Manual de Procedimientos de Laboratorio para el

E.8.Inmunofluorescencia indirecta (IFI):
Esta prueba permite detectar la presencia de anticuerpos específicos anti Leishmania (IgG e
IgM) en suero de pacientes, donde los promastigotes de Leishmania (antígenos) son
adheridos a un portaobjetos. El complejo Ag Ac revelado con isotiocianato de fluoresceína
es visualizado al microscopio de inmunofluorescencia.
Con promastigotes de Leishmania (antígenos), adheridos en un. En caso de ser positiva la
reacción antígeno-anticuerpo es revelado con isotiocianato de fluoresceína es visualizada
con el microscopio de inmunfluorescencia por medio de la adición de una antiinmunoglobulina
humana marcada con isotiocianato de fluoresceína, la reacción
fluorescente da un color verde manzana brillante a los promastigotes (ver fotografía).
• Muestra suero sanguíneo de un minimo de 2ml de sangre.
• MATERIAL Y EQUIPO REQUERIDO:
- Antígeno: promastigotes de Leishmania sp. Fijado en placa
- Sueros:
*Sueros control positivo con título conocido de anticuerpo.
*Sueros control negativo
*Sueros problema de pacientes con sospecha de Leishmaniosis
- Conjugado: anti-Inmunoglobulinas humanas marcada con isotiocianato de
fluorescencia.
- Tampón fosfato salino (PBS) pH 7.2
- Tampón fosfato salino (PBS) pH 7.2 – Tween 80 a 1%
- Azul de Evans.
- Glicerina tamponada, pH 8.5
- Placas de microtitulación de poliestireno.
- Tubos de hemolisis para dilución de suero.
- Papel filtro.
- Cámara húmeda (placa petri conteniendo papel absorbente húmedo).
- Microscopio de fluorescencia
• PROCEDIMIENTO PREPARACION DE ANTIGENO:
- Se requiere una línea constante de cultivo de promastigotes de Leishmania.
- Micropipetas / tips descartables
- Jarros couplin
- El momento de máximo crecimiento (7 a 8 días), se toma la parte liquida del
medio y se la centrifuga a 2500 rpm/10 minutos.
- Se descarta el sobrenadante y se lava el sedimento con PBS, dos veces, por
medio de la centrifugación a 2500 r.p.m. por 10 minutos.
- Descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento con PBS-formalina al 2%
y se deja reposar durante 24 horas.
- Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento con PBS, dos veces, por medio
de la centrifugación a 2500 r.p.m. por 10 minutos.
- Descartar el sobrenadante y diluir el sedimento de la centrifugación final en PBS
hasta obtener de 25 a 30 parásitos por campo microscópico (objetivo de 40 X).
Laboratorio Nacional de Parasitología y Entomología
(LANPE) Página 32 07/12/2003