Tema 11. Espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica.

Milagros Medina
Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular y Celular
Universidad de Zaragoza

Condición que debe cumplir un material
para ser estudiado por RPE
NUMEROSOS SISTEMAS
SATISFACEN ESTA CONDICIÓN
Sustancia paramagnética:
Número impar de electrones
Electrones con espines paralelos (O 2)
Radicales libre (sólido, líquido o gas)
Iones de metales de transición
Defectos en cristales iónicos
Semiconductores
Biradicales, sistemas estado triplete, etc..

Variedad de técnicas espectroscópicas, con principios teóricos
comunes a la resonancia magnética nuclear, utilizadas en el estudio de
la estructura y propiedades de la materia paramagnética
· Información local del centro paramagnético:
- Geometría del entorno
- Distribución electrónica
CW-EPR ENDOR EPR PULSADO
ESEEM
HYSCORE

Radiación
Electromagnética
Campo Campo
Magnético Magnético
muestra
Campo
Magnético
Radiación
dispersada
Detector Detector
Función de la interacción entre la radiación
electromagnética con el momento magnético de una
partícula cargada que gira (electrón) en presencia de un
campo magnético externo (interacción dipolar-magnética)

Zero field Applied field
E
B 0
Bo
S = +1/2
B 0
CONDICIÓN DE RESONANCIA
∆E = h. √ = g.β.Bo
S = -1/2
1ª derivada
3300 3320 3340 3360 3380 3400
CAMPO MAGNÉTICO (Gauss)
hν
∆E

Se trabaja a frecuencia fija de radiación electromagnética
Realizandose un barrido de campo magnético
Resolución de la Anisotropía del Tensor g

CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTRO DE RPE
Valor del Tensor-g (anisotropía)
Refleja la simetría del orbital que contiene al electrón desapareado y
g = g = g Cubic
x y z
g = g ° g Axial
x y z
g
z
g ° g ° g Rhombic
x y z
g
z
g
y
g
x
y
g
g
x
x
g
x
g
g
y
z
z
θ
Φ
g
x
y
g
g
x
B 0
g
y
g
z
g
z

CARACTERÍSTICAS DE UN ESPECTRO DE RPE
Anchura de línea
15 mT
g = 2
3300 3320 3340 3360 3380 3400
CAMPO MAGNÉTICO (Gauss)
Estructura hiperfina
a
A
hν
Increasing B field
0
m s =+1 2
m
s
= - 1 2

UV-Vis spectrometer
Source
Light source
Mono-
chromator
EPR spectrometer
ν
I o
Sample Detector
Source Detector
Klystron
Sample
Cavity
N S
I
Photo-
multiplier
Diode
Absorbance, A
dA
dB
1.0
Frequency
Magnetic field

PROTEÍNAS
-Radicales libres
-Metales
-Grupos Orgánicos
RPE

LÍPIDOS
FLUIDEZ DE LA MEMBRANA CELULAR
SONDAS PARAMAGNÉTICAS

En proteínas:
Existen centros paramagnéticos
En los procesos Biológicos se generan especies paramagnéticas
-Fotosíntesis
-Respiración celular
-Mecanismos de acción de enzimas
METALES Metaloproteínas
RADICALES LIBRES
Amioácidos
Grupos orgánicos

Sondas Paramagéticas:
-En Bicapas lipídicas
Estudio de dinámica de las membranas
Calculo de potenciales electrostáticos en superficie
-En Proteínas:
-Atrapadores de espín
-Etiquetas de espín
+ SH- Cys
S- Cys
Determinación de la topografía de estructuras secundarias
Análisis de interacciones cuaternarias
Análisis de mecanismos de acción enzimáticos
Estudio de procesos dinámicos
Plegamiento de proteínas
Cambios conformacionales
Plegamiento

Interacciones Cuaternarias

ESPECIES PARAMAGNÉTICAS EN PROTEÍNAS
M eta les Rel eva nte s e n Si stema s Bi ol—gicos
Metal Es ta do
con esp’n
V
Mn
Fe
Co
Ni
Cu
Mo
V(III)
VO(IV)*
V(V)
Mn (II)*
Mn (III )
Mn (IV )
Fe(II)*
Fe(III)*
Co(I)*
Co(II)*
Co(III)*
Ni(I)
Ni(II)*
Ni(III)*
Cu(I)
Es p’n
S =
1/2
Valor
t’p ico
de g
T (K)
t’p ica
m edida
%
Natural
Is —topo
con esp’n
1.96 R.T. 99.76
1/2 2.0 R.T. 100
a.s. 2
b.s 1 /2
a.s. 5/ 2
b.s. 1 /2
a.s. 5/ 2
b.s. 1 /2
1/2
2.15
2.15
Cu(II) 1/2 2.15
M o(IV) *
Mo(V)*
M o(VI) *
1/2 1.96
40 K
77 K
77 K
10 K
77 K
77 K
2.19
100
1.134
77 K 69.09
30.91
150 K 15.72
9.46
Factor-g
10 6 5 4 3 2 1.5
Cu 2+ ,
superóxido dismutasa
Fe 3+ , alto espín
rubredoxina
Fe 3+ , alto espín
hemoglobina
FAD sq , radical orgánico
Ni 3+ , hidrogenasa
100 200 300 400
CAMPO MAGNÉTICO, mT
Mo 5+ ,
xantina oxidasa
Mn 2+
[2Fe-2S].
ferredoxina
Fe 3+ , bajo espín
mioglobina

EL GRUPO HEMO EN PROTEÍNAS

EL GRUPO HEMO EN PROTEÍNAS
Citocromo c 6 de Anabaena PCC 7119
0.05
0.00
-0.05
-0.10
-0.15
-0.20
2.94
3.3
2.84
2.34
2.29
1.56
1.43
pH
7
7.84
8.52
8.7
9.3
100 200 300 400 500 600
Campo Magnético (mT)
valor de g
EPR, intensidad relativa
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
-0.20
3.33
3.32
3.31
3.30
3.29
3.28
3.27
3.26
3.25
4 5 6 7 8 9 10 11
pH
4 5 6 7 8 9
pH
10 11

Centro Estado del Fe Señal en RPE, T
oxidado reducido oxidado reducido
[2Fe-2S] 2Fe III
S = 0
[3Fe-4S] 3Fe III
[4Fe-4S]
(HiPIP)
[4Fe-4S]
(Fd)
Cys-S
Cys-S
Cys-S
Cys-S
CENTROS SULFOFÉRRICOS EN PROTEÍNAS
S
Fe
Fe
Fe S
S
S
S
S
S = 1/2
3Fe III +Fe III
S = 1/2
2Fe III +2Fe III
S = 0
Fe
[2Fe-2S]
Fe
[3Fe-4S]
S-Cys
S-Cys
S-Cys
Cys
Cys-S
CH
2 S
Cys
Cys-S
Fe III + Fe III
S = 1/2
2Fe III + Fe III
S = 2
2Fe III +2Fe III
S = 0
Fe III + 3Fe III
S = 1/2
S
Fe
Fe
S
His
S
CH 2
Fe3+
Fe 2+
CH
S
2
S
N
CH 2
His
Fe
S
N
Tipo Rieske
S
Fe
[4Fe-4S]
N
H
N H
S-Cys
S-Cys
- gav2 ancha, g=12
15K
gav>2 -
30K
- gav

Cys-S
Cys-S
Fe
Adrenodoxina
Ferredoxina
S
S
[2Fe-2S]
Benzeno dioxigenasa
Fe
S-Cys
S-Cys
Cys
CH2 S
CH S
2
Cys
Tipo Vertebrado
Tipo Planta
Tipo Rieske
Fe 3+
Xantina Oxidasa
310 330 350 370
CAMPO MAGNÉTICO, (mT)
His
CH 2
S N
S
Fe 2+
CH2 His
N
Tipo Rieske
N
H
N H
Ferredoxina de
Anabaena
Nativa
Cys41Ser
Cys49Ser
Cys46Ser
Cys79Ser
320 340 360 380
CAMPO MAGNÉTICO, (mT)

EL ESTADO Ni-C EN [NiFe]-HIDROGENASAS.
Efecto de la radiación Visible
2H +
H 2
S
Fe
Ni
S
S
[3Fe-4S]
[4Fe-4S]
[4Fe-4S]
aceptor
donador
g
2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9
Ni-C
Ni-L
Ni-C-[4Fe-4S]
Ni-L-[4Fe-4S]
30 K
30 K
5 K
5 K
280 300 320 340 360
CAMPO MAGNÉTICO (mT)

INCONVENIENTES:
No todos los estados de oxidación de una muestra son
detectables en RPE
Perdida dieléctrica producida por el agua
Muestras concentradas
Congelar
La detección de metales requiere temperaturas criogénicas.
He o N 2 líquido
Empleo de muestras limitadas en cantidad. Tejidos o células

1. Ajuste del
Potencial
+ 123
Milivóltios
Oxidante
Reductor
Argón
Electrodos de
Calomelano y
Platino
Extracción
de muestra
Agitador
Argón
Salida
25 °C
Agua
Entrada
Muestra + mediadores
Titulación Redox
De Proteínas con
Al menos un Estado
Paramagnético
3. Espectros de EPR
141 mV
105 mV
58 mV
2 mV
-40 mV
Amplitud de la señal, %
100
80
60
40
2. Extracción de muestras y
congelación
123 52 -20
4. Representación de amplitud vs
potencial redox
20
0
Em
-200 -100 0 100 200
Potencial Redox, mV
300

(a) Benzoquinona
(b) TEMPOL
(c) TEMPOL en glicerol
(d) Radical de Tirosina
320 325 330 335
CAMPO MAGNETICO, mT
RADICALES LIBRES
15 mT
g = 2
3300 3320 3340 3360 3380 3400
CAMPO MAGNÉTICO (Gauss)

Interacciones Hiperfinas del espín con
núcleos de su entorno. Técnicas avanzadas
CW-EPR ENDOR ESEEM
El electrón desapareado actúa
como una sonda para el estudio
de la estructura local