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78 Ensayos para agua dulce Inoculación de las algas en medio sólido para su preservación Bajo condiciones de esterilidad, se transfieren con un asa bacteriológica las algas cultivadas en medio sólido al tubo con medio fresco, esparciendo las células en estría sobre la superficie del medio. La inoculación se inicia en la zona más profunda del tubo y se continúa hacia el exterior. Una vez inoculado los nuevos tubos, se incuban a 24 ± 2 ºC con iluminación continua e intensidad de luz superior a 2 000 luxes por un período entre 48 y 72 horas. Cuando se observe crecimiento se retiran los tubos de la cámara de iluminación y se almacenan en oscuridad a 4 ± 2 ºC. Bajo estas condiciones, las algas continuarán creciendo pero de forma lenta. Preparación del inóculo de algas para desarrollo de pruebas Conocido el número células presentes en el inóculo mediante cámara de Neubauer, se debe hacer una dilución con el fin de obtener en cada vial de prueba una concentración inicial de 10 000 células/mL. Como el volumen final en cada vial, incluyendo el inóculo es de 2.6 mL (figura 5.2), se prepara 2 mL de una suspensión de algas que contenga 2.6 x 10 6 células/mL de la siguiente manera: Volumen (mL) del cultivo de algas para 2 mL = 2 mL / Factor de dilución Factor de dilución (FD) = Número de células/mL en el concentrado/ 2.6x10 6 células/mL La preparación del inóculo que será utilizado en las pruebas debe provenir de un cultivo en fase exponencial. La densidad del cultivo será determinada con ayuda de un celda de conteo o cámara Neubauer. La densidad celular del cultivo se obtiene para poder calcular el factor de dilución necesario para asegurar una concentración de 2.6 millones de células por mililitro (2.6 x 10 6 células./mL) en un volumen de 2 mililitros. Con el fin de ilustrar este cálculo se presenta el siguiente ejemplo: Cálculo del factor de dilución (FD): FD = Número de células/mL en concentrado / 2.6 x 10 6 células/mL
Ensayos de toxicidad crónica con el alga Selenastrum capricornutum 79 Figura 5.2. Esquema del procedimiento de prueba con Selenastrum capricornutum 1. Preparación de inóculo algal Cultivo de S. capricornutum (P. subcapitata) de 4 a 7 días en desarrollo de fase exponencial 2. Método de dilución de muestras Réplicas Control 5 mL muestra Serie 1 Serie 2 Serie 3 3. Preparación de prueba Iluminación 4,000 lux ± 10% opr 72 horas Conteo del número de célular por microscopía óptica con cámara Neubauerl Adición de 18 mL de medio nutritivo enriquecido (8x) enriquecimiento 2.5 mL solución amortiguadora de pruebas (15 mg NaHCo 3 /L) 2.5 mL Solución amortiguadora Transferencia secuencial de 2.5 mL Mezclar Mezclar Mezclar Mezclar 100% 50% 25% 12.5% 0625% 100% 50% 25% 12.5% 0625% Eliminar 2.5 mL Dilución del cultivo para obtener 2 mL con 2.6 x 10 5 células Agitar 3 veces al día Inóculo con 2.6 x 10 5 células Agregar 10 μL a cada celdilla
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