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DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
PARASITARIAS SELECTAS DE RUMIANTES
CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN DISCIPLINARIA EN
PARASITOLOGÍA VETERINARIA
LIBRO TÉCNICO No. 2 DICIEMBRE 2010

SECRETARÍA DE AGRICULTURA, GANADERÍA, DESARROLLO
RURAL, PESCA Y ALIMENTACIÓN
Lic. Francisco Javier Mayorga Castañeda
Secretario
MC. Mariano Ruiz-Funes Macedo
Subsecretario de Agricultura
Ing. Ignacio Rivera Rodríguez
Subsecretario de Desarrollo Rural
Dr. Pedro Adalberto González Hernández
Subsecretario de Fomento a los Agronegocios
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES,
AGRÍCOLAS Y PECUARIAS
Dr. Pedro Brajcich Gallegos
Director General
Dr. Salvador Fernández Rivera
Coordinador de Investigación, Innovación y Vinculación
Dr. Enrique Astengo López
Coordinador de Planeación y Desarrollo
Lic. Marcial A. García Morteo
Coordinador de Administración y Sistemas

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES
PARASITARIAS SELECTAS DE RUMIANTES
Editor:
Bautista Garfias Carlos Ramón
1
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES
AGRÍCOLA Y PECUARIAS
CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN DISCIPLINARIA EN
PARASITOLOGÍA VETERINARIA
JIUTEPEC, MORELOS, MÉXICO
Diciembre 2010

No esta permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni
la transmisión en ninguna forma o por cualquier medio, ya sea
electrónico, mecánico, por fotocopia, por registro o por otros
métodos, sin el permiso previo y por escrito a la Institución.
La información contenida en cada uno de los capítulos es
responsabilidad del autor.
Primera edición 2010
Impreso en México
Esta obra se terminó de imprimir
En Diciembre del 2010
Editor:
Bautista Garfias Carlos Ramón
Revisor de la publicación:
ISBN: 978-607-425-476-1
María Eugenia López Arellano
Libro Técnico No. 2, Diciembre de 2010
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN FORESTALES,
AGRÍCOLA Y PECUARIAS
Av. Progreso #5
Col. Barrio de Santa Catarina, Coyoacán
C.P 04010
Mexico D.F.
Teléfono:(55) 3871 8700
Correo electrónico:bautista.carlos@inifap.gob.mx

Autores
Jesús Antonio Álvarez Martínez
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Raquel Cossío Bayúgar
Investigadora CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Estefhan Miranda Miranda
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Alejandro Sánchez Albarrán
Ex investigador del CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Enrique Liébano Hernández
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Victor Vázquez Prats (finado)
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Carlos Ramón Bautista Garfias
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
David Herrera Rodríguez
Ex Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Pedro Mendoza de Gives
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos

Carmen Rojas Martínez
Investigadora CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
María Eugenia López Arellano
Investigadora CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Alfonso Falcón Neri
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Juan Alberto Ramos Aragón
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Juan Joel Mosqueda Gualito
Ex Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Actualmente profesor de la Universidad Autónoma de
Querétaro
Querétaro, Qro.
Julio Vicente Figueroa Millán
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos
Edmundo E. Rojas Ramírez
Investigador CENID-PAVET, INIFAP
Jiutepec, Morelos

PRÓLOGO
El presente texto tiene como finalidad actualizar el anterior
manuscrito (Diagnóstico de helmintos y hemoparásitos de
rumiantes) publicado en 1989 por la Asociación Méxicana de
Parasitología Veterinaria, A.C. (editado por R. Campos y C.R.
Bautista), en el que todos los autores de cada capítulo se
desempeñaban como investigadores del INIFAP. Dicha
documento fue bien aceptado por estudiantes y profesionistas
interesados en el diagnóstico de parasitosis de rumiantes, por lo
que relativamente en poco tiempo se agotó. El presente
manuscrito, que trata de mantener en lo posible el mismo estilo,
consta de 15 capítulos; la mayoría de ellos son actualizaciones
de la obra citada. Además, se incluyen nuevos capítulos como
son: “Implicaciones de la Epidemiología en el diagnóstico”,
“Extracción de ADN de hemoparásitos”, “ Diagnóstico de
babesiosis bovina por PCR”, “ Diagnóstico de tricomonosis” y
“ Diagnóstico serológico de las infestaciones por Oestrus ovis”
.
Hasta donde fue posible se trataron de evitar los errores; sin
embargo, en el caso de que los haya, se agradecerá al amable
lector cualquier sugerencia u observación al respecto para
mejorarlo en el futuro. Cabe señalar que el contenido de cada
capítulo es responsabilidad del(los) autor(es).
Finalmente, aquí se reúnen las valiosas contribuciones de
compañeros que adquirieron gran experiencia a lo largo de su
vida profesional (fundamentalmente en el INIFAP); muchos
todavía en activo y otros que ya se jubilaron (Doctores David
Herrera Rodríguez, Ricardo Campos Ruelas yAlejando Sánchez
Albarrán), cambiaron de Institución (Dr. Juan Joel Mosqueda
Gualito), o se nos adelantaron en el viaje que todos tenemos que
hacer (Dr. Victor Manuel Vázquez Prats).
Carlos Ramón Bautista Garfias
Jiutepec, Morelos, Diciembre de 2010

INDICE
Página
1. Implicaciones de la Epidemiología en el diagnóstico……..1
2. Fundamentos de microscopía óptica………………..……..10
3. Coprología diagnóstica de helmintos y protozoarios
del aparato digestivo……………………….…………………...26
4. Cultivo e identificación larvaria de nematodos
del tracto gastroentérico………………………………………..43
5. Necropsia e identificación de helmintos del tracto
gastroentérico de rumiantes………………………….……….86
6. Evaluación in vivo de antihelmínticos en rumiantes…....121
7. Diagnóstico de nematodos del tracto gastroentérico
resistentes a los antihelmínticos…………………….………127
8. Hematología diagnóstica……………………………………141
9. Diagnóstico inmunológico y molecular de las
principales helmintiasis en rumiantes………………………152
10. Diagnóstico de la infección por Babesia bovis y B.
bigemina
por medio de la prueba de
Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)………………………….169
11. Extracción de ADN de hemoparásitos………..………….178
12. Diagnóstico de babesiosis bovina por PCR…………....192
13. Diagnóstico de tricomonosis……………………………..198

14. Diagnóstico serológico de las infestaciones por
Oestrus ovis........................................................................
209
15. Soluciones empleadas en el diagnóstico
Parasitológico…………….…………………………………... 218
16. Consideraciones sobre las pruebas
comúnmente utilizadas para el diagnóstico de
enfermedades parasitarias de los
rumiantes ............................................................................ 229

1. Implicaciones de la Epidemiología en el Diagnóstico
JesúsAntonio Álvarez Martínez
1.1. Introducción
En las actividades asociadas a la salud animal, frecuentemente se utilizan
pruebas diagnósticas previas al pronóstico y al tratamiento de diferentes
enfermedades o condiciones fisiológicas. Para el diagnóstico tanto de agentes
infecciosos y no infecciosos es plausible detectar al agente causal, identificar
signos clínicos propios de la condición de interés, cambios patológicos,
cambios bioquímicos, presencia de anticuerpos circulantes. El uso de las
diferentes metodologías puede ser para determinar la frecuencia de la
enfermedad, la identificación del agente, la administración de un tratamiento
preventivo o curativo y en ocasiones hasta un manejo de segregación o
eliminación de animales. Por ende, las pruebas diagnósticas son la base para
precisar una decisión médica y/o administrativa en la prevención y control de
enfermedades (Smith, 2005). Asimismo, las pruebas diagnósticas hacen que
los laboratorios de diagnóstico mantengan un papel preponderante de manera
oficial como parte de los servicios veterinarios de un país. Formalmente este
tipo de laboratorios tienen las funciones de: diagnóstico de enfermedades de
animales que son ingresados al país; vigilancia activa y pasiva del estatus de
enfermedad en las poblaciones animales; pruebas de constatación en
animales o subproductos de origen animal que son exportados a países libres
de enfermedades de interés; consulta e interpretación de pruebas utilizadas
por veterinarios que hacen clínica particular y en algunos casos este tipo de
laboratorios hacen o mantienen contacto directo con instituciones de
investigación, particularmente dirigiendo sus actividades hacia el desarrollo,
mejoramiento y/o validación de ensayos diagnósticos (Schmitt, 2003).
En ocasiones, la disponibilidad y variedad de metodologías hace que las
características propias de cada una, confundan y dificulten la selección de la
más adecuada. Por ejemplo, muchas pruebas son capaces de detectar
anticuerpos circulantes; sin embargo, surge el conflicto de definir en una
respuesta positiva la condición de la enfermedad, o si el resultado es debido a
la presencia de anticuerpos residuales de una infección pasada. Pudiéndose
complicar aún más la explicación cuando existe la presencia de anticuerpos de
tipo calostral en rumiantes jóvenes. Por otra parte, también puede ocurrir que
la prueba seleccionada pueda mostrar reacción cruzada entre dos o más
agentes patógenos.
1

La condición ideal al aplicar una metodología diagnóstica sería identificar de
manera categórica animales positivos o negativos (Stevenson, 2005).
Considerando que su uso puede ser a nivel de hato o individualmente; la forma
usual de clasificar los resultados de una prueba diagnóstica puede ser de tipo
cuantitativo o cualitativo (CDRH, 2007). Los resultados pueden ser
presentados con alguna de tres escalas: nominal, ordinal o de intervalo. De
modo que las interpretaciones pueden ser; positivo o negativo, positivo fuerte o
débil, o bien indicar el grado de reacción dado como un titulo por la dilución del
suero. Es necesario reseñar que las pruebas diagnósticas y las pruebas de
escrutinio se utilizan con diferente objetivo. Las diagnósticas permiten
discriminar a los animales que tienen la enfermedad de interés, de otras
enfermedades, así que se aplican en animales enfermos. Mientras que las de
escrutinio son usadas para la identificación de animales con la enfermedad
aún no manifiesta, en poblaciones aparentemente sanas. Se destaca que la
misma técnica, procedimiento o examen puede ser aplicado para cualquiera
de los dos propósitos, diagnóstico o escrutinio (Smith, 2005).
En la instrumentación y evaluación de una prueba diagnóstica siempre debe
existir una prueba que sea el estándar o prueba que respalde los resultados de
la prueba en desarrollo (Jurgen, 2005). De tal manera que la ”Gold standard” es
una prueba diagnóstica o referencia aceptada para una enfermedad particular,
que nos permite conocer el estado verdadero de un animal y la forma en que
puede ser determinado. En algunos casos, la Gold standard puede estar
compuesta de varias evaluaciones e.g. en paratuberculosis se incluyen:
histopatología, signos clínicos, cultivo, características del hato y edad del
animal (Smith, 2005; Hennekens, 2007). Es importante notar que en ocasiones
la Gold standard puede ser poco práctica, porque la presentación clínica es
muy severa, el costo puede ser elevado, su ejecución tediosa (Furukawa &
Guyatt, 2006). Se ha descrito también que existe una serie de factores que
introducen un sesgo en forma consistente. En los que se pueden incluir una
selección inadecuada de los individuos con y sin el diagnóstico de interés; el
realizar la interpretación de los resultados de la prueba con conocimiento
previos del status de las muestras; falla al utilizar la misma Gold standard para
todos los individuos (Whiting et al.,
2004).
En la práctica con sentido común se debe considerar una aplicación secuencial
de cada prueba diagnóstica, iniciando con los signos o síntomas que se
manifiestan (Citado en Furukawa & Guyatt, 2006).
1.2. Consideraciones sobre las pruebas diagnósticas
Al intentar usar una prueba diagnóstica nueva, es esencial conocer la exactitud
que posee (Knottnerus et al.,
2002). En años recientes se propuso una
mecánica en la que al incluir una prueba nueva de tipo diagnóstico, se compara
con pruebas existentes y se generan tres diferentes rutas diagnosticas; el
reemplazo, el triaje y la agregación (Bossuyt et al., 2006).
1.2.1. Reemplazo de una prueba diagnóstica.
Para el reemplazo pueden
existir una o más nuevas pruebas diagnosticas, pueden variar en mayor
precisión, más fáciles de realizar, más rápidas, etc. Al reemplazar a una
metodología por otra, se recomienda comparar la sensibilidad y especificidad
2

de ambas pruebas, utilizando las mismas muestras o individuos (Irwig et al.,
2002). Es aún mejor el realizar un estudio pareado en el que se utilice un
grupo de muestras, a las que se analice con la prueba existente, la prueba
nueva y una prueba estándar de referencia. prueba nueva de tipo diagnóstico,
se compara con pruebas existentes y se generan tres diferentes rutas
diagnosticas; el reemplazo, el triaje y la agregación (Bossuyt et al., 2006).
1.2.1. Reemplazo de una prueba diagnóstica.
Para el reemplazo pueden
existir una o más nuevas pruebas diagnosticas, pueden variar en mayor
precisión, más fáciles de realizar, más rápidas, etc. Al reemplazar a una
metodología por otra, se recomienda comparar la sensibilidad y especificidad
de ambas pruebas, utilizando las mismas muestras o individuos (Irwig et al.,
2002). Es aún mejor el realizar un estudio pareado en el que se utilice un
grupo de muestras, a las que se analice con la prueba existente, la prueba
nueva y una prueba estándar de referencia. Un ejemplo de reemplazo es la
utilización del ensayo inmunoenzimático en lugar de fijación de complemento
para la detección de Anaplasma marginale.
En donde la prueba estándar es la
observación microscópica de frotis teñidos. En esta condición en particular, la
prueba nueva ha mostrado como ventajas; automatización para analizar un
número considerable de muestras en una misma placa, mayores tasas de
sensibilidad y especificidad, objetividad en los resultados, etc.
1.2.2. Tiaje (selección o clasificación). En el triaje la prueba nueva se incluye
antes que la prueba ya existente y solamente a individuos con algún resultado
particular se les continúa el análisis con la prueba existente. Debido a esto, no
necesariamente implica un reemplazo de técnica diagnostica, pero puede
haber mejoramiento en la exactitud del diagnóstico, reducción del tiempo de
ejecución de una prueba, menor costo, entre otros factores. Este tipo de
diseño de estudios de diagnostico con reacomodo de alguna metodología.
1.2.3. Agregación.
El reemplazo se puede hacer al aplicar una prueba
nueva, posterior a una prueba existente. Cuando la prueba nueva es más
precisa, se incrementa sensibilidad sobre la prueba existente. Se sugiere que
su utilidad podría limitarse a individuos que resultan negativos a la prueba
existente (Macaskill et al.,
2002).
Este modelo para evaluar pruebas resulta una comparación entre pruebas
nuevas y pruebas existentes, aunque es necesario definir desde un principio
cual será el papel de nueva prueba: remplazo, triaje o adición. Lo cual, no se
limita a conocer no únicamente sensibilidad y especificidad. Otro tipo de
factores como objetivo del muestreo, costo, tiempo requerido en su ejecución,
etc. deberán ser considerados para la mejor elección de la prueba (Bossuyt,
2006; Slander, 1979).
Cuando se aplican pruebas diagnósticas generalmente existe confusión entre
los términos sensibilidad y especificidad. Así mismo, de manera impropia se
utiliza sin distinción los conceptos de sensibilidad analítica y sensibilidad
diagnóstica, análogamente especificidad analítica y especificidad diagnóstica
(Saah et al., 1997). El significado de cada concepto depende del contexto en el
3

que se presente; sensibilidad analítica es la habilidad de una prueba para
determinar una sustancia en una muestra contenida en muy bajos niveles. La
forma de expresar la concentración puede ser variar dependiendo de la
prueba, de la naturaleza del agente y de la muestra que se utilice.
1.3. Sensibilidad analítica.
Es la capacidad de un ensayo de detectar la mínima cantidad o concentración
de un analito. Este puede ser de diferente naturaleza por ejemplo para el
diagnóstico de neosporosis mediante el ensayo en cadena de la polimerasa
(PCR) se ha indicado que la sensibilidad analítica permite detectar desde 20
taquizoitos en 20 mg de tejido cerebral (Baszler et al.,
1999). En el caso de
hemoparásitos mediante un ensayo de PCR múltiple que incluye la hibridación
no radiográfica con una sonda de ADN se ha reportado un diagnostico cuya
sensibilidad analítica permite la la detección de 0.00001%, 0.00001% y
0.0001% eritrocitos infectados con Babesia bigemina, Babesia bovis y
Anaplasma marginale,
respectivamente (Figueroa et al., 1993). Con el uso de
PCR en tiempo real y PCR en el formato anidado se reporta una sensibilidad
analítica de hasta 2.5 parásitos por L
de sangre para Babesia bovis y Babesia
bigemina (Kim et al.,
2007). En otro tipo de parasitosis como la causada por
Haemonchus contortus la sensibilidad del examen coproparasitoscópico es
determinada por el conteo de huevos que pueden ser cuantificados, y se indica
que puede ser a partir de 50 huevos por gramo de heces (citado por Chaundary
et al., 2007). Comúnmente para detectar al mismo patógeno existe técnicas
con diferentes principios, interpretaciones de los resultados y diferentes
valores de sensibilidad analítica. Así, para la detección de quistes de
Cryptosporidium parvum en heces de bovino mediante un ensayo
5
inmunoenzimático (ELISA) la sensibilidad analítica permite detectar 3 x 10
quistes por ml (Krzysztof et al., 1990).
En suma la concentración o nivel más bajo detectable representa el límite del
ensayo y por tanto la mayor sensibilidad analítica. Existen dos formas para
determinar la sensibilidad analítica: mediante diluciones seriadas del
patógeno o de la sustancia blanco; la otra forma es estadísticamente,
probando un número significativo de muestras negativas y usando dos o tres
desviaciones estándar sobre el valor medio, lo cual, se usa como el valor más
bajo de detección (Babu et al., 1993; Armbruster et al., 1994). En los
procedimientos como el PCR, o el uso de sondas de ADN se usa el método
empírico antes citado, haciendo diluciones (Figueroa et al., 1993; Ramos et al.,
1992).
1. 4. Especificidad analítica.
La especificidad analítica se refiere a la capacidad de un ensayo de identificar
de manera exclusiva a un agente o sustancia blanco, evitando a otros similares
o diferentes en una muestra. Lo cual, se puede ejemplificar con la
especificidad analítica para detectar quistes de Cryptosporidium sp.,
mediante ELISA, que permite hacer la discriminación con Eimeria
auburnensis, E. bovis, E. ellipsoidalis o E. zuernii (Krzysztof et al., 1990).
Similarmente, al realizar PCR para el diagnóstico de Babesia bovis,
se utilizan
4

iniciadores específicos del género y especie, de manera que no permiten la
detección de B. bigemina y viceversa (Figueroa y Álvarez, 2004).
1.5. Sensibilidad y especificidad epidemiológicas
Los conceptos de sensibilidad y especificidad epidemiológicas son
particularmente imprescindibles, particularmente son necesarios para estimar
la magnitud de enfermedad a nivel de población animal. La sensibilidad
diagnóstica o epidemiológica de una prueba se define como la probabilidad de
que una prueba sea positiva si la enfermedad está presente; es decir, positivos
realmente positivos. Por lo tanto, está más interesada en la detección de la
sustancia o agente y no en la capacidad de detección de la concentración o
nivel más bajo de la sustancia o analito (Saah et al., 1997). En tanto la
especificidad diagnóstica es la capacidad de una prueba para identificar
correctamente como negativo a un individuo que no tiene la condición o
enfermedad de interés; es decir negativos realmente negativos (Smith, 2005).
Es importante considerar que cuando la sensibilidad de una prueba es alta, el
número de individuos clasificados como falsos negativos disminuye,
considerando a éstos como individuos o muestras con resultado negativo que
se sabe pertenecen a enfermos. Pero cuando la especificidad de una técnica
es elevada, el número de individuos de falsos positivos será en baja
proporción, los cuales, son muestras o individuos con resultado positivo que
se sabe son libres de la enfermedad (Hennekens et al.,
2007; Smith, 2005).
1.6. Validación de una prueba diagnóstica
Antes de hacer uso de cualquier metodología diagnostica es un requisito
hacer su validación, proceso que permite ajustarla a un uso muy particular. Al
hacer la validación existen criterios que deber considerarse debido a que
existen variables que pueden afectar la ejecución del ensayo. Las variables
se pueden agrupar en muestra; ensayo y resultado de la prueba. La muestra
en sus características puede estar afectada por interacciones del hospedadoragente
que modifican concentración, composición. Un ensayo posee
características propias asociadas a factores químicos, físicos, biológicos y
asociados al técnico laboratorista que afectan la capacidad de la prueba para
la detección del analito de interés. Tratando sobre el resultado de la prueba,
cada una posee sus propias tasas de sensibilidad, especificidad o valores
predictivos, las cuales, podrán predecir con diferente precisión el estatus de la
condición o enfermedad (Jacobson, 1996; Smith, 2005).
Para que una prueba sea usada de manera regular, esta deberá ser validada.
Durante el proceso de validación la sensibilidad y la especificidad diagnósticas
son los parámetros primarios que se obtienen de una prueba. Un ensayo o
prueba que se ha validado permite identificar animales como positivos o
negativos al ser analizados, el tipo de respuestas puede variar dependiendo
del tipo de agente. En un ELISA para el diagnóstico de Anaplasma marginale
la variable a evaluar regularmente es la detección de anticuerpos (Barigye et
al.,
2004). En un diagnóstico de PCR de tiempo real a partir de ADN derivado
de huevos de Haemonchus contortus se puede estimar el número de huevos
(Harmon et al.,
2007). También para este tipo de parásitos es posible el uso de
5

técnicas coproparasitocópicas en las que la variable es la detección de huevos
en muestras de heces (Muñoz et al.,
2008).
1.7. Cálculo de la sensibilidad y especificidad diagnósticas
Para el cálculo de la sensibilidad y especificidad diagnósticas se utiliza una
tabla de contingencia de 2 x 2, en esta se clasifican los resultados de la prueba
utilizada como positivos (PV) o negativos verdaderos (NV), además se
incluyen los falsos positivos (FP) y falsos negativos (FN) que puedan resultar.
La sensibilidad diagnóstica se calcula de la siguiente manera: positivos
verdaderos/positivos verdaderos + falsos negativos (PV/PV+FN) x 100; la
especificidad diagnostica se calcula así: negativos verdaderos/falsos
positivos + negativos verdaderos (NV/FP+NV) x 100 (Thrusfield, 2004). Una
vez que se define el punto de corte de una prueba o la clasificación de
negativos o positivos, entonces es posible hacer el cálculo de la sensibilidad y
especificidad diagnosticas. Otros de los parámetros con respecto al número
de casos detectados por el escrutinio son los valores predictivos, que son
medidas que indican si un animal tiene o no la enfermedad o ha sido expuesto,
dados los resultados de la prueba con que se analiza la muestra. El valor
predictivo positivo VP(+) se define como la probabilidad de que un animal
tenga la enfermedad, dado que resulta positivo a la prueba aplicada; esta es
calculada como: PV / PV+ FP. Similarmente, el valor predictivo negativo VP (-)
se define como la probabilidad de que un individuo sea negativo verdadero a la
enfermedad, dado que es negativo a la prueba de escrutinio y se calcula como:
NV / FN+NV.
Prueba
Positivo (
+)
Negativo (
- )
Muestras de Animales con
status de Infección Conocido
Infectado No Infectado
(+)
(-)
a
Positivos
Verdaderos
b
Falsos
Positivos
Sensibilidad = (a / a + c) x 100
Especificidad = (b / b + d) x 100
Precisión = (a + d / a+b+c+d) x 100
Prevalencia = (a + c / a+b+c+d) x 100
Valor predictivo (+) = a / a+b x 100
Valor predictivo (-)=d/c+dx100
a+b
c
d
c+d
Falsos Negativos
Negativos Verdaderos
a + c b + d a+b+c+d
Total
6

Ejemplo del cálculo de las tasas de sensibilidad y especificidad diagnósticas
con resultados hipotéticos de un programa de escrutinio con una prueba de
PCR para el diagnostico de Babesia bovis con 95% de sensibilidad y 90% de
especificidad.
Prueba
Positivo (
+)
Negativo (
- )
Infectado
(+)
a
780
c
59
a+c
839
Sensibilidad = 780 / 839 = 93%
Especificidad = 155 / 161 = 96%
Prevalencia = 839 / 1000= 83.9%
Valor predictivo (+) = 780 / 786 = 99%
Valor predictivo (-) = 155 / 214 = 72%
No
Infectado
(-)
1.8. Escrutinio de una enfermedad con pruebas diagnósticas.
Cuando se desea hacer el escrutinio de una enfermedad en una población
definida y que existe(n) una(s) prueba(s) disponible(s). El objetivo primario
será reducir morbilidad y mortalidad de la enfermedad, de modo que se deben
siempre aplicar los principios de prevención y control de la enfermedad. Se
debe clarificar si el programa puede ser instrumentado, esencialmente se
requerirá considerar la factibilidad y la efectividad del programa. Aunque es
indispensable tomar en cuenta que la reducción en morbilidad y mortalidad
posteriores a un escrutinio no son totalmente aceptables sin no se realiza
eficientemente sin afectar a los animales durante el muestreo y además debe
hacerse con un costo razonable.
7
b
6
d
155
b+d
161
a+b
786
c+d
214
a+b+c+d
1000

Literatura citada
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quantitation (LOQ): comparison of the empirical and statistical
methods exemplified with GC-MS assays of abused drugs. Clin Chem
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antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay. J Clin.
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19. Macaskill P, Walter SD, Irwig L, Franco EL. 2002. Assessing the gain in
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20. Muñoz J, Angula F, Ramírez R, Vale O, Chacín E, Simoes D, Atencio A.
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21. Ramos A, Álvarez J, Figueroa M, Solís J, Rodríguez R, Hernández R,
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28. Whiting P, Rutjes AW, Reitsma JB. 2004. Sources of variation and bias in
studies of diagnostic accuracy: a systematic review. Ann.Intern Med.
140: 180-202.
9

2. Fundamentos de microscopia óptica
Raquel Cossío Bayúgar
Estefan Miranda Miranda
2.1. Definición
Los microscopios son instrumentos ópticos de precisión diseñados para
producir imágenes amplificadas y libres de distorsiones de objetos demasiado
pequeños para ser vistos a simple vista. Un microscopio utilizado en
aplicaciones clínicas-científicas debe de cumplir con tres requisitos
fundamentales: 1) producir una imagen amplificada y sin distorsiones del
espécimen, 2). discernir claramente los detalles del espécimen y 3) hacer
estas imágenes y sus detalles registrables al ojo humano y/o a instrumentos de
registro de imágenes tales como cámaras fotografías y/o de video
(Abramowitz, 1987).
2.2. Escalas y medidas usadas en microscopía
Los objetos microscópicos, si bien tienen en común que solo se puedan ser
observados con la ayuda del microscopio, también tienen diversos tamaños, lo
cual creó la necesidad de desarrollar unidades de medidas micrométricas
(figura 1). El micrómetro (μm) es igual a la milésima parte de un milímetro (1 μm
= 0.001 mm) y ha sido adoptado como la unidad micrométrica fundamental
sobre la cual se comparan todos los objetos microscópicos. El nanómetro
(nm), es la milésima parte de 1 μm (1 nm =0.001 μm) y se utiliza para medir
objetos mucho menores a una célula eucarionte, como por ejemplo una
partícula viral. El Angstrom (Ä) es la diezmilésima parte de un μm (1 Ä = 0.0001
μm) y se utiliza para medir unidades todavía más pequeñas como las
macromoléculas por ejemplo las proteínas o los ácidos nucléicos.
En las escalas lineales con aplicaciones científicas se usa la escala decimal
exponencial de submúltiplos del metro (m), de esta manera un milímetro (mm)
-3 -6 -9
es 10 m, un micrómetro (μm) es 10 m, un nanómetro (nm) es 10 m y un
-10
Angstrom (Ä) equivale a 10 m. En la figura 1 se presenta una escala de
tamaños relativos de varios objetos microscópicos. Las células óseas miden
-5 -5
12 a 25 μm (1.2 a 2.5 X 10 m); los espermatozoides 45 a 50 μm (4.5 a 5 X 10
-6
m); los glóbulos rojos 7,5 a 8,5 μmde diámetro (7.5 a 8.5 X 10 m); una bacteria
-6 -8
2-3μm(2a3X10 m);unapartícula viral mide unos 10 nanómetros (10 m) las
-4
neuronas 100-200 μm ( 1a2X10 m);lasfibras musculares estriadas miden
-2
unos 5 cm (5 X 10 m).
10

Figura 2.1. Escala de tamaños relativos de diferentes objetos
microscópicos.
2.3. Evolución de las partes del microscopio
Los microscopios modernos abarcan una serie de avanzados instrumentos
científicos ópticos que constituyen una herramienta fundamental en
disciplinas científicas tales como la geología, microbiología, parasitología,
protozoología y helmintología entre otras (Kapitza, 1997). Estos instrumentos
de precisión han evolucionado durante cientos de años acumulando
refinamientos técnicos los cuales es necesario conocer en su contexto
histórico para entender cómo se han desarrollado las partes que constituyen
un microscopio moderno, los que actualmente se agrupan en dos clases: 1)
microscopios simples los cuales cuentan con un solo lente semejantes a una
lupa que pueden ser sostenidos en una mano (Kapitza, 1997), y 2)
microscopios compuestos que contienen múltiples lentes organizados en
oculares, condensadores de luz y diversos objetivos (Patterson y Kellner,
1917; Reinert, 1974; Stankewitz,1974).
Los microscopios simples actuales, provienen de antecesores desarrollados
hace más de 400 años a partir de lentes convexos que permitían discernir
pequeños especímenes inmovilizados en la mano o sobre soportes especiales
(www.microscopy.fsu.edu/). Este tipo de instrumentos alcanzó su perfección
con el trabajo del Holandés Anton von Leeuwenhoek alrededor de 1660, quién
fue capaz de detectar organismos unicelulares a los que llamó "animáculos"
con ayuda de un instrumento óptico de su creación semejante al mostrado en
la Figura 2.2 (www.microscopy-uk.org.uk/). Los microscopios simples han
variado poco desde su invención y actualmente son muy populares debido a
su bajo costo y diseño ligero y ampliamente usado en áreas tales como
geología, mineralogía y trabajos de campo en la biología (Abramowitz, 1987).
11

Ajuste de
Enfoque
Portaobjetos
Condensador
Cuerpo
Figura 2.2. Descripción de las partes más importantes de un
microscopio simple.
El uso de arreglos de lentes para constituir los primeros microscopios
compuestos se le atribuye a los también holandeses hermanos Janssen a
mediados del siglo XVII (Kapitza, 1997; www.microscopy.fsu.edu), el cual
consistía en dos lentes convexos alineados en series, uno de los cuales se
dispuso cerca del espécimen y se denominó objetivo, así como un segundo
lente cercano al ojo del observador y se denominó ocular (Figura 2.3) (Kapitza,
1997). Esta nueva disposición permitió la experimentación con dispositivos de
diferentes materiales y tornillos de ajuste que permitirían variar la distancia
entre los lentes para lograr un enfoque preciso y una magnificación mayor que
la lograda por un microscopio simple (Davidson y Abramowitz, 1999). Este
incremento de magnificación se logró pagando el precio de la aberración de
imagen, una falla que produce halos de luz y disminuye la calidad de la imagen,
impidiendo discernir los detalles del espécimen a analizar (de Lange et al.,
2001). No fue sino hasta mediados del siglo XVIII en que se comenzaron a
utilizar nuevas tecnologías desarrolladas para la fabricación de lentes de
telescopio con vidrio de mejor calidad, que se descubrió la manera de fabricar
lentes de microscopio corregidos para evitar la aberración cromática,
combinando lentes de diferentes materiales (de Lange et al., 2001) y solo
entonces el microscopio compuesto se aceptó como un verdadero instrumento
científico de precisión (World Health Organization, 1999).
12

Imagen
Final
Ocular
Imagen Virtual
Intermedia
Tornillo de
Enfoque
Objetivo
Espécimen
Condensador
Figura 2.3. Disposición de lentes en un microscopio compuesto.
Consta de dos lentes convexos alineados en series, uno de los cuales
se disponen cerca del espécimen y se denomina objetivo, un segundo
lente se ubica cercano al ojo del observador y se denomina ocular. Esta
nueva disposición permitió la experimentación con dispositivos de
diferentes materiales y tornillos de ajuste que permitirían variar la
distancia entre los lentes para lograr un enfoque preciso y mejorar la
amplificación.
La revolución industrial a finales del siglo XVIII aportó mejores técnicas
mecanizadas en la obtención y fabricación de materiales metálicos y partes
sofisticadas para los soportes y mecanismos móviles que constituyen los
microscopios modernos y alrededor de 1850, emergieron varios fabricantes
europeos de microscopios compuestos de alta calidad en una gran variedad de
diseños, pero cuyo fundamento técnico compartían entre sí, ya que todos ellos
eran microscopios compuestos monoculares con un condensador de espejo e
iluminados por una lámpara de combustión o luz solar, conteniendo todos los
elementos que actualmente podemos encontrar en todos los microscopios
ópticos modernos (Figura 2.4)(Kapitza, 1997; Wallace et al. 2001).
13

Objetivo
Porta
Espécimenes
Condensador
Ocular
Ajuste
de Enfoque
Portaobjetos
Cuerpo
Figura 2.4. Evolución del microscopio compuesto. Los
microscopios compuestos de alta calidad emergieron en una
gran variedad de diseños alrededor de 1850, todos ellos eran
microscopios compuestos monoculares con un condensador de
espejo e iluminados por luz solar o una lámpara de combustión,
este diseño contiene todos los elementos que actualmente
podemos encontrar los microscopios compuestos modernos.
Los microscopios compuestos modernos son en su gran mayoría
binoculares(Patterson y Kellner, 1917) y se caracterizan por desarrollar una
amplificación de la imagen en dos etapas, realizadas por dos sistemas de
lentes separados llamados objetivo y ocular, (montados en los extremos
opuestos de un tubo) (World Health Organization. 1999; www.microscopyuk.org.uk).
El objetivo, localizado cerca del espécimen consta de varios
elementos o lentes que forman una imagen intermedia amplificada del
espécimen bajo estudio. La imagen intermedia es amplificada nuevamente
por el ocular (Figura 2.5) de tal manera que es posible cuantificar el total de la
amplificación de la imagen multiplicando los factores de magnificación óptica
del objetivo y ocular (Kapitza, 1997; Weijer, 2003) (Cuadro 1). Los
microscopios compuestos usan luz transmitida lo que quiere decir que el haz
24
de luz pasa a través y/o se refleja en un espécimen muy delgado ,
generalmente de entre 1 a 100 micrómetros montado en un portaobjetos de
vidrio. De esta forma la luz que pasa a través del espécimen es colectada por
un único lente-objetivo que forma una imagen virtual intermedia en el canal
óptico (Stankewitz, 1974) (Figura 2.5). Los microscopios compuestos son
capaces de resolver detalles de algo tan pequeño como 0.2 μm permitiendo
una magnificación útil de hasta 1000 aumentos, estos microscopios trabajan a
14

distancias muy cortas, generalmente a unos milímetros del espécimen y tienen
una profundidad de campo de solo unas 10 micrómetros (de Lange et al., 2001;
Wallace et al., 2001). Los actuales microscopios además de los elementos
ópticos cuentan con monturas estables y masivas que garantizan
observaciones sin vibraciones, así como componentes mecánicos de alta
tecnología y diseñados ergonómicamente que permiten intercambio, enfoque,
alineamiento, calibración y centrado rápido y preciso de sus diferentes
componentes ópticos sobre los especímenes analizados (Figura 2.5) (Kapitza,
1997; World Health Organization, 1999).
2.4. Objetivos
Son los componentes más importantes de un microscopio debido a que
determinan la calidad de la imagen producida. Existe una amplia variedad de
objetivos que tienen un excelente desempeño y eliminan la mayoría de las
aberraciones ópticas. Algunos objetivos usan sofisticados métodos de
obtención de imágenes, compensando variables como el grosor del
cubreobjetos o la distancia al espécimen (Wallace et al., 2001). Estos objetivos
tienen características medibles como la apertura numérica que es una medida
del poder de resolución y amplificación de la imagen, siendo la resolución la
menor distancia medible entre dos puntos de un espécimen que pueda ser
distinguida, a mayor su valor numérico mayor su poder resolutivo (Abramowitz,
1987). Otra característica medible de los objetivos es el valor de amplificación y
da cuenta del número de veces que una imagen es amplificada. Tanto la
apertura numérica como el valor de amplificación se encuentran grabados en el
objetivo por la mayoría de los fabricantes (Wallace et al., 2001). La mayoría de
los objetivos están diseñados para ser usados sobre especímenes cubiertos
por un cubreobjetos lo que significa que compensan el índice de difracción
ocasionado por el vidrio y el líquido que inevitablemente se encontrará entre el
objetivo y el espécimen (Davidson yAbramowitz, 1999).
15

Figura 2.5. Partes de un microscopio moderno. Los actuales
microscopios son en su mayoría binoculares y cuentan con monturas
estables y masivas que garantizan observaciones sin vibraciones, así
como componentes mecánicos de alta tecnología y diseñados
ergonómicamente que permiten intercambio de lentes, enfoque,
alineamiento, calibración y centrado rápido y preciso de sus diferentes
componentes ópticos sobre los especímenes analizados.
2.5. Oculares
Los oculares trabajan en combinación con los objetivos para magnificar la
imagen virtual intermedia y eliminar las aberraciones cromáticas de manera
que los detalles del espécimen pueda ser observado de manea nítida(Kapitza,
1997). Los oculares son una combinación de lentes y un diafragma fijo que se
encuentran en el interior o en la parte baja del ocular. El grado de
magnificación de la imagen obtenida por la combinación de uso del sistema
objetivo-ocular depende de la relación numérica de sus partes y se deduce por
la multiplicación de sus valores (Davidson yAbramowitz, 1999). En el cuadro 1,
se muestran algunas de las combinaciones más comunes. Al respecto, se
sugiere seleccionar la mejor combinación del par objetivo-ocular con el fin de
lograr la mayor amplificación con la menor distorsión. Por ejemplo, si se
requiere amplificar la imagen unas 250 veces es necesario utilizar un objetivo
25 X en combinación con un ocular 10 X. Cabe hacer notar que mas allá de una
magnificación útil de 1000 no existe una mayor resolución de la imagen debido
a problemas de la física de la transmisión de la longitud de las onda de la luz
visible ya que en este punto la longitud de onda es mayor que los objetos
16

amplificados y por lo mismo imposibles de enfocar mediante lentes, lo que
ocasiona una magnificación denominada "vacía" con poca resolución para
discernir detalles (de Lange et al., 2001).
Cuadro 1. Cálculos de los factores de magnificación. Dependiendo de las
combinaciones entre los objetivos y los oculares. *magnificación vacía.
OCULARES
OBJETIVOS 10 X 15 X 20 X
4 X 40 60 80
25 X 250 375 500
40 X 400 600 800
100 X 1000 1500* 2000*
2.6. Condensador
El propósito de un condensador es concentrar la luz que proviene de una
fuente luminosa y formar un cono de luz en cuya punta se encuentra el
espécimen (Lisfeld,1977; World Health Organization, 1999). Una de las
funciones críticas del condensador es optimizar la luz reflejada y/o transmitida
por el espécimen hacia el objetivo, controlando de esta forma el contraste y la
profundidad de campo. Existen condensadores que incorporan mascarillas y
filtros que se aplican en la microscopía de campo obscuro, polarizante y de
contraste de fases (Kapitza, 1997; Reinert, 1974).
2.7. Porta especímenes
Todos los microscopios incluyen un soporte de la muestra que en algunos
casos se denomina estrado o carro. Es un sistema mecánico que permite
mover la muestra de manera suave en dos ejes (Wallace et al., 2001). Algunos
microscopios como los de luz polarizada requieren que el portaespécimen
permita la rotación de la muestra en 360˚. Los microscopios invertidos,
denominados así porque contienen los objetivos por debajo del espécimen y la
iluminación por encima de este, incluyen soportes para iluminación adicional
y/o micromanipuladores y herramientas de sujeción y microinyección
(Davidson yAbramowitz, 1999) .
17

2.8. Preparación de especímenes
La preparación de especímenes para microscopía implica colocar la muestra
para analizarla sobre un soporte de vidrio denominado portaobjetos (Beaver et
al., 2003; Thienpont et al., 1979). La preparación involucra tres pasos: la
fijación, la disección y la tinción (Pietrzak-Johnston et al., 2000). La fijación
tiene como fin preservar, por tiempo indefinido, la muestra mediante el uso de
substancias que precipitan y/o deshidratan las proteínas y otras biomoléculas
en el interior de las células. Para lograr esto, se puede hacer algo tan simple
como aplicar solo desecación al aire o al calor, o utilizar diversos químicos
como: etanol, metanol, ácido acético, cloruro de mercurio o dicromato de
potasio (Beaver et al., 2003). La disección tiene como objetivo obtener cortes
muy delgados que permitan el paso de suficiente luz a través de ellos, de
preferencia en capas de una sola célula de espesor. Si la muestra involucra
muestras de tejidos complejos estos pueden ser
Cuadro 2. Organismos de interés médico y veterinario
diagnosticables por microscopía.
Organismo Descripción Enfermedades Método de Tinción
que ocasionan aislamiento
Bacterias Organismos Tuberculosis Cultivo Gram
procariontes de Brucelosis
0.5-5 µm de
formas variadas
con pared
celular
Leptospirosis
Hongos Organismos
Eucariontes de Dermatofitosis Frotis Azul de
5-10 µm Histoplasmosis Cultivo. algodón
unicelulares
Levaduriformes
que pueden
formar micelio
multicelular.
Coccidioidomicosis
Protozoarios Organismos Babesiosis Frotis Tinción
Eucariontes Coccidiosis Centrifugación de yodo
Unicelulares de Tripanosomiasis Cultivo Giemsa
10 a 100 µm Amibiasis
Wright
Helmintos Metazoarios Helmintiasis Sedimentación Tinción
gusanos diversas. Centrifigación de Yodo.
redondos y
planos
mayor a 200
µm
Coprocultivo
18

2.9. Tinciones
La tinción es una necesidad para la gran mayoría de los especímenes a
estudiar (Dwight, 2002; Kapitza, 1997; Lane y Europa, 1965; Munger, 1961;
Robinow F. 1977). Las tinciones proporcionan mayor definición y contraste de
las diferentes estructuras biológicas (Lux et al., 2005) , a menudo no es posible
identificar los organismos y/o células analizadas sin la tinción apropiada (Lux et
al., 2005; Munger, 1961; Pietrzak-Johnston et al., 2000 ) . Las tinciones
aplicadas a la microscopia fue una consecuencia de la aparición de los
pigmentos de anilina a mediados del siglo XIX y con el tiempo se han hecho
tinciones específicas para cada biomolécula encontrada en cualquier muestra
biológica (Lane y Europa, 1965; Robinow, 1977; Romanes, 1950). Algunas
muestras húmedas no requieren tinción, ni preparación alguna, ya que es
posible identificar microorganismos tales como algas, radiolarios y ciliados
gracias a sus propios pigmentos naturales internos; sin embargo para la
mayoría de los casos es necesario utilizar una tinción capaz de reaccionar con
toda clase de biomoléculas tal es el caso de la tinción de yodo capaz de
identificar quistes de protozoarios, y huevos de helmintos(Pietrzak-Johnston et
al., 2000; Thienpont et al.,1979).
La mayoría de las aplicaciones de laboratorio requieren una preparación en
frotis que consiste en una dispersión cuidadosa de la muestra sobre el
portaobjetos, así como el uso de diversos fijadores y tinciones especiales de
varios colorantes que proporcionan coloraciones diferentes a diversas
biomoléculas encontradas en los microorganismos y células (Lux et al., 2005) .
Cuadro 3. Procedimientos de preparación de muestras para
microscopia.
Tipo de
preparación
Tipo de
Tinción
Húmeda Yodo Muestras
biológicas
diversas
Frotis Gram
Giemsa
Wright
Aplicaciones Observaciones
Bacteriología
Hematología
Parasitología
Disecciones Diferencial Histología
Patología
19
Procedimiento rápido
aplicable a muestras
de agua y ensayos de
campo.
Económico y
ampliamente usado en
laboratorios de
diagnóstico clínico
Procedimiento
complejo que requiere
equipamiento especial
y experiencia.

Cuadro 4. Tinciones de muestras más usadas en microscopia.
Existen procedimientos de tinciones especializados en teñir las
diferentes biomoléculas presentes en cualquier tipo de
muestra.
Tinción Uso común Núcle Citoplasm Eritrocito Colágen Tinción
o a s o específica
Hematoxilin Tinción Azul _ Rosa _ Ácidos
a general
nucléicos-
Proteinas
Eosina Tinción _ Rosa Naranja Rosa Fibras
general
reticulares
Tricrómica Tejido Rojo Rosa Rojo Verde Fibras
conectivo
musculares
Tinción de Fibras _ _ _ Café Proteínas
plata nerviosas
Ácidos
Nucléicos.
Wright Eritrocitos Azul _ Rojo _ Eritrocitos
Leucocitos
Leucocitos
Giemsa Eritrocitos Rojo _ Rosa _ Eritrocitos
Leucocitos
Leucocitos
PAS Carbohidrato _ Amarillo Verde Verde Carbohidrato
s
s
Hongos
Hongos
Bacterias
Bacterias
Gram Bacterias _ Rosa _ _ Bacterias
2.10. Micrometría
La micrometría o morfometría es el conjunto de técnicas de medición de
longitud, área volumen de objetos microscópicos (Kapitza, 1997; World
Health Organization 1999). Desde las primeras aplicaciones reportadas de un
microscopio, ha existido la necesidad de hacer mediciones precisas de los
especímenes observados. Por ejemplo, Van Leeuwenhoek, utilizó granos de
arena de tamaño conocido para deducir el tamaño de lo eritrocitos humanos
(www.microscopy-uk.org.uk/), actualmente se continua utilizando partículas
de tamaño estándar que se colocan junto con la muestra. Los procedimientos
más usados de medición del tamaño de objetos observados al microscópicos,
son aquellos que recurren a el uso de oculares y portaobjetos micrométricos,
estos aditamentos se comercializan como accesorios de diferentes marcas de
microscopios y ambos albergan una retícula o gratícula en el mismo plano que
el diafragma de campo del ocular por lo que mostrará una escala en foco y
posición aparente con respecto a la imagen del espécimen con el cual se
compara la escala (Davidson y Abramowitz,1999) (Figura 2.6 A), el ocular y
portaobjetos micrométrico pueden usarse solos o en combinación. En ambos
casos se antepone una escala de medición labrados con precisión en el vidrio
(Abramowitz, 1987), que pueden ajustarse a la mayoría de los especímenes
en una muestra, una alternativa a los portaobjetos micrométricos son las
cámaras de Neubauer (Figura 2.6 B) que también contienen una escala
20

eticulada en el vidrio sobre la cual se colocan los microorganismos y/o las
células en un medio acuoso (Pietrzak-Johnston et al., 2000; World Health
Organization, 1999). Las cámaras de Neubauer tienen la ventaja adicional de
permitir al mismo tiempo medir áreas y volúmenes con gran precisión, algo muy
útil para el monitoreo de constantes hematológicas que reportan número,
forma y tamaño de células por volumen de sangre.
A
Figura 2.6. Escalas micrométricas comumente usadas. A Ocular
micrométrico con una escala en el interior del ocular. B
Portaobjetos micrométrico la imagen muestra una cámara de
Neubauer que permite la medición de longitudes, áreas y
volúmenes con gran precisión.
2.11. Fotomicrografía
La captura de imágenes es parte del uso integral de los microscopios ya que
permiten el registro de los especímenes necesarios para los reportes clínicos y
las publicaciones científicas (Hans-Georg, 2002). Para lograr esto los
diferentes fabricantes de microscopios proveen aditamentos para el
acoplamiento de accesorios opcionales escalables destinados a
fotomicrografía (Beckman, 2003; Davidson y Abramowitz, 1999), gracias al
21
B

advenimiento de la fotografía digital la mayoría de los aditamentos actuales se
abastecen para adaptar las principales marcas de cámaras digitales
profesionales o semiprofesionales que se encuentran en el mercado, estas
cámaras generalmente se acoplan al microscopio en el canal óptico y se
conectan electrónicamente a un monitor y/o a una computadora que funciona
como fuente de almacenamiento de las imágenes y al mismo tiempo como
visor y grabador en tiempo real, lo que ha hecho obsoletos los sistemas
basados en película que no pueden hacer esto (Beckman, 2003) . Una ventaja
adicional de la fotografía digital es el hecho que la mayoría de las cámaras
permiten la captura de imágenes en movimiento o video además de las
imágenes estáticas y directamente alimentan una serie de programas de
computadora que pueden hacer cálculos complejos como densitometría,
fluorimetría y espectrofotometría (Beckman, 2003; de Lange et al., 2001;
Hans-Georg, 2002).
2.12. Aplicaciones avanzadas.
Desde hace varias décadas se han hecho modificaciones a los condensadores
de manera que puedan incorporar filtros polarizantes y mascarillas de
contraste de fases de manera que los especímenes puedan ser iluminados
sobre un fondo obscuro y puedan observarse sus patrones de polarización
(Stankewitz y Karbe, 1997; Stankewitz, 1974), estas técnicas tienen gran
aplicación en la geología y biología y permiten incrementar el poder resolutivoanalítico
de los microscopios (Abramowitz, 1987; Davidson y Abramowitz,
1999; World Health Organization 1999). poder resolutivo-analítico de los
microscopios (Abramowitz, 1987; Davidson y Abramowitz, 1999; World Health
Organization 1999). A partir de estas modificaciones se han desarrollado
modernas técnicas de contraste de fases, microscopia polarizante y
microscopia de contraste diferencial de interface (Beckman, 2003) .
Recientemente se han desarrollado microscopios ópticos de alta tecnología
para una gran variedad de aplicaciones avanzadas en áreas tales como la
química, física, geología además de la biología y ciencias
biomédicas(Beckman, 2003; Rieder y Khodjakov, 2003 ) , en la mayoría de los
casos se han modificado las fuentes luminosas para ampliar el espectro le luz
incidente sobre los especímenes de manera que el rango del espectro
infrarrojo se utiliza para obtener espectrometría de objetos microscópicos lo
que hace posible medir la composición química de los especímenes
analizados mediante el acoplamiento de un microespectrómetro (Wallace et al,
2001), este procedimiento de la microscopía se denomina microscopía
infrarroja. Probablemente los mayores avances en la microscopia óptica actual
se esté llevando a cabo en la microscopia fluorescente (Axelrod, 2001;
Beckman, 2003; Haugland, 2005; Lippincott-Schwartz y Patterson, 2003), este
tipo de técnicas ha evolucionado a partir de los microscopios de luz ultravioleta
que durante décadas han sido usadas en el campo clínico (Beckman, 2003;
Wang y Taylor, 1990), este tipo de microscopia se basa en el uso de fluoróforos
que emiten luz en presencia de luz ultravioleta (Haugland, 2005; Wang y Taylor,
1990), estos fluoróforos pueden ser acoplados con sondas moleculares
permitiendo rastrear anticuerpos, antígenos, ácidos nucléicos, substratos
22

enzimáticos, hormonas y receptores celulares (Beckman, 2003; Lisfeld, 1977;
Rieder y Khodjakov, 2003; Sekar, 2003; Weijer, 2003). Probablemente los
mayores avances en este campo se han dado a nivel de la creación de
imágenes digitales de objetos microscópicos en 3D a partir de iluminación con
rayos láser, colimadores y sofisticados algoritmos de computadora que se
acoplan a sensores CCD en avanzados microscopios denominados
confocales (Beckman, 2003; Marriott et al., 1991; Rieder y Khodjakov, 2003;
Sekar, 2003; Weijer, 2003). El advenimiento de las imágenes digitales ha
permitido que la microscopia se convierta en una ciencia analítica de precisión,
ya que actualmente es posible medir variables bioquímicas y metabólicas de
células individuales en tiempo real(Beckman, 2003; Rieder y Khodjakov,
2003;Sekar, 2003; Weijer, 2003).
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25

3. Coprología diagnóstica de helmintos y protozoarios del aparato
digestivo
Alejandro SánchezAlbarrán
3.1.-Introducción
El diagnóstico coprológico de las enfermedades parasitarias se realiza con la
ayuda de dos grandes grupos de métodos: directos e indirectos. Los directos
se basan en la observación de los elementos parasitarios eliminados en las
heces, estos pueden ser parásitos adultos, segmentos de cestodos, larvas y
huevos.
Los métodos indirectos identifican y miden los cambios humorales y tisulares
provocados por las infecciones parasitarias. Estos cambios permiten un
diagnóstico temprano de la de la presencia del parásito, principalmente
durante la fase de invasión cuando el parásito aún no alcanza su desarrollo
sexual, en este caso los elementos de diagnóstico están representados por
anticuerpos específicos, modificaciones enzimáticas o por cambios
hematológicos, parámetros que se manifiestan en mayor o menor grado según
el tipo y la intensidad de la infección del parásito. Los métodos indirectos son
en la práctica menos utilizados; sin embargo, tienen un gran valor en el
diagnóstico parasitario. Un ejemplo es la utilización de los métodos
inmunológicos que tienen un valor preponderante durante el periodo
prepatente. La confiabilidad depende de la sensibilidad y especificidad de las
pruebas así como tipo y calidad de los antígenos utilizados.
Los métodos directos son los más usados y se denominan comúnmente como
coproparasitoscópicos. Estos aportan resultados cualitativos y cuantitativos. A
continuación se señalan algunas de las características de muestreo, así como
algunas de las técnicas coprológicas más utilizadas.
3.2. Muestreo y conservación de heces
Las muestras fecales se obtienen directamente del recto, en bolsas de
plástico. Se debe asegurar la identidad y pureza de la muestra, evitando así la
contaminación por nemátodos de vida libre o parásitos de vegetales.
El número de animales a muestrear varía de acuerdo a las características de la
población y al tipo de estudios a realizar, con las variables controladas se
determina estadísticamente el tamaño de la muestra, conociendo de
antemano las pruebas estadísticas para su análisis, sobre todo cuando se
intente hacer estudios epidemiológicos. Con base en estos planteamientos se
evitan tamaños de muestra pequeños o grandes, lo cual es de poco valor o
requiere de material y tiempo excesivo.
Para el diagnóstico de parásitos de un grupo de animales se recomienda
obtener una muestra representativa de la población, considerando la finalidad
o tipo de explotación, los distintos estratos en que se compone dicho grupo de
animales, como es por edad, estado reproductivo, tipo de explotación, etc.
26

Tradicionalmente se ha tomado el 10 % de la población como una muestra
indicativa para el diagnóstico coproparasitoscópico, pero su validez puede ser
dudosa si se trata de una población grande, también se cuestiona si se obtiene
una muestra numerosa en una población pequeña.
Un criterio recomendado es seleccionar de una población, dos grupos de
animales, uno con animales débiles o de condiciones regulares y otro con
animales de mejor condición física, el resultado promedio de cada grupo da
una idea de las condiciones parasitarias de la población de animales.
La cantidad de muestra a obtener por animal es del orden de los 50 a 100 g
para bovinos y de 10 a 20 g para ovinos y caprinos. Si la cantidad es pequeña,
el resultado suele ser erróneo porque no alcanza la cantidad exacta de heces
que requiere cada una de de las pruebas coprológicas.
Si se desea obtener el total de heces de un día en pequeños rumiantes, con
fines experimentales, se podrán utilizar sacos colectores que se fijan en la
región perianal del animal. Desafortunadamente estos sacos no se venden
comercialmente, se tienen que confeccionar de manera artesanal de acuerdo
a las necesidades particulares, además de que dañan la piel de los animales.
En el caso de que se cuente con los recursos económicos adecuados es
preferible utilizar jaulas metabólicas.
Con el propósito de que las estructuras parasitarias presentes en las heces no
continúen en desarrollo embrionario, las muestras deberán conservarse en
refrigeración lo más pronto posible después de haber sido obtenidas. La
conservación de heces se logra a 4°C por no más de tres a cinco días, cuando
no es posible refrigerar las muestras puede añadírseles una solución
fisiológica conteniendo formol al 5% para detener de manera definitiva el
desarrollo de las formas parasitarias. La solución fisiológica con formol al 5%
para su preparación, requiere de:
Formol comercial…………………..50 mL
Cloruro de sodio……………………..8 g
Agua………………………………1000 mL
Para preservar muestras de heces con la solución con formol al 5% (SF5%) se
sugiere adicionar una parte de heces en tres partes de SF5%.
Las muestras para fines de coprocultivo no deben de contener ningún
preservativo químico, ya que de ellas se pretende obtener el desarrollo de
huevo al estado larval, lo cual se vería impedido. La conservación de las heces
por congelación a -15°C puede ser hasta de un año.
La solución de merthiolate-yodo-formol es ampliamente utilizada para
conservar heces en coprología humana. Este conservador que también es un
colorante, se compone de dos soluciones. Solución madre de MIF (1) y
solución yodada (2) y se requiere prepararla al momento de usarlas.
27

Solución 1
Tintura de merthiolate al 0.1%............................200 mL
Formol comercial……………………………………25 mL
Glicerina……………………………………………….5 mL
Agua………………………………………………...250 mL
Solución 2
Yodo……………………………………………………...5 g
Yoduro de potasio……………………………………..10 g
Agua…………………………………………………..100 mL
La proporción de las dos soluciones es de quince partes de la solución 1 por
una de la solución 2, agregando la 1 a la 2 a fin de evitar la formación de
precipitado. El producto final se incorpora a las heces en proporción de una
parte de heces por diez de la solución. También puede mezclarse en el frasco
donde se va depositar la muestra.
El frasco conteniendo la muestra se deja en reposo para concentrar en la
superficie los ooquistes de protozoarios, huevos de nemátodos y cestodos, el
sobrenadante se obtiene y puede procesarse utilizando otros métodos de
centrifugación.
La mezcla de heces es poco confiable para el conteo de huevos, ya que son
diluidas, sin embargo, tienen gran valor desde el punto de vista cuantitativo, su
utilización para fines de coprocultivo no es posible ya que la solución inhibe el
desarrollo embrionario de los huevos.
3.3. Métodos coproparasitoscópicos
Los métodos coproparasitoscópicos se dividen en cualitativos y cuantitativos,
hay autores que no establecen distinción entre estos, considerando que los
primeros ofrecen parámetros que pueden ser medidos y que además dan
origen a los segundos.
El criterio para seleccionar un método se basa en la capacidad de
concentración o sedimentación de los elementos parasitarios, esto por la
acción de las diferentes soluciones utilizadas, sin embargo, se sabe que los
métodos cuantitativos permiten estimar la gravedad de las infecciones,
también son utilizadas en la evaluación de antihelmínticos entre otros.
Los métodos coproparasitoscópicos han sido objeto de muchas
modificaciones. Existe la necesidad de que la interpretación de los resultados
obtenidos por métodos modificados, se base en cálculos matemáticos y
estadísticos; sin embargo, es común que cada laboratorio realiza
modificaciones a estos métodos que pocas veces se evalúan.
Las características deseadas de un método coproparasitoscópico son:
polivalencia, sensibilidad, de fácil ejecución y resultados confiables.
28

La polivalencia está dada por la capacidad de revelar la presencia de un mayor
número de elementos parasitarios como son: huevos, ooquistes de
protozoarios, larvas de nematodos, segmentos grávidos de cestodos, etc.
Los diversos métodos poseen diferente grado de capacidad polivalente
determinada por el nivel de densidad de la solución utilizada que permite hacer
flotar a las estructuras parasitarias.
Al evaluar los diversos métodos polivalentes es indispensable utilizar las
mismas muestras fecales o bien una suspensión conteniendo un número
conocido de elementos parasitarios; controlando este factor se obtiene el valor
de un rendimiento absoluto. La mejor técnica después de la comparación es
aquella que muestra el número de elementos parasitarios más elevado,
asignándole un 100% de rendimiento; las otras técnicas son juzgadas a partir
de ésta última.
Otro aspecto importante es la facilidad de ejecución. Un método rutinario es
aquel que permite realizar el mayor número de análisis en el menor tiempo
posible, teniendo en cuenta otros factores no menos importantes. Cualquiera
que sea el método utilizado, la precisión de los resultados depende
esencialmente de factores como son: formas de muestreo y la conservación
de la muestra, entre otros.
3.3.1. Método de flotación con solución salina saturada
Este método se utiliza para detectar cualitativamente la presencia de
ooquistes, huevos de nematodos, cestodos, acantocéfalos y ocasionalmente
larvas de nematodos y artrópodos.
El método tiene como principio hacer flotar los elementos parasitarios
contenidos en las heces mediante una solución saturada de NaCl que
puede tener una densidad de 1:15 a 1:20. Un inconveniente de este
método originado por la solución que utiliza, es su inestabilidad, ya que
existe una fácil cristalización del cloruro de sodio con la mínima
evaporación de agua, ya sea dentro de los frascos de almacenamiento,
durante la manipulación en el examen o cuando las laminillas están
montadas sobre la platina del microscopio. La densidad de la solución
se modifica por efecto de la temperatura ambiental, así por ejemplo, los
huevos que tienen densidad entre 1:11 y 1:18, flotan a 20°C, mientras
que a 10 °C sedimentan.
Material:
Vasos de plástico
Coladeras metálicas o de plástico de malla fina
Cucharas, porta y cubreobjetos
Tubo de centrífuga
29

Gradillas
Centrífuga
Microscopio compuesto
Solución saturada de NaCl
Procedimiento:
-Tomar de 5 a 10 g de las heces de diferentes partes de la muestra, esta se
diluye en un primer vaso con una pequeña cantidad de solución saturada de
sal.
-Agregar más solución salina hasta obtener aproximadamente un volumen de
100ml. La suspensión fecal se tamiza utilizando una coladera.
-Llenar dos tubos de centrífuga evitando el desbordamiento.
-Centrifugar durante tres minutos a 2000 rpm previa nivelación de los tubos a
fin de evitar la ruptura de los mismos con la consecuente pérdida de la
suspensión
-Después de la centrifugación obtener 2o3gotas del sobrenadante con un asa
de platino, que se depositan entre porta y cubreobjetos.
-Observar al microscopio con el objetivo de 10x.
Por ser un método cualitativo, la sola presencia de huevos no indica el grado
de infección, por lo que se debe recurrir a un método cuantitativo. En este
sentido, la técnica de flotación ha sufrido modificaciones basadas
principalmente en la densidad y cantidad de las soluciones empleadas, así
como en la cantidad de heces a utilizar.
3.3.2. Método de flotación con solución glucosada.
Constituye uno de los métodos más simples y fáciles de realizar, además de
ser económico, ya que no requiere equipo especializado. La solución que
utiliza es la glucosa a saturación a la cual se le agrega una pequeña cantidad
de fenol para su conservación. El desarrollo de la técnica es similar a la que
utiliza solución saturada, tiene ventajas sobre esta última ya que no hay
precipitación de cristales por lo tanto es menos corrosiva.
3.3.3. Método de flotación con yoduro-mercurato de potasio
Esta solución tiene la ventaja de movilizar todo tipo de huevos, incluyendo los
de trematodos como Fasciola hepatica y Paramphistomum sp. Su densidad es
de 1:44, la mas alta de las soluciones de flotación.
30

Preparación:
Biyoduro de mercurio 150 g
Yoduro de potasio 111g
Agua destilada 399 mL
Este método tiene el inconveniente de necesitar el manejo de un reactivo caro,
tóxico y corrosivo para los objetos metálicos. Su empleo requiere de cuidados
minuciosos. Los huevos de F. hepatica son deformados, además de que
puede digerir pequeños vegetales. En cuanto a su economía, la solución tiene
la ventaja de poder ser reciclada.
Preparación:
-Disolver el yoduro de potasio en la menor cantidad de agua destilada posible.
-Agregar poco a poco el biyoduro de mercurio homogeneizando con un
agitador de vidrio hasta la disolución completa.Agregar el resto del agua.
-La solución se conserva por algunos meses. Se recomienda preparar
suficiente cantidad de solución madre que se conserva perfectamente por
tiempo indefinido.
La solución madre se prepara de la siguiente manera:
Biyoduro de mercurio 100 g
Yoduro de potasio 74 g
Agua destilada 50 mL
Al momento de emplearla se requiere agregar 10 ml de la solución madre
en 24 ml de agua destilada.
Procedimiento:
- Diluir 50 g de heces en 25 mL de la solución: al principio como una mínima
cantidad para después agregar toda.
- Filtrar a través de una coladera de malla fina, colocar el líquido en tubos de
centrífuga.
- Centrifugar de 3 a 4 min a 2500 rpm y obtener una pequeña cantidad de
sobrenadante.
- Observar al microscopio compuesto.
3.3.4. Método de flotación con solución saturada de sulfato de
magnesio.
La saturación corresponde al 35 % con una densidad de 1:22 y tiene una
eficiencia similar a la de la solución de SO Zn.
4
31

Otras soluciones frecuentemente empleadas en las técnicas de flotación son:
- Bicromato de potasio
-Azúcar más SO Zn.
4
- solución de glicerina pura o asociada a una solución saturada de NaCl
- Silicato de potasio.
3.3.5. Valor y límites de la coprología cualitativa
Dos aspectos deben ser considerados en la utilización de estos métodos:
Uno, la presencia de elementos parasitarios son prueba de que existe una
infección; sin embargo, el número de éstos no siempre representa la severidad
de la infección. La interpretación de resultados debe tomar en cuenta factores
que determinan las variaciones en la presencia de huevos tales como:
estandarización de la técnica, interpretaciones personales, así como otros
factores netamente relacionados con la biología de los parásitos como son la
diferencia en la prolificidad de las especies y el ritmo en la ovopostura,
principalmente. Los riesgos de error se superan con exámenes repetitivos
realizados a la muestra del mismo animal.
Dos, la ausencia de elementos parasitarios indica una infección inexistente
siempre y cuando la repetición de los exámenes continúen negativos; que los
elementos parasitarios estén presentes en baja cantidad y estos no se
observen como consecuencia de defectos en la técnica; que los parásitos se
encuentren en estado de inmadurez sexual, es decir, en periodo prepatente o
enquistamiento larvario en diversos tejidos como en la esofagostomiosis
larvaria, pero a pesar de esto pueden existir manifestaciones clínicas de la
infección.
3.3.6. Regeneración del yoduro-mercurato de potasio (Figura 1)
Con la técnica de recuperación se bajan los costos de ejecución del método.
De los 70ml de solución utilizada por cada examen se puede recuperar hasta el
95% de dicha cantidad.
Procedimiento:
-En un recipiente se colecta toda la solución utilizada para ser almacenada y
regenerada posteriormente; jamás tirar al lavabo esta solución incluyendo los
residuos de la cámara de Mc Master.
-Someter a un proceso de precipitación con cal viva en polvo a razón de 30g
por cada 2 litros de solución; adicionar también 5 ml de percloruro de hierro.
-Mezclar con un agitador y dejar sedimentar durante 15 minutos.
-Someter a filtración mediante una bomba de vacío de la siguiente manera:
colocar un embudo obturado con algodón no procesado y humedecido en
agua. El embudo se encuentra en un matraz Erlenmeyer, el cual esta
conectado a una manguera a la bomba de vacío.
-Después de haber filtrado la solución se somete a agitación, preferentemente
32

utilizando un agitador magnético, agregando al mismo tiempo 20 g de carbón
animal en polvo.
-Dejar reposar por algunos minutos y reiniciar una segunda filtración por el
procedimiento señalado.
-Ajustar a 8.2 – 8.6 el ph para tal fin se agrega unas gotas de fenolftaleína y de
ácido clorhídrico puro, con lo cual la solución tomará el color amarillo normal.
-Ajustar la densidad a 1:44 utilizando biyoduro de mercurio en polvo y yoduro
de potasio en cristales (Figura 1).
3.4. Método coprológicos cuantitativos.
3.4.1. Método de Mc. Master.
Este método se utiliza para detectar y cuantificar ooquistes de Eimeria,
huevos
de nematodos y cestodos. Tiene el mismo funcionamiento que el método de
flotación, es decir, por diferencia de densidad los elementos parasitarios
ascienden a la superficie de las cámaras de Mc. Master, quedando los huevos
en la parte inferior del área delimitada; los restos vegetales generalmente
sedimentan. Es un método ampliamente utilizado en todas las especies
animales.
El método ha sido objeto de diversas modificaciones con el fin de obtener una
mayor sensibilidad. Las modificaciones se caracterizan por el tipo y cantidad
de solución utilizada para diluir las heces. Entre las soluciones empleadas
está la de NaCl a saturación, solución de sulfato de zinc al 33 % solución de
sulfato de magnesio, solución de Sheather de azúcar y solución de yodo
33

mercurato de potasio.
En nuestro medio se ha utilizado tradicionalmente la solución de cloruro de
sodio a saturación por ser una de las más económicas y proporciona buenos
resultados
El método se fundamenta matemáticamente en lo siguiente:
-El total de la solución saturada de NaCl que se añade a la pequeña probeta del
equipo es de 28 ml más 2gdeheces medidos por el desplazamiento de 2 ml
que hacen un volumen total de 30 mL.
2
-Cada uno de los compartimentos delimitados mide 1cm .
-Este volumen expresado en porcentaje significa que 15 mL es el 50% del
volumen total de la probeta y 30 corresponde al 100 %. Contados los huevos de
ambas áreas, el resultado se multiplica por 100 y se divide entre dos puesto
que se utilizaron 2 g de excremento. El resultado se expresa como número de
huevos por gramo de heces.
Material:
Equipo de Mc. Master (cámara y probeta)
Gasa
Cucharas
Goteros
Microscopio compuesto
Procedimiento:
-Llenar la probeta con solución salina saturada hasta la marca de 28 mL y
agregar 2 g de heces medidos por desplazamiento de 2 mL.
-Tapar la probeta y homogeneizar su contenido vigorosamente.
-Tomar inmediatamente con el gotero la cantidad suficiente de suspensión
para llenar los compartimentos de la cámara de Mc. Master, evitando las
burbujas de aire.
-Es recomendable antes de obtener la muestra con el gotero, colocar en la
boca de la probeta un pequeño trozo de gasa a fin de detener residuos
vegetales.
-Después de llenar la cámara, dejarla reposar durante 5 minutos a fin de
permitir el ascenso de huevos.
-Observar al microscopio con el objetivo de 10x.
34

-Hacer conversión indicada para obtener el número de huevos por gramo de
heces. Es importante extremar las precauciones sobre la utilización de la
solución salina sobre las lentes del microscopio, ya que ésta es altamente
corrosiva.
3.4.2. Mc. Master modificado por Raynaud
Es un método polivalente que utiliza como solución densa de yodo mercurato
de potasio que tiene una densidad de 1:44 y la cual requiere de un mayor
volumen de solución. Esta técnica es similar a la de Stoll. La cámara de Mc.
Master para la técnica modificada por Raynaud 1970 esta compuesta por un
portaobjetos de largo y ancho habituales (75 x 25 mm) pero con un grosor de 2
mm. Sobre este portaobjetos son pegadas a los extremos y en medio tres
pilares de 1.5 mm de espesor el cual el ancho es igual a la de la lámina
portaobjetos y largo de 15 mm para los dos pilares laterales y de 5 mm para el
pilar medio. Sobre estos tres pilares se fija una laminilla de largo igual a la de la
lamina portaobjetos y de 17 mm de ancho y de 0.5 mm de espesor. De esta
manera son delimitados entre los pilares extremos y medio, dos celdas de 17
mm de ancho (ancho de la laminilla superior) por 20 mm de largo ( 75 – (2 x 15)
– 5) y de 1.5 mm de altura, quedando la laminilla superior dos celdas en las
que son trazadas dos cuadrantes de 10 x 10 mm en los que son trazados en el
sentido longitudinal seis divisiones rectangulares de 10 x 1.7 mm. El volumen
delimitado por estos cuadrantes y el espacio comprendido entre las dos
3,
laminillas es de 150 mm correspondiente a 0.15 mL de liquido.
Procedimiento:
-Colocar 5 g de heces en un vaso de plástico al que se agrega una pequeña
parte de los 70 mL de solución para disolver las heces.
35

-Completar con solución hasta la marca de 70 mL; se introduce algunas perlas
de vidrio para romper el material sodio mediante agitación vigorosa.
-La mezcla se filtra y se obtiene suficiente cantidad para llenar la cámara de Mc
Master, evitando burbujas de aire.
-Dejar reposar durante 5 minutos y observar al microscopio entre 40 y 100
aumentos
3.4.3. Método Universal
Este método se utiliza para detectar y cuantificar un mínimo de 10 huevos por
gramo de heces, cantidad que no detecta el método de Mc. Master. Es de gran
utilidad en la coprología experimental como es la evaluación de
antihelmínticos, en la búsqueda de poblaciones resistentes a los
antiparasitarios y otros.
Procedimiento
-Se requiere una muestra de 3 g de heces medidos por el deslazamiento de 3
mlL de agua.
-Cada muestra se deposita en una probeta que contiene 50 mL de solución
salina saturada, haciendo una suspensión que se pasa a través de una gasa
para separar las partículas gruesas.
-Se toma una parte de la suspensión con la que se llena la cámara universal.
-El conteo de huevos se realiza en las cuatro divisiones de la cámara.
Multiplicando el resultado por 10, expresando el resultado como cantidad de
huevos por gramo de heces.
3.4.4. Método de Stoll
Este método es simple y rápido, permite apreciar el nivel y la evaluación de las
infecciones parasitarias. Cuando existe una eliminación de huevos menor a
100 entonces el método resulta ineficaz, siendo esta una desventaja.
Material:
-Probeta de 18 a 20 cm. de altura por 3.5 a 4 cm. de diámetro y con capacidad
de 100 a 120 mL.
-Pipeta de 1ml graduada en décimas de mL, debiendo estar remarcada en 0.15
con lápiz de diamante. La pipeta deberá tener una perilla de hule.
-Solución de hidróxido de sodio décimo normal (sosa 10 M/10)) a una
concentración de 0.4% para disolver el moco y residuos vegetales sin alterar
los elementos parasitarios.
-Porta y cubreobjetos
36

Procedimiento:
-Diluir 5g de heces con un mínimo de solución en la probeta graduada a 75mL.
-Completar hasta la marca de 75ml con la solución de sosa
-Agregar unas cinco decenas de perlas de vidrio, cerrar con un tapón y
homogenizar con movimientos en cruz y uniformes; no se recomienda el
colado de la suspensión porque pueden quedar adheridos a los vegetales
algunos huevos de nemátodos.
-Tomar inmediatamente después de homogeneizar, 0.15 mL con la pipeta y
depositarlo entre un portaobjetos y un cubreobjetos.
-Contar los elementos parasitarios en la totalidad del montaje usando el
objetivo 10X, “n” representa el número de los huevos conocidos en 0.15 mL de
la suspensión fecal, es decir, 1/500 del volumen total de la suspensión
(75/0.15=500), por lo que bastará multiplicar por 100n el número de huevos
observados en la laminilla (figura 2).
.3.4.5.-Valor y límites de la coprología cuantitativa
La interpretación de la coprología cuantitativa es difícil y delicada por las
mismas razones expuestas en la coprología cualitativa. Los conteos obtenidos
por cualquiera de los métodos, en ocasiones no esta en relación directa con la
intensidad de la infección. El nivel de infección por nemátodos gastroentéricos
en rumiantes de condiciones de clima templado y bajo reserva puede
catalogarse de la siguiente manera:
37

Infección baja 1/400 huevos por gramo de heces (hpg)
Infección moderada de 400 a 1000 hpg
Infección fuerte de 1000 a 2500 hpg
Infección masiva 5000 hpg
3.4.6. Método de sedimentación
Se utiliza para detectar huevos de trematodos que tienen un peso mayor que
la densidad del agua o de algunas soluciones frecuentemente empleadas
para esta prueba.
El fundamento se basa en la capacidad que tienen algunos huevos de
sedimentar dentro de una solución de baja densidad como el agua. Los
huevos de trematodos tienen un color que facilita su localización (no siempre;
por ejemplo, los de Paramphistomum),
más aún cuando al medio se le añade
un colorante de contraste que no toma el huevo-, pero si todo el resto del
material vegetal donde se encuentran.
Existen diversas modificaciones al método, siendo las principales las que dan
origen a la sedimentación simple, múltiple o por centrifugación.
3.4.7. Sedimentación simple.
La suspensión fecal se prepara utilizando una solución de detergente
comercial al 1% en proporción de un volumen de heces por diez de solución de
detergente. La suspensión se filtra en un doble tamiz, el primero en una malla
de 1 mm y el segundo de 500 micras a fin de eliminar los residuos vegetales
de mayor tamaño.
Dejar en reposo durante una hora y posteriormente eliminar por decantación y
sin agitar ¾ partes del sobre nadante, de preferencia por aspiración El
sedimento restante es homogeneizado, tomándose 1-2 gotas para
observarse entre porta y cubreobjetos en el microscopio.
Para facilitar la búsqueda de los huevos de F. hepática,
al sedimento se le
agrega 1 mL de tintura de yodo o 1 mL de una solución acuosa al 1% de azul de
metileno. A este efecto el sedimento adquiere una coloración caoba o azul que
hace contrastar los huevos. Si el examen es transferido para el día siguiente,
es recomendable agregar algunas gotas de formol.
La solución de detergente evita la adherencia de los elementos parasitarios
sobre las paredes del recipiente y sobre la malla y paredes del tamiz. Este
método es considerado como base de la coproscopia cuantitativa ya que es de
fácil ejecución y no requiere material especializado. Su inconveniente es la
ineficiencia para detectar infecciones bajas.
38

3.4.8. Sedimentación múltiple
Como su nombre lo indica, esta técnica consta en llevar a cabo la decantación
sucesiva del sobrenadante de una suspensión fecal después de periodos de
sedimentación. De tal proceso se obtiene un sedimento claro donde se
encuentran los elementos parasitarios. Su utilización está adaptada para la
búsqueda de huevos de Fasciola y Paramphistomum
Material:
Frascos cilíndricos de vidrio de 15 cm de alto por 5 cm de ancho.
Cucharas
Coladeras
Cajas de Petri
Azul de metileno
Microscopio estereoscópico
Procedimiento
Se diluyen 5 g de heces en 150ml de agua, utilizando un vaso de plástico La
suspensión se homogeniza y se efectúa un doble filtrado; el primero utiliza una
coladera cafetera de malla fina y el segundo un tamiz de malla no menos de
280mm La suspensión se somete a un proceso de 3 a 4 sedimentaciones
utilizando frascos de vidrio, la primera de cinco minutos y las restantes de 3
minutos. El sedimento se observa en cajas de Petri con fondo cuadriculado,
agregando a la preparación unas gotas de azul de metileno o cualquier otro
colorante de contraste. Este método ofrece una alta sensibilidad en el
diagnostico de la fasciolosis. En el medio nacional es ampliamente utilizado
gracias a su bajo costo de ejecución
3.4.9. Sedimentación por centrifugación
La variación de la técnica radica en la utilización de la centrífuga y en la
solución del sulfato de aluminio.
Procedimiento
La preparación de la suspensión fecal y el tamizado de la misma se realizan de
la misma manera de la técnica anterior utilizando la proporción de un volumen
de heces por 10 de agua.
Después de haber filtrado la suspensión, se len adiciona 1 mL de la solución al
1% de sulfato de aluminio, manteniéndose en reposo durante 15 minutos.
Descartar tres cuartas partes del sobrenadante y el resto se centrifuga a 2000
rpm durante dos minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante
detal manera que se deje solamente 1 mL del sedimento que después de
39

homogenizado se obtiene las gotas necesarias para la observación al
microscopio.
Este método es más sensible que el anterior, facilita lo observación de los
huevos de parásitos gastroentéricos, pero especialmente los de F. hepatica
con previa coloración del sedimento.
3.5. Método de migración larvaria o de Baermann.
Este método se utiliza para obtener estados larvarios de nemátodos
pulmonares gastroentéricos y larvas titulares presentes en heces y
secreciones.
El método se basa en la capacidad que tienen las larvas de migrar dentro de un
sustrato líquido o semilíquido gracias a su movilidad e hidrotropismo positivo,
hecho por el cual sedimentan al fondo del recipiente que las contiene.
Material:
Embudo de vidrio o plástico de 7 a 10cm de diámetro en la parte mas ancha
Coladera de malla fina de preferencia de alambre con aberturas entre 600 y
700 micras, a fin de servir como soporte y de un segundo tamiz con las heces.
Tubo de ensaye, Manguera de hule látex, Pinza de Mohor, Pipeta Pasteur,
Gaza
Perillas de hule, Cubre y portaobjetos, Microscopio estereoscópico,
Microscopio compuesto
Procedimiento
-Una vez preparado el aparato Baermann, la pinza de paso se cierra y se llena
el embudo con agua hasta rebasar aproximadamente 2cm de la parte inferior
de la coladera; la temperatura del agua no debe sobrepasar los 20 a 25C.
-Colocar un pedazo de gasa sobre la coladera para recibir la cantidad de heces
que se van a analizar. También puede hacerse un muñon de heces con la
gasa depositándolo sobre la coladera.
-Agregar el agua suficiente para cubrir solamente la parte inferior del muñón.
Dejar el reposo entre 12 y 24 horas a fin de permitir la migración larvaria: debe
evitarse la evaporación de agua en tal caso restituir el nivel indicado para no
interrumpir la migración
3
-Al término de este periodo contener, del cubo los primeros 10cm de
sedimento; en ese volumen se encuentran las larvas.
El tubo puede ser centrifugado a 3000 rpm durante tres minutos.
-Eliminar por aspiración el sobrenadante, conservando aproximadamente 1
mlL del sedimento. De éste se toman dos o tres gotas para observarse al
microscopio con el objetivo de 40x.
-Agotar la observación del sedimento cuantificando el número de larvas
presentes y finalmente hacer la conversión de acuerdo a la cantidad de heces
utilizadas, que generalmente son 10g.
40

-Para matar y fijar las larvas debe agregarse una gota de lugol ya que el
constante movimiento de las larvas impide su identificación. (Figura 3).
Literatura consultada
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Ministère de l´Agriculture. 53-123. Paris, France.
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DOC. Ministère de l´Agriculture de l´Alimentation de la Pêche et des
Affaires Rurales République Française P-1309-1351
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infestations parasitaires des bovins, ovins, équins et porcins. Ann
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11. Sapero JJ, Lawless DK. (1953). MIF stain-preservation technique for the
identification of intestinal protozoa.Am J Trop Med Hyg 2:613-619.
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domesticated animals, 6 edition. Baillière, Tindall & Cassell, London, UK.
13. Whitlock HV. (1959). The recovery and identification of the first stage larvae
of sheep nematodes.Aust Vet J 32:310-316.
42

4. Cultivo e identificación larvaria de nematodos del tracto
gastroentérico
Enrique Liébano Hernández.
Pocos Veterinarios en nuestro país pueden asegurar con base científica
cuáles nematodos predominan en determinada área, por cuánto tiempo son
éstos prevalentes, cuales tienen importancia económica, cuantas veces se
debe desparasitar por año, si la rotación de tal o cual potrero es práctico como
medida de control, etc. Dada la importancia que representan las parasitosis
gastroentéricas, es necesario establecer un diagnóstico preciso.
La coprología abarca todos los conocimientos referentes al estudio físico,
químico, bacteriológico y parasitológico de la materia fecal. El análisis del
excremento de rumiantes solamente con base a la cantidad de huevos de
nematodos gastroentericos, no es completo porque no permite diferenciar en
muchos casos las especies de parásitos presentes. Varios de ellos tienen
huevos microscópicamente parecidos. En una identificación
coproparasitoscópica mediante las técnicas cuantitativas ó cualitativas, se
pueden distinguir los huevos de los siguientes géneros de nematodos
gastrointestinales: Toxocará spp, Nematodirus spp, Strongyloides spp, y
Trichuris spp. Sin embargo, es difícil diferenciar los huevos de Haemonchus
spp, Mecistocirrus digitatus, Trichostrongylus spp, Ostertagia spp, Cooperia
spp, Chabertia spp, Oesophagostomum spp, y Bunostomum spp, por
presentar una morfología muy similar.
Aun cuando la técnica de Whitlock para el aislamiento de huevos de
nematodos gastroentéricos no es utilizada rutinariamente en el diagnóstico
parasitario, resulta de gran utilidad en investigaciones que requieren de
huevos de nematodos, como por ejemplo, diagnóstico de poblaciones
resistentes a los antihelmínticos, producción de larvas de los distintos estadios
(L 1, L2yL 3).
Otra posibilidad que se tiene para dar un diagnóstico preciso, es la
identificación de larvas infectantes obtenidas a partir de coprocultivos, dado
que en éstas se pueden establecer las diferencias precisas entre los géneros
de nematodos gastroentéricos y en algunas ocasiones hasta las especies. El
coprocultivo sirve para la obtención de la fase infectante de nematodos
gastroentericos, implica una maduración de los huevos de los parásitos, todo
lo contrario a los cultivos bacteriológicos, en los cuales se obtiene la
multiplicación y aislamiento de bacterias, en el caso de coprocultivos para
larvas de nematodos se inicia el cultivo con los huevos presentes en las heces
que van a dar origen a un número similar de larvas.
4.1. Cultivos larvarios
Las finalidades de éstos son:
a.- Identificación exacta de parásitos. Las larvas infectantes o L3 obtenidas por
coprocultivo poseen características bien precisas ausentes en los huevos. Así
mediante el cultivo de éstas se puede llegar al diagnóstico del género e incluso
de la especie, sin recurrir a la necropsia. De tal forma que se obtiene una
43

interpretación exacta de la coproscopía.
b.- La precisión en el diagnóstico es de suma utilidad en las pruebas de
eficacia antihelmínticas.
c.-
Producción de larvas infectantes destinadas a estudios experimentales.
d. - Producción de material antigénico en estudios inmunológicos.
e.-Estudios
in vitro de sustancias larvicidas.
f.-
Estudios de fases exógenas de parásitos y de diferentes parámetros de
desarrollo larvario.
Las condiciones necesarias para el cultivo larvario son:
a.-
La obtención de las heces debe hacerse por extracción rectal directa para
evitar la contaminación con larvas de vida libre.
b.-
En caso de utilizar heces de ovino y/o caprino, es recomendable mezclar la
muestra con aserrín que facilita la aireación. El aire penetra a través de la cara
externa de los huevos y la cutícula de las larvas. En este sentido, los
requerimientos de aire son altos para la muda, pero son bajos para las larvas
infectantes.
c.-
La humedad es indispensable para el metabolismo de las formas
parasitarias principalmente para humedecer la cubierta externa de los huevos
y la cutícula de las larvas. El óptimo de humedad relativa es entre el 80 y 90 %.
d. - La temperatura óptima para la eclosión larvaria es de 28ª 30C.
e.-
El pH juega un papel importante. Las heces tienen un nivel óptimo para el
desarrollo larvario que va de 6.5 a 7.5.
Para lograr la identificación de los géneros de nematodos gastroentéricos
involucrados se recurre a técnicas de coprocultivo con el objeto de identificar
larvas infectantes que por su morfología pueden ser claramente distinguidas.
Una gran cantidad de métodos han sido desarrollados: Técnica de cultivo en
frasco,Aserrín estéril, Caja de Petri, Corticelli Lai y Hule espuma.
4.1.1. Técnica de cultivo en frasco:
Esta técnica es ampliamente utilizada por muchos laboratorios de
parasitología animal, puesto que requiere material común y su costo es muy
reducido.
Material- Mortero y pistilo ascos de vidrio con boca de 1 ½ pulgadas (3.81 cm) y
cucharas de plástico o aluminio
- Nistatina (Micostatin) en polvo
- Goteros
Procedimiento
Pesar 10 g de heces y mezclar las heces con agua destilada. La mezcla se
coloca en el fondo del frasco, evitando ensuciar las paredes del mismo. Es
polvorear en la superficie una pequeña capa de Micostatín comercial (a la
concentración indicada por el fabricante), por una sola ocasión.
Posteriormente se tapa el frasco sin cerrarlo herméticamente; dejarlo a
temperatura ambiente (dependiendo del lugar si es caluroso su ciclo evolutivo
44

se acortara y en 6 días obtendremos la fase infectante pero si el clima es frió el
ciclo se alargara hasta 15-20 días para obtener la fase infectante. Diariamente
se humedece con agua y se destapa una hora. A los 12 días se agrega unas
gotas de agua corriente sobre una de las paredes del frasco. Inclinando el
frasco se hace girar éste en dos o tres ocasiones. Debe hacerse lentamente
para que el agua bañe completamente toda la pared del frasco. El líquido se
colecta en una caja de Petri para su observación al microscopio
estereoscópico. Realizar la lectura durante tres días seguidos.
La técnica utiliza 10 g de heces puesto que un exceso impide la correcta
oxigenación de los huevos que se encuentran en el fondo del frasco. Este
método es económico y práctico, puesto que fácilmente se puede conseguir
los frascos de cultivo. Debe considerarse que algunos géneros de nematodos
requieren más tiempo de incubación, como es el caso de Nematodirus y
Oesophagostomum.
4.1.2. Técnica de aserrín estéril:
Material
- Mortero y pistilo
-Aserrín estéril
- Cucharas de plástico oAluminio
- Charola de plástico oAluminio
- Frasco de vidrio con boca de 2 a 2.5 y de 6.5 pulgadas (5.08 a 6.35 y de 16.51
cm) de alto.
- Estufa de cultivo
-Autoclave
Procedimiento
Se pesa 20 g de heces y homogeneizar con agua sin cloro. El homogeneizado
se coloca en una charola de plástico y se mezcla con aserrín estéril a razón de
una parte de heces por dos de aserrín. Una vez mezcladas las heces se
colocan en el frasco de vidrio, evitando las paredes y se cierra
herméticamente. El frasco se coloca en una estufa a 27ºC y diariamente se
humedece con agua y se destapa por una hora. El cultivo se prolonga por 8
días. Transcurrido ese tiempo el cultivo se coloca en el aparato de Bareman
para liberar las larvas. Esta técnica requiere de material de laboratorio más
completo, como es la autoclave y la estufa de cultivo.
4.1.3. Técnica en caja de Petri:
Material
- Mortero y pistilo
- Papel filtro
- Cuchara de plástico ó de aluminio
- Caja de Petri de 15 cm de diámetro estufa de cultivo
45

Procedimiento
Se pesan 20 g de heces y se homogeneizan en agua destilada.
Se coloca papel filtro en la caja de Petri y se humedece con agua colocando el
homogeneizado en la superficie del papel, en una capa no muy gruesa y
extendida por toda la base de la caja. Se cultiva en estufa a 27º C y se
humedece con agua y se destapa una hora diariamente durante 8 días. Con
esta técnica existe una baja considerable en el número de larvas cultivadas,
pero las larvas que logran llegar a la fase infectante al obtener el sedimento
este esta muy limpio. Se ha visto que es poco usada en los trabajos de
investigación.
4.1.4. Técnica de heces estériles:
Material
- Mortero y pistilo
- Heces estériles
- Cucharas deAluminio
- Charolas de plástico
- Frascos de vidrio con boca de 2 a 2.5 pulgadas y de 6.5 pulgadas (5.08 a 6.35
y de 16.51 cm) de alto con tapa.
- Estufa
-Autoclave
Procedimiento
Se pesan 20 g de heces las cuales se homogeneizan con agua destilada, el
homogeneizado se coloca en una charola de plástico y se mezcla con otros 20
g de heces estériles. Colocar el homogeneizado en un frasco de vidrio
evitando ensuciar las paredes y se cierra herméticamente. Este se incuba en
estufa a 27º C y se humedece y se destapa diariamente. El cultivo se prolonga
por 8 días. Esta técnica es menos efectiva que la de Corticelli Lai.
4.1.5. Técnica de Corticelli Lai:
Material
- Mortero y pistilo
- Agua destilada
- Cuchara de aluminio
- Caja de Petri de 10 cm de diámetro
- Caja de Petri de 15 cm de diámetro
- Estufa de cultivo
Procedimiento
Se pesan 20 g de heces se homogeneizan las heces con agua sin cloro, el
homogeneizado de heces se coloca en la caja de Petri de 10 cm de diámetro
extendiéndolo perfectamente. La caja de Petri más pequeña. Junto con el
contenido se colocan en la caja de Petri de 15 cm de diámetro, a la cual se le
agrega de 20 a 25 ml de agua destilada, y se tapa. Incubar en estufa a 27º C,
46

Procedimiento
Se pesan 20 g de heces se homogeneizan las heces con agua sin cloro, el
homogeneizado de heces se coloca en la caja de Petri de 10 cm de diámetro
extendiéndolo perfectamente. La caja de Petri más pequeña. Junto con el
contenido se colocan en la caja de Petri de 15 cm de diámetro, a la cual se le
agrega de 20 a 25 ml de agua destilada, y se tapa. Incubar en estufa a 27º C,
humedeciendo con agua y destapando diariamente una hora. El cultivo se
prolonga por 8 días. Transcurrido el tiempo se coloca el líquido en un vaso de
precipitado e iniciar el conteo de larvas.
Con esta técnica se obtienen larvas totalmente limpias, no requiriéndose
emplear el aparato de Baermann. Es una técnica práctica en la cual al día
siguiente ya hay presencia de larvas. Su cultivo también puede ser a
temperatura ambiente prolongándose hasta 10 días.
4.1.6. Técnica con hule espuma:
Material
- Mortero y pistilo
- Hule espuma
- Cucharas de plástico ó aluminio
- Frascos de vidrio con boca de 2.5 y 6.5 pulgadas de altura con tapa.
Procedimiento
Se pesan 20 g de heces estas se homogeneizan con agua destilada, el
homogeneizado se coloca en una palangana de plástico con trozos de hule
espuma de aproximadamente 5 cm de largo por 3 cm de ancho, mezclándose
una proporción de heces por 4 de hule espuma. Una vez hecha la mezcla, se
coloca en un frasco de vidrio y se tapa sin cerrar herméticamente. Diariamente
se humedece con agua y se incuba a temperatura ambiente durante 15 días.
La recuperación de larvas es mediante el aparato de Baermann. Esta técnica
produce excelentes resultados a bajo costo.
4.2. Técnicas para la extracción de larvas infectantes de nematodos
gastroentéricos en pasto y su diferenciación con larvas de vida libre o
fitonematodos
En las diferentes regiones tropicales de México uno de los principales
problemas son las afecciones parasitarias causadas por nematodos
gastroentéricos (n.g.e), los cuales al estar interactuando con los rumiantes,
ocasionan pérdidas de peso, presencia de anorexia, anemia, retardo en el
crecimiento, disminución en la producción de carne y leche, además de retraso
de la madurez sexual. El ciclo biológico de éstos nematodos es directo, la larva
infectante desde el punto de vista epidemiológico, es el eslabón más
importante en la cadena evolutiva de estos vermes, debido a su facilidad de
adaptarse a diversas condiciones climatológicas.
La infección del ganado se realiza al ingerir larvas infectantes a través del
alimento o agua contaminada. El número de larvas ingeridas por los rumiantes
47

es variable, siendo afectado por la longitud de la pastura y por el
sobrepastoreo. La humedad contenida en la materia fecal del ganado puede
cubrir los requerimientos para el embrionamiento de los huevos, obteniendo
en pocos días la primera larva del parásito.
Las larvas migran contaminando las pasturas que circundan la masa fecal y
durante el tiempo lluvioso pueden diseminarse continuamente en el pasto
durante cinco o seis meses. Cuando las condiciones ambientales son
desfavorables las larvas se localizan en las hojas o bien se introducen
verticalmente en la tierra para hibernar. Cuando las condiciones sean
favorables, las larvas se reactivan y retornan a la punta de las hojas de pasto
en el potrero, por lo que es muy importante saber que tan infestado se
encuentra éste y poder dar un tratamiento estratégico a los animales.
La identificación y clasificación del estadio L3 de nematodos gastroentericos en
los pastos, tiene por objeto el estudio estadístico y cinético de la contaminación
de las praderas, lo cual es de gran importancia en la epidemiología de las
parasitosis; la identificación y cuantificación se lleva a cabo en el laboratorio,
utilizando muestras de pasto provenientes de las praderas a estudiar, Euzéby,
(1981).
El principio general para la extracción de las larvas contenidas en los pastos,
se basa en el tamaño y peso de las mismas. Tomando en cuenta este principio,
se enuncia como método general: 1º. El lavado de las muestras de pasto y 2º.
El filtrado o tamizado del sedimento conteniendo a las larvas. Además del
método general, se pueden considerar otros dos métodos: uno, consiste en la
concentración de las larvas por flotación con una solución densa y el otro, se
fundamenta en combinar los principios de flotación y sedimentación, Euzéby,
(1981).
En la actualidad, pocos son los trabajos relacionados con las técnicas para la
extracción de larvas presentes en los pastos, citándose entre otros a Durie,
(1959), Senhorst y Sturrock (1961), Bawden (1969), Heath y Major (1968)
Laboratorio Central Veterinario de Weybridge (LCVW)(1973), Smeal y Hendy
(1972), Van Dyne y Torell, (1974), Burger (1981), Bairden, Duncan y Armour,
(1981), Raynaud y Gruner, (1981). La mayoría de estos investigadores se
basan además del principio general mencionado por Euzéby, (1981), en la
técnica propuesta por Baemann, (1917)- citada por Nemeseri y Holló, (1961),
es decir el de Migración larvaria. También se ha propuesto el uso de algunas
sustancias químicas, como por ejemplo la formalina en diferentes diluciones
en la obtención de larvas de n.g.e. lo que provoca la muerte de los nematodos
de vida libre y fitonematodos, mientras que las L3 de n.g.e, continúan vivas
pero con movimientos más lentos, Nemeseri y Holló, (1961).
4.2.1. Durie, (1959)- citado por Euzéby, (1981), sugiere una técnica para el
lavado de una muestra de hierba, usando un chorro de agua dirigida de abajo
hacia arriba; esta agua arrastrará o contendrá a las larvas presentes en la
hierba, y estará dirigida hacia un tamiz con mallas de 25 (donde se
48

ecolectarán las larvas en un volumen determinado). Seinhorst y Sturrock,
(1961)- citado por Euzéby, (1981), modificaron el funcionamiento del aparato
de Baermann utilizando nuevo material un tanto sofisticado y poco practico, y
donde el tiempomínimo de obtención de la muestra es de 2 días, pudiendo ser
hasta 4 días. Un estudio realizado por Bawden, (1969)- citado por Euzéby,
(1981), sugiere que el sedimento de la muestra de pasto obtenida por la
técnica de Barmann, se filtre sobre tamices con mallas cada vez más finas,
permitiendo el paso de las larvas y colectándose al final sobre filtros " Millipore"
con poros de 10 m de diámetro.
4.2.2. Otro método de investigación consiste en el análisis helmintológico de la
hierba tomada del animal mismo que ya ingirió y masticó, obteniendo la
muestra (100-200) g de hierba por fístula esofágica después de la deglución.
Aunque esta técnica no permite la recuperación total de la hierba ingerida, es
muy interesante, al observarse que únicamente un pequeño número de larvas
se pierde durante la masticación y la deglución y además, constataron que se
puede recuperar mayor cantidad de larvas en la hierba masticada que en la
hierba de las praderas (Heath et al, 1968; Van y Torrell, 1974).
4.2.3. Smeal y Hendy, (1972)- citado por Euzéby, (1981), utilizan un método
donde se procesa un filtrado de suspensión larvaria lo cual proponen el empleo
un aparato bastante complejo, y que requiere más de 12 horas para obtener
resultados; la posible ventaja que ofrezca, es que permite trabajar varias
muestras a la vez. El L.C.V.W. (1973) utiliza la siguiente técnica: Se pesan 500
g de pasto y se sumergen en una cubeta con 10 litros de agua; se deja así
reposar durante dos horas y después se remueve la hierba, sacándola por
pequeñas porciones y comprimiéndola manualmente, se pasa a una segunda
cubeta con agua y se repite el lavado. Las dos cubetas se dejan en reposo
hasta el día siguiente permitiendo así la sedimentación de las larvas. Después
se elimina el sobrenadante hasta dejar 400 ó 500 mL en cada cubeta. Este
sedimento se pasa por tamiz de 100 mallas y se coloca en una copa, donde
permanecerá tres horas para sedimentar. Nuevamente se elimina el
sobrenadante hasta dejar 60 mL y ese sedimento se somete a la flotación de
sal común. Con esta técnica se recogen el 40% de larvas presentes en la
hierba.
4.2.4. Burger, (1981), cita una técnica para la recuperación de larvas de n.g.e.
a partir de forrajes, utilizando una lavadora eléctrica comercial. Él liquido
obtenido del lavado se pasa a través de un tamiz de 250 (para eliminar detritos
vegetales y después las larvas se colectan en una malla de 25 y finalmente
para concentrarlas, se centrifuga tres veces con solución saturada de Sulfato
de Magnesio (s.g.=1.28). El porcentaje de recuperación larval es del 60%
Bairden et al. (1981), al recuperar larvas infectantes de trichostrongylidos a
partir del suelo utilizaron una técnica basada en los principios de
sedimentación y filtración (con mallas de 27m), seguida de una extracción por
medio del aparato de Baermann y obteniendo un 60% de recuperación
larvaria. Raynaud y Gruner, (1981) compararon dos técnicas para evaluar la
49

contaminación de pastos con larvas infectantes de n.g.e.: 1) Técnica de
remojado y colado, en la que la muestra de pasto se deja remojar con agua y
detergente. El pasto se deja así durante 12 horas y al final se pesa a través de
un cedazo de 200 (donde quedaran atrapadas las larvas presentes. 2) Técnica
de lavado mecánico, utilizando una lavadora eléctrica o bien una mezcladora
de cemento, según el método de Jorgensen. El liquido de lavado se pasa por un
cedazo con abertura de 200 (colectándose las larvas hacia un embudo de
metal diseñado especialmente, en el cual se coloca una tela de nylon con malla
de 20 (lo anterior se realiza con la ayuda de una recogedora de plástico
manual).
En nuestro país, pocos son los laboratorios que realizan análisis
helmintológicos de los pastos. En el laboratorio de Helmintología del CENID-
PAVET, INIFAP, se utiliza la técnica de migración larvaria para forrajes.
4.2.5. Técnica de migración larvaria
Material
- Cubeta de plástico de 6 lts
- Gasa de algodón
- Copas de plástico de 500 mL
- Caja de Petri de 10 cm de diámetro
- Pipeta Pasteur con tapón de hule
- Manguera de hule látex
- Porta objetos y cubre objetos
- Solución de tintura de yodo
- Microscopio estereoscópico y microscopio compuesto
Método
1.- Se colocan de 100 a 500 g de pasto cortado en pequeños trozos sobre gasa
de 40x40 cm, se unen las cuatro puntas de ésta, se anudan con un cordel y se
introducen en una cubeta inclinada que contenga agua tibia (25C), La cantidad
de agua será la suficiente para cubrir el paquete de gasa conteniendo la
muestra. Evitar que esta toque el fondo de la cubeta, para lo cual se sujeta con
cáñamo delgado y masking-tape en uno de los bordes de la cubeta.
2.- Se deja reposar la muestra durante 24 horas
3.- Después de transcurrido ese tiempo se retira la muestra suavemente para
no agitar el sedimento, y se decanta el sobrenadante por sifonado con una
manguera de hule látex.
4.- El sedimento que quedó en la cubeta, se recolecta en una copa de plástico y
se deja reposar tres horas.
5.- Después de ese tiempo, se decanta el sobrenadante de la copa también por
sifonado utilizando una manguera de hule látex.
6.- Este último, se pasa a una caja de Petri y se observa al microscopio
estereoscópico con el objetivo de 16x y 40x (Figura 4.1).
50

Figura 4.1. Técnica de migración larvaria
4.3. Lavado de larvas infectantes (L 3)
de nematodos
gastroentéricos con solución de sacarosa al 40%
Al hacer el coprocultivo para obtener las larvas en la fase infectante éstas se
encuentran muy sucias por lo que es importante que una vez que se
concentren, limpiarlas por medio de la técnica de Baermann. Luego las larvas
se filtran a través de un tamiz de malla 100 con la idea de eliminar detritos.
Posteriormente todo el contenido se pasa a unos tubos de plástico de 50 mL los
que se meten a refrigeración a 4ºC por dos horas y luego se elimina el
sobrenadante y se limpia el sedimento. En tubos de ensaye se colocan nueve
mL de sacarosa al 40% y después con mucho cuidado se agrega el sedimento
con larvas deslizándolas por las paredes del tubo de ensaye para
posteriormente centrifugarlas a 3500 r.p.m. durante cinco minutos con la
finalidad de que sedimente la mayor cantidad de contaminantes;
posteriormente se colectan las larvas (contenidas en el anillo que se forma)
para inmediatamente depositarlas en tubos de 10 mL y lavarlas por
centrifugación con agua destilada para eliminar el exceso de sacarosa. Esta
operación se realiza por tres ocasiones a 3500 r.p.m. durante tres minutos y así
poder utilizarlas en diferentes pruebas experimentales (control biológico e
inmunológico, Biología Molecular, Epidemiología y Ecología).
51

4.4. Eliminación de las vainas de larvas infectantes (L 3)
de nematodos
gastroentéricos
La eliminación de la vaina de la larva infectante (L 3)
es de suma importancia
para que la larva pueda continuar evolucionando a L 4, L 5 . En el laboratorio.
Una vez que fueron lavadas las larvas infectantes, fue necesario retirar la
vaina de ellas de manera artificial para dar paso al siguiente estadio larval que
es el cuarto (L 4).
De una botella de hipoclorito de sodio al 6% se colocan en
cuatro tubos de ensaye tres ml de agua y en el primer tubo se le agrega tres mL
de hipoclorito de sodio y de este se hacen diluciones hasta llegar al 0.375% de
concentración. Antes de la realización de cada desenvaine fue necesario
tomar una muestra (gota) de larvas y confrontarla con la solución con
hipoclorito de sodio para verificar el tiempo requerido para el desenvaine, ya
que, incluso en ellas cada organismo responde de manera distinta ante este
estimulo, el tiempo promedio que se requirió para esta operación fue de 5-10
minutos. Después de este lapso de desenvaine rápidamente se enjuagaron
con agua destilada y se centrifugan a 3500 r.p.m. durante tres minutos por tres
ocasiones; en la ultima se retira el sobrenadante dejando solamente el “botón”
de larvas en cada tubo.
52

Características morfológicas de larvas y adultos de nematodos.
Figura 4.2. a) Características generales, b)
tipos de esófago)
a b
53

Características morfológicas de larvas y Diferentes formas de Esófago
de Adultos de nematodos de vida libre y fitonematodos.
Figura 4.3. a) caudas de fitonematodos, b)
características morfológicas
generales de nematodos gastroentéricos en sus diferentes estadios)
a b
54

Figura 4.4. Características morfológicas del estadio infectante (L ) de
3
Haemonchus contortus
Figura 4.5. Porciones anterior y posterior de los diferentes géneros de larvas
infectantes de nematodos gastroentéricos
55

4.5. Identificación de larvas infectantes (L3) de nematodos
gastroentéricos en bovinos y ovinos
Los nematodos tienen afinidad por determinadas porciones del tracto
digestivo, parasitando principalmente al abomaso las siguientes especies:
Haemonchus contortus, Haemonchus placei, Mecistocirrus digitatus,
Trichostrongylus axei, T. colubriformis, T. longispicularis, Ostertagia
circumcincta, O. trifurcata y O. lyrata. En el intestino delgado: Nematodirus
spathiger, N. fillicolis, N. helvetianus, N. battus, Strongyloides papillosus,
Bunostomum trigonocephalum, B. phlebotomum, Cooperia oncophora, C.
pectinata, Trichostrongylus spp, y Toxocara vitulorum, y en intestino grueso:
Chabertia ovina, Oesophagostomum columbianum, O. venulosum O.
radiatum, Trichuris ovis, T. globulosa, Skrjabinema ovis
vryburgi.
y Agriostomum
Las larvas infectantes poseen diferentes tropismos, mismos que determinan
su actividad, tienen por ejemplo un fototropismo negativo a la luz fuerte, por lo
que migran a la base de las plantas durante las horas de mayor intensidad de
56

luz solar, permaneciendo quietas durante ese tiempo. Por el contrario, cuando
la luz solar es poca, como es al amanecer y al atardecer, las larvas se
desplazan con mayor facilidad hacia la punta de los pastos, lo que representa
un fototropismo positivo a la luz tenue, aunado a este último tropismo presenta
un hidrotropismo positivo, provocando ambos una migración vertical. Estas
larvas pasan parte de su ciclo biológico en el exterior, dependiendo de las
condiciones ambientales para su sobrevivencia las encontramos ya sea en el
excremento; conteniendo huevos de estos nematodos o en los pastos en su
fase preparasítica L , L y L El conocimiento morfométrico del estadio larval
1 2 3.
infectante (L ) de los n.g.e. es de gran importancia ya que con base en ello se
3
puede determinar la presencia de los diferentes géneros y especies de
parásitos de los animales, así como establecer el grado y tipo de
contaminación larval de una pastura.
En las claves de identificación larvaria, se señalan aquellos caracteres que
permitan la identificación de un género y en ocasiones hasta de una especie,
como por ejemplo: presencia de la envoltura de la segunda muda o vaina
larval, presencia o ausencia de cavidad bucal, forma y longitud del esófago,
número y forma de las células intestinales. Niec, (1968) clasifica a los
diferentes géneros de larvas infectantes de n.g.e., de acuerdo a lo largo de la
cola de la vaina larva, formando así tres grupos:
Larvas con cola de vaina corta: Trichostrongylus (axei, colubriformis y vitrinus)
yOstertagia (circumcincta y ostertagi) .
Larvas con cola mediana: Haemonchus (contortus y placei) Cooperia
(oncophora, punctata yspp) yMecistocirrus
digitatus.
Larvas con cola de vaina larga: Nematodirus (spathiger, battus, fillicolis,
helvetianus) Oesophagostomum (radiatum y venulosum), Chabertia ovina.
Además de los grupos mencionados, considera por separado a la L3 de
Strongyloides papillosus y Bunostomum spp, por ser la más pequeña en
longitud.
Las características morfológicas, se miden de la siguiente manera:
1.- Longitud total: de la cavidad bucal a la punta de la cola de la vaina.
2.- Longitud del cuerpo de la larva: de la cavidad bucal a la punta de la cola de
larva.
3.- Longitud del esófago: de la cavidad bucal al comienzo del intestino.
4.- Longitud de la cola de la larva: del ano a la punta de la cola de la larva.
5.- Longitud de la cola de la vaina: del ano a la punta de la cola de la vaina.
6.-.Ancho del cuerpo de la larva, medición tomada al inicio del intestino.
57

Arva infectante de Strongyloides spp.
S. papillosus:
ovinos, caprinos, bovinos, búfalos y conejos.
S. ransomi:
cerdos.
S. stercolaris: hombre, antropoides, perro y gato.
S. westeri:
caballo, asno.
S. fuelleborni:
hombre y primates.
S. rati. ratas.
S. avium: aves.
La evolución del huevo o larva infectante a 10 y 15º C es en 7-8 días y a
20-25º C en 7-8 horas. Las larvas de este género son de las más
pequeñas, sin vaina, el esófago es muy largo, aproximadamente 1/3 del
total de la larva y de color claro. El intestino bastante corto, formado por
células mal diferenciadas con oscuras granulaciones. En la porción media
del intestino, se encuentra el primodium genital. En larvas de cultivos viejos,
no se distingue bien el esófago del intestino. La cola larval termina
trifurcada (vista de costado parece bifurcado). Como este género parásita
sobre todo a los animales jóvenes, se piensa que su vía de entrada además
de la oral y la cutánea es principalmente con la leche.
Las infestaciones ocasionadas por el género Strongyloides spp. son de
suma importancia, ya que las diferentes especies de éste género pueden
ser parásitos en el intestino delgado de prácticamente toda clase de
animales domésticos.
58

Figura 4.6. Larva infectante de Strongyloides papillosus
59

Larva infectante de Bunostomum spp
B. trigonocephalum: ovinos y caprinos.
B. phlebotomum: bovinos.
Es la larva más pequeña de los nematodos gastrointestinales de bovinos y
ovinos, la cual esta provista de vaina. En una observación más detallada, la
extremidad anterior es redondeada, la cavidad bucal es pequeña y tiene más o
menos forma de cono o embudo con engrosamiento cutícula. Hay una
pequeña estructura cuticular (anillo nervioso) en forma de media luna en el
extremo anterior del esófago, mide 140 a 175 m de largo y posee un bulbo
manifiesto en la porción posterior. El intestino está bordeado por dieciséis
células intestinales, las que miden 33 x 6 m, pocas veces bien diferenciadas,
con su respectivo núcleo y primordium genital, el cual ésta situado de 240 a 295
m del extremo anterior de la larva. En la extremidad posterior, la punta de la
cola de la larva es obtusa y mide de 55 a 68 m de largo, además la cola de la
vaina larval se proyecta a una distancia de 85 a 150 m del extremo de la larva. A
la temperatura óptima 22-24°C se forman larvas infectantes en 6-7 días.
Esta larva es hematófaga, las larvas de éste género no pueden completar su
crecimiento durante - la fase preparasítica si la temperatura desciende a
menos de 15 C. La vía de entrada puede ser oral o a través de la piel, pero se ha
demostrado experimentalmente, que la vía percutánea es más eficaz para éste
género. El período de latencia es de 4.5 a ocho semanas, dependiendo de la
resistencia del hospedero.
60

Figura 4.7. Larva infectante de Bunostomum trigonocephalum
61

Larva infectante de Trichostrongylus spp.
T. colubriformis:
rumiantes, hombre y cerdo.
T. vitrinus: rumiantes.
T. axei:
rumiantes y equinos.
T. capricola:
ovinos y caprinos.
T. probolurus:
rumiantes y camellos.
T. rugatus:
ovinos y caprinos.
T. falculatus:
ovinos y caprinos.
T. leroux:
rumiantes.
T. tenuis:
aves domésticas.
La larva infectante es activa, entra al hospedero únicamente por la boca,
pudiendo pasar al equino, ganado vacuno y ovejas. Es una larva robusta,
provista de vaina de tamaño pequeño que pertenece al grupo de colas cortas
Niec, (1968). En una observación más detallada, la extremidad anterior es
redondeada con cavidad bucal. El intestino está bordeado por 16 células
intestinales de forma rectangular o triangular, con su respectivo primodium
genital. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva acaba en
diferentes formas o tubérculos, dependiendo de la especie de que se trate. La
cola de la vaina es corta, cónica, aguda. La forma preparasítica, tiene poca
resistencia a las temperaturas bajas y es poco probable que sobreviva hasta la
primavera en lugares donde el invierno es frío y largo; sin embargo, en zonas
templadas y húmedas soportan el invierno, aunque su capacidad de sobrevivir
es menor que la de Ostertagia spp. Atemperatura óptima las larvas infectantes
se desarrollan en 7-8 días.
62

Figura 4.8. Larva infectante de Trichostrongylus colubriformis
63

Larva infectante de Ostertagia - Teladorsagia spp.
O. ostertagi:
bovinos.
Teladorsagia circumcincta:
ovinos y caprinos.
T. trifurcata:
ovinos y caprinos.
Es una larva delgada, provista de vaina de tamaño pequeño y de cola corta.
En una observación más detallada, la extremidad anterior es redondeada con
cavidad presente, el intestino es bordeado por 16 células intestinales de forma
triangular con su respectivo núcleo. En la extremidad posterior, la punta de la
cola de la larva es redondeada con pequeña incisión en la parte ventral de la
larva. La cola de la vaina larval es alargada, puntiaguda con una desviación
característica.
Las formas preparasíticas de éste género, resisten más las temperaturas
bajas que la mayor parte de los otros géneros de la familia, por lo que las
parasitosis por Ostertagia/Teladorsagia predominan en zonas frías. En
temperaturas de 22-24°C se desarrollan las larvas infectantes en seis días.
64

Figura 4.9. Larva infectante de Teladorsagia circumcincta
65

Larva infectante de Mecistocirrus digitatus
En la clave de identificación larvaria existente no se hace mención a esta larva,
excepción hecha de Soulsby, 1965 quien es el único que incluye en su clave de
identificación larvaria la descripción dada por Fernando, 1962. E n 1984
García y Mejía y en 1991 Liébano, describen su morfología. Es una larva
delgada, provista de vaina, pertenece al grupo de vaina corta. En una
observación más detallada la extremidad anterior es redondeada, su esófago
es filariforme. Presenta en la extremidad anterior dos estructuras en forma
arriñonada, situadas paralelamente y de color café oscuro. Es evidente la
presencia de estriaciones cuticulares más marcadas en la región cervical, se
observan también 16 células intestinales de forma pentagonal provistas de un
gran núcleo, así como posibles gránulos alimenticios de gran tamaño y de
aspecto transparente dentro del intestino. En la extremidad posterior, la punta
de la cola de la larva acaba en forma redondeada y la cola de la vaina es corta,
cónica aguda.
Figura 4.10. Larva infectante de Mecistocirrus digitatus
66

Larva infectante de Cooperia spp.
C. curticei:
ovinos y caprinos
C. oncophora:
bovinos
C. punctata:
bovinos
C. pectinata:
bovinos.
Es una larva delgada, provista de vaina, pertenece al grupo de cola mediana.
En una observación más detallada, la extremidad anterior es redondeada, su
cavidad bucal tiene forma de pera o globular. La cavidad bucal comienza en la
faringe posee una cinta fibrinosa, la que al observarse con un objetivo de
mayor aumento, se ven dos puntos refringentes o una línea, detalle
morfológico característico para éste genero. Su esófago es filariforme, con su
respectivo núcleo en cada una de las células que son 16 y su primodium
genital. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva es obtusa,
redondeada. La cola de la vaina larval es ligeramente ondulada. Las células
miden 50 a 80 x 10. La primera célula genital o primodium está situada de 340
a 448 del extremo anterior. Las fases preparasíticas de este género son las
menos resistentes a las temperaturas bajas y a la desecación, por lo que muy
pocas sobreviven después del invierno en los días templados. En el cultivo las
larvas infectantes a temperatura de 22-24ºC se forman en 7 días. La baja
temperatura ambiental y la falta de lluvias, provocan un decremento en la
infección por Cooperia spp., pudiendo sobrevivir sobre las pasturas los
estados libres de éste parásito durante el invierno, aunque puede haber un
incremento de la infección en animales susceptibles durante el invierno. En
Australia se ha establecido que las larvas infectantes de Cooperia spp
persisten viables sobre la pastura por 24 semanas durante el verano y el
otoño, que es cuando hay mayor precipitación pluvial.
67

Figura 4.11. Larva infectante de Cooperia oncophora
68

Larva infectante de Haemonchus spp.
H. contortus:
ovinos y caprinos.
H. similis:
rumiantes.
H. placei:
Bovinos
H. longistipes:
ovinos, cabras, camellos.
La larva de este género requiere de una temperatura más elevada que
las de Ostertagia spp, para llegar a su fase de (L3).Todas las especies de
Haemonchus succionan sangre para alimentarse. Es una larva delgada,
provista de vaina de tamaño medio y de cola mediana. En una observación
más detallada, la extremidad anterior es redondeada, su cavidad bucal es de
forma globular y el esófago es filariforme. El intestino está bordeado por 16
células intestinales con su respectivo núcleo y primodium genital, siendo las
primeras cortas y triangulares y las últimas alargadas y de forma más
pentagonal; cabe destacar que la primera célula es pequeña e irregular y la
última no se encuentra alineada a sus células contigua si no que termina en
forma individual.
En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva acaba en forma
cónica y la cola de la vaina, se va adelgazando hasta finalizar en punta fina,
además presenta una torcedura o fractura inmediatamente después de la
terminación de la punta de la larva, asemejando a una bayoneta.
69

Figura 4.12. Larva infectante de Haemonchus contortus
70

Larva infectante de Chabertia ovina
Esta larva pertenece a la familia trichostrongyloidea. Es una larva provista de
vaina delgada, es de tamaño grande, morfológicamente es muy parecida a la
de Oesophagostomum. El intestino ésta bordeado por 28 a 32 células de forma
rectangular. Pertenece al grupo de las de cola grande (Niec, 1968). En una
observación mas detallada, en la extremidad anterior, la cavidad bucal entra al
esófago a través de una armadura esofágica, la punta de la cola de la larva es
roma, siendo la cola de la vaina muy delgada en su extremo posterior. Levine,
en 1968. La resistencia de los huevos principalmente a la desecación e
influencias externas, es grande. La mayor parte de los ovinos están infectados
con Chabertia ovina, pero la enfermedad pocas veces es aparente. La
chabertiasis se manifiesta como una enteritis intensa, a veces de
consecuencia fatal, que afecta a un grupo de animales. En el ganado bovino
nunca se encuentran manifestaciones clínicas.
Las larvas infectantes se cultivan a temperatura de 22-24°C en seis días. El
periodo prepatente es de 25 días.
71

Figura 4.13. Larva infectante de Chabertia ovina
72

Larva infectante de Oesophagostomum spp
O. columbianum:
ovinos, caprinos y camellos
O. venulosum:
ovinos y caprinos
O. radiatum:
bovinos y búfalos.
Es una larva bastante ancha, provista de una vaina gruesa y floja que forma
ondulaciones muy visibles. Pertenece al grupo de las llamadas de cola
grande. En una observación más detallada, la extremidad anterior es
redondeada, su cavidad bucal recta, de paredes engrosadas y el esófago
filariforme en el estado infectante o L3. El intestino está bordeado por una
cantidad de células intestinales características para cada especie, que puede
ser de 16, 24 ó 32. En la extremidad posterior, la punta de la cola de la larva
termina en forma cónica y la cola de la vaina se va adelgazando hasta finalizar
en una punta fina, en forma de látigo. Esta larvas se cultivan a temperaturas de
22 a 24 C en 7-8 días, son poco resistentes al calor y a la acción de la luz solar.
Efecto sobre el hospedero. Larvas infectivas se refugian en la pared Intestinal,
formándose en el hospedero nódulos del tamaño de una abeja, conocidos
como granulomas, estos impiden el funcionamiento del intestino alternando
con la absorción de líquidos, el resultado es una diarrea negra y mal oliente. La
supervivencia de las larvas en el suelo húmedo es de 3 meses, siendo la
temperatura óptima para su desarrollo de 30 C. Los huevos no resisten la
desecación, pero en cambio cada hembra adulta puede poner alrededor de
12,000 huevos al día (Lapage, 1983).
La supervivencia de las L3 requiere de una humedad de 100% (Quiroz,
1984). En infecciones artificiales en ovinos, con 500 larvas infectantes de O.
columbianum se observó debilitamiento progresivo, pérdida de peso y no
obstante el buen apetito del animal, la lana se hace quebradiza, presentando
diarrea con constipación, palidez de las mucosas y eventualmente parálisis del
tren posterior.
73

Figura 4.14. Larva infectante de Oesophagostomum
colombianum
74

Larva infectante de Nematodirus spp.
N. fillicolis: ovinos y caprinos
N. Spathiger: ovinos y caprinos
N. battus: bovinos: ovinos y camellos.
Las especies de éste género poseen resistencia a los cambios climáticos
extremos mucho mayor al resto de los trichostrongylidos. Su capacidad de
sobrevivir bajo condiciones de congelamiento es muy grande; también
soportan la desecación durante varios meses. Este género se desarrolla
entre 24 y 48°C. Es una larva robusta, provista de vaina de tamaño grande. En
una observación mas detallada, la extremidad anterior es redondeada, la
cavidad bucal esta en forma de tubo recto y el esófago es filariforme. El
intestino está bordeado por ocho grandes células bien delimitadas por un
material denso y granular; con su respectivo núcleo. En la extremidad
posterior, la punta de la cola de la larva es característica para cada especie.
La cola de la vaina larval es bastante larga en forma de látigo. Nematodirus
puede resistir uno o dos años en las praderas. El género Nematodirus se
diferencia en que la larva L1, no abandona el huevo formándose la L3
infectante en 15 a 30 días según especie a temperatura de 24-28 C. La
humedad de los pastos reduce su existencia pero puede soportar la
congelación. Borchert, (1964).
En las condiciones ambientales de Gran Bretaña, los huevos que salen con
las heces se desarrollan lentamente formándose en dos o tres meses la larva
infestante de tercer estadio, hacia finales del verano aunque el desarrollo
puede continuar entre noviembre y marzo. Estos huevos tienen una baja
efectividad para los corderos Gibson, (1958), porque son muy abundantes en
la superficie del suelo pero no en la hierba, por lo tanto son poco flexibles para
la ingestión.
La posibilidad de infestación en los pastos depende de la eclosión y del
traslado de las larvas infestantes a la hierba, lo cual no ocurre hasta la
primavera siguiente. Las larvas comienzan a sensibilizarse para la eclosión
tras una exposición prolongada de frío, y estímulo de la temperatura del suelo
lo cual ocurre en la primavera. Por ejemplo cuando los huevos que contienen
las larvas de N. battus, se exponen a temperaturas de 2-3 C, el número de
larvas que eclosiona al alcanzar la temperatura de 21 C está en proporción
directa con el tiempo en que los huevos estuvieron expuestos a las bajas
temperaturas, alcanzándose un máximo de eclosión en los huevos expuestos
al frío durante siete meses una vez estimulados por la temperatura y la
humedad apropiada se produce una eclosión masiva de larvas infectantes en
primavera, las cuales se acumulan en la hierba.
Nematodirus fillicolis. Es la más pequeña de las larvas de este género. está
encerrada en la segunda muda de la larva. La primera muda es abandonada y
permanece dentro de la vaina al tiempo de eclosionar, La vista lateral de la
punta de la cola de la larva esta redondeada con una profunda muesca
dividiéndola en un lóbulo ventral y un ligero o pequeño lóbulo dorsal. El lóbulo
75

ventral está posteriormente subdividido por una hendidura en dos lóbulos
ventrolaterales, haciendo a la cola trifurcada. La cola difiere de la de N.
spathiger en que no hay proceso de forma de vara situado entre el lóbulo
dorsal y ventral. N. spathiger es la segunda en orden de tamaño, la punta de la
cola de la larva está arquillada y mide de 52-65 de largo y entre el lóbulo dorsal
y ventral de la cola esta digitada, con proyecciones en forma de vara de 10 a
15 de largo N. helvetianus: Es la larva infectiva más larga del género
Nematodirus.
La punta de la cola de la larva es hendida, tiene un lóbulo dorsal y un lóbulo
ventral, entre los cuales está una estructura en forma de alargada que se
extiende más allá del margen del lóbulo terminal. N. battus Es la segunda
larva de este género en cuanto a tamaño, la cola de la larva es plana con un
fino punto, presenta dos proyecciones o apéndices sobre la superficie dorsal,
la muesca o apéndice anterior es pequeño y la posterior, aproximadamente a
37 de la punta de la cola de la larva.
76

Figura 4.15. Larva infectante de Nematodirus battus
77

Clave de identificación de larvas de nematodos pulmonares de bovino y ovino
Etiología
a)
b)
Dictyocaulus filaria (ovinos y caprino) ( Rodolphi, 1809; Railliet y
Henry, 1907 )
Dictyocaulus vivíparus (bovinos, búfalo y reno) ( Bloch, 1782; Railliet y
Henry, 1907)
La Dictiocaulosis es una enfermedad que causa mermas en la
ganadería. La gravedad de esta parasitosis repercute principalmente en
animales jóvenes, en los que produce tos, descarga nasal mucosa,
sobreviniendo disnea, anorexia y caquexia, predisponiendo al animal a
neumonías bacterianas, causadas principalmente por Pasterella sp,
Corynebacterium sp.
muerte.
Estreptococos sp. ocurriendo en alguno de ellos la
Localización
Pasajes aéreos: tráquea, bronquios y bronquiolos.
Distribución geográfica
Es mundial de más importancia en climas templados y en condiciones de
manejo intensivo del pasto, su desarrollo larvario necesita bajas temperaturas
y una adecuada humedad, ya que las temperaturas altas y la luz solar directa le
son perjudiciales.
Ciclo de vida
Este es directo, adultos que viven en los pasajes aéreos depositan huevos
que contienen larvas. Secreciones respiratorias los conducen hacia la boca
donde al ser esputados son ingeridos. La incubación ocurre en los intestinos.
Larvas de primer estadio L , son expulsadas en el excremento sobre el pasto
1
ésta hace su primer muda de uno a dos días para dar origen a la L , la cual
conserva su vaina y se nutre de los gránulos alimenticios que contiene en sus
células intestinales, a los tres o cuatro días se realiza la segunda, dando origen
a la L 3,
o fase infectante a los 4 o 7 días después de salir del hospedero. Larvas
de Dictyocaulus son menos móviles que las de otros parásitos.
Estas características en algunos casos evitan su ingestión por rumiantes los
cuales no pastan en áreas contaminadas por excrementos. Sin embargo,
larvas del nematodo pulmonar frecuentemente viven sobre el hongo Pilobolus,
común en las heces. Cuando el esporangio maduro de Pilobulos,
explota para
liberar las esporas, las larvas que viven sobre el hongo son depositadas sobre
el pasto hasta tres metros de las heces. Esto aumenta la oportunidad de que
las larvas sean injeridas por rumiantes al pastar. Al ser injeridas, las larvas
penetran la pared del intestino y son transportadas a nódulos linfáticos locales
donde mudan de vaina para convertirse en larvas de cuarto estadio. Ellas
entonces viajan por el conducto torácico a la vena yugular y de ahí al lado
78
2

derecho del corazón., el cual las bombea hacia los pulmones. Aquí termina su
ultima muda de vaina, unos 14 días después de su ingestión. Adultos
sexualmente maduros se pueden encontrar 8 días más tarde. Etapas larvarias
pueden permanecer inhibidas en los pulmones hasta por 150 días. Sin
embargo el período prepatente es aproximadamente de 29 días.
Las larvas de Dictyocaulus,
a diferencia de los demás miembros de su
superfamilia, no se alimentan en ninguna de sus etapas. Cuando las larvas
rompen del huevo están provistas de gran cantidad de material nutritivo, que al
microscopio se aprecia como gránulos negros dentro de las células
intestinales y de la cual depende su subsistencia durante todas las etapas
preparasitícas. Las L son perezosas en comparación con las larvas de los
otros Trichostrongyloideos. Sus requerimientos binómicos son más estrictos,
lo que impiden que puedan sobrevivir desecación o el congelamiento, aunque
si puedan subsistir el invierno en zonas húmedas y templadas.
Diagnóstico
3
a) Clínico. En animales jóvenes de seis meses de edad, aunque pueden
presentarse en cualquier edad. En la fase de penetración se han reportado
diarreas. Se presenta un cuadro de bronquitis parasitaria con incremento de la
frecuencia respiratoria tos y exudado nasal; al complicarse con neumonía
bacteriana se presenta fiebre. En becerros principalmente, tos ligera que se
agrava a la segunda semana; disnea, aumento de la frecuencia respiratoria,
estertores, inapetencia y trastornos en el crecimiento. En casos graves
respiración profunda, elevación de la frecuencia cardiaca y signos intensos de
anorexia. Se puede escuchar sonidos indicativos de enfisema La mortalidad
más alta se presenta en el periodo prepatente.
b) Laboratorio (Parasitológico). Identificación de la primera larva en exudado
nasal por examen microscópico directo, diluyendo el moco en solución salina
isotónica o en materia fecal por examen de migración larvaria (Baermann). Los
métodos de flotación y sedimentación pueden ser usados para un examen
rápido.
c) Posmortem. Por la presencia de lesiones y la demostración del agente
etiológico en los conductos bronquiales sus formas larvarias en el exudado
bronquial o traqueal.
El poder identificar las fases larvarias del nematodo pulmonar, representa una
herramienta muy útil para llevar a cabo estudios de diversas áreas como la
Epidemiología de estas parasitosis. Además de que mediante infecciones
controladas pueden evaluar la acción antihelmíntica de algunas sustancias
químicas, En pruebas inmunológicas para la extracción de antígeno de los
diferentes estadios preparasiticos.
79

Características morfométricas de larvas pulmonares
Dictyocaulus filaria
Se observa la presencia de una protuberancia protoplasmática (botón
cefálico) en el extremo anterior. En su inicio el esófago es filariforme. En el
primer tercio del extremo anterior se localiza su poro excretor. En el intestino se
observaron de dos a tres células intestinales de forma irregular de color negro
intenso debido a sus gránulos de inclusión y gran cantidad de gránulos
alimenticios en todo el intestino; En la parte media del cuerpo de la larva se
localiza su primordium genital. En el extremo posterior se observa su poro
anal y la punta de la cola de la larva es suavemente redondeada; Presencia de
vaina.
Dictyocaulus viviparus
Se observó en el extremo anterior ausencia de protuberancia protoplasmática
En su inicio presenta su esófago de tipo filariforme, En el primer tercio del
extremo anterior se localiza su poro excretor, En el intestino se observaron de
dos a tres células intestinales de forma irregular de color negro intenso debido
a sus gránulos de inclusión y gran cantidad de gránulos alimenticios en todo su
intestino; En la parte media del cuerpo de la larva se localiza el primordium
genital. En el extremo posterior se observa su poro anal y la punta de la cola de
la larva es cónica y termina en filamento. Hay presencia de vaina en el primer
estadio una sola y en el tercer estadio o larva infectante se observa dos vainas.
80

Comparación de medidas (m) de los estadios
exógenos larvales de Dictyocalus filaria con las
señaladas por otros autores
81

Evaluación del estadio exógeno del parásito pulmonar Dictyocaulus viviparus.
Figura 4.14. Desarrollo del huevo de D. viviparus y
comparación entre las las larvas de D. viviparus (L1 y L3), L1
de D. filaria y Muellerius capillaria.
82

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85

5. Necropsia e identificación de helmintos del tracto gastroentérico de
rumiantes
Victor Manuel Vázquez Prats
Carlos Ramón Bautista Garfias
A. Sacrificio de animales
B. Colecta de nematodos del aparato digestivo y pulmones
a) Esófago y rumen
b) Abomaso
c) Intestino delgado
d) Intestino grueso
e) Hígado
f) Pulmones
C. Fijación, tinción y montaje de helmintos
a) nematodos
b) Cestodos y trematodos
D. Identificación de nematodos
a) Mammomononogamus spp.
b) Gongylonema spp.
c) Haemonchus spp.
d) Ostertagia spp.
e) Mecistocirrus digitatus
f) Trichostrongylus spp.
g) Toxocara vitulorum
h) Strongyloides papillosus
i) Agriostomum vryburgi
j) Bunostomum spp.
k) Gaigeria pachyscelis
l) Cooperia spp.
m) Nematodirus spp.
n) Chabertia ovina
ñ) Oesophagostomum spp.o) Trichuris spp.
p) Skrjabinema ovis
q) Dyctiocaulus spp.
r) Protostrongylus rufescens
s) Cystocaulus ocreatus
t) Muellerius capillaris
86

E. Identificación de cestodos y trematodos
a) Moniezia spp.
b) Thysanosoma actinioides
c) Paramphistomum cervi
d) Dicrocoelium dendriticum
e) Fasciola hepatica
A. Sacrificio de animales
El sacrificio de los animales se lleva a cabo para la localización e
identificación de especimenes adultos y algunos estadios larvales de
nematodos, trematodos y cestodos.
El sacrificio siempre deberá ser lo mas humanitario posible, evitando al
máximo el sufrimiento del animal. Para esto se recomiendan tres métodos
(NOM-033-ZOO-1995):
a) Electroshock
Se practica generalmente en ovinos. Tiene el inconveniente de que a
nivel de campo no se cuenta con energía eléctrica, por lo que su uso se
circunscribe a laboratorios o instalaciones que cuenten con dicho
servicio.
b) Puntilla
Este procedimiento es muy práctico, principalmente en bovinos; sin embargo,
la persona que lo lleve a cabo debe tener experiencia y ser muy hábil para no
hacer sufrir al animal. Una modificación de dicho método es la llamada “pistola
de émbolo” que se aplica en la frente del animal. Con ambos procedimientos
se descerebra al rumiante.
a) Químico
Aquí se utiliza la administración de una sobredosis de algún anestésico;
el inconveniente radica en el excesivo gasto que genera el
procedimiento, además de que dependiendo del tipo de anestésico, no
se podrá utilizar la carne del animal para consumo humano.
Una vez sacrificado el animal, éste se coloca en posición decúbito dorsal con
los cuatro miembros fijos y se incide a lo largo de la línea alba. Al exponer el
aparato digestivo se procede inmediatamente a llevar a cabo ligaduras dobles,
con hilo cáñamo in situ,
a una distancia de tres cm., aproximadamente, de las
uniones omaso-abomasal, abomaso-duodenal e íleo-cecal (Figura 5.1),
con la finalidad de evitar la migración parasitaria de un compartimiento a otro;
luego se liga el esófago y el recto. Posteriormente se lleva a cabo un corte
transversal en el esófago, tráquea y recto para examinar los órganos
digestivos.
87

88
Figura 5.1. Representación esquemática del tracto digestivo de los rumiantes domésticos en el que se indican donde se
deben llevar a cabo las dobles ligaduras.

A continuación se realiza una inspección minuciosa para detectar larvas de
cestodos como son las fases larvarias de Taenia spp. y Echinococcus spp
(quiste hidatídico) en la cavidad abdominal. Posteriormente, se disectan los
compartimientos entre las doble ligaduras, separando además el esófago,
laringe, tráquea, rumen, abomaso, intestino delgado, intestino grueso y los
pulmones.
B. Colecta de nematodos del aparato digestivo y pulmones
Cuando se requiere hacer la recolección de helmintos de un animal
sacrificado, es importante saber cuáles son los estadios de desarrollo y
géneros que pueden encontrarse, ya que podrían pasar desapercibidos,
debido al desconocimiento de su tamaño, localización o color, entre otras
características.
Antes de iniciar la colección de helmintos es importante tener a la mano
recipientes de plástico o de vidrio, instrumental necesario para la necropsia,
solución de formol al 10%, solución salina fisiológica e hilo cáñamo. Todos los
recipientes deberán estar etiquetados con tinta indeleble, conteniendo la
siguiente información: especie animal, raza, número de identificación, órgano
o compartimento, cantidad del contenido y preservativo empleado.
Una vez disecados los órganos y compartimentos, se procede a la colecta de
helmintos. Este proceso varía de acuerdo al órgano y compartrimento de que
se trate.
89

90
fiigura 5.2. Localización de los principales géneros de helmintos en rumiantes domésticos.

a) Esófago y rumen
El esófago se incide longitudinalmente y se buscan helmintos en la
submucosa, colectándose los especimenes en un recipiente conteniendo
solución salina fisiológica.
El rumen se incide y se extrae el bolo ruminal, buscando los helmintos
adultos en la pared del rumen y en las glándulas ruminales: Al bolo ruminal se
le realizan lavados y pasajes de éstos por cedazos para buscar helmintos, los
cuales se colectan en solución salina fisiológica.
b) Abomaso
El abomaso se coloca en una palangana de plástico de aproximadamente
cinco litros de capacidad y se incide longitudinalmente por su curvatura mayor,
colectando su contenido en el recipiente. Posteriormente se realizan lavados
de la mucosa con agua simple, de preferencia con una pizeta. Una vez lavado
el abomaso, se procede a la colección de los especimenes adheridos a ella,
los cuales se depositan en la palangana; hecho lo anterior, el contenido de la
palangana se afora a uno, dos o tres litros, dependiendo del volumen
colectado y se agita uniformemente en forma de cruz para homogeneizar
perfectamente el contenido. De éste, se obtiene una alícuota del 10%,
pudiendo ser de 100, 200 o 300 ml, dependiendo del volumen total aforado. A
esta alícuota se le adicionan 10 ml de formol al 10% para su conservación. En
el caso de querer obtener especimenes vivos, el resto del contenido aforado
se pasa por un cedazo de 500 micrómetros (micras) de diámetro,
recuperándose los helmintos del sedimento, los que se colocan después en
solución salina fisiológica.
Para la colecta de larvas histotrópicas, el procedimiento es el siguiente:
después de haber lavado perfectamente la mucosa abomasal, con un
portaobjetos o con un sustituto (por ejemplo, una espátula), se raspa toda la
mucosa y se coloca en un recipiente con jugo gástrico artificial, el cual se tapa
e incuba a 37 °C durante 24 horas; una vez transcurrido dicho tiempo, el
contenido se pasa por una coladera y se procede a localizar las larvas en el
contenido, utilizando para ello un microscopio compuesto,
c) Intestino delgado
Este órgano se coloca en una palangana de plástico y se incide
longitudinalmente, cuidando de que el contenido se colecte en la palangana.
Posteriormente se lava toda la mucosa del intestino y el contenido se afora a
uno, dos, tres o cuatro litros. Se agita vigorosamente para homogeinizarlo
perfectamente. De éste se obtiene una alícuota del 10% del volumen total, que
puede ser de 100, 200, 300 o 400 ml. A continuación, a esta alícuota se le
adicionan 10 ml de formol al 10% para su preservación.
Para la colecta de larvas histotrópicas, se requiere que después de lavar el
órgano se deben separar y cortar los primeros cinco metros, a partir del píloro,
en segmentos de tres a cuatro cm, los que se colocan en un recipiente con
jugo gástrico artificial.Acontinuación, el recipiente ya tapado se coloca a 37 °C
durante 24 horas, después de las cuales el contenido se pasa a través de una
91

coladera y luego se procede a la colecta de las larvas con la ayuda de un
microscopio compuesto.
d) Intestino grueso
Una vez expuesto este órgano, se procede a hacer una incisión longitudinal
desde el ciego hasta el recto, cuidando de que todo el contenido se vierta
sobre una palangana. Debido a la consistencia de éste, es preciso agregar
agua hasta hacerlo lo más fluido posible. Con base en las características
morfológicas de los helmintos localizados en el intestino grueso, se procede
de dos maneras: la primera, es mediante la obtención de una alícuota del 10%
del volumen total, de manera similar a lo señalado para el abomaso y el
intestino delgado. La segunda, requiere la observación de la totalidad del
contenido, utilizando cedazos, ya que los helmintos se pueden observar a
simple vista. Cuando se hace el homogeneizado es necesario desbaratar toda
la materia sólida, para evitar que algunos helmintos pasen desapercibidos. Es
recomendable adicionar formol al 10%, tanto a la alícuota como al conjunto de
helmintos colectados para su conservación.
e) Hígado
Se lleva a cabo una disección minuciosa de este órgano, incidiendo los
conductos biliares donde se pueden encontrar helmintos. Cuando se
encuentra uno o varios ejemplares de, éste(os) se coloca(n) en solución salina
fisiológica. En el hígado se pueden encontrar principalmente Fasciola
hepatica (trematodo) y Thysanosoma actinoides (cestodo).
f) Pulmones
Una vez expuesto el aparato respiratorio, se hace una observación de la
laringe para la búsqueda de helmintos. Posteriormente, se incide
longitudinalmente la tráquea y, a través del árbol bronquial, se realiza una
disección minuciosa para localizar helmintos. Los nematodos tienden a
ubicarse en el lóbulo apical (lóbulo craneal) derecho. Los helmintos adultos se
colectan en formol al 10% o en solución salina fisiológica, dependiendo del
destino que se pretenda dar a los especimenes.
Para el caso de larvas histotrópicas, una vez revisados los pulmones, éstos
se seccionan en fragmentos de dos a tres cm cúbicos, los cuales se depositan
en un frasco conteniendo jugo gástrico artificial. A continuación se tapa el
frasco y se incuba a 37 °C durante 24 horas. Transcurrido este periodo, el
contenido se pasa a través de una coladera y se buscan las larvas en el
sedimento utilizando un microscopio compuesto.
C. Fijación, tinción y montaje de helmintos
Estos procedimientos varían dependiendo de los especimenes
obtenidos por lo que se desglosan por clases:
a) nematodos
Los procesos se inician con la fijación de los nematodos, los que si están
vivos, se colocan en alcohol etílico al 70% caliente (entre 60 y 70 °C) con el fin
92

de matarlos y provocar en ellos el estiramiento. Si los nematodos se
encuentran en formol al 10%, se realizan varios lavados con solución salina
para eliminarlo. El inconveniente de los nematodos conservados en formol, es
que los especimenes conservan la posición que tenían al estar vivos, por lo
que es común observarlos enroscados, lo que dificulta la medición de los
mismos. El aclarado de los especimenes se hace con lactofenol de Amann,
dejándolos reposar inmersos en él en una caja de Petri, para después colocar
cada ejemplar entre un portaobjetos y un cubreobjetos, evitando dejar
burbujas y luego se procede a identificar (rotular) la laminilla. Este
procedimiento aclara la cutícula del nematodo lo que facilita la observación de
sus estructuras internas. En la práctica se ha observado que las laminillas con
especimenes en lactofenol de Amann, pueden mantenerse por varias
semanas o meses, solo hay que agregar más según sea necesario.
Si se requieren preparaciones permanentes, se procede a llevar a cabo la
técnica de tinción con Hemalumbre de Meyer, que se describe a continuación:
Después de fijar los parásitos con formal al 10% o con alcohol etílico al 70%,
éstos se lavan con agua destilada y se colocan en una caja de petri con papel
filtro, después se adiciona el Hemalumbre de Meyer y se deja a temperatura
ambiente durante 24 a 48 horas; pasado este tiempo se decanta el colorante y
se lavan los especimenes varias veces con agua destilada hasta que ésta no
muestre rastros del colorante. Posteriormente, los parásitos se deshidratan al
pasarlos sucesivamente en alcoholes del 40%, 50%, 60% y 70%, decolorando
luego en alcohol ácido. La deshidratación se continúa utilizando
sucesivamente alcoholes del 80%, 90%, 96% y alcohol absoluto. Cada pase
en cada uno de los diferentes alcoholes dura de 12 a 24 horas. A continuación,
los parásitos se aclaran con xilol fenicado y creosotado durante 20 minutos
para luego montarlos con bálsamo del Canadá, haciendo presión con una
pinza. Finalmente, para secarlos, se colocan en una estufa bacteriológica a 37
°C durante 12 a 24 horas; después se limpian y etiquetan.
b) Cestodos y trematodos
El proceso se inicia con la compresión de los helmintos, lo que se lavan
perfectamente con solución salina fisiológica y se colocan entre dos
portaobjetos, comprimiéndolos utilizando ligas de hule, de manera que cada
ejemplar quede extendido. Después, los helmintos se fijan, para lo cual se
introducen en un recipiente conteniendo formol al 10% y se dejan 24 horas.
Luego se extrae el fijador y se quitan las ligas para montar cada uno en placas
de vidrio y luego se fijan con grenetina. Posteriormente se introducen en un
recipiente con formol al 10%. Si se quiere hacer preparaciones permanentes
de los trematodos, se emplea la técnica de tinción de Hemalumbre de Meyer,
descrita anteriormente
. D. Identificación de nematodos
a) Mammomonogamus spp.
Los miembros de este género (dos especies) pertenecen al órden
Rhabditida, Familia Syngamidae. Mammomonogamus laryngeus se localiza
93

en la laringe de bovinos; mientras que M. nasicola se localiza en la cavidad
nasal de bovinos, ovinos y caprinos.
Los ejemplares adultos de M. laryngeus son de color rojizo y están en cópula
permanente. Poseen cápsula bucal en forma de globo o de copa (Figura 5.3),
que en su base tiene ocho costillas o dientes dispuestos simétricamente en
círculo, alcanzando el borde de la cápsula bucal. El macho mide de 3 a 3.5 mm
de longitud y posee una bursa copulatriz pequeña, un rayo dorsal simple y no
tiene espículas. La hembra mide de 8.5 a 10 mm de largo; la distancia de la
vulva al extremo anterior es de 2.3 a 3.2 mm y la distancia del ano a la punta de
la cola es de 167 a 295 m.
Figura 5.3. Extremo anterior de un macho de
Mammomonogamus laryngeus mostrando la cápsula bucal en
forma de globo o copa (Castaño et al.,
2006)
b) Gongylonema spp.
Este género (orden Spirurida, Familia Thelaziade) contiene tres especies: G.
pulchrum (Figura 5.4a ),que se localiza en forma de zig-zag en la mucosa y
submucosa de la faringe, esófago y rumen de bovinos y caprinos; G.
verrucosum que se localiza en la mucosa del rumen de bovinos, ovinos y
caprinos y G. monning,
que se localiza en la mucosa y submucosa del rumen
de los ovinos y caprinos.
Los ejemplares adultos presentan cápsula bucal pequeña, cilíndrica con dos
labios pequeños y alas cervicales desarrolladas. El macho mide seis cm de
longitud con la extremidad posterior enrollada en espiral; no presenta bursa
copulatriz pero si alas caudales asimétricas (Figura 5.4b).
94

Posee dos espículas; la izquierda es alargada y delgada, mientras que la
derecha es pequeña y robusta. La hembra mide más de 15 cm de longitud, es
ovovivípara y posee una vulva subterminal.
Figura 5.4. Morfología de adultos de Gongylonema spp.
a,
extremo anterior; 1967).
b,
extremo posterior del macho ( Soulsby,
c) Haemonchus spp.
Este género (orden Strongyla, Familia Trichostrongylidae) contiene tres
especies de importancia: H. contortus, que se localiza en el abomaso de ovinos
y caprinos, H. placei que se localiza en el abomaso de bovinos y H. similis que
se localiza en el abomaso de bovinos y ovinos.
Los gusanos adultos de este género presentan una cavidad bucal pequeña,
conteniendo una lanceta oral en su interior (Figura 3a) ; además presenta un
par de papilas cervicales notorias con dirección anteroposterior. A
continuación se presentan las características de los adultos de las tres
especies:
H. contortus ( Figura 5.5): El macho mide de 10 a 20 mm de longitud, es de
color rojizo y tiene una bursa copulatriz con dos lóbulos laterales grandes y un
lóbulo dorsal pequeño y asimétrico, sostenido por el rayo dorsal, que es
robusto en forma de “ Y” invertida ( Figura 5b).
Las espículas son gruesas,
miden de 450 a 500 micrómetros ( m)
de longitud, presentando un pequeño
95

gancho en su terminación; el derecho mide de 41a46myel gancho izquierdo
de 21 a 40 m. La hembra mide de 18 a 30 mm de largo; debido a su aspecto de
este gusano es conocido como “ palo de barbería”(
Figura 5 c), que es originado
por la disposición de los ovarios de color blanco enrollados en espiral alrededor
del intestino de color rojo. Además, presenta una lengüeta supravulvar
alongada (Figura 5d).
H. placei:
El macho mide de 13a15 mm de longitud; presenta espículas de
450 a 470 mde largo. El gancho derecho de las espículas mide de 52 a 55 m,
el gancho izquierdo mide de 24 a 30 m.
Aunque asimétrico, el rayo dorsal es
largo y delgado. La hembra mide de 17 a 19 mm de largo, presentando una
protuberancia a la altura de la vulva en forma de botón.
H. similis:
El macho mide de 8.4 a 9.5 mm de longitud. Sus espículas son
cortas con una longitud de 318 a 375 m;
el gancho derecho de la espícula
mide de 66 a 71 m, mientras que el gancho izquierdo mide de 50.6 a 51 mde
largo; el rayo dorsal es asimétrico corto y robusto. La hembra mide de 11.5 a
12.6 mm de longitud y tiene una vulva que se abre en la cara interna de la
lengüeta supravulvar.
Figura 5. 5.
Representación esquemática de la morfología de
adultos de Haemonchus contortus. a, extremidad anterior;
b,
bursa copulatriz del macho; c, intestino y ovarios; d,
lengüeta
supravulvar (Ambia, 1981).
96

d) Ostertagia y Teladorsagia spp.
Las cuatro especies importantes de este género (orden Ascaridida, Familia
Trichostrongylidae): Ostertagia ostertagi, Teladorsagia circumcincta, T.
trifurcata y O. lyrata,
se localizan en el abomaso de bovinos, ovinos y caprinos.
Los gusanos adultos de este género presentan una cavidad bucal pequeña, el
cuerpo es de color café por lo que se le conoce como “ gusano café del
estómago”.
Su cutícula presenta estriaciones transversales y longitudinales;
tiene papilas cervicales prominentes en punta y dirigidas hacia atrás. A
continuación se indican las principales características morfológicas de los
adultos de las cuatro especies:
O. ostertagi:
El macho mide de 6.5 a 7.5 mm de longitud; tiene una bursa
copulatriz grande con dos lóbulos laterales trilobulados y uno dorsal pequeño;
las espículas son largas de 220 m
de longitud (Figura 5.6a). La hembra mide
de ocho a nueve mm de longitud, presenta una lengüeta supravulvar y su cola
es cónica y aguda (Figura 5.6b).
Teladorsagia circumcincta:
El macho mide de 7.5 a 8.5 mm de longitud.
Sus espículas miden de 280 a 320 m
de largo y su terminación presenta un
proceso cuticular romo. La hembra mide de nueve a 12 mm de longitud y en la
punta de su cola presenta de cuatro a seis anillos cuniculares (Figura 6c).
T.
trifurcata:
El macho mide de 6.5 a 7 mm de longitud. Sus espículas miden
de 150 a 180 m
de largo, con una bifurcación en la porción distal y terminan en
un proceso quitinoso. La hembra mide de nueve a 12 mm de longitud y en la
punta de su cola tiene de cuatro a cinco anillos cuniculares (Figura 5.6d).
O. lyrata: El macho mide nueve mm de longitud. Sus espículas mide 230 m
de largo. La hembra es similar a la de O. ostertagi.
Figura 5.6. Características morfológicas de adultos del
Ostertagia. a, O. ostertagi:
extremo posterior del macho y b,
extremo posterior de la hembra;
c,
Teladorsagia circumcincta:
extremo posterior de la hembra; d, T.
trifurcada: extremo posterior
de la hembra ( Duna,
1983).
97

e) Mecistocirrus digitatus
Este género (orden Strongylida, Familia Trichostrongylidae) contiene una
especie, M. digitatus,
que se localiza en el abomaso de bovinos y ovinos.
Los ejemplares adultos (Figura 5.7) presentan una cavidad bucal pequeña con
una lanceta oral. Su cuerpo presenta estriaciones transversales, que son más
gruesas y notorias en la región cervical. Las papilas cervicales son romas y
dirigidas lateralmente. El macho es de color rojizo, mide de 20 a 21.5 mm de
largo; el rayo del lóbulo dorsal es simétrico. La hembra tiene un aspecto de “
palo de barberia”, debido a la disposición de los ovarios de color blanco
enrollados en espiral alrededor del intestino de color rojo; mide de 26 a 30 mm
de longitud; no presenta lengüeta supravulvar y la vulva se localiza muy cerca
del extremo posterior.
Figura 5.7. Características morfológicas de Mecistocirrus digitatus
adultos. a, extremo anterior; b, bursa copluatriz del macho;
c,
intestino y ovarios de la hembra; d,
extremo posterior de la hembra
( Ambia,
1981).
98

f) Trichostrongylus spp.
Este género (orden Strongyla, Familia Trichostrongylidae) contiene varias
especies de importancia veterinaria: T. axei,
que se localiza en el abomaso de
ovinos, bovinos y caprinos; T. colubriformis, T. falculatus, T. vitrinas y T.
longispicularis, que se localizan en el intestino delgado de bovinos, ovinos y
caprinos; T. capricol, T. probulurus, T. rugatus y T. drepanoformis que se
encuentran en el intestino delgado de ovinos y caprinos.
Los especimenes adultos (Figura 5.8) de este género son de tamaño
pequeño, delgados y de color café rojizo pálido. No presentan cápsula bucal y
su poro excretor es notorio en la extremidad anterior. A continuación, se
indican las características morfológicas de algunas especies:
T. axei:
El macho mide de dos a seis mm de longitud; su rayo dorsal no está
separado de la bursa copulatriz; sus espículas son de color oscuro y de
diferente forma y tamaño; la izquierda mide de 95 a 120 m
y la derecha de 75
a 95 m. La hembra mide de tres a ocho mm de longitud y la vulva se
encuentra a 1/5 del final del cuerpo.
T. colubriformis:
El macho mide de 4.5 a cinco mm de longitud, presenta
bursa copulatriz desarrollada con grandes lóbulos laterales; el lóbulo dorsal no
está bien definido; las espículas son robustas de 135 a 160 mm. La hembra
mide de cinco a siete mm de longitud y la vulva se localiza a la mitad del final
del cuerpo; la extremidad posterior termina en punta cónica.
T. falculatus:
El macho mide de 4.5 a 5.5 mm de longitud, sus espículas son
desiguales; la izquierda mide 136 myla derecha 127 mde
largo. La
morfología de la hembra se desconoce.
T. vitrinus: El macho mide de cuatro a 72 . mm de longitud: sus espículas son
iguales y miden de 150 a 175 m
de largo. La hembra mide de cinco a ocho mm
de longitud.
99

Figura 5.8. Algunas estructuras de ejemplares adultos de
Trichostrongylus spp. a, bursa copulatriz del macho;
b,
espículas; c,
aparato ovoyector de la hembra.
g) Toxocara vitulorum
Esta especie (orden Ascaridida, Familia Anisakidae) se localiza en el
intestino delgado de bovinos y raramente de ovinos.
Los especimenes adultos (Figura 5.9) presentan tres labios con papilas en la
parte anterior. El macho mide de 15 a 24 cm de longitud y contiene una
pequeña espina en la parte posterior; tiene cinco pares de papilas postanales y
un número variable de papilas preanales. Las espículas tienen una longitud de
950 a 1250 m.
La hembra mide de 22 a 30 cm de largo y la vulva está situada a
18 / del extremo posterior.
100

Figura 5.9. Representación esquemática de la parte posterior de
ejemplares adultos de Toxocara vitulorum. a, hembra; b,
macho.
( Morales,
1977).
h) Strongyloides papillosus
Esta especie de nematodo que pertenece al Orden Rhabditida, Familia
Rhabbditidae, se localiza en el intestino delgado de bovinos, ovinos y
caprinos.
Los gusanos adultos (Figura 5.10) son partenogenéticos. La hembra mide de
tres a seis mm de longitud y su cola mide de 73 a 86 m
de largo. Presenta una
cutícula finamente anillada; la abertura genital se localiza en el último tercio del
cuerpo y el ano se abre por delante de la extremidad que termina en punta
roma.
Figura 5.10. Morfología de una hembra adulta de Strongyloides
papillosus.
El extremo anterior se encuentra en la parte superior
101

i) Agriostomum vryburgi
Esta especie (Orden Strongylida, Familia Ancylostomatidae) se localiza en el
intestino delgado de bovinos.
Los gusanos adultos (Figura 5.11) tienen una cápsula bucal que se abre
anterodorsalmente y es profunda. Posee dos pequeñas lancetas subventrales;
en el margen oral tiene cuatro pares de dientes y una corona radiada
rudimentaria.
El macho mide de 9.2 a 11 mm de longitud; sus espículas miden de 83 a 87
μm
de largo. La hembra mide de 13.5 a 15.5 mm de longitud.
Figura 5.11. Morfología del extremo anterior de adultos de
Agriostomum vryburgi.
a, vista lateral; b,
vista dorsal ( Soulsby,
1987).
j) Bunostomum spp.
Las especies de importancia veterinaria de este género (Orden Rhabditida,
Familia Ancylostomatidae), B. trigonocephalum y B. phlebotomum,
se
localizan en el intestino delgado; la primera, en el de ovinos y caprinos y la
segunda, en el de bovinos.
Los gusanos adultos (Figura 5.12) presentan una cutícula dorsal en la parte
anterior del cuerpo; la cápsula bucal es infundibular con dos semilunas
cuticulares ventrales en los márgenes. Tienen dos pequeñas lancetas cerca
del esófago y un par de lancetas subventrales en las paredes laterales de la
cápsula. Las características morfológicas de las dos especies se indicadan a
continuación:
B. trigonocephalum:
El macho mide de 12 a 17 mm de largo y sus espículas
tienen de 600 a 640 m
de longitud. La hembra mide de 19 a 26 mm de largo y
su cola tiene de 250 a 275 m
de longitud, terminando en forma redonda.
102

B. phlebotomum:
El macho mide de 10a12 mm de longitud; sus espículas
son filariformes y miden de 3.5 a 4 mm de largo. La hembra mide de 16 a 19
mm de longitud.
Figura 5.12. Características morfológicas del extremo anterior ( a)
y de la bursa copulatriz ( b)
de Bunostomum spp ( Morales 1977)
k) Gaigeria pachyscelis
Esta especie (Orden Strongylida, FamiliaAncylostomatidae) se localiza en el
intestino delgado de ovinos y caprinos.
En los gusanos adultos (Figura 5.13), la cápsula bucal contiene un amplio
cono dorsal, carece de dientes dorsales y presenta un par de lancetas
subventrales; cada una de las cuales posee varias cúspides. El macho mide
20 mm de longitud, tiene pequeños lóbulos laterales en la bursa copulatriz; las
espículas son delgadas con extremos curvados, carentes de púas; miden de
125 a 133 m
de largo. La hembra mide de 30 a 35 mm de longitud.
103

Figura 5.13.- Morfología del extremo anterior de un ejemplar
adulto de Gaigeria pachyscellis ( Soulsby,
1987).
l) Cooperia spp.
Este género pertenece al Orden Strongylida, Familia Trichostrongylidae,
contiene cuatro especies de importancia veterinaria ( C. curticei, C. oncophora,
C. pectinata y C. punctata,) que se localizan en el intestino delgado de bovinos,
ovinos y caprinos.
Los especimenes de este género (Figura 5.14) presentan estriaciones y
dilataciones en la cutícula de la parte anterior del cuerpo. Las características
morfológicas de los adultos de las especies antes mencionadas se indican a
continuación:
C. curticei:
El macho mide de 4.6 a 5.4 mm de longitud y sus espículas de
135 a 145 m
de largo. La hembra mide de 4.8 a 6.2 mm de largo; la vulva se
observa como una línea transversal en el cuarto posterior del cuerpo. El
aparato ovoyector mide de 375 a 560 m
de largo.
C. oncophora:
El macho mide de 55 . a 9mm
de largo y sus espículas de 240
a 300 m
de longitud. La hembra mide de seis a ocho mm de largo; en la región
de la vulva tiene una protuberancia y el aparato ovoyector mide 700 m
de
largo.
C. pectinata:
El macho mide siete mm de longitud y sus espículas de 210 a
260 m
de largo. La hembra mide de 75 . a 9mm
de largo.; en la vulva presenta
una proyección vesicular situada entre 1.6 y 2 mm de la parte posterior final del
cuerpo.
C. punctata:
El macho mide de 47 . a 59 . mm de largo y sus espículas de 120
a 150 m
de longitud. La hembra mide de 5.7 a 7.5 mm de largo; la vulva
presenta una elongación longitudinal y el aparato ovoyector mide de 250 a 530
m
de largo.
104

Figura 5.14. Morfología de gusanos adultos de Cooperia.
a,
Cooperia cuticei:
a1, bursa copulatriz del macho; a2,
extremo
anterior. b, espículas de machos: b1, C. curticei; b2:
C. punctata;
b3:
C. pectinata ( Soulsby,
1987).
m) Nematodirus spp.
Este género pertenece al Orden Strongylida, Familia Trichostrongylidae,
contiene cuatro especies de importancia veterinaria que se localizan en el
intestino delgado: N. spathiger y N. filicollis afectan a los bovinos y ovinos, N.
helvetianus a los bovinos y N. battus a los ovinos.
Los vermes de este género (Figura 5.15) tienen el cuerpo muy delgado y
reducido hacia el extremo anterior. La boca circular tiene un par de coronas:
una interna con seis papilas largas y una externa con seis papilas. El cuerpo
tiene 18 estriaciones longitudinales y no presenta papilas cervicales. Las
características morfológicas de las cuatro especies mencionadas se indican a
continuación:
N.
spathiger: El macho mide de 10 a 19 mm de largo. Presenta una bursa
copulatriz pequeña; las espículas miden de 700 a 1100 m
de largo y con
terminación en forma de cuchara. La hembra mide de 15 a 29 mm de largo y la
vulva está situada en el cuarto final del cuerpo.
N. helvetianus:
El macho mide de 11 a 17 mm de largo. Su bursa copulatriz
es pequeña; las espículas miden de 900 a 1250 m
de longitud. La hembra
mide de 18 a 25 mm de largo.
N. filicollis:
El macho mide de 10 a 15 mm de largo. Posee una bursa
copulatriz larga: los anillos de los lóbulos laterales son largos y alongados; las
espículas miden de 680 a 950 m
de longitud, teniendo una membrana
Terminal en forma de lanceta. La hembra mide de 15 a 20 mm de largo y su
vulva se encuentra en el último tercio posterior del cuerpo.
105

N. battus:
El macho mide de 10a13mm de largo y sus espículas de 850 a
950 m
de longitud, cuyas puntas están unidas por una membrana. La hembra
mide de 17 a 22 mm de largo.
Figura 5.15. Morfología comparativa de los extremos posteriores
de hembras ( a1 y b1) y machos ( a2 y b2)
adultos de Nematodirus
spathiger ( a) y N. battus ( b).
n) Chabertia ovina
En este género (Orden Strongylida, Familia Trichonematidae) la única
especie de importancia, Chabertia ovina,
se localiza en el intestino grueso de
bovinos, ovinos y caprinos. Este nematodo ( Figura 5.16) presenta una cápsula
bucal subglobular, carente de dientes y con dirección anteroventral, que
contiene dos pequeñas coronas. El macho y sus espículas miden de 13 a 14 y
de 1.3 a 1.7 mm de longitud, respectivamente. La hembra mide de 17 a 20 mm
de largo, su cola mide de 200 a 230 m
de longitud y la vulva se encuentra
entre 375 a 400 m
de la parte posterior.
106

Figura 5.16. Morfología de adultos de Chabertia ovina.
a,
extremo
anterior; b;
extremo posterior del macho ( Dunn,
1983).
ñ) Oesophagostomum spp.
Las tres especies importantes de este género (Orden Strongylida, Familia
Trichonematidae) se localizan en el intestino grueso: O. columbianum y O.
venulosum afectan a ovinos y caprinos; mientras que O. radiatum a bovinos.
Los gusanos de este género (Figura 5.17) se caracterizan por ser grandes y
poseer una cápsula bucal cilíndrica. La boca tiene una dirección
anteroposterior rodeada por dos coronas de hojas; en la parte anterior se
encuentra el surco cervical y la cutícula se extiende a cada lado para formar
una vesícula cefálica. Las principales características morfológicas de las
especies mencionadas, se indican a continuación:
107

Figura 5.17. Morfología del extremo anterior de adultos de tres
especies de Oesophagostomum: a, O. venulosum; b,
O.
columbianum; c, O. radiatum ( Morales,
1977).
o) Trichuris spp.
Las especies importancia veterinaria de este género (Orden Enoplida,
Familia Trichuridae), T. ovis y T. globulosa,
se localizan en el intestino grueso
de bovinos, ovinos y caprinos.
El cuerpo de los especimenes adultos se caracteriza por estar conformado
por una parte anterior muy delgada y una parte posterior gruesa; a este verme
también se le denomina “ gusano en forma de látigo”.
Las características
morfológicas de los adultos de las especies indicadas, se señalan a
continuación:
T. ovis ( Figura 5.18): El macho y su espícula miden de 50 a 60 y 4.8a6mm
de longitud, respectivamente. La cubierta de esta última está conformada por
espinas filosas. La hembra mide de 35 a 70 mm de largo; la vgina es pequeña y
se evierte hacia la vulva alargada.
T. globulosa:
El macho mide de 40 a 70 mm de longitud y su espícula es
redondeada, midiendo de 4.2 a 4.8 mm de largo. La hembra mide de 42 a 60
mm de longitud.
108

Figura 5.18. Morfología de una hembra adulta de Trichuris ovis.
El
extremo anterior se muestra en la parte inferior izquierda
p) Skrjabinema ovis
En este género (Orden Ascaridida, Familia Oxiuridae) una sola especie es
importante: Skrjabinema ovis que se localiza en el intestino grueso de ovinos y
caprinos.
Los vermes adultos de este género (Figura 19) presentan tres labios en la
boca. El macho mide de 2.3 a 3.7 mm de largo y su espícula mide de 60 a 120
m
de longitud. Estos gusanos tienen una expansión caudal casi circular,
sostenida por un par de proyecciones preanales largas. La hembra mide de 5 a
10 mm de largo y la vulva se encuentra entre 1.6 y 3.1 mm de la parte anterior.
Figura 5.19. Morfología del extremo caudal de un espécimen
adulto de Skrjabinema ovis. a, vista ventral; b,
vista lateral.
109

q) Dyctiocaulus spp.
En este género (orden Strongylida, Familia Dyctiocaulidae) dos especies
son de importancia para los rumiantes domésticos: Dyctiocaulis viviparus que
afecta bovinos y D. filaria que afecta a ovinos y caprinos. Dichos vermes se
localizan en los bronquios y bronquiolos.
Los gusanos adultos son largos, delgados y de color blanquecino; su cápsula
bucal es pequeña y presentan un pequeño anillo alrededor del extremo
posterior del cuerpo. Las características morfológicas particulares de las
especies indicadas se mencionan a continuación:
D. viviparus:
El macho mide de 17a55mm de longitud y sus espículas de
195 a 215 m;
los radios medio, lateral y posterolateral están fusionados
(Figura 5.20a). La hembra tiene una longitud de 23 a 80 mm y la vulva se
encuentra en el sexto posterior del cuerpo.
D. filaria: El macho mide de 25 a 80 mm de largo. Su bursa copulatriz es
pequeña con rayos laterales; sus espículas son cortas, iguales, robustas y
porosas, miden de 400 a 600 m
de longitud, dando el aspecto de un par de
calcetines (Figura 5.20b). La hembra es ovovivípara, mide de 43 a 112 mm de
longitud; los úteros se presentan opuestos y la vulva está cerca de la parte
media del cuerpo.
Figura 5.20. Morfología del extremo posterior del macho adulto
de Dyctiocaulus: a, D. viviparus: vista ventral; b,
D. filaria:
vista
lateral ( Dunn,
1983).
110

) Protostrongylus rufescens
En este género (Orden Strongylida, Familia Protostrongylidae) una especie
es de importancia: P. rufescens.
Se localiza en bronquios y bronquiolos de
ovinos y caprinos. Los especimenes adultos son filariformes y de color rojo. El
macho mide de 16 a 46 mm de longitud y sus espículas miden de 230 a 240 m
de largo (Figura 5.21). La hembra mide de 25 a 65 mm de longitud y la vulva se
encuentra próxima al ano.
Figura 5.21. Vista ventral de la bursa copulatriz del macho de
Protostrongylus rufescens ( Olsen,
1974).
s) Cystocaulus ocreatus
Este género (Orden Strongylida, Familia Protostrongylidae) contiene una
especie de importancia: C. ocreatus,
que se localiza en el parénquima
pulmonar, bronquiolos terminales y alvéolos de ovinos y caprinos.
Microscópicamente, los gusanos adultos tienen un aspecto filariforme. El
macho mide de 80 a 90 mm de longitud y sus espículas miden de 275 a 379 m
de largo. La hembra mide de 130 a 160 mm de largo y presenta una pre-vagina. t) Muellerius capillaris
Al igual que el género anterior, éste (Orden Strongylida, Familia
Protostrongylidae) posee una especie de importancia: M. capillaris que se
localiza en el parénquima pulmonar, bronquios terminales y alvéolos de ovinos
y caprinos.
111

Los adultos tienen un aspecto de vermes capilares. El macho tiene una
longitud de 11 a 14 mm y su extremidad posterior se encuentra enrollada con 11
o 13 vueltas; la bursa copulatriz es reducida y con espículas curvadas (Figura
22) que tienen una longitud de 140 a 160 m.
La hembra mide de 19 a 23 mm de
largo y su vulva se encuentra cerca del ano, a una distancia de entre 110 y 130
m,
próxima a la punta de la cola.
Figura 5.22. Vista lateral del extremo caudal curvo de un macho
de Muellerius capillaris ( Olsen, 1974).
E. Identificación de cestodos y trematodos
a) Moniezia spp.
Las especies de este género (Orden Anoplocephalidae, Familia
Anoplocephala) importantes para los rumiantes son dos: M. expansa y M.
benedeni,
que se localizan en el intestino delgado de bovinos, ovinos y
caprinos. Sus características morfológicas son las siguientes:
M. expansa:
Los especimenes adultos llegan a medir hasta 600 cm de largo.
El escolex mide entre 0.38 y 0.8 mm de ancho y posee cuatro ventosas
prominentes; no existe rostelo ni ganchos. Los segmentos (proglótidos) son
mas anchos que largos y las glándulas interproglotídeas están colocadas en
una línea alargada a cada lado de la línea media (Figura 5.23a).
M. benedeni:
Los cestodos adultos no pasan de los 40 cm de largo; esta
especie es similar a M. expansa; sin embargo, los proglótidos de M. benedeni
miden 26 . cm y las glándulas interproglotídeas están colocada en una fila corta
y continua en la parte media de cada proglótido (Figura 5.23b).
112

Figura 5.23. Morfología de los proglótidos de Moniezia expansa
( a) y Moniezia benedeni ( b)
b) Thysanosoma actinioides
En este género (Orden Anoplocephalidae, Familia Thysanosomidae)) sólo
una especie, T. actinioides,
es de importancia para los rumiantes domésticos.
Se localiza en los conductos biliares, conductos pancreáticos e intestino
delgado de ovinos, caprinos y, esporádicamente, de bovinos. Los cestodos
adultos miden de 15 a 30 cm de longitud (Figura 5.24).
El escólex presenta cuatro ventosas prominentes. El proglótido es más ancho
que largo (Figura 5.25) y presenta órganos reproductores dobles. Las
glándulas vitelinas están compactadas en posición caudal inmediata posterior
al ovario; existen prolongaciones largas en forma de fleco en el borde posterior
del proglótido.
113

Figura 5.24. Ejemplar adulto de Thysanosoma actinioides
colectado de los conductos biliares de un ovino. El extremo
anterior se encuentra en el lado izquierdo ( Fotografía : Carlos
Ramón Bautista Garfias) .
Figura 5.25. Morfología de un proglótido de
actinioides.
Thysanosoma
c) Paramphistomum cervi
Esta especie de la Familia Paramphistomatidae se localiza en el rumen de
bovinos, ovinos y caprinos. Los especimenes adultos ( Figura 5.26) son de
color rojo; el cuerpo es piriforme, ligeramente cóncavo en la parte ventral y
convexo en la parte dorsal. Poseen una gran ventosa posterior; miden de 5a13 mm de longitud.
114

Figura 5.26. Representación esquemática de un ejemplar adulto
de Paramphistomum cervi.
d) Dicrocoelium dendriticum
Esta especie de trematodo pertenece a la familia Docrocoellidae y se localiza
en los conductos biliares de bovinos, ovinos y caprinos.
Los gusanos adultos ( Figura 5.27) miden de 6a10mm de largo, su cuerpo es
alargado y lanceolado; es estrecho en el extremo anterior y ancho en el
posterior. Detrás de las gónadas, toda la zona central se encuentra ocupada
por las ramas transversales del útero, repleto de huevos marrones.
115

Figura 5.27. Representación esquemática de la morfología de un
espécimen adulto de Dicrocoelium dendriticum.
e) Fasciola hepatica
Esta especie de gran importancia económica en México y muchos otros
países, pertenece a la Familia Fasciolidae. Se localiza en los conductos
biliares y vesícula biliar de bovinos, ovinos y caprinos principalmente; sin
embargo, también puede afectar a otras especies entre las que se encuentra
el hombre.
El trematodo adulto (Figura 5.28) mide de 15 a 50 mm de largo y de 4 a 14
mm de ancho. El cuerpo es aplanado dorsoventralmente con forma de hoja; es
de color café y su tegumento tiene muchas espinas pequeñas; posee dos
ventosas: una oral en el extremo anterior y otra ventral; además presenta los
aparatos masculino y femenino simultáneamente.
116

Figura 5.28. Ejemplar adulto de Fasciola hepatica. ( Fotografía :
Carlos Ramón Bautista Garfias)
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120

6. Evaluación in vivo de antihelmínticos en rumiantes
David Herrera Rodríguez
A. Introducción
B. Evaluación por Conteos de Huevos en Heces
C. Prueba Crítica
D. Prueba Controlada
E. Literatura Recomendada
A. Introducción
Desde hace más de 30 años la búsqueda de nuevos antihelmínticos ha sido
una de las prioridades de las compañías farmacéuticas. Durante años, miles
de productos han sido probados buscando que algunos de ellos tuvieran
potencial antihelmíntico. Las investigaciones estuvieron destinadas al
descubrimiento de nuevos compuestos químicos con actividad antihelmíntica
y por otro lado al mejoramiento de las formulaciones de compuestos
existentes actualmente en el mercado para hacerlos mas eficientes.
Para llevar a cabo la selección de algún compuesto éste tenía que ser probado
bajo diferentes condiciones, así como sobre diferentes tipos de parásitos y
desde luego probado en diferentes especies animales, para esto se han
desarrollado diferentes pruebas.
En la actualidad son tres las pruebas con animales que se utilizan para
reconocer la actividad antihelmíntica de un producto, ya sea que dicho
producto este en vías de ser liberado al mercado o si tal producto va a ser
introducido a algún otro país, éste deberá de ser evaluado bajo las condiciones
del país, región o lugar donde se pretende sea utilizado, siguiendo para esto,
las normas que para tal efecto exigen las autoridades sanitarias de cada lugar
donde se pretenda introducirlo. Los laboratorios farmacéuticos que se dedican
a producir antihelmínticos, tienen que probar una gran cantidad de
compuestos, buscando de esta manera alguno con potencial antihelmíntico.
B. Evaluación Por Conteos de Huevos por Gramo en Heces
La primera prueba se utiliza como una prueba preliminar de escrutinio es el
conteo de huevos en las heces, en la que gran cantidad de compuestos son
utilizados, posteriormente únicamente las substancias que mostraron
evidencias de tener algún tipo de actividad antihelmíntica son probados en
animales, primero bajo condiciones de laboratorio, para posteriormente ser
probados en el campo.
De igual forma, cuando un compuesto ya esta en el mercado de algunos
países y el laboratorio productor pretende introducirlo en otros, deberá
presentar evidencia de que el compuesto funciona bajo las condiciones de ese
121

lugar, para ese efecto la prueba de conteo de huevos en heces podría ser
utilizada.
La evaluación de antihelmínticos utilizando animales como, bovinos, ovinos y
caprinos, es muy costoso debido principalmente al precio de estas especies
animales en el mercado, además de que una evaluación involucra otros
gastos como son; el uso de corrales, la alimentación de los animales,
contratación de personal para el cuidado y la limpieza de los animales, el uso
de laboratorios equipados y sobre todo la contratación de personal altamente
calificado para la realización de las pruebas que se pretendan efectuar. Es
importante hacer notar que los procedimientos técnicos que se deben utilizar
en esos estudios están referidos en los documentos publicados por la WAAPV
( Second Edition of Guidelines for Evaluating the Efficacy of Anthelmintics in
Ruminants ( Bovine, Ovine, Caprine). Veterinary Parasitology 58: 181- 213,
1995)
Se recomienda que las pruebas de campo con animales para evaluar la
efectividad de algún compuesto en particular, se utilice la formulación del
compuesto tal y como será comercializado.
Para este efecto se recomienda utilizar la prueba de Conteo de Huevos por
Gramo en heces y de ser posible usar conteos y diferenciación de larvas
infectantes. Esta prueba consiste básicamente de dos muestreos de heces
antes del tratamiento y tres después del mismo, esto es, a los 7, 14 y 21 días.
Otro aspecto importante a considerar es que se deberán tratar por lo menos
100 animales que procedan de diferentes regiones climáticas, de esta manera
se evaluarán además las variaciones medioambientales, diferentes cepas de
parásitos y diferentes prácticas de manejo y alimentación a que son sometidos
los animales
C. Prueba Crítica
Esta prueba fue diseñada por Hall y Foster en 1918, consiste el lo siguiente: un
animal infectado es tratado con un compuesto bajo experimentación,
posteriormente se procede a recolectar todas las heces eliminadas por el
animal los siguientes 3 a 4 días, estas se examinarán buscando la presencia
de parásitos. Una vez hecho esto el animal es sacrificado, colectándose y
contando todos los parásitos presentes en el tracto digestivo. La siguiente
fórmula se utiliza para calcular el porcentaje de efectividad del compuesto:
122

Donde: PE = Porcentaje de Efectividad
P
PE = -------------------- X 100
P+R
P = Número de Parásitos en Heces Postratamiento
R =Número de Parásitos encontrados en el animal después de la
necropsia
Esta prueba tiene la ventaja de que cada animal sirve como su propio testigo y
se pueden obtener resultados válidos utilizando grupos de animales en los
cuales las cargas parasitarias individuales no sean uniformes. Sin embargo,
esta prueba tiene la desventaja de que muchos de los parásitos que se
localizan en el estómago o en el intestino delgado son digeridos en su paso por
el tracto gastrointestinal, por esta razón se considera que esta prueba tiene
bastantes limitaciones cuando se usa para evaluar antihelmínticos que actúan
contra nematodos que habitan el intestino delgado y no se recomienda contra
parásitos que se localizan en el estómago. Se considera que la Prueba Crítica
da excelentes resultados cuando se utiliza para evaluar antihelmínticos que
actúan contra parásitos localizados en el intestino grueso.
D. Prueba Controlada
Esta prueba fue descrita por Moskey y Hardwood en 1941. En esta prueba los
animales destinados son divididos en dos grupos, uno de los cuales es tratado
con el compuesto bajo evaluación y el otro grupo queda como testigo sin
tratamiento. Aproximadamente 7 días después ambos grupos son sacrificados
y sus vísceras colectadas para su examen, en el cual todos los parásitos
presentes son recuperados y contados utilizando para ello un método de
dilución.
Este método consiste en lo siguiente: el abomaso, intestino delgado e intestino
grueso son colectados realizando dobles ligaduras, en el caso del abomaso en
la unión omaso-abomasal y en la unión abomaso– duodenal; para el intestino
delgado se utiliza la ligadura hecha en la región abomaso-duodenal y en la
válvula ileocecal y por último el intestino grueso se separa haciendo una
ligadura en el recto. Una vez separados cada uno de estos órganos se procede
a disectarlos siguiendo su eje longitudinal y se colecta todo su contenido en un
recipiente, aforándose luego a 1, 2, 3, 4 ó mas litros, dependiendo del volumen
que contuvieran. Una vez realizado esto se toma un 10% del volumen total, al
cual se le agregan 10 ml. de formol para preservarlo.
123

Posteriormente se inicia la revisión del contenido de cada órgano para la
colecta y identificación de todos los parásitos presentes. Los parásitos
separados del contenido son colocados en Lactofenol de Amann para
aclararlos y posteriormente son montados en portaobjetos para identificarlos
con base en sus características morfológicas.
La evaluación de la efectividad antihelmíntica del compuesto se lleva a cabo
utilizando la siguiente fórmula:
PPGT- PPGD
Efectividad = ------------------------- x 100
PPGT
Donde: PPGT = Promedio de Parásitos en el Grupo Testigo
PPGD = Promedio de Parásitos en el Grupo Tratado
Para buscar especies de parásitos que penetran la mucosa abomasal o
intestinal se procede a realizar un raspado de la mucosa de ambos órganos y
someterla a la técnica de Digestión Artificial. En el caso del intestino delgado
se separa el 10% de la longitud total del órgano, iniciando esta separación en
el duodeno. Para la identificación de la formas larvarias se emplean claves con
las características morfométricas.
Para localizar a los nematodos pulmonares adultos y colectarlos, los
pulmones se revisan siguiendo los conductos del árbol bronquial,
posteriormente, se separa una porción correspondiente al 10% del volumen
total la cual es seccionada en trozos pequeños para someterla a la técnica de
digestión artificial, buscando obtener formas inmaduras de los parásitos
pulmonares.
Animales artificialmente infectados con una cantidad conocida de parásitos
son considerados como el mejor material experimental para ser usados en
esta prueba, aunque animales naturalmente infectados, si estos provienen de
una misma área o de un mismo rancho, también son de utilidad, debiéndose
comprobar por medio de exámenes coproparasitoscópicos cuantitativos y por
la identificación de larvas en heces los géneros presentes en cada uno de lo
sujetos de experimentación. Posteriormente se formarán los grupos
aleatoriamente.
Dado que esta prueba esta diseñada para la obtención de la efectividad de
productos antihelmínticos sujetos a evaluación contra formas adultas de
nematodos gastroentéricos, se han diseñado algunas modificaciones a esta
prueba para utilizarla contra formas inmaduras. Esta es la prueba de elección
recomendada por la Asociación Mundial de los Avances en Parasitología
Veterinaria y deberá de ser utilizada para la correcta evaluación de
124

antihelmínticos especialmente aquellos de reciente introducción en el
mercado
Literatura recomendada
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Nacional De Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria. Libro
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De Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria. Libro Técnico
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Recomendations for Ovines.
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58: 181-
213.
126

7. Diagnóstico de Nematodos del Tracto Gastroentérico Resistentes a los
Antihelmínticos
Pedro Mendoza de Gives
7.1. Introducción
El uso continuo y constante de los compuestos químicos antihelmínticos para
desparasitar al ganado implica una severa presión sobre el genoma de los
parásitos quienes como parte de su proceso adaptativo natural ante
situaciones adversas, sufren cambios en su genoma para permitirle evadir el
efecto detrimental de los antihelmínticos mediante el establecimiento de
mecanismos de detoxificación (Köhler, 2001) lo que generalmente se conoce
como resistencia antihelmíntica (Montalvo et al., 2006).
Los problemas de resistencia antihelmíntica en nematodos gastrointestinales
en México han sido encontrados principalmente en ovinos (Campos, 1989,
Montalvo et al., 2006, Torres Acosta et al., 2003) y en cabras (Torres-Acosta et
al., 2005) y en bovinos en menor porcentaje ( Encalada Mena et al.,
2008;
Mendoza de Gives et al., 2010). El fenómeno de la resistencia antihelmíntica,
se ha presentado en prácticamente todo el mundo, sobre todo en rebaños
ovinos y caprinos; siendo Haemonchus contortus, Teladorsagia circumcincta y
Trichostrongylus colubriformis los principales géneros involucrados en este
proceso (Ehevarria et al., 1996; Eddi et al. , 1996). Los productos derivados de
los bencimidazoles, imidazotiazoles y lactonas macrocíclicas son los
compuestos que con mayor frecuencia sido encontrados como causantes de
este fenómeno en los parásitos además de ser las únicas familias disponibles
en la actualidad (Torres-Acosta et al., 2005; Da Silva et al.,
2007).
El problema más severo y preocupante en relación a la resistencia
antihelmíntica en los parásitos hacia diversos antihelmínticos ocurre cuando
los parásitos han desarrollado resistencia a más de un grupo de compuestos
con distinto mecanismo de acción, lo que se conoce como resistencia
antihelmíntica múltiple, en la que se corre el peligro de que los antihelmínticos
disponibles comercialmente no tengan una eficacia antihelmíntica
satisfactoria; recientes notificaciones indican la presencia de este problema en
diversos países (Zajac et al., 2000, Chandrawathani et al., 2003; Schnyder et
al., 2005, Sargison et al., 2007; Ghisi et al., 2007) poniendo en riesgo la vida de
los rebaños.
Importancia de un diagnóstico preciso y confiable de Resistencia
Antihelmíntica. Identificar la presencia de nematodos resistentes a los
antihelmínticos es una tarea difícil, pero indispensable ya que el éxito de los
tratamientos químicos antihelmínticos dependerá entre otros factores de la
susceptibilidad de los parásitos hacia el medicamento utilizado; de manera que
si un rebaño es tratado con un producto al cual los parásitos ya
desencadenaron el fenómeno de resistencia antihelmíntica, su eficacia se
127

verá reducida. El diagnóstico de resistencia en los parásitos requiere del
apoyo de técnicas específicas, ya que los nematodos no se ven a simple vista
pues se encuentran como fase adulta habitando el tracto digestivo de los
animales. Sin embargo, una forma que sugiere que los medicamentos no
están siendo efectivos contra los parásitos es identificando los signos clínicos
y el estado general de salud que guardan los animales una vez que fueron
desparasitados con los compuestos antihelmínticos seguido de las técnicas
tradicionales de diagnóstico coproparasitoscópico como la técnica de
McMaster que es la mas adecuada y que permite determinar la cantidad de
huevos de nematodos por g de heces de los animales. Para poder establecer
un programa adecuado de control y prevención de las nematodiasis
gastrointestinales de los rebaños es necesario contar con un diagnóstico
preciso del tipo de parásitos que están afectando a los animales: así como las
cargas parasitarias en los animales e información adicional sobre que
productos antihelmínticos, a que dosis y con que frecuencia se han estado
utilizando y por supuesto, para poder elegir el antihelmíntico idóneo es
necesario saber si los parásitos que afectan al ganado presentan el fenómeno
de resistencia antihelmíntica hacia este u otros compuestos antihelmínticos
disponibles.
7.2. Modos de acción de los antihelmínticos
El modo de acción de los antihelmínticos es variable y en algunos casos poco
conocido. Las lactonas macrocíclicas (ej. ivermectinas y milbemicinas)
ejercen su efecto antihelmíntico produciendo parálisis de las fibras
musculares de los nematodos y bloqueando el movimiento faríngeo, por lo
cual el nematodo muere de inanición (Geary et al.,
1993;
Martín, 1996; Koetze,
1998).
Esto es debido a la acción de la ivermectina en los receptores de los
canales de glutamato de cloro (GluCl) el cual es un receptor celular (Cully et al.,
1996, Vassilatis et al.,
1997).
Al unirse la ivermectina al receptor incrementa los
niveles de polarización de la membrana y bloquea la repolarización, causando
parálisis muscular y desprendimiento del nematodo (Cully et al.,
1994;
Cheeseman et al.,
2001).
Otro grupo de compuestos de gran importancia como antihelmínticos son los
imidazotiazoles, que han sido clasificados como agonistas nicotínicos que
ejercen su efecto sobre el sistema nervioso de nematodos (Evans & Martín,
1996). La superficie del soma de los nematodos cuenta con múltiples
receptores nicotínicos específicos para el neurotransmisor acetil colina
(nAchR), los cuales se activan ante la acción de los imidazotiazoles. La unión
de los imidazotiazoles a los nAchR despolariza la membrana y causa parálisis
espástica del músculo del nematodo, el cual es posteriormente expulsado
(Martín, 1996, Martín et al., 1998).
Por otro lado, se encuentra el grupo de los bencimidazoles que ha recibido
mayor atención debido a que es un grupo antihelmíntico de amplio efecto
128

contra nematodos gastroentéricos en pequeños rumiantes. Estos compuestos
basan su acción antihelmíntica a nivel utra-estructural de las células somáticas
de nematodos ( Borgers y De Nollin, 1975).
El resultado de la acción de estos
compuestos se manifiesta por la pérdida de la polimerización de los
microtúbulos citoplasmáticos, específicamente actúan sobre la subunidad
proteínica - tubulina ( Friedman y Platzer, 1978;
Lacey, 1988; Sackett y Varma,
1993).
La acción de la droga sobre la ß-tubulina es inhibir su desdoblamiento,
evitando así la unión de otras moléculas de tubulina (Sackett y Varma, 1993).
Asimismo, Jasmer et al. , (2000) sugieren que la ausencia de -tubulina inhibe el
transporte de vesículas secretoras, liberando así las enzimas responsables del
daño tisular en NGE.
7.3. Métodos de diagnóstico de Resistencia antihelmíntica
Existe una variedad de pruebas de diagnóstico de resistencia antihelmíntica
que han sido desarrolladas por diversos autores con resultados variables, por
lo que se ha propuesto buscar una manera de homogeneizar los métodos de
detección de este fenómeno en los parásitos basados en estándares
internacionales (Coles et al., 2006). Hasta ahora, el método más ampliamente
utilizado a nivel mundial a nivel de campo para determinar la presencia de
resistencia antihelmíntica en nematodos, es la reducción de la cuenta de
huevos fecales, conocida por sus siglas en inglés como FECRT (Faecal Egg
Count Reduction Test). Existen otros sistemas de evaluación de la resistencia
antihelmíntica en nematodos; Yendo desde métodos sencillos con rangos
variables de sensibilidad, hasta algunos más sofisticados incluyendo algunas
pruebas moleculares altamente sensibles pero con algunas limitantes como
los altos costos (Coles et al., 2006). A continuación se hace una breve reseña
de dichos métodos:
7.3.1. Método de reducción de la cuenta de huevos fecales (FECRT)
Este método está avalado por la Asociación Mundial para Avances en la
Parasitología Veterinaria ( WAAVP) y se fundamenta en la diferencia que existe
entre las medias aritméticas del número de huevos eliminados en las heces de
grupos control y tratados en el segundo muestreo (después del
tratamiento) ( Coles et al., 1992, 2006). Esta técnica es aplicable a la evaluación
de la resistencia en nematodos hacia cualquier antihelmíntico de amplio
espectro de los tres grupos disponibles actualmente en el mercado. Para esta
prueba se forma aleatoriamente un grupo homogéneo de aproximadamente 15
animales (ovinos y cabras) infectados en forma natural con nematodos
parásitos del tracto gastrointestinal, previo diagnóstico coproparasitoscópico.
Se recomienda que se seleccionen animales jóvenes de entre3a6meses de
edad de preferencia que hayan nacido en la propiedad o en la zona en donde la
prueba será llevada a cabo. Se recomienda que las cargas de huevos se
encuentren arriba de los 150 huevos por g de heces ( hpg). Los animales no
deben haber sido tratados en las pasadas 8 a 12 semanas. Debe haber un
129

grupo control sin tratar para permitir conocer los cambios naturales en las
cuentas de huevos durante la prueba ( Jabbar et al., 2006). Un mínimo de 5
gramos de heces deberán ser colectados directamente del recto de cada
animal. Las muestras deben ser puestas en recipientes individuales sellados y
ser enviados rápidamente al laboratorio para el conteo de huevos. Si las
muestras restantes de heces son requeridas para la elaboración de cultivos
para la obtención e identificación de especies de estadios larvarios las
muestras no deben ser almacenadas a 4 C ya que puede afectar la eclosión de
algunas especies como Haemonchus contortus.
Si el promedio de la cuenta de
huevos por grupo se encuentra por debajo de 150 hpg, el objetivo de la
evaluación de la resistencia no será confiable. El conteo promedio del hpg por
debajo de 150 puede ser común en ovinos adultos. En cuanto a los
tratamientos se recomienda que los animales sean tratados con un
antihelmíntico de acuerdo a las indicaciones y dosis recomendaciones por el
fabricante de acuerdo a la dosis en miligramos por k de peso (para propósitos
de investigación) o de acuerdo al peso de los animales más pesados del grupo
(para diagnóstico veterinario). Las muestras deben ser colectadas de 10 a 14
días después del tratamiento (Coles et al., 1992) ; aunque esto dependerá del
grupo de antihelmíntico que se vaya a evaluar. Por ejemplo, si se va a evaluar
Levamisol, se recomienda tomar la segunda muestra entre los 3 y los 7 días
postratamiento; aunque algunos autores recomiendan y justifican
ampliamente que la muestra de heces sea tomada después del día 7
(Grimshaw et al., 1996). Para el caso de derivados de Benzimidazoles entre 8 y
10 días y si se trata de Lactonas macrocíclicas entre 14 y 17 días (Coles et al.,
2006).
Asimismo, se recomienda llevar a cabo el conteo de huevos por g de heces
mediante una técnica de McMaster modificada en la que se pesan e g de heces
en un recipiente adecuado. Se agregan 42 mL de agua y se hunden por un
período de entre unos minutos y una hora hasta que las heces de
reblandezcan. Se lleva a cabo una homogeneización usando un agitador o una
cuchara hasta romper los péllets de heces. Tan pronto como sea después de
haber tomado las muestras, el material es tamizado en una coladera de 100
mallas (abertura de 0.15 mm) en un tamiz de 20 cm de diámetro en un vaso o un
recipiente equivalente. El líquido restante se mezcla y se vierten 15 ml en un
tubo de centrífuga de 17 ml. Se centrifuga durante 2 minutos a 300Xg
(Aproximadamente 1500 rpm) en una centrífuga convencional y se succiona o
se decanta suavemente el sobrenadante. Se agita el tubo para aflojar el
sedimento, luego se adiciona una solución saturada de cloruro de sodio hasta
dar el mismo volumen anterior (15 mL). El tubo se deberá invertir cinco o seis
veces e inmediatamente tomar una muestra con una pipeta Pasteur y llenar la
cámara de McMaster. Repetir el proceso de inversión y llenar la segunda
cámara de McMaster. Los huevos son contados utilizando un microscopio de
luz con el objetivo 40X por debajo de la primer laminilla que conforma la cámara
de McMaster justo debajo de la graduación (en donde existe un volumen de 0.3
ml). Se multiplica el número de huevos dentro de los canales marcados para tal
130

efecto por 50 para dar el número de huevos en la muestra fecal. Para una
mayor sensibilidad en el conteo se puede contar todos los huevos presentes
en cada cámara (volumen total 1 mL y multiplicar por 15 para obtener el
numero de huevos por g de heces) (Coles et al., 1992).
Para una información más detallada de estas técnicas se recomienda
consultar las guías para evaluación de la eficacia antihelmíntica que pueden
ser adoptadas para investigar la resistencia antihelmíntica (Wood et al., 1995;
Duncan et al., 2002)
. Una limitante en el uso de esta técnica es que la cantidad
de huevos en las heces muchas veces no correlaciona con la carga parasitaria
en los animales ya que solo las hembras maduras producen los huevos y los
machos y hembras jóvenes inmaduras quedan excluidos de tal estimación
(Jabbar et al., 2006).
Para poder interpretar los datos obtenidos se recomienda calcular la media
aritmética, el porcentaje de reducción y el intervalo de confianza 95%. La
media aritmética es preferible que la media geométrica, ya que es más fácil de
calcular, provee de una mejor estimación de la eliminación de huevos por los
parásitos, además de ser una medida más conservadora de la eficacia
antihelmíntica. La fórmula para calcular el porcentaje de reducción es:
% Reducción = 100(1-Xt/Xc);
Donde: t corresponde al conteo de huevos del grupo tratado a los 10 a 14 días,
y c corresponde al conteo de huevos del grupo control a los 10 a 14 días.
El uso de un programa RESO es de gran utilidad para analizar los datos. La
resistencia está presente si: 1) el porcentaje de reducción en el conteo de
huevos es menor del 95%: y 2) si el conteo resulta menor que 90%, a una
confiabilidad del 95%. Si solo uno de los dos criterios se presenta se considera
como sospechoso. Aunque este criterio parece válido para Benzimidazoles e
Ivermectina en todos los países y para Levamisol en Australia, bajo
condiciones del Reino Unido las condiciones para la resistencia al levamisole
han sido indicadas por la prueba FECRTen campo, pero no confirmadas en
laboratorio (Coles et al., 1992).
7.3.2. Método in vitro para detección de huevos de nematodos
resistentes a los antihelmínticos
La realización de un método in vitro para evaluar resistencia antihelmíntica,
tiene grandes ventajas ya que es un método sencillo de llevar a cabo, es muy
económico y no requiere de animales, ni el espacio para alojarlos. López
Arellano, 2004, presenta un interesante capítulo donde habla de esta
metodología como se describe a continuación: Este método esta indicado
para evaluar la presencia de resistencia en nematodos hacia los
antihelmínticos pertenecientes a los grupos 1 (Benzimidazoles) y 2
(Imidazotiazoles ie., Levamisole). Esta prueba se basa en la actividad de los
compuestos antihelmínticos para detener la eclosión de los huevos de los
131

nematodos. Hay varias maneras de llevar a cabo esta prueba. Una manera
sencilla para evaluar la resistencia de huevos de Haemonchus contortus a
Bencimidazoles, tomando como ejemplo al Tiabendazol, consiste en exponer
huevos del parásito a la acción antihelmíntica del compuesto a diversas
concentraciones mediante la realización de diluciones dobles, ejemplo:
0.1562, 0.0781, 0.0390, 0.0195, 0.0097, 0.0048, 0.0024, 0.0012, 0.0006 y
-1
0.0003 mgml . Para disolver el Tiabendazol, se recomienda utilizar 15 l de
ácido clorhídrico para un volumen final de 5 ml. Se utilizan placas de cultivo
celular de 24 pozos (NUNC), en donde se colocan tres repeticiones de 480 l de
las diferentes concentraciones de tiabendazol. En cada concentración se
colocan en promedio 100 huevos en un volumen de 20 l, posteriormente las
placas son incubadas a 27 C durante 24 h. Asimismo, cada dilución debe
incluir un testigo bajo las mismas condiciones que el grupo tratado, pero sin
antihelmíntico. La inhibición del desarrollo embrionario se lleva a cabo con
yodo al 2%. Posteriormente, se realiza el conteo de huevos o de larvas
eclosionadas, para su posterior análisis estadístico.
Los resultados obtenidos serán analizados mediante un análisis
Probit (Programa Polo-PC), el cual proporciona la Dosis Letal 50 ( DL50)
necesaria para obtener el Índice de Resistencia (IR). Se entiende por IR como
el número de veces que se requiere aumentar la DL50 obtenida de la cepa
susceptible, para producir los mismos efectos en la cepa resistente. El IR se
obtiene al aplicar la siguiente formula:
IR =
DL 50 de la cepa resistencia.__
DL 50 de la cepa susceptible.
Los resultados serán considerados como porcentaje de desarrollo
embrionario y se deberán graficar tomando como eje de las “x” a las diferentes
concentraciones del antihelmíntico, y “y”, a los porcentajes de desarrollo
embrionario (Figura 7. 1 y 7.2).
132

Figura 7.1. Porcentaje de desarrollo de huevos de H.
contortus resistentes a Bencimidazoles.
Figura 7. 2. Porcentaje de evolución de huevos de H.
contortus susceptibles a Bencimidazoles.
133

Interpretación de la prueba
En la Figura 7.1, se puede apreciar que a partir de la concentración 0.004, el
porcentaje de desarrollo embrionario se eleva considerablemente, dando un
resultado positivo a resistencia antihelmíntica. En la gráfica 2, por el contrario,
se aprecia que solo hasta una concentración muy baja 0.0006, la curva
ligeramente se eleva, dando un resultado negativo a esta prueba (López
Arellano, 2004).
Otra manera de realizar la prueba es utilizando placas de microtitulación de 48
pozos. Las drogas pueden ser diluidas en DMSO (Dimetil Sulfóxido). El
número de huevos embrionados y larvas eclosionadas se cuentan bajo el
microscopio. Es necesario, estimar una dosis discriminatoria más que calcular
una dosis Letal , con lo que la sensibilidad de la prueba puede ser
50
sustancialmente mejorada y ofrece una estimación cuantitativa del porcentaje
de huevos resistentes en las muestras fecales. La dosis discriminatoria es
aquella que mata al 99% de los huevos susceptibles con lo que los huevos que
logran eclosionar a esta dosis son considerados resistentes (Coles et al.,
2006). De forma similar a la prueba anterior, los resultados se obtienen al
comparar los promedios de eclosión de huevos en una serie de placas
tratadas con el producto a evaluar, con respecto a un control similar, sin recibir
el antihelmíntico para ser considerado como control de comparación. Por otro
lado, a pesar de que la estimación de una dosis discriminatoria aumenta la
sensibilidad y simplifica la prueba, esta no es confiable para detectar
resistencia a Lactonas Macrocíclicas en nematodos de bovinos y ovinos ya
que los radios de resistencia son muy pequeños (Gopal et al., 1999).
7.3.3. Prueba controlada in vivo
Esta prueba es la más confiable y exacta para confirmar la presencia de
resistencia antihelmíntica. El protocolo recomendado como guía para evaluar
la eficacia de compuestos antihelmínticos publicado por la W.A. AVP . . ., puede
ser utilizado y adaptado para determinar la resistencia antihelmíntica (Wood et
al., 1995; Duncan et al., 2002).
Esta prueba se sustenta en una comparación
de la población parasitaria de parásitos adultos y larvas en hipobiósis entre
dos grupos de animales, uno tratado con el antihelmíntico a evaluar a las dosis
terapéuticas recomendadas por el fabricante y otro con un placebo, sin el
antihelmíntico. Los resultados son obtenidos a través del sacrificio de los
animales de ambos grupos para la obtención y cuantificación tanto de larvas
en hipobiósis, dentro de la mucosa gástrica, como de parásitos adultos en los
diferentes compartimentos gástricos. Los resultados son considerados con
base en la comparación de las medias aritméticas entre ambos grupos. Para
poder llevar a cabo esta prueba se requiere la utilización de animales,
alimentación y un espacio para alojarlos; así como de personal para el manejo
y cuidados de los animales, lo que significa una gran limitante desde el punto
de vista económico.
134

7.3.4 Métodos moleculares para diagnóstico de resistencia
Los mecanismos moleculares responsables de la resistencia antihelmíntica
hacia los diferentes compuestos antihelmínticos han sido poco estudiados y
únicamente se ha descrito la técnica en detalle para diagnóstico de resistencia
a Benzimidazoles, como el mecanismo para levamisole/ Pyrantel y la
resistencia a Lactonas macrocíclicas permanece sin dilucidar. La utilización de
herramientas moleculares como PCR en tiempo real y el análisis de
Pyrosecuenciación para el diagnóstico de pequeñas mutaciones causantes
de la resistencia antihelmíntica, hasta ahora no han sido desarrolladas
satisfactoriamente. La manera en que hasta ahora se puede realizar una
prueba molecular de resistencia antihelmíntica en nematodos hacia los
compuestos mencionados, se basa en la utilización de ADN proveniente una
mezcla de larvas con lo que se podría obtener una prueba de resistencia de
manera rutinaria, de otra manera evaluar la resistencia en un numero
representativo de estadios únicos es demasiado costoso y no se justifica tal
gasto.
7.3.4.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La sensibilidad de la técnica molecular de RT-PCR (Transcripción Reversa -
en Cadena de la Polimerasa) se recomienda para detectar RA a los
bencimidazoles en H. contortus. Se recomienda utilizar larvas infectantes L3
sin vaina, las cuales serán conservadas a – 70C hasta su uso. El DNA deberá
ser extraído con base en el protocolo (anexo 1).Las muestras serán
amplificadas iniciando con 4 min a 94C. seguida por un ciclo de 40 a 94C por
30 sec, el alineamiento se realizará a 57C
por 30 sec y la extensión se realizará
a 72C por un min. El paso final se realizará a 72C
por 5 min. La presencia de
DNA será confirmada por geles de agarosa al 1%
con bromuro de etidio. La
aplicación de esta técnica a nivel comercial estará sujeta a un estudio previo
sobre aspectos económicos de la técnica con respecto a los beneficios
esperados, considerando los altos costos del equipo especializado para llevar
a cabo las pruebas moleculares correspondientes (LópezArellano, 2004)
Anexo 1
Preparación de DNA genómico de H. contortus usando una
microcentrífuga
Preparación de la muestra
1. Pesar hasta 20 mg de la muestra de tejido y colocarla en un tubo de
microcentrifuga de 1.5 ml
2. Adicionar 274 l de Solución de Digestión de la Mezcla Master a cada
tubo
135

3. Incubar la muestra del tubo toda la noche (16-18 horas ) en 55C en un
bloque de temperatura
4. Adicionar 250 l de Wizard SV Lisis Buffer a cada muestra. Vortexear
5. Procesar el lisado tan rápido como sea posible después, adicionando
Buffer Lisis. Si congela a -70C el lisado debería de descongelar y
calentar a 55C por una hora previo procesamiento. El lisado debe
estar tibio para procesar previo procesamiento. El lisado debe estar
tibio para procesar
Purificación de ADN genómico del Lisado usando Microcentrifuga
6. Transferir cada muestra lisada del tubo de 1.5 ml a una mini columna
separada de Wisard SV MinicolumAssemly
7. Centrifugar rápido el ensamblado a 13,000 xg por 3 minutos
8. Eliminar la mini columna del ensamblado y descartar el liquido en el
tubo colector
9. Adicionar 650 l Wisard SV Wash Solution (con 95% de etanol
adicionado) para cada ensamblado. Centrifugar a 13,000 xg por 1
minuto. Descartar el líquido desde el tubo colector. Repetir este paso
para un total de cuatro lavados
10. Descartar el liquido desde el tubo colector y re-ensamblar la mini
columna ensamblada. Centrifugar por 2 minutos a 13, 000 xg para
secar la matriz unida
11. Transferir la Wizard SV Minicolumn a un tubo nuevo de 15 . ml.
Adicionar de 50 a 100 l a temperatura ambiente
12. Centrifugar la mini columna. Eluir el tubo ensamblado a 13,000xg por
1 minuto. No descartar el líquido eluído del tubo.
13. Adicionar de 50 a 100 l adicionales de Agua libre de nucleasas e
incubar a temperatura ambiente por 2 minutos. Centrifugar el tubo
ensamblado de la mini columna/eluida 13,000xg por 2 minutos.
14. Remover la mini columna y conservar el DNA purificado de -20C a -
70C
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140

8. Hematología Diagnóstica
JesúsAntonio Álvarez Martínez
Carmen Rojas Martínez
A.- Introducción
La sangre tiene el propósito de proveer a las células del cuerpo de agua,
oxigeno, electrolitos, nutrientes y hormonas; al mismo tiempo, la sangre recibe
los productos de desecho para transportarlos a los órganos de excreción
( Reece 2009).
Por otra parte, la sangre puede alojar a diversos parásitos de los géneros:
Babesia spp. Theileria spp. Eperythrozoon spp. además de rickettsias como
Anaplasma spp. ( Khan et al., 2004; Al- Khalifa et al.,
2009).
B.-Toma y conservación de sangre
El sistema vacutainer es ideal para la obtención de una muestra de sangre en
pequeños y grandes rumiantes. El sistema consiste en un tubo de vidrio con
tapón del cual se ha evacuado el aire, lo que permite la captación de un
volumen adecuado de sangre para un estudio rutinario. En caso de dificultarse
su disponibilidad, es suficiente el uso de agujas y jeringas desechables. El sitio
de punción debe estar limpio y los instrumentos de extracción es necesario
que sean estériles.
La sangre puede obtenerse de capilares o de venas; si es de capilar el sitio
más usual de sangrado es la oreja o la punta de la cola. Para ello se debe
emplear aguja de calibre del núm. 18, o bien, algún estilete desechable. La
sangre venosa es la muestra más común que se obtiene y la técnica de
muestreo varía de acuerdo con la especie animal.
La vena yugular en los rumiantes es la más usada cuando se dispone de
equipo vacutainer; la aguja se introduce a lo largo de la vena; también se
puede obtener la muestra con una aguja de calibre 16-18 y aplicando una
ligera succión con la jeringa. En bovinos los vasos caudales de tipo venoso o
arterial, también son frecuentemente usados. Para esto, se alza la cola del
animal y se clava la aguja de calibre 18 en la línea media. Dentro del manejo de
la muestra se debe considerar el tipo de instrumento utilizado para la
extracción de la sangre. Si se utilizó una jeringa con aguja de pequeño calibre,
está última debe quitarse antes de expulsar la sangre, evitando con esto la
hemólisis de la muestra. Desde el momento de la toma, la muestra debe estar
bien identificada y se requiere mantenerla en hielo o en refrigeración pero
nunca en congelación.
Cuando en el muestreo se empleen anticoagulantes, el recipiente debe
agitarse suavemente para homogenizar su distribución si es liquido, o para
disolverlo si esta como sal.
141

Los movimientos bruscos provocan la ruptura de las células rojas,
especialmente con animales lipémicos.
En estudios de rutina se debe incluir un procedimiento definido con pruebas
completas que lleven un tiempo razonable.
Se considera aceptable la siguiente secuencia:
1.- Preparación del frotis (Houwden 2000)
2.- Determinación del valor del hematocrito (NCCLS 2000; Bull y Hay 2001)
3.- Tinción del frotis (Houwden 2000)
4.- Determinar la concentración de hemoglobina
5.- Biometría: conteo de glóbulos rojos y blancos
6.- Determinación de proteínas plasmáticas con un refractómetro manual
(George 2001)
7.- Conteo diferencial de leucocitos (Tvedten y Korcal 1996)
C.- Suero y plasma
El suero es el líquido de color paja claro que se separa de la sangre coagulada;
se obtiene colectando sangre en un frasco o tubo de vidrio limpio y seco. Es
ventajoso colocar de costado el recipiente colector inmediatamente después
de la toma de la sangre, con el objeto de ofrecer una mayor superficie de
liberación de suero. Al presentarse la retracción del coágulo se libera el suero,
que se recupera por decantación; generalmente no se requiere la
centrifugación. El proceso puede acelerarse manteniendo el frasco o tubo con
la muestra en un baño María a 37 °C durante 1-2 horas.
En ocasiones se requiere clasificar el suero, para ello se puede centrifugar a
800 x g durante 15 min. Luego, el suero se decanta o se retira con una pipeta y
para su conservación requiere mantenerse en congelación hasta su uso.
El plasma es una porción que tiene las proteínas que existen en el suero, que
mantiene a los factores de la coagulación como el fibrinógeno y la protrombina.
El volumen de plasma generalmente excede el 50% de la sangre general.
Las muestras de plasma requieren una adecuada conservación, debido a que
las células continúan su metabolismo. Como ejemplo se puede citar a la
glucosa que es utilizada por las células y los electrolitos que se difunden en el
plasma al referirse las células. Por estas razones, la sangre entera requiere
combinarse con una sustancia anticoagulante que se selecciona de acuerdo
con el tipo de análisis propuesto. La muestra de sangre completa no se altera
en 24 horas si es refrigerada (Vahdat et al.1979).
D.- Anticoagulantes
Son sustancias que se emplean para suprimir o retardar la coagulación de la
sangre; puede actuar in vivo o in vitro,
o en ambos casos como ocurre con la
heparina. Los anticoagulantes pueden ser usados en forma cristalina o en
forma de líquidos son de uso común los oxalatos, el citrato de sodio, las sales
di potásicas o di sódicas de etilendiaminotetraacetico (EDTA), y la heparina
(Jones 1985a, 1985b: Mohri et al. 2007). Los tres primeros actúan ligando
142

iones de calcio que normalmente se requieren en el mecanismo del coágulo; la
heparina previene la coagulación interfiriendo con la conversión de la
protrombina en trombina y con la acción de la trombina sobre el fibrinógeno.
Los oxalatos se han reemplazado por el EDTA en estudios de la morfología de
los elementos sanguíneos. Los oxalatos producen artefactos en los leucocitos
debido a esto los frotis deben realizarse a pocos minutos de que la sangre se
mezcle con el anticoagulante; los artefactos son cristales de oxalato
fagocitados por los neutrófilos y causa cambios en la morfología de los núcleos
en los linfocitos.
Una combinación de 0.8 g de oxalato de potasio y 1.2 g de oxalato de amonio
disuelto en 100 mL de agua destilada, es un anticoagulante balanceado. Esta
combinación es usada a razón de 0.1mL por cada mL de sangre.
El citrato de sodio se usa como anticoagulante a una parte en solución acuosa
al 3.8% en nueve partes de sangre; es decir al 10%. Esta solución es muy útil
en transfusiones. La heparina es un anticoagulante natural que se produce en
varios tejidos, pero se encuentra en forma abundante en el hígado. Esta
sustancia no altera excesivamente el volumen de los eritrocitos, sin embargo,
no es recomendable si se van a hacer los frotis porque las células se tornan
azulosas con la solución de Wright; también interfiere con las determinaciones
de fibrinógeno, y sólo retardan la coagulación más no la evita. Comúnmente se
usa en solución al 1% por lo que a una concentración de 0.1 mL previene la
coagulación de 5.0 ml de sangre.
El EDTA denominado también como secuestreno o verseno, es el preferido
para estudios morfológicos de la sangre; puede ser usado como sal di sódica o
potásica, esta última es la más soluble. Generalmente el EDTA se usa a una
concentración de 1.0-2.0 mg/ml de sangre. La refrigeración de la muestra con
EDTA es apropiada para determinar el volumen celular, hemoglobina, y conteo
de células hasta por más de 24 horas pos-colección. Comercialmente existen
tubos para sangrado que contienen ya este anticoagulante.
Este procedimiento consiste en extender sobre un portaobjetos una gota
pequeña de sangre en una sola capa, evitando la superposición de células. La
técnica comprende (Houwden 2000):
- Colocar una gota de sangre (2-3 l) en un portaobjetos limpio,
desengrasado y seco.
- Hacer contacto con otro portaobjetos con la gota de sangre.
- Inclinar en un ángulo de 30-45 grados, para que por capilaridad se
extienda en el borde que toca la gota.
- Deslizar de un sólo impulso al portaobjetos inclinado desde el sitio
dónde se coloca la muestra hasta el lado opuesto
- Secar la sangre para lo cual se ondea rápidamente el portaobjetos al
aire en una corriente de aire tibio.
- El secado deficiente ocasiona lisis de los eritrocitos.
- secado deficiente ocasiona lisis de los eritrocitos.
- Aplicar la coloración deseada.
143

Cuando se considera que los parásitos de interés son escasos, se realiza un
frotis grueso, en caso contrario se recomienda el frotis delgado.
La elección de los colorantes y métodos de tinción dependerá de la
disponibilidad de los mismos, los más usuales son las soluciones de Giemsa y
Wright.
E.- Frotis
Este procedimiento consiste en extender sobre un portaobjetos una gota
pequeña de sangre en una sola capa, evitando la superposición de células. La
técnica comprende (Houwden 2000):
- Colocar una gota de sangre (2-3 l) en un portaobjetos limpio,
desengrasado y seco.
- Hacer contacto con otro portaobjetos con la gota de sangre.
- Inclinar en un ángulo de 30-45 grados, para que por capilaridad se
extienda en el borde que toca la gota.
- Deslizar de un sólo impulso al portaobjetos inclinado desde el sitio
dónde se coloca la muestra hasta el lado opuesto
- Secar la sangre para lo cual se ondea rápidamente el portaobjetos al
aire en una corriente de aire tibio.
- El secado deficiente ocasiona lisis de los eritrocitos.
- secado deficiente ocasiona lisis de los eritrocitos.
- Aplicar la coloración deseada.
Cuando se considera que los parásitos de interés son escasos, se realiza
un frotis grueso, en caso contrario se recomienda el frotis delgado.
La elección de los colorantes y métodos de tinción dependerá de la
disponibilidad de los mismos, los más usuales son las soluciones de
Giemsa y Wright.
F.- Tinción de Wright (Clark, 1981; Hematology, 1993)
Este colorante es azul de metileno policromado con bicarbonato de sodio y con
agregado de eosina, esta última se combina y resulta un compuesto
precipitado es el colorante de Wright en polvo.
Se emplea en forma concentrada, lo que hace que sea un método rápido. Esta
tinción es recomendable para el trabajo rutinario como es el conteo diferencial
de leucocitos.
La tinción estándar de Wright se prepara con 0.1g de polvo de colorante
disuelto en 60 ml de alcohol metílico libre de acetona y de acido acético. La
solución se coloca en un frasco ámbar y se mantiene en reposo durante 2 a 4
semanas. Se hace pasar por un papel filtro antes de su uso. El añejamiento del
colorante puede ser a 37C.
La tinción comprende:
- Fijar el frotis con alcohol metílico durante 2a3min
- Preparar 4 ml de la solución colorante con 6 ml de agua destilada
- con la mezcla resultante cubrir al frotis
144

- El colorante diluido se deja actuar durante 4 min
- Lavar con agua corriente y secar
G.- Tinción de Giemsa (Clark, 1981; Hematology, 1993)
Se usa para identificar parásitos en la sangre; este colorante esta formado a
base de Eosina y azul de metileno. El procedimiento es muy sencillo y
comprende:
- Fijar el frotis con alcohol metílico durante 2-3 min.
- El colorante líquido se diluye al 10% en agua destilada y dejar actuar en
el frotis durante 15-30 min.
- Se lava con agua corriente y se seca al aire.
H.-Diagnóstico de parásitos sanguíneos
El diagnóstico de parásitos puede ser de tipo directo o indirecto. El primero
comprende la observación de las manifestaciones clínicas de la enfermedad
de interés, y la confirmación depende de la identificación del parásito en la
sangre. Sin embargo, es importante la forma indirecta de diagnóstico mediante
la determinación de anticuerpos séricos circulantes, para lo cual se emplean
técnicas como la fijación de complemento (FC) la prueba de
inmunofluorescencia indirecta (IFI), hemoaglutinación pasiva (HA), el ensayo
inmunoenzimático (ELISA), etc.
El diagnóstico directo tiene la desventaja de que se recomienda casi
exclusivamente durante la fase clínica de la enfermedad, de manera que se
dificulta el reconocimiento de los animales portadores sanos. Por otra parte las
pruebas serológicas permiten su fácil identificación, como ocurre con la
prueba de FC en la anaplasmosis bovina, o con la técnica de
inmunofluorescencia indirecta (IFI) en la babesiosis bovina.
I.-Identificación directa de parásitos sanguíneos
La toma de sangre de la vena yugular o de la vena caudal, no es satisfactoria
excepto en la presentación clínica de la enfermedad, debido a que se diluye la
presencia de las células infectadas. La sangre periférica obtenida de los
capilares de la oreja o de la punta de la cola, son mejores porque existe mayor
concentración de células infectadas. La localización de estas últimas se facilita
revisando a lo largo de los bordes del frotis esto sucede así porque la mayor
densidad de las células infectadas permite ubicarlas en esos sitios. Para la
determinación de anticuerpos se requiere el suero; a partir de éste se trabajan
las pruebas pertinentes o disponibles en los laboratorios de diagnóstico.
a) Babesiosis
Esta enfermedad se caracteriza por anemia hemolítica, fiebre, hemoglobinuria
y en ocasiones la muerte de los animales. El género causal es típico de los
145

protozoarios, poseen localización intraeritrocítica (Kuttler, 1988; Homer et al.,
2000; Bock et al. 2004).
El diagnostico directo no es posible en la forma crónica, cuando se presenta la
enfermedad los eritrocitos infectados tienen una gravidez especifica menor
que los eritrocitos maduros no infectados; estos últimos tienden a ser más
grandes. Las células infectadas se acumulan preferentemente en la periferia
del frotis. Para el diagnóstico se recomienda la toma de muestras de los
capilares de la oreja y se tiñen los frotis dando una especial atención ala
búsqueda de los parásitos. Puede prepararse un frotis grueso y teñirlo con
Giemsa; en este caso los eritrocitos son lisados liberando el protozoario
infectado (OIE, 2008).
En nuestro país las especies reconocidas son Babesia bovis y Babesia
bigemina (McElwain et al. 1988), miden aproximadamente entre 3-6 m,
respectivamente. La morfología presenta variaciones, pero son típicos los
pares en forma de pera unidos; se pueden encontrar formas redondas, ovales
o irregulares. La B. bovis ocupa una situación marginal en los eritrocitos,
mientras que B. bigemina ocupa casi dos terceras partes de los eritrocitos
(Figura 8.1).
Figura 8.1. Merozoitos de
trofozoitos de B. bigemina
Babesia bovis y merozoitos y
b) Theileriosis
Es una enfermedad causada por protozoarios que se localizan en la sangre
del rumiante, específicamente en bovinos, ovinos y caprinos; es una
enfermedad importante en la costa del Este en EE.UU. y en África Central se
ha reportado en bovinos y en venados (Hall y Baylis 1993; Trees 1999).
Los parásitos se multiplican en linfocitos y de ahí invaden a los eritrocitos. En
general, en los frotis teñidos se encuentran cuerpos semejantes a
piroplasmas, su tamaño es de 2 m
y aparecen como peras, anillos o en
formas de comas (Bishop et al. 2004; Brown 2008).
146

c) Tripanosomiasis
Esta enfermedad es causada por un grupo de parásitos cuyo aspecto es de
una hoja alargada con un flagelo característico; tiene un solo núcleo sencillo;
el flagelo se extiende del extremo posterior hasta el agudo extremo anterior
(Osorio et al., 2008). Regularmente se ven en los frotis entre las células, nunca
dentro de ellas. En EE.UU. y Canadá se han identificado especies no
patógenas como Trypanosoma theileri (Schlafer, 1979). Algunos
tripanosomas son más fácilmente identificables por frotis en punción de
nódulos linfáticos y es posible aislarlos in vitro a partir de sangre periférica
(Verloo et al. 2000).
d) Eperythrozoonosis
Es una enfermedad típicamente latente en el ganado. No se encuentra en los
eritrocitos sino sobre ellos, así como en el plasma entre las células; causan
anemia por destrucción de glóbulos rojos. Se han identificado en Argelia,
Francia, Estados Unidos y otros países. La especie reconocida en los bovinos
es E. wenyoni (Smith et al. 1990); en ovinos era E. ovis (Ichijo et al. 1982); sin
embargo, posteriormente se determinó que esta última especies es en
realidad un micoplasma por lo que se propuso reclasificarlo como
Mycoplasma ovis comb. nov. (Neimark et al. 2004).
Teñidos con Giemsa aparecen con las células como cuerpos de color rosado
purpúreo, la mayoría en forma de anillo, otros son ovales, o en forma de coma
miden de 0.3-1.5 mm de diámetro.
Pueden contarse de 1-50 o más parásitos en una sola célula (Kreier y Ristic
1963; Gothe y Kreier 1977; Kreier y Ristic 1984).
e) Hemobartonelosis
Es una enfermedad causada por Haemobartonella bovis;
su patogenicidad es
dudosa. Se presentan formas cocales, bacilares o cuerpos irregulares, a
veces en gran número en un sólo eritrocito (Gothe y Kreier 1977; Kreier y Ristic
1984).
147

f) Anaplasmosis
En México, se ha identificado únicamente al Anaplasma marginale (Figura
8.2) organismo que se caracteriza por ocasionar anemia progresiva mas
severa en animales adultos que en animales jóvenes; esporádicamente
causa la muerte (Cossio Bayúgar et al. 1997). Su distribución es más amplia
debido a que puede ser transmitida por una diversidad de artrópodos, como
tábanos, moscas, mosquitos y garrapatas; además por el uso de instrumentos
contaminados como agujas hipodérmicas usadas en las desparasitaciones
(Bautista, 1996; Corona et al. 2004).
Figura 8.2. Anaplasma marginale (cuerpos iniciales)
148

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151

9. Diagnóstico inmunológico y molecular de las principales helmintiasis
en rumiantes
María Eugenia LópezArellano.
9.1. Introducción
La gran diversidad de agentes patógenos como virus, bacterias, hongos y
parásitos, afectan severamente la salud de animales salvajes y domésticos,
perjudicando el entorno ambiental y productivo (International Federation for
Animal Health, 2005). Además, cierto número de patógenos, cuyo habitat son
los animales domésticos, representan importantes focos de transmisión de
enfermedades hacia el hombre (FoodAgriculture Organization, 2005).
Por décadas, el control de patógenos se ha realizado a través de productos
químicos, con efectividad letal alrededor del 100%. Sin embargo, el
incremento de resistencia a los antibióticos y antiparasitarios ha disminuido la
eficacia de los mismos, dificultando el control de patógenos en las últimas
décadas. Por ejemplo, organismos altamente patógenos como son
Staphylococcus aureu, microorganismo que produce una enterotoxina
bacteriana que afecta a seres humanos, y que se localiza en productos de
origen animal; Candida albicans, hongo endógeno que afecta a seres humanos,
y Haemonchus contortus, nematodo hematófago de rumiantes, ambos
patógenos altamente frecuentes (Kato et al., 1996, Montlavo et al.,
2006).
El problema de resistencia a productos químicos se puede observar en forma
unilateral, hacia una sal activa, o múltiple, contra más de un sal activa. Ambos
tipos de resistencia han incrementado mucho en los últimos años, causando
severos problemas de salud animal, por ejemplo, en Sudáfrica, la pérdida de
efectividad antihelmíntica de contra diferentes géneros de nematodos
gastrointestinales ( ngi)
de rumiantes debido a resistencia múltiple provocó la
quiebra económica de varios ovinocultores (Van Wyk, 2002). Otro ejemplo
muy importantes es el caso del protozoario que afecta a humanos, Plasmodium
falciparum,
el cual desarrolló resistencia hacia el fármaco cloroquina,
incrementado el riesgo de muerte en humanos. Asimismo, ambos casos han
mostrado mecanismos de detoxificación en el sitio de acción, la membrana
celular de patógenos tolerantes al fármaco, debido a mutaciones genéticas,
heredables e irreversibles (Wernsdorfer, 1979, Kwa et al.,
1983).
La interacción biológica entre hospedero y microorganismo es un importante
factor a conocer en las diversas áreas de estudio involucradas en la
producción y previo al diagnóstico. El conocimiento de aspectos biológicos
relevantes de patógenos y de los mecanismos de acción durante la infección,
podrían favorecer la aplicación de medidas correctivas para evitar y/o
controlar el agente en estudio. En el área veterinaria los estudios de
diagnóstico molecular han aportado conocimiento para la detección de
resistencia a los antiparasitarios. Nematodos en rumiantes como los ngi y
152

pulmonares Dictyocaulus spp, Haemonchus spp, Ostertagia sp y Teladorsargia sp,
presentan diferentes mecanismos para tolerar la acción tóxica de los
derivados de las principales familias de antihelmínticos, como son
bencimidazoles, lactonas macrocíclicas e imidazotiazoles (Khöler 2001,
Molento et al., 2006).
Los mecanismos genéticos de resistencia antihelmíntica se deben a
mutaciones en los sitios de acción en ngi (Khöler, 2001). En caso de los
derivados de los bencimidazoles, su acción es sobre las células epiteliales del
intestino, específicamente por inhibir la polimerización de los monómeros -
tubulina en los isotipos 1-2, los cuales forman parte de la base estructural de
los microtúbulos que conforman el soporte de la membrana célular.Al inhibirse
la polimerización por acción de los bencimidazoles, la función de absorción de
los nutrientes se afecta en los nematodos, causando la muerte por falta de
alimento. En caso de la las lactonas macrocícliclas, los mecanismos genéticos
son variables y en algunos casos poco conocido. Uno de los mecanismos es
por la acción de lactonas sobre los canales de glutamato de cloro (GluCl), los
cuales son receptores celulares. Al unirse las lactonas al receptor,
incrementan los niveles de polarización de la membrana y bloquea la repolarización,
causando parálisis muscular y desprendimiento del nematodo.
Los imidazotiazoles son reconocidos como agonistas nicotínicos debido a
que tienen efecto sobre el sistema nervioso de nematodos. La superficie del
soma de los nematodos cuenta con múltiples receptores nicotínicos
específicos para el neurotransmisor acetil colina (nAchR), los cuales se
activan ante la acción de los imidazotiazoles. La unión de los imidazotiazoles a
los nAchR despolariza la membrana y causa parálisis espástica del músculo
del nematodo, el cual es posteriormente expulsado (Khöler, 2001).
Los estudios anteriores, aportan importantes datos para realizar el
diagnóstico de helmintos (ej. nematodos) para aplicar el tratamiento
adecuado, previendo la pérdida animal y disminución de la producción
zootécnica. En particular, los rumiantes domésticos de regiones tropicales y
templadas son altamente susceptibles a ngi y pulmonares (ngiyp), trematodos
y cestodos. Además, la mayoría de los helmintos han desarrollado
mecanismos de adaptación al hospedero para sobrevivir al ambiente que los
rodea. Morfológicamente, las fases infectantes de ngiyp conservan una
cubierta de queratina que los protege de condiciones climatológicas
extremas, temperatura mayor de 35 C y menor a 9 C (Ashman et al., 1995).
Por otro lado, los trematodos y cestodos son organismos con ciclo indirecto, el
cual requiere de hospederos intermediarios, por ello también es necesario
conocer el entorno de los parásitos, así como las condiciones ambientales que
favorecen su desarrollo (Soulsby, 1987).
El diagnóstico de laboratorio es una herramienta para definir el agente causal
y el proceso de la enfermedad en animales relacionados a estudios de
vigilancia epidemiológica, medidas preventivas como son evitar
153

contaminación por helmintos en productos de origen animal (leche, carne), y
finalmente el diagnóstico podría ser incluido en la vigilancia de importación y
exportación de animales, esto último para prevenir la entrada de nuevos
géneros de helmintos resistentes a los antihelmínticos (Shallig et al., 1994,
Dalton et al., 2003, Montalvo et al., 2006). Por otro lado, la información
generada en el diagnóstico parasitológico, inmunológico y molecular son
fuente de apoyo en las diferentes áreas de estudio dirigidos hacia la
prevención y control de helmintos. Sin embargo, es necesario identificar
previamente el problema a resolver y establecer estrategias de trabajo que se
adapten a las condiciones de laboratorio, estudio e incluso a la aplicación de
control en campo.
Lo más importante del diagnóstico en área de helmintología es el material
biológico, la forma de obtención, conservación y procesamiento del mismo, lo
cual asegura calidad y durabilidad. Se sugiere realizar el diagnóstico con base
al previo conocimiento de patógenos con objeto de optimizar tiempo y equipo
de laboratorio, así como disminuir el manejo del germoplasma.
A continuación se describen las principales tecnologías empleadas en el
diagnóstico inmunológico y de biología molecular relacionado a las
helmintiasis en rumiantes domésticos.
9.2. TÉCNICAS EN INMUNOLOGÍA
9.2.1. OBTENCIÓN DE ANTÍGENOS
Los estadios infectantes y adultos son usados comúnmente en el diagnóstico
de helmintos. El primer paso para la preparación de antígenos es la colecta del
mismo. Las soluciones amortiguadores de fosfatos con pH neutro y (SSAF,
Anexo 1) soluciones bacteriostáticas como 0.1% de azida de sodio son
recomendadas. La conservación de muestras a 4C, se usa con objeto de
evitar la desnaturalización del material. Asimismo, el uso de material estéril,
refrigeradores y congeladores y espectrofotómetro se emplean para la
preparación y determinación del mismo. A continuación se ejemplifica la
obtención de tres diferentes tipos de productos metabólicos,
excreción/secreción, superficie y de membrana aplicados a Haemonchus spp
(nematodo), Fasciola hepatica (trematodo) y Moniezia (cestodo).
EXTRACTO CRUDO Ó SOMÁTICO: El extracto crudo (EC) de los helmintos
esta conformado por moléculas de queratina, lípidos, carbohidratos y
proteínas, que los protegen y les aportan energía. Previo a su uso, se debe
lavar el germoplasma en SSAF, pH 7.2 y antibiótico (Anexo 1). Los parásitos
serán macerados en mortero a4C,sonicador, estallamiento osmótico, etc.,
conteniendo SSAF y detergentes que ayuden a solubilizar proteínas de
membrana como son: 0.1 a 1% de Triton X-100 y 0.1%-2% de 3-[(3-
Cholamidopropyl) dimethylamino]-1-propanesulphonate (CHAPS). Se
154

ecomienda usar inhibidores enzimáticos a 0.1mM phenilmethilsulfonil fluoride
ó 1 mM de N-tosyl-L-lysine chloromethyl ketone disueltos en Isopropanol.
Macerar la muestra, procurando no generar calor, centrifugar a 3000 y 10,000
rpm a 4C por 10 min. La obtención de proteínas se deberá realizar de 20,000 a
100,000 rpm por 30 min a 4C y conservar el sobrenadante a –70C (Gamble &
Mansfield, 1992; Munn et al.,
1993; Lopez de Mendoza, 1999).
El perfil de proteínas se podrá observar en geles de poliacrilamida (SDS-
PAGE), la concentración del gel variará entre 4-6% para el superior y de 8 a 15
% para el inferior (Anexo 1) dependiendo de cada laboratorio.
ANTÍGENOS DE SUPERFICIE: Las moléculas de superficie (S) de
nematodos parásitos en rumiantes son claves para iniciar la interacción
hospedero-parásito. Existen numerosas moléculas que conforman a la
superficie de helmintos son: epidermis, mesodermis e hipodermis. Los
productos de S son obtenidos principalmente de los diversos estadios
infectantes de los helmintos se realiza por el uso de sustancias químicas
eliminadas por la mayoría de helmintos, y por sustancias propias del
hospedero. Por ejemplo, la adición in vitro de pH acido (2 a 4) o tripsina, los
cuales simulan el pH en abomaso de rumiantes, cerdo y humanos,
contribuyendo a la liberación de las capas superficiales de los nematodos
Haemonchus spp y Trichinella spp y del trematodo, Schistosoma spp liberando así
las moléculas de S que podrían ser empleadas como antígenos (Lopez de
Mendoza et al.
2000).
Los antígenos de S podrán ser colectados usando los siguientes agentes
solubles:
1. Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) a concentración de 0.25% al
0.5%
2. 10 mM 2-mercaptoethanol y sodium
3. Duodecyl sulphate (SDS) al 0.1%,
Se disuelve el agente soluble en SSAF pH 7 por un periodo de 2 a 12 h a 37C.
En caso de las larvas infectantes (L 3)
de Haemonchus sp,
estas serán incubadas
a 37 C por 4 h con 0.1% de CTAB. La muestra se podrá dializar para concentrar
y eliminar el agente reductor. Posteriormente, se realizará la centrifugación de
20,000 a 50,000 rpm a 4C por 30 min. El sobrenadante se colectara y se
conservara a -70C hasta su uso (Cox et al., 1989). Se recomienda concentrar
la muestra, utilizando membrana de diálisis* ó poly-ethilene glycol ó tubos
concentradores de proteínas (diferentes marcas, por ejemplo Millipore) a 4C y
centrifugación.
*NOTA: EL TAMAÑO DE PORO DE LA MEMBRANA DEPENDERÁ DEL
PESO MOLECULAR DE LAPROTEÍNA
155

EXCRECIÓN/SECRECIÓN: Los productos de excreción/secreción (ES) son
moléculas de diferente tamaño y origen, generadas durante el metabolismo de
los helmintos, así como también por liberación de las proteínas localizadas en
diferentes estructuras de los helmintos, por ejemplo, el lumen intestinal. Se
6
sugiere usar 2x10 estadios infectivos recién colectados ò2gdeadultos.
Previamente, los parásitos serán tratados con antibiótico-antimicótico (Anexo
1) e incubados con una mezcla de SSAF pH 7.2, 5-methoxy-N,N dimethyl
tryptamine (DMT, estimula las secreción de esófago) y antibiótico/antimicótico
(Anexo 1). Los organismos serán incubados a 25C por 16 h y posteriormente
centrifugados a 10,000 a 100,000 rpma4C.Elsobrenadante se conservará a –
70C hasta su uso (Curtis, 1996, Lopez de Mendoza et al.,
1999)
.
9.2.2 PROCEDIMIENTOS
La metodología para realizar el diagnostico inmunológico ha tenido gran
avance debido a la inclusión de antígenos recombinantes, anticuerpos
monoclonales, células del sistema inmune marcadas con fluoróforos, etc. Así
como también a la nueva generación de equipo utilizado en proteómica. En el
mercado existen diversos y variados productos para perfeccionar y facilitar las
metodologías mas empleadas, sin embargo, el área de diagnóstico en
parasitología veterinaria aun no es completamente atendida y por ello requiere
de establecer metodologías en laboratorio. Se deberá de considerar que las
técnicas de diagnóstico requieren de ensayos y previos a su aplicación.
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD. Las técnicas de diagnóstico requieren
confiabilidad, por ello es recomendable determinar la sensibilidad y
especificidad de las mismas.
a) La prueba proporciona resultados positivos, cuando el individuo es
verdaderamente positivo a la enfermedad al detectar la respuesta a través de la
siguiente fórmula:
Sensibilidad: Animales con la enfermedad positivos a la prueba
Total de animales con la enfermedad
x 100
b) Especificidad es la seguridad que tiene la técnica para detectar
anticuerpos contra un antígeno específico y se determina por la siguiente
fórmula:
Especificidad: Número de animales negativos a la enfermedad a la prueba x 100
Número de animales sin la enfermedad
A continuación se describen las técnicas de diagnóstico más usadas en el área
de helmintología Pecuaria:
156

9.2.2.1. INMUNODIFUSIÓN SIMPLE/DOBLE EN AGAR:
Es el equilibrio
molecular que se observa en la interacción antígeno-anticuerpo sobre
una delgada malla de gel. Ambas muestras son atraídas por afinidad
iónica, lo cual tiende a precipitar las moléculas cuando se encuentran en
medio isotónico.
a. La reacción se detecta en 0.75% de agarosa diluida en 0.85% de
solución salina en placas Petri de 10 cm de diámetro ó sobre
portaobjetos nuevos.
b. Procedimiento: Distribuir la agarosa en la placa/portaobjetos a
temperatura de 18C, evitando burbujas y permitir que enfríe por
15 min a temperatura ambiente (TA). Formación 6 pozos de 10 x
20 mm de diámetro; uno en el centro y 5 alrededor. Una muestra
se coloca en el centro para que migre pasivamente hasta
interaccionar con la muestra heteróloga correspondiente,
entonces se llevara a cabo la precipitación
9.2.2.2. ELECTROFORESIS Y WESTERN BLOT.
Se conoce como
electroforesis al movimiento de partículas cargadas bajo la influencia de
un campo eléctrico. Las moléculas que componen los antígenos son de
diferente tamaño y presentan diferente carga neta, por lo cual la
velocidad de migración depende de factores como pH, concentración
del medio, temperatura e intensidad del campo eléctrico (Laemli, 1970).
Algunos ejemplos son: inmunoelectroforesis y electroforesis en geles de
poliacrilamida con agentes reductores cono el sodium duodecyl
sulphate (SDS-PAGE), (Munn et al., 1987; Roitt et al,
1996).
9.2.2.3. SDS-PAGE y WESTERN BLOT t. La detección de la reacción
antígeno-anticuerpo en SDS-PAGE, tiene diversas aplicaciones, como
es la determinación del perfil y transferencia de proteínas o moléculas
de ácidos nucleicos. Al transferirse el patrón de proteínas del gel de
SDS-PAGE a membrana de nitrocelulosa (NC) se denominará Western
blot, siguiendo el principio de carga iónica. Transferidas las moléculas,
se podría realizar la inmuno-electrotransferencia para detección de la
interacción antígenos-anticuerpo. El Anexo 1 muestra la preparación de
soluciones comúnmente usadas. A continuación se describen
generalidades del procedimiento:
* Utilizar de 40 a 60 μg de proteína contenida en 50 μL
*El tiempo de separación en mini-geles y transferencia es de 60 a 90
min a 25C. En caso de utilizar geles de mayor tamaño, separar
proteínas por 12 h/ 4C.
*Incubar la membrana de NC con el anticuerpo primario por 30 a 60
min. Realizar de 3 a 5 lavados con SSAF y Tween al 1%, y adicionar el
segundo anticuerpo marcado con una enzima (peroxidasa o alacalinfosfatasa)
durante 45 min. En caso de rumiantes, utilizar dilución
157

1:3000 y para animales de laboratorio 1:1000. El reconocimiento de la
interacción antígeno-anticuerpo, se realizará directamente por
quimioluminiscencia o por adición de un cromógeno enzimático
especifico (Anexo 1)
9.2.2.4 ANÁLISIS INDIRECTO DE LA ENZIMA LIGADA A UN
INMUNOABSORBENTE INERTE (ELISA). Debido a su alto grado de
sensibilidad y especificidad la técnica de ELISA es confiable y de uso
común. La técnica de ELISA cuenta con otras variedades para su uso
en campo como son la técnica de Difusión en gel-ELISA (DIG-ELISA)
en caja Petri y técnica en papel de nitrocelulosa, (ELISA-punto) DOT-
ELISA. VerAnexo para la preparación de solución.
9.2.2.5 DIFUSIÓN EN GEL-ELISA (DIG-ELISA). Adicionar 10 ml de antígeno
(10 μg por ml) e incubar por 12 h a TA con buffer pH 9.6. Posterior a
cada paso, lavar 3 veces con 15 ml de SSAFT. Posteriormente, el agar
bacteriológico (1%) con leche descremada se vierte formando una
delgada capa (0.5mm) de agar sobre la caja Petri de 10 cm. dejar
melificar por 10 min. Realizar perforaciones homogéneas sobre el agar
de 3 mm aproximadamente y adicionar el suero primario y sueros
controles sin diluir por 12 h a TA. Posteriormente, incubar con
peroxidasa a 1:3000 y 1:2000 de conejo anti-ovino IgG (uso comercial)
para H. contortus y F. hepatica,
respectivamente. Después de los
lavados, agregar agarosa al 0.75% en solución de citrato pH 5.0,
mezclando con el sustrato, OPD ó ABTS a TA. Los resultados de
lectura se realizarán 20 min después, con una regla transparente,
medir el diámetro de los círculos amarrillo-naranja. (Bautista et al.,
1989)
9.2.2.6 ELISA Indirecta en placas de 96 pozos.
La reacción se realiza en
placa de polystirene de 96 pozos. La concentración seleccionada de
antígeno de extracto/crudo de H. contortus o de D. viviparus es de 2μg a
5μg de proteína por ml, respectivamente. Adsorber el antígeno a la
placa con solución de carbonato pH 9.6 ó por 12 h a 4C ó con SSAF pH
7 por 2 h a 37C. La interacción primaria antígeno-anticuerpo 1:100 se
realizara por 2h a TA y el conjugado se incuba por 45 min a la misma
dilución que en DIG-ELISA. La reacción se observará entre 10 y 45 min
después de adicionar el sustrato enzimático, leer en espectrofotómetro
(405 nm, utilizandoABTS) para placas de ELISA.
9.2.2.7.DOT-ELISA. El ensayo inmunoenzimático se realizará en papel de
0.45 de nitrocelulosa. La técnica se puede realizar en círculos de 5 mm
ó en tiras de papel de 10 mm x 2 cm. El tiempo de incubación para cada
paso en DOT-ELISA es de 30 min. Se adiciona 10 μl de proteína pura o
a concentración de 30μg por ml. Lavar extensivamente y colocar la
solución de bloqueo (ver Anexo 1), la cual puede cubrir todo el papel ó
solo el sitio donde se coloco la muestra. Posteriormente, colocar 10 μl
158

de suero, aproximadamente y dejan secar por 30 min para
despuéslavar y agregar el sustrato, DAB (Anexo 1).
9.2.2.8 Inmunofluorescencia indirecta (IFI) y directa (IFD) . En nematodos,
la técnica de IFI es ampliamente usada en estudios y diagnóstico de
inmunolocalización, son muy practicas y relativamente de fácil uso.
IFI:
Se pueden emplear estadios vivos o fijados en parafina/resina (Ej. L1
de Trichinella spiralis, L3-L4de H. contortus). La larva viva se conserva a 25C y
equivale al antígeno, el cual será expuesto al suero, concentrado o diluido (1:
100 – 1:1000) de 15 min a 12 h. Posterior a cada paso, se realizaran lavados
con SSAF y 0.1 Tween-20 en tubos de 1.8 ml o placas de 24 pozos. El
conjugado con fluoróforos (isothiocyanate de fluoresceína, PK) podrán ser
usados para evaluar muestras de conejo anti-ovino/bovinos en rango de 1:100
a 1:1000 por 45 min. Envolver con aluminio la muestra en estudio. Leer la
muestra en un microscopio de florescencia a longitud de onda requerida por el
filtro. Ej. fluoresceína a 490 nm (Lopez de Mendoza et al.,
2000; Lopez-
Arellano et al. , 2002).
IFD.
Las secciones del helminto en estudio podrán ser fijadas con
paraformaldehído al 2% por 3 h a 25C, seguido de rehidratación con etanol con
rango de 10% al 100% por 30 min. También, se podrá usar resina comercial,
siguiendo las instrucciones del fabricante (ej. 2-hydroxyethyl methacrylate). La
parafina líquida de uso histológico es muy recomendable. Al agregar la
parafina y los nematodos, se sumergen en nitrógeno líquido por segundos
para agrupar a los parásitos. Las muestras agrupadas se podrán conservar a -
20C hasta su uso. Posteriormente, se podrán realizar cortes histológicos de
2.5 μm a 10 μm de grosor. El procedimiento para inmunofluorescencia directa
se deberá realizar en similar forma a la técnica de IFI, pero utilizando
directamente el marcador fluorescente.
9.2.2.9. Inmunofluorescencia (IF) para detección de lípidos.
Se sugiere
usar 50 estadios en fase infectante (L3, metacercaria) de Trichinella/
Haemonchus/ Fasciola/ Moniezia,
etc. Los lípidos de superficie serán
activados durante 15 a 45 min en soluciones de fosfatos pH
acido/alcalino o tripsina. Posteriormente, la muestra se marca con
conjugado fluorescente para lípidos como es el FITC-cationized
ferritin (Molecular Probes, Oregon, USA), el cual se usa para marcar
sitios aniónicos, ó usar otras pruebas aniónicas como AF18 y PKH26.
Al terminar, lavar la muestra con SSAF pH 7 para equilibrar y fijarla en
portaobjetos para leer. (Lopez de Mendoza et al.,
2000)
El uso de controles negativos y positivos, son necesarios para detectar
auto-fluorescencia y no dar falsos positivos o negativos.
159

9.3. TÉCNICAS MOLECULARES
La tecnología para el estudio y detección de ácidos nucleicos ha tenido gran
impacto en muchas áreas de parasitología, incluyendo la identificación de
modelos, como es el nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans (9.9 Mb) y el
nematodo hematófago, Haemonchus spp (60 Mb), así como parásitos que
afectan animales y humanos como los trematodos Schistosoma spp y F. hepatica
(270 Mb) (Sanger Institute, www.sanger.ac.uk; TIGR database, www.tigr.org;
Genome Biology, genomebiology.com). La secuenciación total de éstos
patógenos han apoyado el estudios filogenéticos, ejemplo C. elegans,
con el
cual se ha permitido determinar importantes mecanismos de virulencia en
nematodos similares a los que se observan en géneros de la familia
Trichostrongylidae (Dressen et al ., 2004 ).
Diversas técnicas han sido aplicadas a helmintos, entre las principales están:
hibridación de ácidos nucleicos, clonación, secuenciación de DNA, reacción
en cadena de la polimeraza (PCR). En particular, la aplicación de la técnica de
PCR (Saiki et al., 1985; Mullis et al.,
1986) ha revolucionado la investigación y
se ha encontrado que el PCR tiene amplia aplicabilidad, debido principalmente
a la sensibilidad, la cual permite la implicación de genes o fragmentos de los
mismos a partir de una mínima cantidad de material biológico. El método de
extracción de los ácidos nucleicos (DNA/RNA) es muy importante porque nos
garantiza la pureza, confiabilidad de resultados y conservación de mismos
(Peña et al., 1994, Gómez et al.,
1997).
Por otro lado, podría ser difícil obtener ADN/RNA en cantidades suficientes y
puros, provenientes de algunos estadios de helmintos, debido a la cutícula de
queratina que los conforman (Dawkins & Spencer, 1989) y a múltiples
substancias que precipitan los ácidos nucleicos durante el proceso de
aislamiento (Simposon et al., 1982; McManus et al.,
1985), lo cual inhibe la
subsecuente amplificación enzimática. Por ello, el uso de tratamientos con
SDS y proteinasa K, seguido por la extracción de fenol/cloroformo y
precipitación con etanol son reactivos usados para solventar dicho problema
(Passer et al.,
1993). Asimismo, un amplio rango de mini-columnas para la
purificación de ácidos nucleicos está actualmente disponible en el mercado,
por lo que ahora es posible obtener diferentes tipos de DNA/RNA provenientes
de helmintos con mayor confiabilidad de resultados.
A continuación se describen algunos ejemplos de los métodos moleculares
para el diagnóstico en helmintos, iniciando con la obtención de DNA
genómico de H. contortus,
la cual podría ser aplicad a otros helmintos. La
preparación de soluciones se podrá observar en el Anexo 2
160

9.3.1. EXTRACCIÓN DE ADN
1. UTILIZAR 5,000 larvas (L 3/L 4) ó adultos (1-20) de H. contortus
a. Macerar en mortero estéril a 4C
b. Romper la integridad de larvas por choque con nitrógeno
liquido
2. HOMOGENIZAR la muestra utilizar con 10 ml de solución de
extracción y 100 μg por ml de PROTEINAZA K, incubar a 45C la
muestra por 12 h en un tubo estéril
3. AGREGAR un volumen equivalente de FENOL/ CLOROFORMO/
ALCOHOL ISOAMÍLICO (24:25:1 v/v) agitar la muestra manualmente
y con cuidado por 10 min
4. CENTRIFUGAR la muestra a 3000 rpm durante 10 a 15 min a 4C
5. SEPARAR la muestra en tres fases: Fase blanquecina que se localiza
en la parte inferior (correspondiente al fenol-cloroformo); fase
intermedia, transparente y fase acuosa en la parte superior, dónde
permanece el DNA.
6. TRANSFERIR cuidadosamente la fase acuosa/superior a un tubo
limpio, cuidando de no tomar la interfase
7. HACER de 2 a 3 extracciones similares, hasta observar un color
transparente.
8. PRECIPITAR el DNA al adicionar dos volúmenes de etanol absoluto,
dejar a -20C toda la noche
9. CENTRIFUGAR la muestra en tubos estériles de 1.8 ml a 14 rpm por
60 min a 4C para que precipite el DNA. El DNA precipitado es difícil de
observar, se podría ver un botón traslúcido en el lado lateral del tubo, el
sobrenadante se elimina. También se podría no ver y perderlo, por lo
cual debe de tener cuidado al decantar.
10. LAVAR el botón de DNA con 0.5 ml de etanol al 70% agitar 10 min
manualmente de manera suave hasta obtener una emulsión completa
11. CENTRIFUGAR a 14 000 rpm por 10 min a 4C
12. SECAR el pellet a TAen la campana de flujo laminar por 30 min
13. RESUSPENDER en agua libre de DNA/RNAasa e incubar 10 min a 55
C
14. Conservar a -70C ó en nitrógeno líquido hasta su uso.
9.3.2. EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS DE TEJIDO UTILIZANDO
REACTIVOS COMERCIALES
La extracción de tejido de larva y adulto DE H. contortus se ha realizado
a través de reactivos comerciales, los cuales, son productos
confiables en su mayoría para su uso. Asimismo, se sugiere que el
investigador/académico y estudiante seleccione el que mejor
procedimiento que se adapte a sus condiciones de trabajo. Asimismo,
las adaptaciones de los métodos de trabajo dependerán del equipo en
laboratorio.
161

1. EJEMPLO: EXTRACCIÓN DNA/RNA UTILIZANDO TRIZOL
(INVITROGEN)
a. Agregar 1 ml de Trizol por 0.2 a 0.4 g (larva) de H. contortus. En
caso de utilizar adultos se sugiere de 1 a 5 helmintos.
b. Homogenizar: Incubar 5 min a temperatura ambiente (TA)
c. Agregar 200 μl de cloroformo por cada ml de Trizol
d. Agitar vigorosamente e incubar de 2 a 3 min a TA
e. Centrifugar a 12,0000 rpm por 10 min a 4C
er
f. Separación de RNA/DNA/Proteínas en la 1ª, 2ª., y 3 fase,
respectivamente
i. RNA
1. Adicionar 1 ml de isopropanol, agitar
2. Centrifugar a 12,000 rpm por 10 min a 4C
3. Eliminar sobrenadante y lavar el paquete de
RNA en 1 ml de etanol al 100% y secar el
RNA
4. Re-suspender el RNA en 20 μl de agua libre
de DNA/RNAasa
ii. DNA
1. Transferir el DNAa otro tubo
2. Agregar 1 ml de etanol al 100% y agitar
3. Centrifugar a 5000 rpm por 5 min a 4C
4. Lavar la pastilla con 1 ml de etanol al 75%
5. Centrifugar a 7500 rpm por 5 min a 4C
6. Lavar la pastilla con etanol al 100%, secar el
DNA
7. Re-suspender el DNA en 20 l de agua libre de
DNA/RNAasa
A continuación se describen algunas de las principales soluciones empleadas
en Inmunología y Biología Molecular.
DETERMINACIÓN ESPECTROFOMÉTRICA DE LA CONCENTRACIÓN DE
INICIADORES ( PRIMERS)
Usar los iniciadores a un volumen final de 0.2 μM (200 nM) de los iniciadores
(nmoles)
1.
Para obtener la solución stock se disuelve el contenido del primer
liofilizado a 200 μM, posteriormente el stock se diluye 1:10.
162

2.
3.
Para obtener 20 μM se recomienda utilizar 2 μl para 100 μl de
reacción para finalmente tener 0.2 μM
La fórmula empleada requiere de la nM de los iniciadores (nmoles)
-6 -9
200 μM = 200 x 10 moles = nmoles x 10 nmoles
1000 x ml
-9
Donde: xml = ( nmoles x 10 moles) (1000 ml)
-6
200 x 10 moles
200 μM x ml = nmoles/200
Multiplicar los nanomoles del primer x 5 (es una constante) para
obtener la cantidad de agua en microlitros
nM x x (5) = 200 μM
Ej:60nMx5=300μldeagua
DETERMINACIÓN ESPECTROFOMÉTRICA DE ADN
La concentración de DNA se determina a 260 y 280 nm de una dilución
previamente establecida. La cantidad de ADN dependerá del total de ADN
colectado, en caso de estadios infectivos de helmintos se utilizan diluciones
que van de
- 1:100 a 1:200 y en caso de evaluar el ADN genómica de los hospedero
infectados se recomienda una dilución 1:40.
- Determinar la absorbancia de la dilución a 260 /280 nm. La lectura de
260 permite calcular la concentración de DNA en la muestra teniendo
en cuenta que 1 unidad de densidad óptica (OD) corresponde a 50 μg
por ml para ADN de doble cadena. La relación de la lectura a 260 nm
entre la lectura a 280 nm (OD 260/OD 280)
de un estimado de pureza de la
muestra de ADN. Preparaciones puras de ADN tienen valores > 1.8. Si
hay contaminación con fenol ó proteínas el valor de la OD es
significativamente menor que 1.8 y no es posible determinar con
exactitud la concentración de DNAen la muestra.
Concentración deADN =Ax f dilución x 50
Donde:A= absorbancia
f = factor de dilución
9.3.3. Descripción de la metodología para el diagnóstico de alelos
específicos asociados a la resistencia al grupo de bencimidazoles por
técnica de Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR)
Se empleará un paquete de 0.2 ml de L3 de nematodos sin vaina y la extracción
de ADN se realizará como se describe a continuación: 300 l de buffer de
extracción (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 5mg/ml de proteinaza K) se
mezclará con las L 3,
las cuales serán incubadas a 4C durante toda la noche.
Posteriormente, la proteinaza K se inactivará por incubación a 95C por 20 min,
163

seguida por 15 min en congelación antes de su uso. Las condiciones óptimas
de PCR se establecerán con base en la metodología descrita por Silvestre &
Humbert (2000), Sambrook et al.,(1989) y Elard et al.,
(1998) . Se mezclará 7 l
de larvas digeridas, 1 U de Taq polimeraza, 2.5 ul de buffer 10x, 1 mM de
MgCl 2,
0.1 de dNTP y 18 pmol de cada iniciador. Las muestras serán
amplificadas iniciando con 4 min a 94C. seguida por un ciclo de 40 a 94C por 30
sec, el alineamiento se realizará a 57C por 30 sec y la extensión se realizará a
72C por un min. El paso final se realizará a 72C por 5 min. La presencia deADN
será confirmada por geles de agarosa al 1% con bromuro de etidio.
Los geles de agarosa serán preparados como se describe a continuación:
BUFFER TAE (10X)
40mM Tris-Acetato
1 mM EDTA, pH 8.0
1.- Disolver 48.4 g de Tris base en 800 mL de agua bidestilada (bd).
2.- Agregar 11.4 mL de Ácido acético glacial y 50 mL de EDTA (200 mM, pH
8.0).
3.- Aforar a1L.
EDTA 200 mM
a) Disolver 37.22 g de EDTA (ácido etilendiaminotetracético) en
400 mL de agua bi-destilada.
b) Ajustar a pH 8.0
c) Aforar a 500 ml
Preparación de geles de agarosa
1.- Pesar:
Gel 1%
Gel 1.5%
0.30 g deAgarosa
0.45 g deAgarosa
2.-Adicionar laAgarosa a 30 mL de Buffer TAE (1X)
3.- Disolver en horno de microondas (debe verse traslucida), el tiempo es de
aproximadamente 15 segundos.
4.- Dejar enfriar un poco
5.-Añadir 1.5 μl de Bromuro de Etidio (EtBr)
6.- Homogenizar bien
164

7.- Verter en la charola de la cámara horizontal de electroforesis, con el peine
puesto
8.- Dejar enfriar totalmente hasta que este sólido
9.- Colocar en la cámara (de negativo a positivo, los pozos van en el polo
negativo).
10.-Adicionar Buffer TAE a la cámara hasta la marca indicada
11.- Poner las muestras en cada pozo.
12.- Poner la tapa, y correr a 100 volts, de 40-60 minutos
Finalmente, el resultado se podrá observar en una cámara con luz ultravioleta,
sólo se recomienda tener cuidado con el EtBr.
La metodología descrita en este capítulo podría ser adaptada a las condiciones
de los helmintos que se desean diagnosticar. Asimismo, la biotecnología es
actualmente una ciencia que va creciendo y se va perfeccionando, nuevos
programas de software, así como nuevos genes se están notificando, muchos
de ellos para la aplicación de diagnóstico. Otro ejemplo de diagnóstico
molecular, podría ser la identificación de citocinas implicadas en la resistencia
y susceptibilidad de ganado, cuya aplicación podría integrarse a la selección
de individuos altamente susceptibles o a la ganadería con problemas severos
de resistencia antihelmíntica. A este respecto, sugiero la integración de
alternativas de diagnóstico, como son las herramientas moleculares junto con
las parasitológicas, claro, esto va a depender de las posibilidades del
productor, y de los laboratorios de diagnóstico a nivel nacional.
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Wernsdorfer W. H. Drug resistant malaria, Endeavour, New series, 8,
1979.
167

ANEXO I
SOLUCIÓN SALINA AMORTIGUADORA DE FOSFATOS pH 7.2 (0.1 M)
Reactivo/Sol.
Madre
1x 5x 10x
Cloruro
(NaCl)
de Sodio 8.5 g 42.5 g 85.0 g
Fosfato de Sodio 0.39 g 1.95 g 3.9 g
(NaH2P042H20)
Fosfato de Sodio 1.068 g 5.34 g 10.68
dodecahidratado
(Na2H2PO412H2O) H2O
c.b.p.
destilada 1000 ml 1000 ml 1000 ml
Preparación de 1 lt 200 ml sol 100 ml sol
madre madre
800 ml H2O 900 ml H2O
dest. dest
SUBSTRATOS
2´2-azinodi-(ethyl-benzothiazoline-sulfonic-acid (ABTS)
1. Ácido cítrico 0.5 M pH 4.0
2. Sol de trabajo
9.94 ml buffer citrato
50 l sol. Madre deABTS
10 l H202 Leer a 405 nm
4-Chloro-naphtol p
SOLUCIÓN 1: 10 mM Tris-HCl y 150 mM NaCl
SOLUCIÓN 2: 0.6g de 4-chloro-naphtol; 20 ml Metanol y a 4C
SOLUCIÓN DE TRABAJO: Sol 1:100 mL+ Sol 2: 20 mL + 60 l de Peróxido de
Hidrógeno
INHIBIDOR DE PROTEASAS
Phenyl-methyl-sulphoxide 1 mM (PMSF)
PM 172.4 (SIGMACHEMICAL)
0.00172 g para 10 ml de isopropanol
168

10. Diagnóstico de la infección por Babesia bovis y Babesia bigemina por
medio de la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI)
Alfonso Falcón Neri
JuanAlberto RamosAragón
10.1. Introducción
El método tradicional de diagnostico de la babesiosis, es mediante la
identificación del agente causal, por medio del examen microscópico de frotis
finos y gruesos de sangre teñidos. Por ejemplo, con colorante Giemsa. La
sensibilidad de esta técnica es tal que puede detectar parasitemias como un
7
parásito por 10 glóbulos rojos (Bose et al, 1995). La diferenciación de especies
se puede realizar en frotis finos pero se dificulta en gruesos los cuales tienen
mayor sensibilidad. Esta técnica es útil para detectar infecciones agudas, pero
no para la detección de infecciones crónicas, subclínicas y/o detección de
portadores asintomáticos, en los cuales, las parasitemias son muy bajas (OIE).
Por esta razón, se han implementado diversas técnicas serológicas entre las
cuales se incluye, Fijación del complemento (Mahoney 1962),
hemoaglutinación indirecta (Goodger 1971), aglutinación rápida en tarjeta
(Todorovic y Kuttler 1974), aglutinación con partículas de latex (López et al.
1978), e inmunofluorescencia indirecta, (Goff et al. 1982).
La prueba de inmunofluorescencia fue descrita por primera vez a principios de
1940. Para 1954 se describió la técnica de Inmunofluorescencia indirecta. Esta
método consiste en conjugar ciertos colorantes fluorescentes con el
anticuerpo, resultando un conjugado sensible con reactividad inmunológica
inalterada (Sikora y Smedley 1986), en la cual tenemos un antígeno fijado a
una superficie, en este caso un porta objetos de vidrio, si hay anticuerpos
específicos para el antígeno en el suero proveniente de los animales a probar
se forma un complejo antígeno-anticuerpo; luego se adiciona un segundo
anticuerpo conjugado a un colorante fluorescente y se expone a luz ultra
violeta (UV); entonces, el complejo emite una luz fluorescente cuyo color
dependerá del fluorocromo empleado.
Las partículas que se hacen luminiscentes al ser expuestos a rayos
ultravioleta, X y/o catódicos, se dice que son fluorescentes. Si la luminiscencia
continúa después de haber sido cortada la excitación se dice que es
fosforescente (Klein y Hurlbut 1970).
Los fluorocromos son moléculas químicas que absorben luz a una
determinada longitud de onda y emiten a otra diferente. Se caracterizan por
sus espectros de excitación y de emisión, por lo que su utilización está
condicionada por el tipo de láser del que disponga el citómetro y de la longitud
de onda a la que se exciten ellos mismos. El espectro de excitación y emisión
varía con los diferentes fluorocromos. Si disponemos de una láser con una
longitud de onda de 488 nm los fluorocromos que utilicemos deberán ser
capaces de ser excitados a esta longitud de onda y además emitir en
longitudes lo mas lejanas posibles entre ellas. En las pruebas de
inmunofluorescencia los anticuerpos conjugados con fluorocromos la
intensidad de fluorescencia detectada por el citómetro es directamente
169

proporcional al número de moléculas unidas al antígeno. La intensidad de
fluorescencia también depende del fluorocromo utilizado, ya que hay
fluorocromos que emiten con mayor intensidad que otros. En algunas
ocasiones ciertos fluorocromos producen el llamado fenómeno “Quenching”
referido como la transferencia de energía entre dos moléculas marcadas con el
mismo fluorocromo, y que están suficientemente cercanas. Debido a ello una
molécula puede ser excitada por la luz del láser y por la luz que emite la otra
molécula. Los fluorocromos mas utilizados son:
FITC: Isocianato de fluoresceina. Se excita con luz azul a 490nm y emite a
514nm. Produce Quenching.
-La familia Alexa Fluor. Que se puede excitar desde los 346 nm. y emite hasta
los 775 nm dependiendo de el cromóforo usado
- PE: Ficoeritrina. Se excita a 480 nm pero no es su máximo (565 nm) y emite a
578 nm. No produce Quenching.
- PerCP: Proteína Clorofila Peridinina. Se excita a 488 nm y emite a 520 nm
- TRITC: Isocianato de Tetrametil Rodamina se excita a 540 nm y emite a 570
nm.
- Rojo Texas: Se excita a 596 nm y emite a 615 nm
- Ficocianina: Se excita a 620 nm y emite a 650 nm.
-Aloficocianina: Se excita a 650 nm y emite a 660 nm.
- Tricolor: Se excita a 540nm y emite a 570nm.
- APC: Utilizado como cuarto color en citometros de BD. Se excita a 635 nm y
emite a 670 nm.
- Los fluorocromos empleados para marcar ácidos nucleicos son:
- Yoduro de Propidio que se excita a 493 nm y emite a 630 nm,
- Bromuro de Etidio
- Naranja de Acridina que para marcar ADN se excita a 480 nm y emite a 510
nm y paraARN se excita a 440/470 nm y emite a 650 nm,
- Hoescht 33342 que se excita a 343 nm y emite a 482 nm, Naranja de Triazol
que se excita a 509 nm y emite a 533 nm, Mitramicina, - - Cromomicina A3, y el
DAPI que se excita a 345 nm y emite a 455 nm. (www.citometriadeflujo.com)
Esta prueba nos permite identificar animales que alguna vez estuvieron
expuestos a un patógeno y que fueron capaces de montar una respuesta
inmune en contra del mismo, es de suma utilidad para realizar estudios
epidemiológicos, además de poder discriminar animales negativos de los
positivos en la selección de individuos para ser utilizados en investigaciones.
10.2. Preparación de antígeno:
Para la preparación del antígeno que va a ser utilizado en la prueba de IFI para
el diagnóstico de la babesiosis, primeramente se tendrá que contar con sangre
que contenga una buena cantidad de glóbulos rojos infectados con el parásito,
por lo menos 3% de parasitemia, esto se puede lograr de dos maneras: La
primera, por medio del cultivo del parásito in vitro (Palmer et al. 1982, Figueroa
et al. 1984) y la segunda por medio de inoculación múltiple en becerros
170

esplenectomizados. Para el cultivo in vitro. Un vial de B. bigemina y/o B. bovis
(que se mantuvieron en congelación en nitrógeno liquido), se descongela y se
le adiciona medio de VYM (Vega et al. 1985a,b), se centrifuga a 1000 x g por
10 minutos, después de la centrifugación, del paquete de eritrocitos se toma
0.1 mL y se adiciona 1 mL de medio de cultivo que contiene 0.600 ml de medio
199 y 0.400 ml de suero normal de bovino y 5% de eritrocitos normales, se
coloca en un pozo de una placa para cultivo celular de 24 pozos, y se
incuban
a 37°C en una atmósfera de 5% de CO 2, 5% de O2y90% N 2.
El medio de cultivo es reemplazado cada 24 h, realizando sub-cultivos
cada 72 h hasta que se tenga un porcentaje de eritrocitos parasitados
superior al 4%. La sangre infectada obtenida del cultivo in vitro,
se
centrifuga a 1340 x g durante 20 min a 4°C; se desecha el
sobrenadante y el paquete de eritrocitos se lava por centrifugación a
1340 x g durante 20 min a 4°C con medio de VyM, se desecha el
sobrenadante y se repiten los lavados 2 veces más, los eritrocitos se
resuspenden en medio de VyM adicionado con 0.5% de albúmina
sérica bovina y con esta suspensión se elaboran frotis procurando
cubrir la mayor superficie del portaobjetos, luego se dejan secar a
temperatura ambiente durante una hora; después se empaquetan, se
rotulan y se mantienen en congelación a -20°C hasta su uso.
Para la obtención de eritrocitos infectados por el segundo método, se
requiere un becerro esplenectomizado, al que se le inocula con 15 ml
de sangre infectada con Babesia spp, se suministran 7.5 ml por vía
intra-muscular y 7.5ml por vía intravenosa. Diariamente el animal es
monitoreado registrando su temperatura rectal; además de tomarle
muestras
sanguíneas y por la técnica de micro-hematocrito determinar el
volumen celular aglomerado (VCA), y realizar frotis sanguíneos los cuales
serán teñidos con colorante Giemsa, con el fin de determinar la presencia del
parásito. Cuando se obtenga una parasitemia mayor de 2.5%, se colectará
sangre desfibrinada utilizando un matraz de Kitazato al vacío con perlas de
vidrio.
La sangre infectada con Babesia spp. se centrifuga a 1340 x g durante 20
min a 4°C, se desecha el plasma y la capa flogística, el paquete de
eritrocitos se lava por centrifugación a 1340xg durante 20 min a 4°C con
medio de VyM, se desecha el sobrenadante y se repiten los lavados 2
veces más. Los eritrocitos se resuspenden en medio de VyM adicionado
con 0.5% de albúmina sérica bovina, y se preparan las laminillas como en
el caso anterior.
171

Figura 10.1. Preparación del frotis de anfígeno de IFI
Figura 10. 2. Apariencia del frotis de anfígeno de IFI
172

10.3. Toma de la muestra:
Para realizar la prueba de inmunofluorescencia indirecta se requiere suero.
En los bovinos la colecta de sangre para la obtención del suero, por lo tanto
tomaremos aproximadamente 5 ml sin adicionar ninguna anticoagulante, se
podrá hacer con una jeringa, depositando su contenido en otro tubo de ensaye
limpio o con equipo “Vacutainer”. Se deja reposar el tiempo suficiente para que
se forme el coágulo, el cual se puede retirar con un palillo y el suero se decanta
a un tubo limpio. En todos los pasos es importante rotular los tubos con la
identificación del animal y los datos que se requieran para un buen manejo de
la muestra, el suero se guarda en congelación hasta su uso.
10.4. Desarrollo de la prueba:
Se saca el antígeno del congelador y se pone a desecar durante 30 minutos en
un matraz kitasato con cloruro de calcio (CaCl 2)
conectado por medio de un
tubo flexible a una bomba de vacío con presión negativa, enseguida se fija y se
hace permeable las membranas del antígeno sumergiéndolo en acetona
durante 15min. Posteriormente se procede a marcar con lápiz graso doce
círculos de aproximadamente 10 mm. de diámetro, según se aprecia en la
Figura 10.3.
Figura 10.3. Apariencia del frotis de anfígeno de IFI, mostrando
la distribución de los círculos marcados con lápiz graso.
En el centro del primero de los círculos se colocan 7 μl del suero control
positivo, en el circulo de abajo el suero control negativo, y en los demás
círculos los sueros problema, todos diluidos 1:80 en una solución buffer salina
1
de fosfatos (PBS)1X , adicionando 5% de suero de conejo como que actuara
como bloqueador de reacciones inespecíficas evitando que se mezclen los
sueros del ensayo, manteniendo la posición horizontal del portaobjetos. Éstos
se incuban durante 30min en una cámara húmeda a 37°C, se realizan 3
lavados con PBS1x/Tween 20 al 0.01% en agitación suave durante 5 min.
Posteriormente se coloca en cada uno de los círculos 7 μl de IgG de conejo anti
bovino conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) previamente
titulado; (para lo cual se harán diluciones del conjugado de 1:100 hasta
1:10,000 en PBS, realizando la prueba con sueros positivos y negativos para
encontrar la dilución de trabajo) adicionando 5% de suero de conejo como
173

loqueador y se incuba durante 30 min a 37°C en la cámara húmeda.
Posteriormente se realizan dos lavados con PBS1x/Tween 20 al 0.01% y uno
con agua bi-destilada, durante 5min en agitación suave. En cada uno de los
círculos se coloca una gota de glicerina bufferada, adicionada con azul de
Evans (ver soluciones al final del capitulo), para evitar la fluorescencia
inespecífica, para ser observadas en un en un microscopio de fluorescencia
con filtros específicos para FITC, utilizando el objetivo de inmersión 100X.
10.5. Interpretación de la prueba:
Para interpretar la prueba hay que observar cuidadosamente los dos controles
(-y +) y comparar con los sueros problema, si en el campo visual no vemos
absolutamente nada el resultado es negativo, si observamos los parásitos
fluoresciendo (Figura 10.4), el resultado es positivo, si vemos fluorescencia
inespecífica es decir si no vemos la forma de los parásitos o solo vemos el
contorno de los eritrocitos, se puede considerar como sospechoso, lo cual se
confirma repitiendo la prueba.
Figura 10. 4. Reacción positiva a la prueba de IFI
Microfotografía de Babesia bigemina marcada con un antisuero
específico revelada con un antisuero de conejo anti IgG bovina
conjugado con FITC, en un microscopio de Epifluorescencia con
filtro de excitación de 999 nm.
174

Anexos
A 10.1. Reactivos:
Fosfato de Potasio KH2PO4 Fosfato de Sodio NaHPO4
Cloruro de Sodio NaCl
Cloruro de Calcio CaCl 2.2H2O Fosfato de Potasio KH2PO4 Sulfato de Magnecio MgSO 4.7H2O Glicerina
Twen 20
Glucosa
Adenina
Guanosina
A. 10.2. Preparación de soluciones
Solución Buffer de Fosfatos (PBS)
KH2PO4 7.65 gr
NaHPO4 23.94 gr
NaCl 12.75 gr
Ajustar a pH 7.2 y aforar a 1 litro con agua destilada.
Glicerina fosfatada
9 partes de glicerina por una de PBS
Azul de Evans 25.0 mg
Agua destilada cbp 100 mL
Solución de VyM 5X
Reactivo Cantidad (gr)
CaCl 2.2H2O KCl
0.08
2.0
KH2PO4 MgSO 4.7H2O NaCl
7.075
0.77
35.38
Na2HPO 4.7H2O Glucosa
7. 25
102.5
Adenina 0.21
Guanosina 0.705
Agua ultra pura cbp 1000 mL Filtrar y ajustar pH 7.2
175

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176

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Cultivation of Babesia bigemina. Am. J. Vet. Res. 1985ª; 46;416-419.
17. Vega, C.A., Buening, G.M., Rodriguez, S.D., Carson, C.A. y
McLaughlin, K.: "Cryopreservation of Babesia bigemina for in
vitro
cultivation".Am. J. Vet. Res. 1985b; 46:421-423.
177

11. Extracción de ADN de hemoparásitos
Juan Joel Mosqueda Gualito
11.1. Introducción
Actualmente, el diagnóstico de muchas enfermedades parasitarias está
basado en el análisis de ácidos nucleicos, específicamente el ADN. Las
técnicas moleculares como el PCR, permiten analizar cantidades muy
pequeñas de ADN, de tal manera que se permite la identificación de agentes
parasitarios en cantidades no detectadas por métodos convencionales (Weiss
1995; Prichard 1997; Singh 1997; Zarlenga and Higgins 2001) . Para poder
analizar el ADN de los parásitos de interés es necesario, en la gran mayoría de
los casos, extraerlo de los tejidos y las células y agregarlo en forma pura y en
cantidades conocidas. Por lo tanto, una característica importante del ADN
analizado mediante este tipo de pruebas es su calidad y pureza; es por esto
que el método de extracción de ADN es fundamental para asegurar el éxito de
la prueba (Watson, Gilman et al. 1998; Bartlett 2003). Un ADN de mala calidad,
es decir que esté parcialmente degradado, no podrá ser analizado; por otra
parte, si éste viene contaminado con otros agentes químicos utilizados
durante la extracción o con proteínas, no podrá ser cuantificado correctamente
o bien estas sustancias inhibirán la reacción de PCR o terminarán degradando
el ADN de la muestra. El ADN genómico es fácil de obtener en forma
fragmentada, pero la dificultad de obtener ADN se incrementa conforme
aumenta su tamaño y las moléculas de más de 150 kilobases (Kb) se
fragmentan fácilmente por fuerzas generadas durante procesos usados
comúnmente para su purificación (Sambrook and Russell 2001) .
11.2. Fundamento de la manipulación del ADN
La extracción de ADN está basada en tres pasos fundamentales que son la
homogenización, la separación y la purificación. Cada una de ellas es
importante para asegurar la calidad de ADN de la muestra (Sambrook, Fritsch
et al. 1989).
La homogeinización es el primer paso en el proceso de extracción de ADN y
consiste en disgregar la estructura tisular y celular con el objetivo principal de
facilitar la liberación de los ácidos nucleicos. La homogeinización se puede
realizar mediante métodos físicos como el macerado, la sonicación, la
ebullición, la congelación-descongelación o el choque osmótico; métodos
químicos como el uso de detergentes (principalmente SDS); o biológicos como
el uso de proteinasas como la proteinasa K, la lisozima, etc. La idea es romper
el tejido de forma mecánica y posteriormente liberar los ácidos nucleicos de las
células lisando las membranas con detergentes y enzimas; éstas últimas
además destruyen los complejos núcleo-proteicos, incrementando la pureza
del ADN. El método de homogeinización a utilizar depende principalmente del
tipo de tejido del cual se quiera extraerADN; si es de parásitos completos como
178

helmintos o bien de órganos o tejidos donde se alojen los parásitos, se deben
de utilizar métodos de homogeinización más fuertes como el macerado y la
ebullición. Si se trata de parásitos unicelulares purificados o de parásitos
localizados en la sangre, los métodos son enfocados a lisar las células y liberar
los ácidos nucleicos utilizando SDS y digestión enzimática. El principal
problema durante la homogeinización esque no se logra liberar el ADN
totalmente y aún se encuentra contaminado principalmente con proteínas.
Este es la principal causa de fracaso durante la extracción y si hay
contaminación con proteínas o tejidos completos al final de este paso, en los
pasos siguientes será imposible liberar el ADN de estos contaminantes y se
tendrá, en su defecto que repetir todo el proceso, como se explica en las
siguientes secciones, lo cual incrementa el tiempo y el consumo de reactivos.
Sin lugar a dudas, una combinación de dos o más métodos de
homogenización siempre será mejor que un solo método. Un punto importante
a considerar es la adición de EDTA, el cual inhibe las nucleasas, enzimas que
degradan los ácidos nucleicos (Sambrook and Russell 2001). Un vez que el
ADN ha sido liberado, se procede al siguiente paso de separación.
Durante la separación se pretende disociar elADN de los demás componentes
celulares; para esto se utilizan principalmente agentes orgánicos como el
fenol, aunque también se utilizan el cloroformo y el alcohol iso-amílico (Moore
y Dowhan 1998). El fenol es un agente desnaturalizante de las proteínas que
facilita su remoción de los ácidos nucleicos durante el proceso de extracción
(Kirby 1957). El cloroformo también desnaturaliza las proteínas además de
estabilizar la interfase, reduciendo la cantidad de fase acuosa retenida en la
fase orgánica, incrementando así la densidad de la mezcla y facilitando la
remoción de lípidos. Finalmente, el alcohol iso-amílico ayuda a la separación
de proteínas desnaturalizadas e incrementa la separación de fases (Ambion
2007). El resultado es la formación de tres fases en la mezcla: una fase
superior acuosa conteniendo los ácidos nucleicos (ADN y ARN), una fase
intermedia conteniendo proteínas y complejos núcleo-proteicos y una fase
inferior orgánica conteniendo los agentes orgánicos e impurezas (Sambrook y
Russell 2001).
Otro método de separación de ADN incluye el uso de membranas que
funcionan mediante cromatografía de intercambio ónico con resinas a base de
grupos cationes como el dietilaminoetil (DEAE) (Budelier y Schorr 1998). El
fundamento de las resinas se basa en la interacción entre los grupos fosfato de
la cadena de ADN que están cargados negativamente, y los cationes de la
membrana. Mediante lavados con soluciones de diferentes concentraciones
de sales, se puede controlar la unión, la astringencia y la elusión del ADN de la
membrana (QIAGEN 2003). Los métodos basados en este principio tienen la
ventaja de no usar agentes orgánicos como el fenol o el cloroformo que son
muy tóxicos y que requieren procedimientos especiales para su manejo,
almacenaje y eliminación en cualquier laboratorio (Sambrook y Russell 2001).
La idea de la separación es eliminar la mayoría de las proteínas y otros
contaminantes de la fase donde se mantiene el ADN; sin embargo siempre
179

quedan unos pocos residuos que hay que purificar y de esta manera mantener
el ADN en forma prácticamente libre de otros compuestos. El último paso
consiste en la purificación deADN de la muestra con el objeto de eliminar todas
esas proteínas y contaminantes y dejar el ácido nucleico en solución listo para
usarse. La purificación se basa en la precipitación del ADN y lavados
usualmente con etanol a diferentes concentraciones para remover los
remanentes de proteínas y sobre todo el fenol y las sales que pueden inhibir las
reacciones de PCR. Si el método de separación se hizo a base de fenolcloroformo,
será necesario precipitar el ADN mediante etanol absoluto o
isopropanol y después someterlo a lavados con etanol diluido para remover
sales; si el método de separación fue a base de resinas, se procederá a
realizar los lavados directamente. Al final de este proceso se deberá eliminar
todo el fenol de la muestra ya que éste afectará la cuantificación por
espectrofotometría. Esto se puede hacer desecando el ADN ya sea mediante
centrifugación o desecado al vació o por ventilación. Una vez que se ha
eliminado todo el etanol contaminante el ADN se puede resuspender en agua
libre de nucleasas o bien en algún búfer a base de Tris y EDTA. Debido a que el
ADN ha formado una pastilla muy compacta en el fondo del tubo donde se
desecó usualmente la resuspensión se obtiene dejando el ADN con el líquido
en suspensión por varias horas a 37C y posteriormente se pasa por una putilla
de micropipeta suavemente para lograr una resuspensión homogénea
(Sambrook y Russell 2001).
Una vez que el ADN se ha resuspendido y cuantificado (ver Nota), se debe
preferentemente, alicuotar y almacenar a -20 o a -70°C hasta su uso, ya que la
congelación-descongelación continua de la muestra afectará eventualmente
su calidad. Bien almacenado puede durar incluso varios años. Este ADN ya
puede entonces utilizarse para las distintas aplicaciones, después de ser
cuantificado.
Nota: Al realizar extracciones de ADN, frecuentemente quedan proteínas
contaminantes en la muestra; las proteínas están fuertemente unidas al ADN y
es prácticamente imposible la remoción total de éstas. Para determinar la
concentración y pureza del ADN en solución, se mide la absorbancia de luz
ultravioleta (UV) en un espectrofotómetro.
Tanto el ADN como las proteínas absorben luz UV, pero cada uno tiene curvas
de absorbancia distintas. La máxima absorbancia de luz para el ADN es a una
longitud de onda de 260 nm y para las proteínas a una longitud de onda de 280
nm. Una densidad óptica (OD) de 1 corresponde a 50 μg/ml aproximadamente
para el ADN de doble cadena (E5) (Wassenaar 2002). El radio de las lecturas a
260 y 280 nm (OD 260/OD 280)
proporciona un estimado de la pureza del ácido
nucleico. Preparaciones puras de ADN tienen valores OD /OD de 1.8. Si
260 280
260 280
hay contaminación con proteínas o fenol, el valor de OD /OD será
significativamente menor a 1.8 y no se podrán hacer cuantificaciones
confiables de la cantidad de ADN (Sambrook et al. 1989). Aunque este método
no es muy confiable, es el más utilizado. Tiene las desventajas de no poder
180

determinar concentraciones reducidas de ADN y de ser un método confiable
sólo en un rango limitado de concentraciones (5 a 90 μg deADN/ml).Además a
260 nm también otras moléculas como el ARN, el fenol y el EDTA tienen
máxima absorción, y si e ADN está contaminado con estas moléculas, la
cuantificación será errónea. La concentración de ADN también puede
determinarse mediante un trans-iluminador de UV usando diluciones
conocidas de ADN y tiñéndolo con bromuro de etidio a una concentración de
0.5 μg/ml (Sambrook and Russell 2001).
11.3. Consideraciones sobre la manipulación del ADN
El método de extracción de ADN depende de varios factores, principalmente,
la aplicación, el tiempo, el costo y el tipo de muestra. Cuando se requieren
volúmenes grandes de ADN de pocas muestras, el método tradicional de
fenol-cloroformo es preferible; sin embargo éste método tiene tantos pasos (lo
cual resulta en un método largo) que resulta impráctico cuando se procesan
muchas muestras simultáneamente. En la actualidad hay muchas compañías
que ofrecen kits basados en membranas de resinas para la extracción de ADN
de diferentes tejidos, incluyendo sangre, los cuales son rápidos, con
protocolos fáciles de realizar y que permiten trabajar con un número de
muestras muy elevado al mismo tiempo. Sin embargo, son los métodos más
costosos y la cantidad de ADN purificada es muy poca debido a la capacidad
de la membrana utilizada. Todo esto debe tomarse en cuenta cuando se escoja
el método de extracción. Recientemente algunas compañías has desarrollado
métodos de extracción de ADN que no utilizan fenol ni cloroformo y que no son
a base de columnas de afinidad, lo cual permite obtener ADN en grandes
cantidades y de muy buena calidad e integridad en un tiempo reducido. Uno de
ellos es el “Puregene DNA extraction kit” de la compañía Gentra Systems,
ahora QIAGEN (QIAGEN 2007), el cual se ha utilizado con éxito para purificar
ADN de organismos patógenos sanguíneos como Anaplasma marginale y
virus de diferentes tejidos incluyendo sangre (Fahle y Fischer 2000; Brayton et
al. 2001).
El tipo de tejido de donde se extrae el ADN es lo más importante a considerar.
Por ejemplo, cuando se extrae ADN de Babesia spp. o de Anaplasma
marginale que se encuentran en los eritrocitos, la idea es eliminar la mayor
cantidad de células nucleadas de la sangre (glóbulos blancos) y dejar
únicamente los eritrocitos parasitados. Después se pueden eliminar la
mayoría de los eritrocitos ya sea por lisis por choque osmótico, por
congelación-descongelación y centrifugación (Figueroa et al. 1996). Cuando
se desean extraer ácidos nucleicos de parásitos extracelulares o se desean
purificar únicamente los parásitos intraeritrcíticos, se pueden purificar de las
demás células de la sangre por gradientes de densidad y a partir de las células
purificadas se puede hacer la extracción deseada (Rodriguez et al. 1986; Vega
et al. 1986; Mosqueda et al. 2004). Si los parásitos se encuentran en tejidos del
vector, como las garrapatas, se pueden macerar las garrapatas completas o,
idealmente, separar los tejidos específicos y con ellos hacer la extracción de
181

los ácidos nucléicos (Scoles et al. 2005). Es importante entender que a veces
las cantidades de los parásitos en los tejidos son tan bajas que deben de
buscarse métodos que concentren su cantidad, favoreciendo las
probabilidades de extracción de los ácidos nucleicos. El objetivo de este
capítulo además de explicar el fundamento de la manipulación de los ácidos
nucleicos, es el de proporcionar una serie de protocolos que exitosamente han
sido utilizados para la extracción de ácidos nucleicos de hemoparásitos de
importancia veterinaria.
11.4. Protocolos de extracción de ADN
A continuación se detallan varios protocolos que se utilizan en el laboratorio,
basados en el método tradicional de fenol-cloroformo y que se han adaptado
de protocolos publicados previamente (Hernandez et al. 1998; Strauss 1998;
Bartlett y White 2003; Pearson y Stirling 2003), así como un método de
purificación a base de columnas de afinidad (Promega), y el método de
extracción de Gentra (QIAGEN 2007). Estos protocolos a su vez pueden
optimizarse de acuerdo a las necesidades particulares de cualquier parásito
en estudio o bien a las necesidades del laboratorio.
Protocolo 1.
Pasos para la extracción de ADN de sangre infectada con Babesia spp.,
mediante el método de fenol-cloroformo-alcohol iso-amílico.
1. La sangre infectada se debe obtener siempre con anticoagulante en
bolsa o tubos, o bien desfibrinada con perlas de vidrio. Se vacía a
tubos de centrífuga de 15 ò 50 ml y se centrifuga a 1340 x g por 15-25
minutos, se desecha el plasma y las células blancas y el paquete de
eritrocitos conteniendo los parásitos se utiliza para la extracción.
2. Tomar un volumen de eritrocitos infectados y agregar 10 volúmenes
de búfer de extracción.
3. Incubar las muestras homogenizadas por 5 minutos a temperatura
ambiente para permitir la disociación
completa de los complejos de núcleo-proteicos.
4. Agregar Proteinasa K (100 μg/ml) e incubar toda la noche a 45 °C en
baño maría.
5. Colectar la mezcla en tubos de 1.5 ml. No agregar más de 700 μl por
tubo.
6. Agregar 1 volumen de fenol-cloroformo-alcohol iso-amílico y tapar los
tubos de forma segura.
7. Agitar suavemente los tubos durante 10 minutos.
8. Centrifugar las muestras en una micro-centrífuga a 3000 rpm durante
10 minutos a 15 °C.
9. Después de la centrifugación, la mezcla se separa en tres fases: una
fase clara superior, una interfase y una fase inferior turbia. El ADN
permanece en la fase acuosa. Transferir la fase acuosa a otro tubo,
182

teniendo mucho cuidado de no tocar la interfase; a veces es preferible
dejar un poco del volumen de la fase acuosa para no contaminar la
muestra con proteínas de la interfase.
Nota: Las fases deben estar bien separadas. Si el ADN se observa
viscoso o contiene una gran cantidad de proteína, se debe centrifugar
uno o dos minutos más (Sambrook and Russell 2001).
10. Repetir los pasos 8-11 hasta que se obtenga una fase acuosa clara.
Estos lavados son muy importantes cuando se extrae ADN de sangre
ya que los eritrocitos contienen mucha hemoglobina que es difícil de
eliminar.
11. Precipitar el ADN de la fase acuosa obtenida mezclándola con 2
volúmenes de etanol absoluto frío e incubar en CO2 sólido por cinco
minutos. También se puede incubar a -20 °C toda la noche o se puede
incubar la muestra a -70 °C por un par de horas.
12. Centrifugar las muestras a máxima velocidad por 30 minutos a 4ºC. El
ADN precipitado, usualmente invisible antes de la centrifugación,
forma una pastilla al fondo y a los lados del tubo.
13. Decantar el sobrenadante muy cuidadosamente para no perder la
pastilla.
14. Lavar el ADN una vez con 500 μl de etanol al 70% mantenido a
temperatura ambiente.
15. Mezclar las muestras con un vortex y centrifugar máxima velocidad
por 10 minutos a 4°C.
Para disolver elADN:
16. Secar la pastilla brevemente por 15 a 20 minutos en una campana de
flujo laminar o bien en un una centrífuga al vacío. Secar demasiado el
ADN dificultará la re-suspensión posterior de este (Bartlett y White
2003).
17. Disolver el ADN en agua libre de DNasas pasándolo varias veces por
una punta de micro-pipeta, e incubándolo por 10 min a 55 °C.
18. Determinar la cantidad deADN por espectrofotometría.
Protocolo 2.
Pasos para la extracción de ADN de garrapatas Boophilus spp.
infectadas con Babesia spp., utilizando el método de fenol-cloroformoalcohol
iso-amílico.
1. Obtener los parásitos para su maceración en un mortero. El número
varía según el tamaño y edad de las garrapatas, pero preferentemente
no usar más de 1 g de larvas ( ≤20000
larvas) o dos o tres garrapatas
adultas. Idealmente los parásitos, ya sea larvas o adultos deben haber
sido previamente congelados a -70 °C. Si son garrapatas adultas,
ayuda si éstas han sido evisceradas con anterioridad para eliminar el
exoesqueleto.
2. Mantener el mortero y su pistilo también a -70 °C. Si no se cuenta con
un ultra-congelador, se puede preparar un baño de CO2 sólido y
metanol y dejarlo a que alcance una temperatura estable. Dentro del
183

año se coloca el mortero y el pistilo hasta que alcancen la temperatura
de baño (ayuda si se mantienen previamente a -20 °C).
3. Agregar 10 volúmenes de búfer de extracción al mortero (quitar el
pistilo primero) y colocar los parásitos encima del búfer.
4. Pulverizar la muestra con el pistilo usando un movimiento circular
manteniendo el mortero firmemente y evitando tocar la cabeza del
pistilo con los guantes. La muestra está lista cuando se observe un
polvo fino y homogéneo.
5. Con una punta de 1000 μl, colectar la mezcla en tubos de 1.5 ml. No
agregar más de 700 μl por tubo.
6. Incubar las muestras homogenizadas por 5 minutos a temperatura
ambiente para permitir la disociación completa de los complejos
núcleo-proteicos.
7. Agregar Proteinasa K (100 μg/ml) e incubar toda la noche a 45 °C en
baño maría.
8. Agregar 1 volumen de fenol-cloroformo-alcohol iso-amílico y tapar los
tubos de forma segura.
9. Agitar suavemente los tubos durante 10 minutos.
10. Centrifugar las muestras en una micro-centrífuga a 3000 rpm durante
10 minutos a 15 °C.
11. Después de la centrifugación, la mezcla se separa en tres fases: una
fase clara superior, una interfase y una fase inferior turbia. El ADN
permanece en la fase acuosa. Transferir la fase acuosa a otro tubo,
teniendo mucho cuidado de no tocar la interfase; a veces es preferible
dejar un poco del volumen de la fase acuosa para no contaminar la
muestra con proteínas de la interfase.
Nota: Las fases deben estar bien separadas. Si el ADN se observa viscoso
o contiene una gran cantidad de proteína, se debe centrifugar uno o
dos minutos más (Moore y Dowhan 1998).
12. Repetir los pasos 8-11 hasta que se obtenga una fase acuosa clara.
13. Precipitar el ADN de la fase acuosa obtenida mezclándola con 2
volúmenes de etanol absoluto frío e incubar en CO2 sólido por cinco
minutos. También se puede incubar a -20 °C toda la noche o se puede
incubar la muestra a -70 °C por un par de horas.
14. Centrifugar las muestras a máxima velocidad por 30 minutos a 4ºC. El
ADN precipitado, usualmente invisible antes de la centrifugación,
forma una pastilla al fondo y a los lados del tubo.
15. Decantar el sobrenadante muy cuidadosamente para no perder la
pastilla.
16. Lavar elADN una vez con 500 μl de etanol al 70%.
17. Mezclar las muestras con un vortex y centrifugar máxima velocidad
por 10 minutos a 4°C.
Para disolver el ADN:
18. Secar la pastilla brevemente por 15 a 20 minutos en una campana de
flujo laminar o bien en un una centrífuga al vacío. Secar demasiado el
ADN dificultará la re-suspensión posterior de este (Bartlett and White
184

2003).
19. Disolver el ADN en agua libre de DNasas pasándolo varias veces por
una punta de micro-pipeta, e incubándolo por 10 min a 55 °C.
20. Determinar la cantidad deADN por espectrofotometría.
Protocolo 3.
Pasos para la extracción de ADN de Babesia spp., a partir de cultivo in
vitro,
mediante el método de fenol-cloroformo-alcohol iso-amílico.
1. Cosechar los cultivos y colocarlos en tubos de 15 ó 50 ml de acuerdo al
volumen final. Centrifugar a 1340 g por 15-25 minutos, desechar el
medio de cultivo y el paquete de eritrocitos conteniendo los parásitos
se utiliza para la extracción
2. En tubos de 50 ml, tomar 2 ml del paquete de eritrocitos infectados y
agregar 45 ml de medio RPMI con glicerol al 7%.
3. Incubar a 37 °C durante 35 minutos. Centrifugar a 1340 g durante 20
minutos a 4 °C.
4. Retirar el sobrenadante.
5. Lavar con RPMI, y centrifugar a 1340 g durante 20 minutos a 4 °C. Es
hasta este paso que se observa la lisis de eritrocitos.
6. Retirar el sobrenadante, cuidando de no tomar el paquete de parásitos
que está al fondo del tubo como una fase viscosa y clara.
7. Proceder a la extracción de ADN, agregando 10 volúmenes de búfer
de extracción.
8. Incubar las muestras homogenizadas por 5 minutos a temperatura
ambiente para permitir la disociación completa de los complejos de
núcleo-proteicos.
9. Agregar Proteinasa K (100 μg/ml) e incubar toda la noche a 45 °C en
baño maría.
10. Colectar la mezcla en tubos de 1.5 ml. No agregar más de 700 μl por
tubo.
11. Agregar 1 volumen de fenol-cloroformo-alcohol iso-amílico y tapar los
tubos de forma segura.
12. Agitar suavemente los tubos durante 10 minutos.
13. Centrifugar las muestras a 3000 rpm durante 10 minutos a 15 °C.
14. Después de la centrifugación, la mezcla se separa en tres fases: una
fase clara superior, una interfase y una fase inferior turbia. El ADN
permanece en la fase acuosa. Transferir la fase acuosa a otro tubo,
teniendo mucho cuidado de no tocar la interfase; a veces es preferible
dejar un poco del volumen de la fase acuosa para no contaminar la
muestra con proteínas de la interfase.
Nota: Las fases deben estar bien separadas. Si el ADN se observa
viscoso o contiene una gran cantidad de proteína, se debe centrifugar
uno o dos minutos más (Moore and Dowhan 1998).
185

15. Repetir los pasos 8-11 hasta que se obtenga una fase acuosa clara.
Estos lavados son muy importantes cuando se extrae ADN de sangre
ya que los eritrocitos contienen mucha hemoglobina que es difícil de
eliminar.
16. Precipitar el ADN de la fase acuosa obtenida mezclándola con 2
volúmenes de etanol absoluto frío e incubar en CO2 sólido por cinco
minutos. También se puede incubar a -20 °C toda la noche o se puede
incubar la muestra a -70 °C por un par de horas.
17. Centrifugar las muestras a máxima velocidad por 30 minutos a 4º C. El
ADN precipitado, usualmente invisible antes de la centrifugación,
forma una pastilla al fondo y a los lados del tubo.
18. Decantar el sobrenadante muy cuidadosamente para no perder la
pastilla.
19. Lavar elADN una vez con 500 μl de etanol al 70%.
20. Mezclar las muestras con un vortex y centrifugar máxima velocidad
por 10 minutos a 4°C.
Para disolver el ADN:
21. Secar la pastilla brevemente por 15 a 20 minutos en una campana de
flujo laminar o bien en un una centrífuga al vacío. Secar demasiado el
ADN dificultará la re-suspensión posterior de este (Bartlett y White
2003).
22. Disolver el ADN en agua libre de DNasas pasándolo varias veces por
una punta de micro-pipeta, e incubándolo por 10 min a 55°C.
23. Determinar la cantidad deADN por espectrofotometría.
Protocolo 4.
Pasos para la extracción de ADN de sangre infectada con Babesia spp.,
mediante el kit comercial Wizard® SV Genomic DNA Purification System
de Promega.
1. La sangre infectada de debe obtener siempre con anticoagulante en
bolsa o tubos, o bien defibrinada con perlas de vidrio. Vaciar la sangre
a tubos de centrífuga de 15 o 50 ml y centrifugarla a 1340 g por 15-25
minutos, desechar el plasma y las células blancas y resuspender el
paquete de eritrocitos conteniendo los parásitos en PBS 1X y se
congela a -20 °C o -70 °C.
2. Al siguiente día descongelar la muestra y centrifugarla a 3500 rpm por
25 minutos a 4°C. Se retira el sobrenadante y la pastilla se vuelve a
suspender en PBS. El proceso se repite hasta que la pastilla sea de
color gris, la cual contendrá pocas membranas de eritrocitos y
mayormente parásitos de Babesia.
3. Tomar 200 μl de esta pastilla y mercarlos con 150 μl del búfer de lisis
del kit y se mezcla por pipeteo.
4. Transferir la muestra lisada a una columna del kit la cual se coloca en
un tubo colector (Wizard® SV MinicolumnAssembly).
5. Centrifugar la muestra a 13,000 g por 3 minutos.
6. Remover la columna del tubo colector y desechar el líquido del tubo
186

colector. Se vuelve a ensamblar la columna al tubo colector.
7. Adicionar 650 μl a la columna de la solución de lavado del kit (que ya
debe contener etanol) y centrifugar la muestra a 13,000 g por 1
minuto. Remover la columna del tubo colector y desechar el líquido
del tubo colector. Volver a ensamblar la columna al tubo colector y
repetir este paso para un total de cuatro veces.
8. Desechar el líquido del tubo colector, re-ensamblar la columna y
centrifugar por 2 minutos la muestra a 13,000 g, esto con objeto de
secar la matriz de unión de la columna.
9. Transferir la mini-columna a un nuevo tubo de 1.5 ml. Adicionar 30 μl
de agua libre de nucleasas que debe estar a temperatura ambiente.
Incubar por 2 minutos a temperatura ambiente.
10. Centrifugar la columna ensamblada en el nuevo tubo colector a
13,000 g por 1 minuto.
11. Sin desechar el ADN eluido, agregar otros 10 μl de agua libre de
nucleasas a la columna y centrifugar la columna ensamblada en el
nuevo tubo colector a 13,000 g por 1 minuto. El volumen total eluido es
de 40 μl.
12. Remover la columna y desecharla, y el ADN eluido se utiliza para
determinar la cantidad deADN por espectrofotometría.
13. Guardar a -20 ó -70 °C.
Protocolo 5.
Pasos para la extracción de ADN de sangre infectada con Babesia spp.,
mediante el kit comercial Puregene DNA Purification System (QIAGEN).
1.
El paso uno es idéntico al paso 2 del protocolo 4.
2.
El paso dos es idéntico al paso dos del protozoo 4.
3. Tomar 300 μl de la pastilla formada en el paso 2 y mezclarlos con 900
μl de la solución de lisis de células rojas sanguíneas (RBC) del kit.
Incubar por un minuto a temperatura ambiente; invertir el tubo
suavemente diez veces durante la incubación.
4. Centrifugar por 20 segundos a 13,000-16,000 x g. Remover la mayor
cantidad de sobrenadante posible con una pipeta dejando
5.
aproximadamente unos 10-20 μl de líquido residual encima de la
pastilla.
Vortexear vigorosamente por 10 segundos para resuspender la
pastilla en el líquido residual; esto facilita mucho la lisis celular en el
paso siguiente. No debe permanecer la pastilla de células después de
este paso.
6. Adicionar 300 μl de la solución de lisis celular del kit a las células
resuspendidas y pipetear varias veces para lisar las células. Las
muestras son estables en esta solución de lisis celular por hasta dos
años a temperatura ambiente.
7. Se puede dar un tratamiento con RNasa que es opcional.Aquí hay que
adicionar 1.5 μl de solución de RNasa A al lisado celular. Mezclar la
muestra invirtiendo el tubo 25 veces y se incuba a 37°C por 15
187

minutos. Nota: si se trabaja con muestras congeladas el tratamiento
con RNasas se puede omitir.
8. Colocar la muestra un minuto en hielo para enfriarla rápidamente.
9. Adicionar 100 μl de la solución de precipitación de proteínas del kit.
10. Vortexear vigorosamente a máxima velocidad por 20 segundos para
mezclar la solución de precipitación de proteínas uniformemente
con el lisado celular.
11. Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 1 minuto. Las proteínas
precipitadas deben formar una pastilla compacta de color café oscuro.
Si la pastilla de proteínas no es compacta, repita el paso 10, seguido
de una incubación en hielo por 5 minutos y después repita el paso 11.
12. Verter el sobrenadante conteniendo el ADN (dejando la pastilla de
proteínas precipitadas en el tubo usado) a un tubo nuevo de 1.5 ml
conteniendo 300 μl de isopropanol al 100% (2-propanol).
13. Mezclar invirtiendo suavemente 50 veces.
14. Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 1 minuto; el ADN será visible en
forma de una pastilla pequeña de color blanco.
15. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo brevemente en una toalla de
papel absorbente. Adicionar 300 μl de etanol al 70% e invertir el tubo
varias veces para lavar la pastilla deADN.
16. Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 1 minuto. Cuidadosamente
elimine el etanol invirtiendo el tubo. Tenga cuidado de no perder la
pastilla deADN.
17. Invertir y secar el tubo en una toalla de papel absorbente nueva y deje
secar al aire 5 segundos (o hasta que no se observe etanol residual).
18. Adicionar 100 μl de solución de hidratación de ADN y mezcle en el
vortex por 5 segundos a media velocidad para mezclar bien. O bien
resuspender el 100 μl de agua libre de nucleasas.
19. Incubar la muestra a 65°C por 5 minutos para acelerar la hidratación.
20. Guardar a -20 o a -70 °C.
Materiales:
1. Tubos de centrífuga de 15 y 50 ml.
2. Tubos de micro-centrífuga de 1.5 ml.
3. Búfer de Extracción de ADN; EDTA 100 mM, Tris 10 mM, SDS 0.5 %,
ajustar el pH a 8.0.
4. Fenol-Cloroformo-Alcohol isoamílico 25:24.1.
5. Etanol 100%.
6. Etanol 70% en agua.
7. Mortero y pistilo estériles y mantenidos a -20 ó -70 °C.
8. Medio RPMI.
9. Medio RPMI con glicerol al 7%.
10. Agua libre de nucleasas.
11. Proteinasa K.
12. Micropipetas de 10, 200 y 1000 μl.
13. Puntas para micropipeta de preferencia con filtro de 10, 200 y 1000 μl.
14. Guantes de látex desechables.
188

Equipo:
1. Micro-centrífuga.
2. Centrífuga refrigerada de mesa.
3. Vortex.
4. Baño María a 45°C.
5. Congelador a -20 °C ultra-congelador a -70 °C.
6. Espectrofotrómetro.
Literatura citada
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2 Bartlett, J. M. S. (2003). Extraction of Nucleic Acid Templates. PCR
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3 Bartlett, J. M. S. and A. White (2003). Extraction of DNA from Whole
Blood. PCR Protocols. J. M. S. Bartlett and D. Stirling. New Jersey,
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9. Kirby, K. S. (1957). A new method for the isolation of deoxyribonucleic
acids; evidence on the nature of bonds between deoxyribonucleic acid
and protein. Biochem J 66(3): 495-504.
189

10. Moore, D. and D. Dowhan (1998). Manipulation of DNA. Current
Protocols in Molecular Biology. F. M. Ausubel, R. Brent, R. E.
Kingstonet al. USA, John Wiley & Sons. 1: 2.0.1-2.1.10.
11. Mosqueda, J., A. Falcon, et al. (2004). Babesia bigemina sexual
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antibodies in the midgut of infected Boophilus microplus ticks. Int J
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12. Pearson, H. and D. Stirling (2003). DNA Extraction from Tissue. PCR
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191

12. Diagnóstico de babesiosis bovina por PCR
Carmen Rojas Martínez
JesúsAntonio Álvarez Martínez
Julio V. Figueroa Millán
12.1. Introducción
En la ganadería que se desarrolla en regiones tropicales de México, los
bovinos se encuentran expuestos a una gran cantidad de agentes patógenos
de diferente naturaleza, destacando los que causan la babesiosis.
Comúnmente se presentan como infecciones mixtas de Babesia bovis y
Babesia bigemina (Solís, 1991; Rodríguez et al., 2003). Las manifestaciones
clínicas de la babesiosis se caracterizan por fiebre, anorexia, anemia, abortos
y muerte (Álvarez y Canto, 1985; Mahoney & Ross, 1972; Bock & De Vos,
2001). Para la prevención, el uso de inmunógenos es el procedimiento más
adecuado; sin embargo, en nuestro país no existe ninguna vacuna comercial
disponible. Por lo que la práctica de un diagnóstico oportuno y preciso puede
permitir encauzar las actividades de prevención o control disponibles.
Generalmente el diagnóstico presuntivo se basa en los signos clínicos, la
historia clínica del hato y la presencia de los vectores. Pero el diagnóstico
confirmativo generalmente requiere del uso metodologías de laboratorio.
Existen métodos de diagnóstico directo e indirecto, el más frecuentemente
solicitado es de tipo directo, el frotis sanguíneo teñido con Giemsa para
Babesia spp. (Caballero, 1993). Esta técnica presenta un uso limitado para la
identificación de los parásitos circulantes exclusivamente durante la fase
aguda de la enfermedad. Así, en animales que se han recuperado y se
mantienen como portadores asintomáticos, es sumamente difícil su
identificación. Por otra parte, existen procedimientos indirectos con principio
inmunológico, que permiten la detección anticuerpos específicos circulantes.
De estos los más usados son ELISA en el formato indirecto (Barros et al.,
2005; cuyas tasas de sensibilidad son superiores al 98% (Madruga et al.,
2001). En este formato se han incorporado proteínas recombinantes como la
rMSA-2c como antígenos en la prueba (Bono et al., 2008). Una técnica
descrita aunque poco utilizada es la prueba rápida de conglutinación la que ha
mostrado excelentes tasas de sensibilidad y especificidad superiores al 90%
(Madruga et al.,
2000). Otra que se ha usado es el ELISA (Montenegro-James
et al., 1990) y la inmunofluorescencia indirecta (IFI) (Cantó et al. , 2003). Con
los resultados de este tipo de pruebas, la interpretación no necesariamente
conlleva a la aplicación de tratamientos quimioterapéuticos; puede ocurrir que
un resultado positivo indique una previa exposición, pero no necesariamente
infección al momento del muestreo, en ocasiones puede tratarse de
anticuerpos calostrales en becerros, o hasta de portadores convalecientes
(Álvarez y Cantó, 1985; Figueroa et al., 1993). La magnitud que estas
enfermedades puede entenderse conociendo que la prevalencia de
babesiosis es de hasta 90% (Álvarez y Cantó, 1985) y la de anaplasmosis de
más del 50% (Rodríguez et al., 2003). En el desarrollo, adaptación y
aplicación de pruebas diagnosticas de tipo molecular en babesiosis nuestro
192

grupo de investigación ha sido pionero (Figueroa et al., 1992; 1998; Ramos et
al., 1992; Figueroa et al., 1998). Se han reportado diferentes publicaciones de
PCR para discriminación entre aislados de Babesia bovis (Lew et al., 1997), se
han comparado con pruebas serológicas (Calder et al., 1996). Recientemente
se ha descrito un PCR en tiempo real para la cuantificación de infección en
sangre de bovino infectado y en hemolinfa de garrapatas (Howell et al., 2007).
En general esta metodología resulta en un alto costo además requiere equipo
y su ejecución puede considerarse sofisticada. Por lo que es necesario
mantener su precisión, efectividad, pero tratando de hacerla más eficiente.
Una posibilidad es adaptar los sistemas individuales a PCR multiplex, para
optimizar costo y tiempo usando la misma muestra y reactivos. Por lo que el
objetivo de este en estudio fue instrumentar un ensayo de PCR-duplex para la
identificación de portadores asintomáticos de Babesia bovis y Anaplasma
marginale.
12.2 Extracción ADN
Inicialmente se adiciono saponina previo a la extracción del ADN según se
descripción previa (Figueroa et al., 1993). Posteriormente se uso un kit
comercial, basado en el uso de columnas(Mo Bio U.S.A).
1. A 100l a de paquete de glóbulos rojos previamente lavados con
Pbs. agregar 250 al de buffer de lisis (0.015 % saponina, 35m M de
NaCl Y 1mMEDTA)
2. Agitar en vortex suavemente
3. Centrifugar a 10, 000 rpm x 5 min
4. Retirar sobrenadante con una punta y agregar al pellet
1 ml. de PBS
5. Centrifugar a 10,000 rpm x 2 min.
6. Repetir pasos 4y 5.
SEGUIR PROTOCOLO MO BIO PARA EXTRACCIÓN DE ADN NÚM DE
CAT. 12334-50
Agregar 1 ml. de la sol. de lisis TD1 al pellet
Homogenizar suavemente usando una punta
Transferir la muestra a una columna de extracción
Centrifugar 30 seg. a 10,000 RPM
Descartar buffer centrifugado
Agregar a la columna 400 al de la sol.
Repetir pasos 4 Y 5
TD2
Centrifugar 1 min. a 10,000 rpm para eliminar totalmente el
buffer TD2
Transferir la columna a un tubo nuevo
Agregar a la columna 50 de la sol. TD3 justo en el centro
Centrifugar 30 seg. a 10, 000 rpm
Descartar la columna
193

Para determinar la concentración de ADN hacer una
dilución 1/100 en buffer TE
Dependiendo de la concentración envialar y congelar a -70ºC.
12.3 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Se utilizó un formato de PCR anidada por lo que se diseñaron oligonucleótidos
tomando como base secuencias previamente reportadas para B. bovis
(Figueroa et al., 1983) y para A.marginale (Torioni et al., 1998). En el diseño de
las secuencias se mantuvieron temperaturas de alineamiento (Tm) similares.
Para amplificar en PCR sencillo en B.bovis se utilizaron los oligonucleotidos:
F5 CGAGGAAGGAACTACCGATG
́ 3 ́, R5´GGAGCTTCAACGTACGAGGT3 ́.
En Anaplasma marginale F5 ́ACCTTCTGCTGTTCGTTGC3,
R5´TGTACCACTGCCATGCTTAAG3´. Par el PCR anidado las secuencia
fueron: B. bovis F5´TGGCTACCATGAACTACAAGACTTA3
́,
R5´GAGCAGAACCTTCTTCACCAT3 ́. Para A.marginale: F5
ĆATAGCCTCCGCGTCTTT3 ́,R5́CTTAAACAGCTCCTCGCCTT3.
Se usó un
gradiente de temperatura para determinar la temperatura óptima de
alineamiento para ambos agentes. Se incluyeron temperaturas de 55°C hasta
65°C. Se utilizo una mezcla maestra comercial. Se utilizaron 2.5 μl de la mezcla
maestra se agregaron 5 μl de ADN de cada parasito y 0.1 μM de cada iniciador,
se ajusto a un volumen de 25 μl. Para el PCR anidado se transfirieron 4 μl del
producto del primer PCR y se adiciono el segundo par de iniciadores. El
protocolo de amplificación fue: precalentamiento 95 C̊ 5 min un ciclo; 94 C̊ 1
min. , 60.8 C 1 min., 72 ̊C 2min. 35 ciclos y una extensión final 72 C. ̊ La
visualización de los productos de amplificación se realizó en geles de agarosa
al 2.5 %.
Secuencia de primers (iniciadores)
194

Mezcla maestra (master mix)
La extracción de ADN se llevó a cabo por separado y, antes de preparar la
mezcla maestra, los primers y el ADN se mezclaron en volumen proporcional,
ajustando finalmente con agua, para tener un volumen final de 25 L.
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13. Diagnóstico de tricomonosis
Carlos Ramón Bautista Garfias
Introducción
Tritrichomonas foetus (Excavata; Parabasalia) es un protozoario parásito
flagelado (Owen y Crews, 2006); morfológicamente es similar a T. suis
(BonDurant y Honigberg, 1994) que provoca la enfermedad conocida como
tricomonosis. Durante mucho tiempo se pensó que solo afectaba al ganado
bovino; sin embargo, recientemente se descubrió que también afecta al gato
doméstico (Gookin et al.,
1999).
En el ganado bovino, la tricomonosis es una enfermedad venérea
económicamente importante que causa infertilidad y abortos. En el gato
doméstico, es una enfermedad entérica que produce colitis y diarrea crónica
(Gookin et al.,
2006).
En el ganado bovino infecta tanto al macho como a la hembra. En el primero,
se localiza en las secreciones de la cubierta epitelial del pene, prepucio y
uretra distal donde provoca una infección asintomática persistente. En la
segunda, el parásito infecta la mucosa del tracto reproductor y da lugar a
manifestaciones clínicas distintas que oscilan desde una vaginitis o cervicitis
hasta una endometritis y aborto (BonDurant, 1997). En el gato, el parásito
reside en el lumen del ileum, ciego y colon (Gookin et al.,
2002).
La tricomonosis bovina se encuentra en áreas dónde se cría ganado vacuno
de manera natural como los E.U.A., México, Costa Rica y Argentina; mientras
que la tricomonosis felina, hasta la fecha, solo se ha detectado en los E.U.A.
Morfológicamente los organismos T. foetus son pleomórficos pero
generalmente presentan una forma piriforme con el extremo anterior
redondeado y el posterior apuntado. T. foetus mide aproximadamente 20 x 10
m
y tiene un solo núcleo y cuatro flagelos (Figura 13.1). Éstos, se originan del
complejo kinetosoma en el extremo anterior. Tres de los flagelos se
encuentran en la parte anterior, mientras que el cuarto se extiende hacia atrás.
La membrana ondulante, con tres o cinco ondas y un movimiento vibrante
característico, son características de T. foetus.
198

}
Figura 13.1. Estructura de un trofozoito de Tritrichomonas foetus.
Ciclo biológico
En bovinos, el organismo se transmite por el coito (Figura 13.2) y en los gatos
por la ingesta de materia fecal (Figura 13.3). Este protozoario se multiplica por
fisión binaria longitudinal. No hay reproducción sexual y no se han observado
estadios de resistencia del parásitos al medio ambiente (OIE, 2004).
199

Figura 13.2. Ciclo biológico de Tritrichomonas foetus en bovinos.
La tricomonosis bovina es una enfermedad de transmisión
sexual. El macho infectado ( a) es un portador asintomático que
aloja al trofozoíto de T. foetus ( b)
en el prepucio, pene y uretra
distal. Durante el apareamiento con una hembra susceptible ( c)
ocurre la transmisión de parásito que infecta los órganos
reproductores y se multiplica en ellos lo que puede provocar el
aborto. Un macho susceptible se puede infectar con T. foetus
durante el apareamiento con una hembra infectada.
Figura 13.3. Ciclo biológico de Tritrichomonas foetus en gatos.
La tricomonosis felina es una enfermedad diarreica de
transmisión orofecal. En un gato infectado ( a)
el trofozoito de T.
foetus ( b) se multiplica en la mucosa del ileum ( 1),
ciego y colon
( 2).
El parásito sale al exterior en las heces diarreicas. Un gato
susceptible ( c)
se infecta por vía oral.
200

Patogenia y lesiones
Bovino: En el macho produce una infección asintomática persistente; mientras
que en la hembra provoca vaginitis, cervicitis, endometritis y aborto entre el
segundo y el cuarto mes de gestación, (Campero y Cobo, 2006). T. foetus se
adhiere a células de mamífero y muestra citotoxicidad hacia éstas. El parásito
protozoario puede ser invasivo al feto y se ha observado en la placenta,
pulmón fetal, intestino y nódulos linfáticos
Gato: Tanto en machos como en hembras produce colitis y diarrea crónica,
principalmente en gatos jóvenes.
Signos clínicos
Bovinos: En el macho la infección asintomática; en la hembra se observa
vaginitis, cervicitis, endometritis y aborto.
Gatos: Diarrea.
Diagnóstico
El diagnóstico se puede llevar a cabo por distintos métodos que van desde la
historia clínica, cultivo in vitro (Pérez et al.,
2006), examen microscópico
directo de secreciones, pruebas inmunológicas como el ensayo
inmunofluorescente (IFA por sus siglas en inglés) (Corbeil et al.,
2008) y el
ensayo inmunoenzimático (ELISA) (Voyich et al.,
2001), hasta ensayos de
biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)(Níkel
et al. , 2002; Parker et al., 2003; Grahn et al., 2007; Dufernez et al.,
2007;
Kennedy et al.,
2008) y PCR en tiempo real (MacMillen y Lew, 2006).
Colecta de muestras y cultivo in vitro.
Colecta de muestras
De acuerdo con la OIE (2004) es importante evitar la contaminación fecal al
colectar las muestras prepuciales de los toros o bien muestras vaginales de las
vacas, ya que se pueden introducir protozoarios intestinales que pueden
confundirse con T. foetus.
Se debe eliminar el material externo y los pelos
sucios del alrededor del orificio prepucial o de la vulva, pero debe evitarse la
limpieza del área con desinfectantes, ya que puede disminuir la sensibilidad
del diagnóstico. En los toros se colectan las muestras por medio del raspado
de la mucosa prepucial y del pene con una pipeta de inseminación artificial o
una escobilla metálica, mediante lavado prepucial o bien lavando la vagina
artifical después de haber colectado el semen. Esta última técnica no es
recomendable ya que su sensibilidad puede ser menor. Las muestras de vacas
se recogen por medio del lavado de la vagina o raspando el cérvix con una
pipeta de inseminación artificial o una escobilla metálica.
201

Cuando las muestras deban enviarse a un laboratorio y no puedan recogerse
en 24 horas posteriores a la colecta, debe utilizarse un medio de transporte(por
ejemplo, medio de Winters, solución salina martiguadota de fosfatos con suero
fetal bovino al 5%, o leche descremada, con o sin antibióticos (Reece et al.,
1983) o en tioglicolato (Bryan et al.,
1999), o la bolsa de plástico de cultivo de
campo (Bryan et al., 1999, Thomas et al.,
1990). Las muestras deben
protegerse de la exposición a la luz y deben mantenerse arriba de 5°C y por
debajo de los 38°C (Bryan et al.,
1999).
Cultivo in vitro
1. La muestras se inoculan en un medio de cultivo comercial (InPouch TF;
Biomed Diagnostics; San Jose, California, USA) o en medio de transporte al
tiempo de la colecta; en este caso dicho medio se transfiere, el mismo día de la
colecta, al medio modificado de Diamond (MDM)(Bryan et al.,1999).
El
material de vidrio utilizado debe lavarse con agua destilada, evitando el uso de
detergentes. EL MDM consiste en: 2 g de tripticasa de peptona, 1 g de extracto
de levadura, 0.5 g de maltosa, 0.1 g de clorhidrato de L-cisteina y 0.02 g de
ácido ascórbico y se lleva hasta 90 mL con agua destilada que contiene, de
cada uno, 0.08 g de H2HPO4 y KH2PO4, y se ajusta hasta pH 7.2-7.4 con
hidróxido sódico o ácido clorhídrico. Después de la adición de 0.05 g de agar, el
medio se coloca en la autoclave durante 10 minutos a 121°C. Se deja enfriar
hasta los 49°C y entonces se añaden asépticamente 10 mL de suero de bovino
inactivado (inactivado mediante calentamiento hasta 56°C durante 30
minutos), 100,000 unidades de penicilina G cristalizada y 0.1 g de sulfato de
estreptomicina. El medio se reparte asépticamente en alícuotas de 10 mL en
viales estériles de 16 x 125 mm con tapón de rosca y se refrigeran a 4°C hasta
su uso (OIE, 2004).
1. Las muestras sembradas, tanto en el kit comercial como en el MDM se
incuban a 37 C y se examinan por microscopia de luz en los días uno, cuatro y
ocho después de la colecta.
2. En las muestras donde se observen los organismos, se preparan laminillas
fijadas y teñidas con una tinción Yodo Wright-Giemsa (Lun y Gajadhar, 1999).
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Actualmente se dispone más información sobre el uso de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) (Níkel et al. , 2002; Parker et al., 2003; Grahn et
al., 2007; Dufernez et al., 2007; Kennedy et al.,
2008) y PCR en tiempo real
(MacMillen y Lew, 2006) para la detección de T. foetus.
Las secuencias de los primers (secuenciadores) que utilizaron Níkel et al.,
(2002) en su PCR mejorada, que amplifican una región del gene ARN
ribosomal 5.8S de T. foetus y que proporcionaron buenos resultados son las
siguientes:
202

Upstream primer (TF211A):
5'CCTGCCTGTGGATCAGTTTCGTTA3'
Downstream primer (TF211B):
5'GCGCAATGTGCATTCAAAGATTCG3'
Tratamiento
Bovinos: Hasta la fecha no hay un medicamento aprobado para tratar esta
enfermedad en los bovinos; sin embargo, estudios experimentales con AlPcS
(4) y terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas en inglés) son alentadores para
el desarrollo de nuevos tratamientos de la tricomonosis bovina (Silva et al.,
2007). Cabe señalar que las hembras infectadas a las que si se les da un
descanso sexual y tratamiento sintomático regresan a la viabilidad
reproductiva. Por el contrario, el macho permanece como portador
asintomático y representa un riesgo de infección para las hembras.
Gatos: Se ha demostrado que la administración oral de ronidazole (30 a 50
mg/kg) cada 12 horas durante 14 días controla la diarrea y erradica la infección
(Gookin et al.,
2006). Lo anterior es importante ya que se ha informado que es
posible infectar vaquillas con un aislado de T. foetus de origen felino (Stockdale
et al.,
2007).
Epidemiología
De acuerdo a la OIE, la tricomonosis (Trichomoniasis, clasificada como B112)
es una enfermedad venérea del ganado cuya distribución es mundial (OIE,
2004). Entre 1990 y 2004 se publicaron siete trabajos sobre tricomonosis
bovina en México (García, Milián yAnaya, 2005).
Prevención y control
Algunas de las recomendaciones para la prevención incluyen:
1) Control del desplazamiento de los animales.
2) Evitar que los animales pasten en terrenos públicos.
3) Comprar solo vaquillas o toros vírgenes.
4) Obtener cultivos de muestras de prepucio (ver colecta de muestras)
de todos los toros que se compren.
5) Las vacas y vaquillas que se compren deben ser criadas de manera
separada.
6) mantener hasta donde sea posible la juventud (edad promedio) de
los toros del hato.
7) Limitar la longitud de la época de apareamiento (60 a 90 días).
8) No usar vacas de condición desconocida durante la época de
apareamiento. 9) Se sugiere llevar a cabo inseminación artificial con
semen de toros libres de la enfermedad.
203

Para el control se sugieren las siguientes medidas:
1) Acelerar el diagnóstico (por ejemplo mediante PCR) y remoción
de toros infectados.
2) Comprar sementales negativos a pruebas de diagnóstico (cultivo
in vitro y PCR).
3) Reducir la edad promedio del toro del hato. Se sugiere mantener
un solo semental por hato para reducir el riesgo potencial a la
enfermedad.
4) Criar los mismos toros con el mismo ganado entre una y otra
temporada de apareamiento hasta que la enfermedad se haya
controlado.
5) Reducir el tiempo de la temporada de apareamiento a no mas de
90 a 120 días y llevar a cabo examen de preñez de 45 a 60 días
después. Conformar hatos de alto y bajo riesgo.
6) Cualquier vaca que aborte o muestre descargas uterinas debe ser
aislada y examinada para determinar la presencia de la
enfermedad y diferenciarla de campilobacteriosis bovina,
7)
leptospirosis y brucelosis.
Si es posible, se debe vacunar a todas las hembras del hato con
una
vacuna aprobada contra tricomonosis, en el caso de que el
biológico esté disponible (por ejemplo las vacunas Trich Guard o
Trich Guard V5L de Fort Dodge Laboratorios, Fort Dodge, Iowa,
E.U.A.). En el caso de México, aún no hay disponibilidad del
biológico. Los estudios realizados hasta la fecha en países
latinoamericanos como Argentina indican que la efectividad de las
vacunas contra tricomonosis bovina es variable y se requiere
llevar a cabo mas ensayos de campo (Cobo y Campero,
2002;Campero y Cobo, 2006).
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207

Lecturas complementarias
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Institute.1994:
http://cati.csufresno.edu/sjer/rese/94/940301/index.html
2. Tricomonosis felina:
http://www.tffelines.com/whatistf.html;
http://www.fabcats.org/tritrichomonas.htm
208

14. Diagnóstico Serológico de las Infestaciones por Oestrus ovis
Carlos Ramón Bautista Garfias
14.1. Introducción
La infestación por larvas de O. ovis (gusano de la nariz de los borregos) es
conocida como estrosis. En presencia de la mosca, las ovejas y las cabras se
alteran mucho, agitando sus cabezas, empujando sus fosas nasales en el
polvo, resoplando, lo que indica intentos por escapar de algo que persiste en
entrar en sus fosas nasales. En los animales parasitados hay una descarga
purulenta de las fosas nasales, agitación vigorosa de la cabeza y a veces la
descarga ocasional de las larvas, pérdida del apetito y rechinido de los dientes.
Cuando los animales caminan, sus patas delanteras son levantadas como si
estuvieran dando de manotazos. La mayoría de los casos de estrosis no
terminan fatalmente, pero la muerte puede ocurrir en una semana o menos
después de la aparición de signos agravados (Hall y Wall, 1995).
Oestrus ovis L. es una especie de mosca ampliamente distribuida en el
mundo; es un poco mas pequeña que la abeja doméstica ( Apis mellifera),
con
la que tiene cierto parecido. Las larvas de O. ovis son las causantes de la
enfermedad conocida como estrosis. Clasificación de O.ovis:
Reino: Animalia,
Phylum: Arthropoda, Clase: Insecta, Orden: Diptera, Suborden: Brachycera,
Familia: Oestridae, Subfamilia: Oestrinae, Especie: Oestrus ovis (Myers et al.,
2008).
Las larvas de O. ovis son parásitos obligados de los conductos nasales de
ovejas ( Ovis aries) y cabras ( Capra hircus)
(Hall y Wall, 1995; Yilma y Dorchies,
1991; Cepeda et al., 1999; Murguia et al., 2000; Yacob et al.,
2004) y
ocasionalmente infectan ojos (oftalmomiasis), boca, nariz y oídos en el
hombre ( Homo sapiens) (Hall y Wall 1995, Sigauke et al.
2003; Masoodi y
Hosseini 2004, Dunbar et al. 2008, Pandey et al. 2009; Thakur et al.
2009). En
los últimos años se ha sugerido que las larvas de O. ovis podrían actuar como
vectores de enfermedades producidas por priones en animales (por ejemplo,
Scrapie) y el hombre (Lupi 2003, 2005; Botelho y Lupi 2008; Corona et al.
2006, 2009)
En la figura 14.3.1 se muestra el ciclo biológico de esta especie miasígena.
El diagnóstico es difícil puesto que se puede confundir con los signos
provocados por otras enfermedades; sin embargo, con base en el
conocimiento de que los borregos y cabras montan una respuesta inmunitaria
contra las larvas (Bautista, 1987, 1996; Tabouret et al.,
2003), se han
desarrollado pruebas serológicas para la detección de anticuerpos circulantes
contra las larvas de esta mosca (Bautista et al., 1982, 1988; Tabouret et al.
2001;Otranto et al.,
2004).
209

Figura 14.3.1.Ciclo biológico de Oestrus ovis (Bautista 2006).
14.2. Preparación de antígeno de larvas de Oestrus ovis
De acuerdo con estudios previos, se recomienda colectar larvas del segundo
estadio (L2) de O. ovis a partir de ovejas o cabras sacrificadas en el rastro.
Luego, las larvas se lavan minuciosamente con solución salina amortiguadora
de fosfatos (pH 7.2) estéril, conteniendo inhibidores de proteasas y se
maceran con un homogeinizador de cristal en baño de hielo. A continuación, el
macerado se deja en agitación lenta utilizando un rotor magnético durante 18
horas a 4 °C. Transcurrido ese tiempo, la suspensión se centrifuga a 5000 x g
durante 30 minutos (4°C) en una centrífuga refrigerada. Posteriormente, se
colecta el sobrenadante que constituye “el antígeno” y se descarta el
sedimento. Finalmente, se determina la cantidad de proteína por medio del
método de Lowry et al.
(1951) o de Bradford, y se envasa el antígeno en
alícuotas que se congelan a -70 °C hasta su uso.
14.3. Prueba de Inmunoensayo en Capa Delgada (ICD)
Esta prueba, relativamente fácil de hacer y de bajo costo, es ideal para
llevarse a cabo en el campo ya que no requiere de condiciones complicadas
para llevarse a cabo. La técnica se basa en la capacidad de muchas
preparaciones antigénicas de adsorberse con firmeza a superficies de plástico
(poliestireno) y de formar una capa homogénea que mantiene su actividad
serológica, sobre la que se colocan diluciones de los sueros a analizar.
Después de un periodo de incubación, lavado y secado, la interacción
antígeno-anticuerpo es visible cuando la superficie se expone al vapor de agua
o al vaho de la boca. En el sitio en el que ocurrió una respuesta específica
antígeno-anticuerpo se observa la formación de gotas de agua de mayor
tamaño en comparación con las que se forman en el lugar donde no se
210

presentó una reacción antígeno-anticuerpo y solo se encuentra el antígeno
( Figura 14.3.2).La
condensación del agua en el área de la reacción antígenoanticuerpo
específica se debe a la formación de complejos proteícos
hidrofílicos de un tamaño mayor a los del antígeno soluble.
Figura 14.3.2. Fotografía de la prueba de ICD. La flecha indica el
lugar de inicio de las diluciones de un suero positivo a anticuerpos
específicos contra el antígeno adsorbido a la placa (en este caso
el suero titulado fue positivo a una dilución 1:1024). Es posible
observar la diferencia en los patrones de condensación de agua.
14.3.1. Procedimiento de la prueba
1.
2.
3.
Se usan cajas de Petri de plástico (poliestireno) “nuevas”,
preferentemente de 8.5 cm de diámetro.
Cada caja se lava con 10 ml de etanol al 70% y se seca con la
ayuda de un ventilador.
Se vierten 15 ml de solución salina por caja y luego se agrega el
antígeno en cantidad suficiente para obtener una concentración
final de 180 g/ml.
211

4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Las cajas se incuban en cámara húmeda a 37°C durante 30
minutos.
Se elimina el antígeno y cada caja se lava tres veces con agua
destilada.
Secar las cajas con el ventilador, ya están sensibilizadas. Pueden
utilizarse inmediatamente o guardarse en cámara húmeda a 4°C
(máximo una semana) para su uso posterior.
Para la titulación de un suero conocido, se hacen diluciones dobles
empleando solución salina amortiguadora de fosfatos (SSAF) pH
7.2 como diluyente.
Colocar 5 microlitros de cada una de las diluciones en la superficie
de la caja con una separación aproximada de 1 cm entre una y otra
( Figura 14.3.2).
Cuando el número de gotas sea mayor de 10, es
recomendable colocar un rodete de papel humedecido en la
cubierta de la caja, que funcionará como cámara húmeda interna y
evitará que las gotas se sequen.
Incubar en cámara húmeda a 37°C durante 60 minutos.
Retirar las cajas de la cámara, quitar el papel filtro de cada cubierta
y llenar ésta con agua a 60 °C; invertir cada caja sensibilizada
sobre la cubierta, dejándola así por aproximadamente 60
segundos.
Lavar cada caja tres veces con agua destilada y luego secarla
perfectamente con el ventilador.
Llenar nuevamente la cubierta de cada caja con agua a 60°C,
luego invertir la caja sobre la cubierta y dejarla por un tiempo
aproximada de entre 45 a 120 segundos.
14.3.1.2. Interpretación de la prueba
En los sitios donde se colocan los sueros que contiene anticuerpos
específicos contra el antígeno adsorbido en la caja, se observa una
condensación de agua mayor que la que ocurre en el resto de la superficie de
la caja y ésta será inversamente proporcional a la dilución de suero ( Figura
14.3.3). La lectura se hace considerando los siguientes parámetros:
(+) Gotas grandes que llenan la superficie de aplicación del suero.
( -)
Patrón de condensación igual a la superficie donde no se aplicó suero.
212

Figura 13.3.3. Prueba de ICD. A,
Patrón de colocación de los
sueros; B,
sugerencia del número de sueros a probar en una
placa de poliestireno de 8.5 cm de diámetro.
14.4. Ensayo Inmunoenzimatico (ELISA).
En los últimos años uno de los ensayos que más se han utilizado para la
detección de anticuerpos IgG anti-O. ovis en ovinos y cabras es el ELISA
utilizando diferentes antígenos (Goddard et al., 1999; Bauer et al.,
2002;
Papadoupolus et al., 2006; Angulo-Valadez et al.,
2008). Sin embargo, este
ensayo se puede llevar a cabo en laboratorio utilizando el antígeno de L2
(descrito en esta sección) diluidos a 2 μg/ml en buffer de carbonatos (0.015 M
Carbonato de Sodio, 0.03 M Bicarbonato de Sodio, pH 9.6) y distribuidos en
placas de 96 pozos (Nunclon surface, Nunc, Denmark). Se incuba por 1 hora a
37 ºC y luego toda la noche a 4 ºC. Los pozos se lavan tres veces con PBST
(0.01 M fosfato, 0.15 M cloruro de sodio, pH 7.2 y 0.1% Tween 20).
Los pozos cubiertos con antígeno se incuban 30 minutos a 37 ºC con una
solución de leche descremada al 10% y luego se descarta la solución. Se
adicionan muestras de suero diluido 1:50 (cabras) ó 1:200 (ovejas) en PBST y
se lavan tres veces con PBST antes de adicionar el anticuerpo conjugado con
peroxidasa (anti-IgG de cabra (No. #A5420) ó anti-IgG de oveja (No. #A3415),
Sigma, St. Louis, MO) diluido 1:2000 en buffer de carbonatos (60 minutos de
incubación a 37 ºC).
Se hacen tres lavados finales con PBST antes de adicionar e incubar (37 ºC)
100 μl por pozo del cromógeno
(0.4 mg/ml OPD (No. P5412) para cabras ó
ABTS (No. P6782) para ovejas, Sigma, St. Louis, MO). Después de 1 hora, las
densidades ópticas (DO) se determinan con un espectrofotómetro al medir la
213

absorbancia a 454 nm (cabras) 405 nm (ovejas).
Se utilizan sueros negativo (animales no infectados con O. ovis)
y positivo
(animales infectados con O. ovis)
se usaron como controles de referencia. Los
resultados se pueden expresar como % del control positivo como sigue
(Angulo-Valadez et al., 2008, 2009):
(En general se acepta que un animal se puede considerar postitivo si el valor
obtenido es mayor a 20% del control positivo)
Literatura citada
1.
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Anticuerpos (%)
=
DOmuestradesuero–DOcontrol
negativo
DO control positivo – DO control
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217

15. Preparación de soluciones comúnmente empleadas en el laboratorio
de Parasitología Veterinaria
Edmundo E. Rojas Ramírez
A.- Soluciones de flotación
a) Salina isotónica
b) Salina saturada
c) Glucosada
d) Sulfato de zinc
B.- Soluciones para fijación
a) Formol al 10%
b) Alcohol al 70%.
C.- Tinciones
a) Lugol
b) Carmín Bórax
c) Carmín bórax de Grenacher
d) Azul de metileno
e) Carmín propiónico
f) Giemsa
g) Violeta de genciana
h) Colorante de Romanyl
i) Colorante de Wright
D.- Soluciones para montajes
a) Líquido de Hoyer
b) Solución de Faure
c) Xilol fenicado y creosotado
E.- Soluciones empleadas en la Técnica de ELISA
a) Solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) 0.1 %
b) Solución amortiguadora de carbonatos (SAC) pH 9.6
c) Solución concentrada de fosfatos
d) Solución salina amortiguadora de fosfatos (SSAF) 1X Tween-20 0.05 %, pH
7.2.
e) Solución de bloqueo, leche descremada al 5 %
f) Solución amortiguadora de Tris pH 9.5
F- Soluciones empleadas para el análisis de ácidos nucleicos en geles de
agarosa
a) TBE 5x
b) EDTA(0.5 M pH 8)
c) TBE 0.5x
d) Bromuro de Etidio (10 mg/ml)
e) Agarosa 1 %
f) Agarosa 2 %
218

G- Soluciones varias
a) Jugo gástrico artificial
b) Solución para evaginar cisticercos
c) Lactofenol deAmann
H.- Lecturas recomendadas
Introducción
Las soluciones en química, son mezclas homogéneas de sustancias en
iguales o distintos estados de agregación. La concentración de una solución
constituye una de sus principales características y expresa la relación de la
cantidad de soluto con respecto de la cantidad de solvente. La sustancia
disuelta se denomina soluto y está presente generalmente en pequeña
cantidad en comparación con la sustancia donde se disuelve denominada
solvente.
Estas soluciones especiales permiten la confiabilidad de las técnicas
empleadas para el diagnóstico de laboratorio en Parasitología Veterinaria.
A.- Soluciones de flotación
Las soluciones de flotación tienen como principio la separación de partículas
en una fase líquida. Estas soluciones separan partículas de mayor y menor
densidad.
a) Salina isotónica
Las soluciones salinas isotónicas son utilizadas con la finalidad de mantener el
equilibrio osmótico cuando se lavan células cuya integridad física requiere ser
mantenida, por ejemplo las células sanguíneas pueden ser lavadas con esta
solución sin sufrir daños aparentes.
Cloruro de sodio…………….. 8.5 g
Agua destilada c.b.p………… 1000 mL
Se coloca el cloruro de sodio en un matraz de 1 litro y se completa el volumen
b) Salina saturada
Una de las utilidades de esta solución es para las técnicas de flotación de
huevos de parásitos para su identificación morfométrica.
Agua destilada………………. 1000 mL
Cloruro de sodio…………….. Asaturación
Agregar el cloruro de sodio poco a poco y agitar hasta que ya no se disuelva,
hasta llegar al punto de saturación.
c) Glucosada
Útil para las técnicas de flotación de huevos de parásitos, para su
219

identificación morfométrica.
Azúcar……………………….. 1280 g
Agua destilada……………… 1000 mL
Formol al 10%....................... 25 mL
La densidad puede variar de entre 1:05 y 1:15.
d) Sulfato de zinc
También ésta solución es empleada en las técnicas de flotación de huevos de
parásitos para su identificación morfométrica.
Sulfato de zinc……………….. 333 g
Agua destilada……………… 1000 mL
La densidad deberá ser de 1: 18.
Densidad de algunas soluciones comunes en el laboratorio de Parasitología:
Sal Densidad
Nacl
NaNO3
Mg SO4
ZnSo4
NaNO3
ZnSO4
MgSO4
HgI y KI
Saturación
Saturación
Saturación
Saturación
380 g/l de agua
333 g/l de agua
335 g/l de agua
10gdeHgl+7.4g
De KI en 26.5 litros
de agua
1:20
1:39
1:30
1:49
1:20
1:18
1:28
1:44
B.- Soluciones de fijación
Indicadas principalmente para la preservación de especímenes
histopatológicos.
a) Formol al 10%
Esta solución es comúnmente utilizada para la fijación de estructuras
celulares ó el mantenimiento de la estructura de organismos
microscópicos y macroscópicos
.
Formol…………………….. 10 c.c.
Agua destilada……………. 90 c.c.
220

) Alcohol a diferentes porcentajes
Para la fijación de nemátodos éstos deben previamente colocarse en cajas de
Petri con Solución Salina Fisiológica o bien en Solución de Ringer, lavarlos
varias veces y antes de 24 hrs se fijan y se colocan en una solución
conservadora.
C.- Soluciones colorantes
Los colorantes biológicos están adaptados a propósitos especiales. Se utilizan
en diversos procedimientos. En parasitología animal principalmente para
colorear microorganismos en frotis principalmente para colorear rickettsias y
protozoos.
a) Lugol
Se usa principalmente para preservar y teñir protozoos
Cristales de yodo…………….. 5 g
Yoduro de potasio……………. 10 g
Agua destilada………………. 100 mL
Se disuelve el yoduro de potasio en el agua y enseguida se agregan los
cristales de yodo, agitando constantemente para que se disuelva la mayor
cantidad posible. Se guarda en frascos ámbar, procurando que todo el exceso
de yodo que queda en el sedimento también se vacíe en el frasco; esto se hace
para que la solución permanezca con la concentración deseada durante
mucho tiempo.
b) Carmín bórax
% Alcohol etílico Absoluto Agua destilada
30
50
70
80
35 ml
55 ml
73 ml
85 ml
Carmín………………………….. 1.5 g
Bórax…………………………… 2.0 g
Agua destilada………………. . 50.0 mL
221
65 ml
45 ml
27 ml
15 ml

c) Carmín bórax de Granacher
Carmín......................................... 3.0 g
Bórax (puro)................................ 4.0 g
Agua destilada.......................... 100 mL
Alcohol al 70%........................... 100 mL
Agregar el Carmín y el bórax al agua, dejar hervir y disolverlos durante 30
minutos, posteriormente agregar el alcohol al 70% y dejar sedimentar por 48
horas. Por último filtrar.
d) Azul de metileno
Principalmente usado para estudiar morfología de microorganismos.
Azul de metileno……………….. 0.3 g
Hidróxido de potasio…………… 0.01 g
Alcohol etílico…………………… 30.0 mL
e) Carmín propiónico
Carmín…………………………… 1 g
Ácido propiónico………………... 100 mL
Hervir la mezcla hasta obtener una solución saturada. Se enfría y se filtra. La
mezcla se mantiene en refrigeración. El ácido propiónico se puede sustituir por
ácido acético, dando resultados similares.
f) Giemsa
Se utiliza para teñir frotis de sangre, donde además de las células sanguíneas
se observan los microorganismos. Primero se fija el frotis con alcohol metílico,
después se cubre con colorante y se lava con agua de la llave.
Metanol absoluto…………………. 610 mL
Glicerina…………………………. 390 mL
Colorante de Giemsa…………… 6.75 g
Disolver el polvo (colorante) poco a poco en la glicerina y dejar en agitación
continua a 60ºC por 24 horas. Dejar enfriar a temperatura ambiente en
agitación (aprox. 1a2horas). Posteriormente agregar el metanol y dejar en
agitación constante por otras 24 horas. Filtrar la solución en papel Whatman
No. 1. Este proceso es tardado.
Debe conservarse en frascos ámbar o plástico opaco, evitar que la luz del sol le
de en forma directa. Dejar incubar a 37º por lo menos 7 días antes de usar.
222

g) Violeta de Genciana
Principalmente usado para bacterias anaerobias.
Cristal violeta……………………. 1 g
Agua destilada………………….100 mL
Se hierve la solución, se filtra y se deja reposar una semana. Se utiliza como
colorante en la técnica de sedimentación.
h) Colorante de Romanyl
Esta solución se emplea para conservar órganos con su color natural. Los
trozos de órganos se fijan con formol al 5% durante 30 minutos, se enjuaga y
se colocan en el colorante de Romanyl. Cerrar herméticamente el frasco
sellando con resistol, ya que si le entra oxígeno, la solución toma una
coloración obscura.
Formol al 40%................................ 120 mL
Piridina…………………………… 10 mL
Hidrosulfito de sodio…………….. 20 g
Agua destilada............................. 1000 mL
Nicotina cruda 5%.......................... 10 mL
i) Wright
Colorante de Wright…………….. 0.6 g
Alcohol metílico………………….. 360.0 mL
D.- Soluciones para montajes
Empleadas principalmente para la preservación de huevos y parásitos
adultos.
a) Líquido de Hoyer
Empleado principalmente para el montaje de ácaros
Agua destilada………………….. 50 mL
Goma arábiga…………………... 30 mL
Hidrato de cloral............................200 g
Glicerina.........................................20 mL
b) Solución de Faure
Recomendada para montar nematodos adultos.
Hidrato de cloral………………… 100 g
Goma arábiga................................ 60 g
Glicerina.......................................... 40 mL
Agua destilada............................. 100 mL
223

c) Xilol fenicado creosotado
Xilol……………………………… 60 mL
Creosota de Haya……………… 40 mL
Fenol……………………………. 3 mL
E- Soluciones empleadas en el ELISA
Las soluciones amortiguadoras son disoluciones que por el agregado de
cantidades moderadas de ácidos o bases fuertes mantienen prácticamente
constante el pH
Solución de lauril sulfato de sodio (LSS) o dodecil sulfato de sodio (SDS)
0.1 %.
Detergente iónico que dispersa los componentes iónicos de las membranas y
desnaturaliza las proteínas
SDS……………………………… 0.1 g
Agua destilada…………………. 100 mL
Diluir 0.1 de SDS en 100 ml de agua destilada y se almacena a temperatura
ambiente hasta su utilización.
b) Solución amortiguadora de carbonatos (SAC) pH 9.6
Carbonato de sodio Na2CO3P.M. 106 (30 mM).……… 3.18 g
Bicarbonato de sodio NaHCO3 a 84.01 (70 mM)....… 5.88 g
Agua destilada…………………………………………… 1000 mL
Se disuelven las sales en 800 ml de agua destilada. Se ajusta el pH a 9.6 y se
afora a 1000 ml. Guardar a 4º C
c) Solución amortiguadora de fosfatos concentrada 0.1 m (SAF 10X)
Fosfato de sodio monobásico hidratado
(NaH2PO4H2O) 19Mm……….................. 2.62 g
Fosfato de sodio dibásico anhidro
(Na2HPO4H2O) 81Mm………………………11.5 g
Aguadestilada………………………………1000 mL
Disolver las sales en 800 mL de agua destilada, si es necesaria se calienta
para disolver los cristales, se afora a 1000 mL y se guarda a 4ºC.
d) Solución salina amortiguadora de fosfatos (SSAF) 1X Tween-20
0.05%, pH7.2.
Cloruro de sodio NaCl a 0.875%................8.75 g
SAF 10X Tween 20……………………………20 mL
Agua destilada………………………………1000 mL
224

e) Solución de bloqueo, leche descremada al 5 %.
Leche descremada…………………………… 1 g
SSAF 1X Tween 20………………………….20 mL
Se disuelve la leche en SSAF 1X Tween 20, esta cantidad es suficiente para
una placa y se prepara al momento en que se va a utilizar.
f) Solución amortiguadora de Tris pH 9.5.
Trizma base C4H11NO3a0.1 mM…………...............21.11 g
Cloruro de magnesio anhidro Mg CL2 a 50 mM………4.7 g
Cloruro de sodio NaCl……………………………………2.92 g
Agua destilada……………………………………………1000 mL
Disolver en 800 mL de agua destilada el MgCl2 y una vez disuelto se agrega el
NaCl y al final el C4H11NO 3,
ya disueltos se ajusta el pH a 9.5 y se afora a 1000
ml y se guarda a 4 ºC.
F.- Soluciones utilizadas para electroforesis de los productos de PCR
En la electroforesis de los productos de PCR la agarosa comúnmente se
emplea para la elaboración de geles. Una vez polimerizados, los geles pueden
ser empleados para separar fragmentos de DNA. La electroforesis utiliza un
campo eléctrico para separar moléculas de diferente tamaño las cuales al
pasar por el gel las más pequeñas se mueven más rápido que las grandes. El
agar del gel de agarosa es elaborado de algas marinas altamente purificadas
empleadas para separar moléculas de DNA con rangos de longitud desde 100
hasta de 10, 000 nucleótidos. El gel es sumergido en una cámara con la
solución TBE.5x que conduce la corriente eléctrica. Las muestras de DNA
(puede ser un producto de amplificación por PCR) son depositadas en los
pozos elaborados previamente con peines especiales introducidos en la
agarosa y se le adiciona un buffer de carga adicionado con dos colorantes que
dejan una banda visible color azul para saber cuánto se ha separado la
muestra. Los grupos fosfato en la estructura de DNA se cargan negativamente
debido a las cargas negativas que le otorga el oxígeno al grupo fosfato, el DNA
se mueve atraído por el polo positivo cuando se somete a un campo eléctrico.
En la elaboración del gel se adiciona un colorante que se vuelve fluorescente
cuando se intercala con el DNA (Bromuro de Etidio que se une estrechamente
a la doble hélice del DNA), el complejo emite luz en la región visible del
espectro cuando es excitado por luz ultravioleta, lo que permite observar la
separación de los fragmentos de DNA.
a) TBE 5x
Tris base molecular SIGMAChemical Co……………54 g
Acido bórico Electrophoresis Reagent SIGMA………27.5 g
EDTA0.5 M pH 5……………………………………… 20 mL
225

) EDTA (0.5 M pH 8)
Disodio EDTA2H2O SIGMAChemical Co………… 186.1 g
Agua destilada……………………………………………800 mL
Agitar vigorosamente y ajustar el pH a 8
c) TBE 0.5x
TBE 5x…………………………………………………100 mL
Agua mQ esterilizada………………………………...900 mL
Mezclar el TBE 5x con el agua mQ y aforar a 1000 ml
d) BROMURO DE ETIDIO (10 mg/ml)
Bromuro de etidio………………………………………1 g
H O……………………………………………………100 mL
2
Mezclar con un agitador magnético durante algunas horas y almacenar en un
recipiente de aluminio o un frasco oscuro
e) AGAROSA 1 %
TM
Agarosa GIBCOBRL ultra PURE LIFE TECHNOLOGIES…………….. 1 g
TBE 0.5x………………………100 mL
Pesar 1gdeagarosa y mezclar con el TBE 0.5x. Calentar la mezcla hasta
derretir todos los grumos.
e) AGAROSA2 %
TM
Agarosa GIBCOBRL ultra PURE LIFE TECHNOLOGIES…………….. 2 g
TBE 0.5x………………………100 mL
Pesar 2gdeagarosa y mezclar con el TBE 0.5x. Calentar la mezcla hasta
derretir todos los grumos.
G- Soluciones varias
a) Jugo gástrico artificial
Se utiliza para el diagnóstico de larvas histotrópicas de nemátodos
gastroentéricos, además de ser ampliamente empleada para el diagnóstico de
la triquinelosis
Pepsina……...............................6 g
Ácido clorhídrico.........................7 mL
Agua destilada......cbp................1000 mL
226

) Solución para evaginar cisticercos.
Sol. Sal. Fisiológica…………… 50 mL
Bilis de bovino…………………. 40 mL
Calentar a 40º C en baño Maria y colocar los cisticercos en un recipiente junto
con esta solución por espacio de dos horas.
c) Lactofenol de Amann
Esta solución se recomienda para el aclarado de la cutícula de helmintos con el
propósito de observar las estructuras internas.
Fenol……………………………. 20 g
Glicerina………………………… 40 mL
Acido láctico……………………. . 20 mL
Agua destilada……………cbp 100 mL
Literatura recomendada
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Parasitología Veterinaria. Asociación Mexicana de Parasitología
Veterinaria A.C.: Diagnóstico de las parasitosis internas de los rumiantes
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(ELISA). A guide with abstracts of microplate applications. Dynatech
Laboratories, INC. 1979.
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16. Consideraciones sobre las pruebas comúnmente utilizadas para el
diagnóstico de enfermedades parasitarias de los rumiantes
Carlos Ramón Bautista Garfias
16.1. Consideraciones generales
La selección de una determinada prueba de diagnóstico, dependerá de
diferentes factores que se deberán tomar en cuenta según sea el caso. En este
sentido, se encuentran las características del hospederero y del parásito, tipo
de prueba e infecciones concurrentes, entre otros factores, si es que se
pretende llevar a cabo el diagnóstico adecuado y por consiguiente el
tratamiento o control de determinada enfermedad parasitaria.
En los siguientes tres cuadros se resumen las consideraciones generales
sobre las pruebas de diagnóstico. En el 16.1, se indican algunas de los
principales puntos a tomar en cuenta, como son por ejemplo, si el parásito es
helminto o protozoario, qué tipo de enfermedad provoca, el tipo de respuesta
de acuerdo a la especie animal afectada, qué características posee la prueba
de diagnóstico a utilizarse y, en el caso de la pruebas inmunológicas, las
propiedades del antígeno utilizado en la prueba de diagnóstico. En el 16.2 se
señalan los puntos relativos a las pruebas de diagnóstico confiables y en el
16.3 se indican los criterios utilizados para la selección de pruebas de
diagnóstico confiables.
Cuadro 16.1. Consideraciones sobre las pruebas de diagnóstico
229

Cuadro 16.2. Pruebas de diagnóstico confiables
Cuadro 16.3. Criterios para la selección de pruebas de
diagnóstico confiables
16.2. Sugerencias sobre la utilización de este libro
En las siguientes tres figuras, se propone de manera gráfica y rápida qué
capítulos consultar en este manuscrito para el diagnóstico de enfermedades
parasitarias comunes de bovinos (Figura 16.1) de ovinos (Figura 16.2) y de
caprinos (Figura 16.3).
230

Figura 16.1. Sinopsis del diagnóstico de algunas parasitosis de
bovinos utilizando este manuscrito.
231

Figura 16.2. Sinopsis del diagnóstico de algunas parasitosis de
ovinos utilizando este manuscrito.
232

Figura 16.3. Sinopsis del diagnóstico de algunas parasitosis de
caprinos utilizando este manuscrito.
16.3. Algunos laboratorios reconocidos de diagnóstico parasitológico
veterinario
CENID-PAVET del INIFAP, Carr. Fed. Cuernavaca-Cuautla No. 8534 Col.
Progreso, Jiutepec, Estado de Morelos. C.P. 62550. Tel (777) 319-2848.
CENAPA (SENASICA), Carr. Fed. Cuernavaca-Cuautla No. 8534 Col.
Progreso, Jiutepec, Estado de Morelos. C.P. 62550. Tel. (55) 5905 1000 ext.
53117
Departamento de Parasitología, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,
UNAM. Circuito Exterior, Ciudad Universitaria, Delegación Coyoacán, México,
D.F. C.P. 04510. Tel. (55) 5622 5999 ext. 12
233

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Esta publicación se imprimió en Diciembre de 2010
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