />
i<br />
j<br />
( y<br />
ij<br />
k − 2<br />
− y )<br />
n ⋅ ( y − yˆ<br />
)<br />
Esto mi<strong>de</strong> la difer<strong>en</strong>cia media <strong>en</strong>tre la media <strong>de</strong> las réplicas <strong>de</strong> cada patrón y su correspondi<strong>en</strong>te<br />
valor estimado por la regresión. Cabe esperar que si el mo<strong>de</strong>lo lineal es correcto, las varianzas<br />
MSLOF y MSPE serán comparables. Si MSLOF es mayor que MSPE el ajuste no es correcto y hay<br />
que utilizar otro mo<strong>de</strong>lo o reducir el ámbito <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>traciones <strong>en</strong> el cuál se hace el calibrado.<br />
Para comparar MSLOF y MSPE hacemos un test F <strong>de</strong> varianzas calculando:<br />
MS<br />
F =<br />
LOF<br />
cal<br />
MS PE<br />
Si Fcal < Fk-2,n-k,α (obt<strong>en</strong>ido <strong>de</strong> tablas) se acepta que existe bu<strong>en</strong> ajuste al mo<strong>de</strong>lo lineal.<br />
Los cálculos <strong>de</strong> ANOVA pue<strong>de</strong>n ser un poco <strong>en</strong>gorrosos y se recomi<strong>en</strong>da el uso <strong>de</strong> planillas <strong>de</strong><br />
cálculo que facilitan mucho la tarea.<br />
<strong>Detección</strong> <strong>de</strong> datos anómalos<br />
La regresión por cuadrados mínimos es muy s<strong>en</strong>sible a la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> datos anómalos. Por ese<br />
motivo es necesario graficar los puntos experim<strong>en</strong>tales junto a los puntos predichos por la<br />
regresión, <strong>de</strong> manera <strong>de</strong> <strong>de</strong>tectar si alguno <strong>de</strong> ellos está influ<strong>en</strong>ciando la recta <strong>de</strong> regresión.<br />
También es posible calcular un parámetro que nos indica si los residuos <strong>de</strong> un punto dado son<br />
anormalm<strong>en</strong>te altos. Este parámetro es el residuo estandarizado:<br />
Residuo estándar:<br />
i<br />
i<br />
i<br />
s<br />
i<br />
y<br />
i<br />
2<br />
2<br />
( y − yˆ<br />
)<br />
Un residuo estándar cercano o mayor que 1.5 indica que este residuo es anormalm<strong>en</strong>te alto,<br />
puesto que está a una distancia igual a 1.5 veces su <strong>de</strong>sviación estándar. Este punto <strong>de</strong>be ser<br />
examinado mas cuidadosam<strong>en</strong>te para <strong>de</strong>terminar la causa <strong>de</strong>l residuo alto. Esto pue<strong>de</strong> <strong>de</strong>berse a<br />
una falla <strong>en</strong> la medición <strong>de</strong> la señal o a un problema <strong>de</strong> ajuste <strong>de</strong> la recta al mo<strong>de</strong>lo lineal. En<br />
todo caso, pue<strong>de</strong> int<strong>en</strong>tarse repetir la regresión quitando este punto <strong>de</strong>l juego <strong>de</strong> datos, para ver<br />
<strong>de</strong> que manera cambia el valor <strong>de</strong> p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te y or<strong>de</strong>nada al orig<strong>en</strong>.<br />
Protocolos <strong>de</strong> calibración<br />
Para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> la conc<strong>en</strong>tración pue<strong>de</strong>n ser utilizados distintos modos <strong>de</strong><br />
calibración <strong>de</strong>p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>do <strong>de</strong>l analito y <strong>de</strong> la técnica instrum<strong>en</strong>tal usada. El caso <strong>de</strong>scripto<br />
anteriorm<strong>en</strong>te se <strong>de</strong>nomina calibración externa porque las muestras y los patrones se<br />
<strong>de</strong>terminan <strong>en</strong> forma separada.<br />
i<br />
CALIBRACION 7
Otros modos también son utilizados: calibración interna, método <strong>de</strong>l agregado patrón<br />
y técnicas <strong>de</strong> dilución isotópica.<br />
<strong>Calibración</strong> interna:<br />
Si antes <strong>de</strong> la <strong>de</strong>terminación se le agrega a la muestra una cantidad fija <strong>de</strong> una sustancia<br />
con características químicas similares a las <strong>de</strong> la especie a <strong>de</strong>terminar, esta sustancia es llamada<br />
estándar interno y el método se <strong>de</strong>nomina <strong>de</strong> calibración interna o método <strong>de</strong>l estándar<br />
interno. El agregado sirve para calibrar un paso crítico que <strong>de</strong> otra manera introduce una gran<br />
incerteza, por ejemplo el volum<strong>en</strong> <strong>de</strong> muestra inyectado <strong>en</strong> una corrida <strong>de</strong> Cromatografia<br />
Gaseosa. La señal producida por este estándar interno es producida <strong>en</strong> las mismas condiciones<br />
que la <strong>de</strong> los analitos, porque se <strong>en</strong>cu<strong>en</strong>tran juntos <strong>en</strong> la muestra. Para averiguar la conc<strong>en</strong>tración<br />
<strong>de</strong> los analitos, se aplica alguno <strong>de</strong> los mo<strong>de</strong>los lineales vistos anteriorm<strong>en</strong>te utilizando como<br />
señal <strong>de</strong>l patron, la señal producida por el estándar interno. La conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong>l estándar interno<br />
pue<strong>de</strong> variarse para comprobar la linealidad y construir una curva <strong>de</strong> calibrado, o pue<strong>de</strong> usarse un<br />
mo<strong>de</strong>lo <strong>de</strong> un único patrón. Hay que t<strong>en</strong>er <strong>en</strong> cu<strong>en</strong>ta que si el estándar interno no ti<strong>en</strong>e la misma<br />
s<strong>en</strong>sibilidad <strong>en</strong> el <strong>de</strong>tector que los analitos, hay que corregir las señales <strong>de</strong> estos con un factor <strong>de</strong><br />
respuesta. Estos factores <strong>de</strong> respuesta se calculan a priori mediante estándares <strong>de</strong> los compuestos<br />
a <strong>de</strong>terminar (ver Willett, J. E., Gas Chromatography, Analytical Chemistry by Op<strong>en</strong> Learning,<br />
Wiley, 1987).<br />
La forma más sofisticada <strong>de</strong>l método <strong>de</strong>l estándar interno es el método <strong>de</strong> dilución<br />
isotópica. Aquí se opta por agregar a la muestra una sustancia que es químicam<strong>en</strong>te igual a la<br />
sustancia a <strong>de</strong>terminar pero aún así discernible <strong>de</strong> la original. Este método utiliza la misma<br />
sustancia como patrón pero con al m<strong>en</strong>os un átomo <strong>de</strong> su estructura reemplazado por un isótopo.<br />
Por ejemplo, 12 C es reemplazado por 13 C <strong>en</strong> un compuesto orgánico. Para este método <strong>de</strong>be<br />
utilizarse un técnica selectiva a isótopos, g<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te espectrometría <strong>de</strong> masa.<br />
Agregado patrón<br />
En el método <strong>de</strong>l agregado patrón se le agrega a la muestra, conc<strong>en</strong>traciones creci<strong>en</strong>tes <strong>de</strong>l<br />
analito <strong>de</strong> interés. La señal obt<strong>en</strong>ida se <strong>de</strong>berá a la cantidad <strong>de</strong> analito originalm<strong>en</strong>te pres<strong>en</strong>te <strong>en</strong><br />
la muestra sumados a la cantidad agregada. El propósito <strong>de</strong> este método es g<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te corregir<br />
efectos <strong>de</strong> interfer<strong>en</strong>cias multiplicativas ‡ <strong>de</strong>bidas a la matriz <strong>de</strong> la muestra. Una vez obt<strong>en</strong>idas, la<br />
señales instrum<strong>en</strong>tales se grafican versus las cantida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> analito añadidas. La recta <strong>de</strong><br />
regresión se calcula <strong>de</strong> manera usual. Para conocer la conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> la muestra incógnita se<br />
extrapola la recta al punto sobre el eje x don<strong>de</strong> y=0. La intersección negativa sobre el eje x<br />
correspon<strong>de</strong> a la cantidad <strong>de</strong> analito <strong>en</strong> la muestra problema. Este valor vi<strong>en</strong>e dado por b/m. En<br />
este caso los resultados se expresan como:<br />
2<br />
b s y 1 y<br />
x = ± t , N −2<br />
⋅ + 2<br />
m m N m S xx<br />
α (13)<br />
En esta expresión no aparece L como <strong>en</strong> la expresión (11), puesto que no se hac<strong>en</strong> réplicas <strong>de</strong><br />
cada muestra, sino que se hace un agregado patrón por cada una <strong>de</strong> ellas. Esto <strong>de</strong>manda mucho<br />
tiempo y esfuerzo. No <strong>de</strong>bemos olvidar que para obt<strong>en</strong>er el valor <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>tración <strong>en</strong> la muestra<br />
original, <strong>de</strong>bemos corregir al valor <strong>de</strong> x y a su incertidumbre, por las diluciones hechas.<br />
‡ Las interfer<strong>en</strong>cias multiplicativas son aquellas que produc<strong>en</strong> un cambio relativo <strong>en</strong> la conc<strong>en</strong>tración. Por ejemplo,<br />
la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> aluminio <strong>en</strong> exceso <strong>en</strong> la muestra disminuye la señal <strong>de</strong> un electrodo <strong>de</strong> ion selectivo a fluoruro <strong>en</strong> un<br />
50 %.<br />
CALIBRACION 8
<strong>Límite</strong> <strong>de</strong> <strong>Detección</strong><br />
En Análisis Instrum<strong>en</strong>tal, <strong>de</strong>bemos apr<strong>en</strong><strong>de</strong>r a elegir la técnica correcta para cumplir con<br />
nuestro análisis. Para ello, <strong>de</strong>bemos comparar muchas “figuras <strong>de</strong> mérito” <strong>de</strong> cada método. Las<br />
figuras <strong>de</strong> mérito forman una base común sobre las que se pue<strong>de</strong>n comparar los métodos<br />
analíticos. Ya hemos visto algunas figuras <strong>de</strong> mérito, como ser la s<strong>en</strong>sibilidad, la exactitud y la<br />
precisión. Otra figura <strong>de</strong> mérito importantísima es el <strong>Límite</strong> <strong>de</strong> <strong>Detección</strong>. El cálculo <strong>de</strong>l límite<br />
<strong>de</strong> <strong>de</strong>tección respon<strong>de</strong> la pregunta: ¿Cuál es la m<strong>en</strong>or conc<strong>en</strong>tración que po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>tectar con<br />
este método <strong>de</strong> análisis? Para respon<strong>de</strong>r a esta pregunta, <strong>de</strong>bemos analizar cuál es la m<strong>en</strong>or señal<br />
<strong>de</strong>tectable<br />
La probabilidad que la más pequeña señal analítica discernible, yL , pue<strong>de</strong> ser medida y<br />
no correspon<strong>de</strong> a una fluctuación aleatoria <strong>de</strong> la medida <strong>de</strong>l blanco, yB , <strong>de</strong>p<strong>en</strong><strong>de</strong> <strong>de</strong> a cuantas<br />
unida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong>l blanco (sB ) está yL <strong>de</strong> y B (promedio <strong>de</strong> las medidas <strong>de</strong>l<br />
blanco). Si la difer<strong>en</strong>cia <strong>en</strong>tre y B e yL es 3sB la probabilidad que la medida <strong>de</strong> yL sea una<br />
fluctuación <strong>de</strong>l blanco es m<strong>en</strong>or que el 0,13% (si el número <strong>de</strong> medidas <strong>de</strong>l blanco es superior a<br />
25).<br />
Para <strong>de</strong>terminar la conc<strong>en</strong>tración límite, xL ,, IUPAC <strong>de</strong>fine que :<br />
y L = y B + ksB<br />
(14)<br />
don<strong>de</strong> k es un valor que se elige <strong>de</strong> acuerdo al nivel <strong>de</strong> confianza que se <strong>de</strong>see, g<strong>en</strong>eralm<strong>en</strong>te 3.<br />
La conc<strong>en</strong>tración límite es una función <strong>de</strong> yL y por lo tanto:<br />
( y L − y B )<br />
x L =<br />
m<br />
(15)<br />
Sustituy<strong>en</strong>do la ecuación (14) <strong>en</strong> la (15) se obti<strong>en</strong>e que:<br />
x<br />
ksB<br />
= (16)<br />
L<br />
m<br />
Por lo tanto el límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección pue<strong>de</strong> <strong>en</strong>contrarse dividi<strong>en</strong>do ksB por la p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te<br />
obt<strong>en</strong>ida por regresión <strong>de</strong> la curva <strong>de</strong> calibración. Sin embargo, la conc<strong>en</strong>tración límite así<br />
obt<strong>en</strong>ida será un reflejo <strong>de</strong>l verda<strong>de</strong>ro límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección sólo si la p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te, m, y la or<strong>de</strong>nada al<br />
orig<strong>en</strong>, b, están bi<strong>en</strong> calculadas.<br />
El método IUPAC utiliza como fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> variabilidad <strong>de</strong> las señales, la <strong>de</strong>sviación<br />
estándar <strong>de</strong>l blanco. Un método alternativo, aunque m<strong>en</strong>os usado, utiliza la <strong>de</strong>sviación estándar<br />
<strong>de</strong> los residuales <strong>de</strong>l calibrado sx (ecuación 11) como estimador <strong>de</strong> la <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong>l<br />
blanco. Esto es útil si no se ha repetido el blanco y sB no pue<strong>de</strong> calcularse.<br />
El método <strong>de</strong>finido por la ecuación (16) es válido solo si la principal fu<strong>en</strong>te <strong>de</strong> error está<br />
<strong>en</strong> el blanco. Por lo tanto, <strong>en</strong> la mayoría <strong>de</strong> los casos este método dará límites <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección mas<br />
bajos que si se ti<strong>en</strong>e e cu<strong>en</strong>ta todo el error <strong>de</strong>l calibrado.<br />
Un <strong>de</strong>tallado artículo sobre límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección pue<strong>de</strong> leerse <strong>en</strong> Analytical Chemistry; 55<br />
(1983) 712A. (este artículo pue<strong>de</strong> obt<strong>en</strong>erse <strong>en</strong> la biblioteca C<strong>en</strong>tral Leloir).<br />
Bibliografía<br />
D.A. Skoog, J.J. Leary, Analisis Instrum<strong>en</strong>tal, Áp<strong>en</strong>dice 1, McGraw-Hill, 4ta. Edición, 1994.<br />
J.C. Miller, J.N. Miller, Estadística para Química Analítica, Addison-Wesley, 1993.<br />
M.A. Sharaf, D.L. Illman, B.R. Kowalski, Chemometrics, Wiley, 1986<br />
R. Kellner, J.M. Mermet, M. Otto, H.M. Widmer, Analytical Chemistry, Capítulo 12, Wiley-<br />
VCH, 1998.<br />
G.L. Long, J.D.Winefordner; Analytical Chemistry; 55 (1983) 712A.<br />
CALIBRACION 9
PROBLEMAS<br />
1.- Un método oficial para el análisis <strong>de</strong> hidrocarburos clorados <strong>en</strong> muestras <strong>de</strong> aire ti<strong>en</strong>e una<br />
<strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> 0,030 ppm.<br />
a.- Calcular el intervalo <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong>l 95% para la media <strong>de</strong> cuatro medidas obt<strong>en</strong>idas con<br />
este método.<br />
b.- Cuantas medidas <strong>de</strong>berán hacerse si se pret<strong>en</strong><strong>de</strong> que el intervalo <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong>l 95% valga<br />
±0,017.<br />
2.-La exactitud <strong>de</strong> un método analítico se suele evaluar analizando uno o varios materiales<br />
estándar <strong>de</strong> refer<strong>en</strong>cia cuya composición se conoce. Siempre, la medida experim<strong>en</strong>tal <strong>de</strong>l análisis<br />
x diferirá <strong>de</strong>l valor verda<strong>de</strong>ro μ obt<strong>en</strong>ido con el estándar. Reor<strong>de</strong>nando la ec. (2) se pue<strong>de</strong><br />
<strong>de</strong>terminar si la difer<strong>en</strong>cia x − μ es <strong>de</strong>bida a un error sistemático.<br />
ts<br />
Si | x − μ | > existe un error sistemático.<br />
N<br />
ts<br />
Si | x − μ | ≤ no queda <strong>de</strong>mostrada la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> un error sistemático.<br />
N<br />
Determine si <strong>en</strong> los sigui<strong>en</strong>tes ejemplos hay alguna evi<strong>de</strong>ncia <strong>de</strong> error sistemático. En todos los<br />
casos utilice un nivel <strong>de</strong> confianza <strong>de</strong>l 95%.<br />
a.- Se analiza un material <strong>de</strong> refer<strong>en</strong>cia cuyo valor <strong>de</strong> conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> Hg se halla<br />
certificado y vale 0.389%. El mismo material se analiza mediante Espectrometría <strong>de</strong><br />
Absorción Atómica por G<strong>en</strong>eración <strong>de</strong> Vapor frío <strong>de</strong> Mercurio obt<strong>en</strong>iéndose los<br />
sigui<strong>en</strong>tes valores : 0,389; 0,374; 0,371. ¿Cuál es la mínima difer<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> porc<strong>en</strong>tajes <strong>de</strong><br />
mercurio que po<strong>de</strong>mos <strong>de</strong>tectar con este experim<strong>en</strong>to? ¿Cómo disminuye el sesgo<br />
<strong>de</strong>tectable?<br />
b.- El tanto por ci<strong>en</strong>to <strong>de</strong> níquel <strong>en</strong> una muestra particular <strong>de</strong> un acero <strong>de</strong> refer<strong>en</strong>cia es <strong>de</strong><br />
un 1,12%. Un nuevo método espectrométrico para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> níquel produjo los<br />
sigui<strong>en</strong>tes resultados (<strong>en</strong> %): 1,10; 1,08; 1,09; 1,12; 1,09.<br />
c.- Se estudió la exactitud <strong>de</strong> un método volumétrico para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> calcio <strong>en</strong><br />
minerales calcáreos analizando una piedra caliza estándar que cont<strong>en</strong>ía 30,15 % <strong>de</strong> CaO.<br />
El resultado <strong>de</strong> la media <strong>de</strong> cuatro análisis fue <strong>de</strong> 30,26% <strong>de</strong> CaO, con una <strong>de</strong>sviación<br />
estándar <strong>de</strong> 0,085%.<br />
• Indican estos datos la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> un error sistemático?<br />
A partir <strong>de</strong> un elevado número <strong>de</strong> análisis, se estableció la <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> la<br />
población. O sea s → σ = 0,094% <strong>de</strong> CaO.<br />
• Indicarían estos datos la pres<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> un error sistemático?<br />
• Cambian las conclusiones si el estándar ti<strong>en</strong>e una incertidumbre igual a 0.014%<br />
<strong>de</strong> CaO con una probabilidad <strong>de</strong> error <strong>de</strong>l 5%?<br />
3.- Se han analizado una serie <strong>de</strong> soluciones estándar <strong>de</strong> fluoresceína con un<br />
espectrofluorómetro, obt<strong>en</strong>iéndose las sigui<strong>en</strong>tes int<strong>en</strong>sida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>cia (<strong>en</strong> unida<strong>de</strong>s<br />
arbitrarias):<br />
Int<strong>en</strong>sidad fluoresc<strong>en</strong>cia<br />
(unida<strong>de</strong>s arbitrarias)<br />
Conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong><br />
fluoresceína (pg/ml)<br />
2,1 5,0 9,0 12,6 17,3 21,0 24,7<br />
0 2 4 6 8 10 12<br />
CALIBRACION 10
a.- Calcule la p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te y la or<strong>de</strong>nada al orig<strong>en</strong> <strong>de</strong> la recta <strong>de</strong> regresión para los datos mostrados.<br />
b.- Calcule la <strong>de</strong>sviación estándar residual y los límites <strong>de</strong> confianza (al 95%) para la p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te y<br />
la or<strong>de</strong>nada al orig<strong>en</strong>.<br />
c.- Determine las conc<strong>en</strong>traciones, las <strong>de</strong>sviaciones estándar y sus límite <strong>de</strong> confianza (95%) para<br />
soluciones con int<strong>en</strong>sida<strong>de</strong>s <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>cia <strong>de</strong> 2,9; 13,5 y 23 unida<strong>de</strong>s (L=1). Analice cual<br />
pres<strong>en</strong>ta el mejor límite <strong>de</strong> confianza <strong>en</strong> valores absolutos. Analice don<strong>de</strong> es conv<strong>en</strong>i<strong>en</strong>te que<br />
caiga el valor <strong>de</strong> la señal <strong>de</strong> la muestra <strong>de</strong>ntro <strong>de</strong> la curva <strong>de</strong> calibración.<br />
d.- Si se consi<strong>de</strong>ra como el promedio <strong>de</strong> cuatro medidas el valor <strong>de</strong> int<strong>en</strong>sidad <strong>de</strong> fluoresc<strong>en</strong>cia<br />
<strong>de</strong> 13,5, cuáles serán los valores <strong>de</strong> la <strong>de</strong>sviación estándar <strong>de</strong> la conc<strong>en</strong>tración calculada y el<br />
límite <strong>de</strong> confianza?. Y si fuera el promedio <strong>de</strong> ocho? Analice cual es la mejora obt<strong>en</strong>ida al<br />
aum<strong>en</strong>tar el número <strong>de</strong> medidas.<br />
e- ¿El análisis <strong>de</strong>l gráfico <strong>de</strong> residuos indica una bu<strong>en</strong>a linealidad?<br />
4-En la tabla sigui<strong>en</strong>te se muestran los resultados para la curva <strong>de</strong> calibrado <strong>de</strong> la <strong>de</strong>terminación<br />
<strong>de</strong> Mn usando un Espectrómetro <strong>de</strong> Absorción Atómica por Llama. Las alturas <strong>de</strong> las señales se<br />
midieron con un registrador electrónico.<br />
Conc<strong>en</strong>tración 0 1 2 3 4 5<br />
(ppm)<br />
Señal (altura <strong>en</strong><br />
unida<strong>de</strong>s<br />
arbitrarias)<br />
0.00 0.98<br />
0.90<br />
2.10<br />
2.20<br />
3.16<br />
3.22<br />
3.68<br />
3.72<br />
4.15<br />
4.27<br />
Repita los cálculos <strong>de</strong> los puntos a y b <strong>de</strong>l ejercicio anterior. Compare el ancho <strong>de</strong> los intervalos<br />
<strong>de</strong> confianza.<br />
Analice gráficam<strong>en</strong>te los residuos <strong>de</strong> la regresión. ¿Hay alguna t<strong>en</strong><strong>de</strong>ncia?<br />
Analice si exist<strong>en</strong> fallas <strong>de</strong>l ajuste mediante un Test F.<br />
Si <strong>de</strong>tecta una falla <strong>de</strong> ajuste ¿Cómo la solucionaría?.<br />
5-Los sigui<strong>en</strong>tes resultados se obtuvieron para la <strong>de</strong>terminación <strong>de</strong> Tl por medio <strong>de</strong><br />
Espectrometría Atómica con Horno <strong>de</strong> Grafito. La evaluación <strong>de</strong> la señal se hizo a través <strong>de</strong>l área<br />
<strong>de</strong>l pico obt<strong>en</strong>ido. A las señales <strong>de</strong> las muestras, se les restó automáticam<strong>en</strong>te a través <strong>de</strong>l<br />
software <strong>de</strong>l espectrómetro, la señal obt<strong>en</strong>ida para el blanco.<br />
Conc<strong>en</strong>tración<br />
<strong>de</strong> Tl (ng/ml)<br />
20 40 60 80 100<br />
Absorbancia<br />
(área <strong>de</strong>l pico<br />
A.s)<br />
0.038 0.089 0.136 0.186 0.232<br />
Calcule los intervalos <strong>de</strong> confianza (95%) para la p<strong>en</strong>di<strong>en</strong>te y la or<strong>de</strong>nada al orig<strong>en</strong>. Calcule la<br />
s<strong>en</strong>sibilidad con su incerteza. Decida mediante un test <strong>de</strong> hipótesis si la corrección hecha con el<br />
blanco está bi<strong>en</strong> realizada.<br />
6.- La conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> plata <strong>en</strong> una muestra <strong>de</strong> <strong>de</strong>sechos fotográficos se <strong>de</strong>terminó por<br />
espectrometría <strong>de</strong> absorción atómica con el métodos <strong>de</strong> las adiciones estándar. Se obtuvieron los<br />
sigui<strong>en</strong>tes resultados: A un volum<strong>en</strong> <strong>de</strong> 10.00 ml <strong>de</strong> muestra se agregan volúm<strong>en</strong>es variables <strong>de</strong><br />
una solución patrón <strong>de</strong> 100.0 mg/l <strong>de</strong> Ag y se completa hasta un volum<strong>en</strong> final <strong>de</strong> 25.0 ml.<br />
Volum<strong>en</strong> agregado <strong>de</strong> la<br />
solución estándar <strong>de</strong> Ag (ml)<br />
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00<br />
Absorbancia 0,32 0,41 0,52 0,60 0,70 0,77 0,89<br />
CALIBRACION 11
Determine la conc<strong>en</strong>tración <strong>de</strong> Ag <strong>en</strong> la muestra, y obt<strong>en</strong>ga los límites <strong>de</strong> confianza al 95% para<br />
esa conc<strong>en</strong>tración.<br />
7.- Utilizando los datos <strong>de</strong>l problema 3. Determine el límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección según:<br />
a.- Ecuación (16), consi<strong>de</strong>rando que la <strong>de</strong>sviación estándar relativa <strong>de</strong>l blanco es <strong>de</strong>l 5%.<br />
b.- Ecuación (16), consi<strong>de</strong>rando que la <strong>de</strong>sviación estándar relativa <strong>de</strong>l blanco es igual a la<br />
<strong>de</strong>sviación estándar residual (sy).<br />
8- Un método <strong>de</strong> análisis <strong>de</strong> Pb <strong>en</strong> leche <strong>en</strong> polvo consiste <strong>en</strong> digerir las muestras sólidas <strong>en</strong> un<br />
digestor <strong>de</strong> microondas cerrado y analizar la solución obt<strong>en</strong>ida mediante Voltametría <strong>de</strong><br />
Redisolución Anódica. Se digier<strong>en</strong> 0.25 g <strong>de</strong> leche con 10 ml <strong>de</strong> ácido y se los lleva a un<br />
volúm<strong>en</strong> final <strong>de</strong> 25 ml con agua <strong>de</strong>stilada. Se realiza una curva <strong>de</strong> calibrado utilizando patrones<br />
acuosos cuya conc<strong>en</strong>tración está <strong>en</strong>tre 0 y 60 ng/ml <strong>de</strong> Pb y se obti<strong>en</strong>e la recta <strong>de</strong> regresión<br />
y=0.002+0.00291x. Para estimar el límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección se realizan 10 réplicas idénticas <strong>de</strong>l<br />
blanco, incluída la digestión. Se obti<strong>en</strong><strong>en</strong> las sigui<strong>en</strong>tes señales (áreas <strong>de</strong> pico <strong>en</strong> unida<strong>de</strong>s<br />
arbitrarias).<br />
Blanco Area<br />
1 0.025<br />
2 0.037<br />
3 0.012<br />
4 0.029<br />
5 0.048<br />
6 0.026<br />
7 0.024<br />
8 0.015<br />
9 0.041<br />
10 0.019<br />
Determine el valor <strong>de</strong> la señal crítica (k=3).<br />
Determine el límite <strong>de</strong> <strong>de</strong>tección <strong>de</strong> Pb <strong>en</strong> la muestra sólida expresado <strong>en</strong> microgramos <strong>de</strong> Plomo<br />
por gramo <strong>de</strong> leche.<br />
CALIBRACION 12
TABLA I.- Valores <strong>de</strong> z para distintos niveles <strong>de</strong> confianza<br />
Nivel <strong>de</strong><br />
z Nivel <strong>de</strong><br />
z Nivel <strong>de</strong><br />
z<br />
confianza, %<br />
confianza, %<br />
confianza, %<br />
50 0,67 90 1,64 99 2,58<br />
68 1,00 95 1,96 99,7 3,00<br />
80 1,29 96 2,00 99,9 3,29<br />
TABLA II.- Valores <strong>de</strong> t para varios niveles <strong>de</strong> confianza<br />
Grados <strong>de</strong> Factor para un intervalo <strong>de</strong> confianza, %<br />
libertad 80 90 95 99 99,9<br />
1 3,08 6,31 12,7 63,7 637<br />
2 1,89 2,92 4,30 9,92 31,6<br />
3 1,64 2,35 3,18 5,84 12,9<br />
4 1,53 2,13 2,78 4,60 8,60<br />
5 1,48 2,02 2,57 4,03 6,86<br />
6 1,44 1,94 2,45 3,71 5,96<br />
7 1,42 1,90 2,36 3,50 5,40<br />
8 1,40 1,86 2,31 3,36 5,04<br />
9 1,38 1,83 2,26 3,25 4,78<br />
10 1,37 1,81 2,23 3,17 4,59<br />
11 1,36 1,80 2,20 3,11 4,44<br />
12 1,36 1,78 2,18 3,06 4,32<br />
13 1,35 1,77 2,16 3,01 4,22<br />
14 1,34 1,76 2,14 2,98 4,14<br />
∞ 1,29 1,64 1,96 2,58 3,29<br />
Tabla III.- Propagación <strong>de</strong>l error <strong>en</strong> los cálculos aritméticos<br />
Tipo <strong>de</strong> cálculo Ejemplo* Desviación estándar <strong>de</strong> x<br />
CALIBRACION 13