Manual de Procedimientos de Laboratorio para el

- Estufa a 37grados centígrados
- Lector ELISA para microplacas
- Impresora para lector ELISA
• PROCEDIMIENTO:
- Diluir el antígeno en tampón carbonato-bicarbonato 0.06 M, pH 9.6
- Sensibilizar las placas colocando 100 ul del antígeno diluido en cada pocillo de
la placa.
- Colocar las placas en cámara húmeda e incubar a 37ºC por 2 horas o en
refrigeración (4C) por 18 horas.
- Lavar 3 veces con PBS -Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez.
- Adicionar 200 ul de solución BSA al 1% o leche en polvo descremada al 5%
(diluido en tampón carbonato-bicarbonato 0.06 M. pH 9.6) en cada pocillo e
incubar en cámara húmeda a 37ºC por una hora. Esto evitará reacciones
inespecíficas.
- Lavar 3 veces con PBS-Tween 20 al 0.05% por diez minutos cada vez.
- Diluir los sueros problema al doble a partir de 1/10 en PBS-Tween 20 al 0.05%
(1/10, 1/20, 1/40,1/80, ...); colocar 100 uL en cada pocillo e incubar en cámara
húmeda a 37ºC por dos horas.
- Lavar 3 veces con PBS -Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez con una
leve agitación.
- Adicionar 100 uL de conjugado e incubar en cámara húmeda a 37ºC por una
hora. Previamente, diluir el conjugado según su título en PBS-Tween 20 al
0.05% .
- Lavar 3 veces con PBS - Tween 20 al 0.05% por 10 minutos cada vez.
- Colocar rápidamente 100 uL del sustrato recién preparado e incubar en
oscuridad (lejos de la luz), por 30 minutos a temperatura ambiente.
- Detener la reacción adicionando 100 uL de HCL 2N o H2SO4 2N en cada
pocillo.
- Realizar la lectura utilizando un lector de ELISA con filtro de 492 nm.
• LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS:
En caso que la muestra sea positiva, se forma el complejo antígeno-anticuerpo específico,
manifestado por un producto coloreado y soluble.
- Resultado Cuantitativo: Se obtiene midiendo las densidades ópticas (grados de
absorbancia) de los productos solubles, mediante el lector de ELISA
(espectrofotómetro).
=el blanco debe dar una lectura inferior a 0.100
=los sueros negativos dan lecturas menores a 0.200.
=los sueros positivos son mayores a 0.200
• FACTORES DE ERROR:
Los resultados falsos positivos y falsos negativos suelen deberse a reacciones inespecíficas:
- Reacciones cruzadas con otros tripanosomideos, principalmente Trypanosoma.
- Bloqueo inadecuado de las placas.
Laboratorio Nacional de Parasitología y Entomología
(LANPE) Página 30 07/12/2003