Ácido Acético - R-Biopharm AG

Ácido Acético
Método UV
Para la determinación de ácido acético en
alimentos y otros materiales
Cat. No. 10 148 261 035
Test-Combinado para 3 x 11 determinaciones
BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM
Enzymatic BioAnalysis/Food Analysis
Para uso in vitro solamente
Almacenar a 2-8° C
Esta traducción en español has sido realizada por R−Biopharm
Latinoamérica con el objeto de ayudar a los usuarios a entender el
procedimiento, pero no se actualizan regularmente por lo que no
pueden remplazar las instrucciones en inglés. Las instrucciones de
uso que son válidas, son aquellas incluidas en cada kit en Alemán y
en Inglés, dado que están escritas e impresas por el fabricante
(Roche). Refiérase siempre a las instrucciones incluidas en cada kit.
Principio (Ref. 1)
El ácido acético (acetato) se convierte en acetil-CoA en presencia de
la enzima acetil-CoA sintetasa (ACS) 1 , adenosina-5’-trifosfato (ATP) y
coenzima A (CoA) (1).
(1).
(1) Acetato+ ATP + CoA ⎯ ACS → acetil-CoA + AMP 2 + pirofosfato
Acetil-CoA reacciona con oxalacetato a citrato en presencia de citrato
sintetasa (CS) (2).
(2) Acetil-CoA+ Oxaloacetato + H 2 O ⎯ CS → citrato + CoA
El oxalacetato requerido para la reacción (2) se forma a partir de L-
Malato y nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD) en presencia de L-
malato deshidrogenasa (L-MDH). En esta reacción el NAD es
reducido a NADH.
(3) L-Malato + NAD + ⎯ L-MDH → Oxalacetato + NADH + H +
La determinación se basa en la formación de NADH medido por el
aumento de la absorción de luz a 340, 334 ó 365 nm. Debido al
equilibrio de la reacción indicadora precedente, la cantidad de NAD
formado no es linealmente (directamente) proporcional a la
concentración de ácido acético (para los cálculos, ver mas adelante).
El test combinado contiene
1 Botella 1: con aprox. 32 ml de solución conteniendo:
Buffer trietanolamina, pH aprox. 8.4; ácido L-Málico, aprox. 134 mg;
cloruro de magnesio x 6 H 2 O, aprox. 67 mg
2 Botella 2: con aprox. 280 mg de liofilizado, que consiste de:
ATP, aprox. 175 mg; CoA, aprox. 18 mg; NAD, aprox. 86 mg
3. Botella 3 con aprox. 0.4 ml suspensión, que consiste de:
L-malato deshidrogenasa, aprox. 1100 U; citrato sintetasa, aprox.
270 U
4. Tres Botellas 4 con acetil-CoA sintetasa liofilizada, aprox. 5 U c/una
5. Botella 5: Solución control de Ácido acético para control del ensayo
(la medición de la solución control no es necesaria para el cálculo de
los resultados). Usar la solución control sin diluir (fecha de
vencimiento: ver etiqueta del frasco)
Preparación de las soluciones para 10 determinaciones
1. Usar la solución de la Botella 1 sin diluir
2. Disolver el contenido de la Botella 2 con 7 ml de agua bidestilada.
3. Usa la suspensión de la Botella 3 sin diluir.
4. Disolver el contenido de una Botella 4 con 0.25 ml de agua
bidestilada.
Estabilidad de los reactivos
La solución 1 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta).
Llevar la Solución 1 a 20-25ºC antes de su uso.
El contenido de la Botella 2 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta).
La solución 2 es estable por 4 semanas a 2-8ºC ó por 2 meses de –
15 a -25ºC.
El contenido de la Botella 3 es estable a 2-8ºC (ver etiqueta).
Los contenidos de las Botellas 4 son estables a 2-8ºC (ver etiqueta).
La solución 4 estable por 5 días a 2-8ºC.
Procedimiento
Longitud de onda 3 : 340 nm, Hg 365 nm ó Hg 334 nm
Cubeta de vidrio 4 : 1.00 cm de paso de luz
Temperatura: 20-25ºC
Volumen final: 3.230 ml
Leer contra aire (sin cubeta en el paso de luz) ó contra agua
Soluc. de muestra: 0.3-30 ug de ácido acético/ensayo 5 (en 0.100-
2.000 ml de volumen de muestra
1 ACS, también conocido como acetato tiokinasa
2 AMP = adenosina-5’-monofosfato
3 La máxima absorción del NADH es a 340 nm. Si se usan fotómetros con lámpara de
vapor, las mediciones se hacen a 365 nm ó 334 nm.
4 Si se desea se pueden utilizar cubetas descartables en lugar de las de vidrio.
5 Ver instrucciones para el desarrollo del ensayo
Pipetear en la cubeta Blanco Muestra
solución 1 1.000 ml 1.000 ml
solución 2 0.200 ml 0.200 ml
SN de Muestra* - 0.100 ml
agua bidestilada 2.000 ml 1.900 ml
Mezclar** y leer las absorbancias de las soluciones (A 0 ). Adicionar:
suspensión 3 0.010 ml 0.010 ml
Mezclar** y leer las absorbancias de las soluciones (A 1 ) luego de
aprox. 3 min. Iniciar la reacción por el agregado de:
solución 4 0.020 ml 0.020 ml
Mezclar**, esperar hasta que la reacción se detenga (aprox. 10-15
min) y leer las absorbancias de las soluciones (A 2 ). Si la reacción no
se ha detenido luego de 15 min, continuar leyendo las absorbancias a
intervalos de 2 min hasta que el aumento de la absorbancia sea
constante por 2 min.
*Enjuagar el tip de la pipeta con solución de muestra antes de dispensar la solución de
muestra.
** Por ejemplo, con una espátula plástica ó por agitación después de cubrir la cubeta con
Parafilm (marca registrada de la American Can Company, Greenwich, Ct., USA).
Si la absorbancias A 2 aumenta constantemente, extrapolar la
absorbancias al tiempo de la adición de la solución 4 (ACS) (ver
también pto. 7).
Determinar la diferencia de absorbancias (A 1 – A 0 ) y (A 2 -A 0 ) para el
blanco y las muestras. Con el equilibrio de la reacción indicadora
precedente, no hay proporcionalidad linear (directa) entre la diferencia
de absorbancia medida y la concentración de ácido acético.
La siguiente fórmula, que debe ser utilizada generalmente para
reacciones indicadoras como la precedente, sirve para calcular
∆A á. acético (ver Ref. 1.2):
(A 1 -A 0 ) 2 muestra (A 1 -A 0 ) 2 blanco
∆A á. acético = [(A 2 -A 0 ) muestra – ------------------] – [(A 2 – A 0 ) blanco – --------------
]
(A 2 -A 0 ) muestra (A 2 -A 0 ) blanco
La diferencia de absorbancias medida debe, como regla, ser mayor a
0.100 unidades de absorbancia para obtener resultados
suficientemente precisos (ver “Instrucciones para el desarrollo del
ensayo” y “Sensibilidad y Límite de detección” pto. 4).
Cálculos
De acuerdo a la ecuación general del cálculo de las concentraciones:
c = V x PM x ΔA (g/l)
ε x d x v x 1000
V = volumen final (ml)
v = volumen de muestra (ml)
MW = peso molecular de la sustancia a ensayar (g/mol)
d = paso de luz (cm)
ε = coeficiente de extinción del NADH a:
340 nm = 6.3 (l x mmol -1 x cm -1 )
Hg 365 nm = 3.4 (l x mmol -1 x cm -1 )
Hg 334 nm = 6.18 (l x mmol -1 x cm -1 )
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Corresponde para ácido acético:
3.230 × 60.05 1.940
c = ----------------------------------- x ∆A = ------------ x ∆A (g acético / l
ε x 1.00 x 0.100 x 1000 ε de sol. de muestra)
Si la muestra se ha diluido durante la preparación, los resultados
deben multiplicarse por el factor de dilución F.
Cuando se analizan muestras sólidas ó semisólidas que se pesan
para la preparación de la muestra, los resultados se calculan a partir
de la cantidad pesadas:
c ác. acético (g/l de sol. )
Contenido ác. acético = ------------------------------------------ x 100 (g / 100g)
peso muestra en g/l sol.
1. Instrucciones para el funcionamiento del kit
La cantidad de ácido acético presente en el ensayo debe ser entre 0.6
ug y 30 ug (medido a 365 nm) ó 0.3 ug y 15 ug (medido a 340 nm,
334 nm) respectivamente. Para obtener una diferencia de
absorbancias suficiente, la solución de muestra debe diluirse para dar
una concentración de ácido acético entre 0.06 y 0.3 g/l ó 0.03 y 0.15
g/l respectivamente.
Tabla de dilución
Cantidad estimada de ácido
acético por litro
Dilución con
agua
Dilución
factor F
medido a
340 ó 334 nm 365 nm
< 0.15 g 0.3 g - 1
0.15-1.5 g 0.3-3.0 g 1 + 9 10
1.5-15 g 3.0-30 g 1 + 99 100
> 15 g > 30 g 1 +999 1000
Si la medida de la diferencia de absorbancias (∆A) es muy pequeña
(ej. < 0.100), debe prepararse nuevamente la solución de muestra
(pesar mas cantidad de muestra ó diluir menos la muestra) ó el
volumen de muestra que se pipetea en la cubeta puede aumentarse
hasta 2.000 ml. El volumen de agua agregada debe, en ese caso,
disminuirse para obtener el mismo volumen final en el ensayo para la
muestra y el blanco. El nuevo volumen de muestra v debe tomarse en
cuenta en los cálculos.
2. Información técnica
2.1. En la determinación de ácido acético (muestras ácidas) debe
tenerse en cuenta que, al llevar a cabo la preparación de la muestra,
el analito volátil no se pierda. Esto puede evitarse alcalinizando la
muestra, el acetato resultante no es volátil.
2.2. Al hacer los cálculos de los resultados, debe indicarse claramente
si los resultados se expresan como ácido acético (masa molar 60.05
g/mol) ó como acetato (masa molar 59.04 g/l). (En determinaciones
enzimáticas, se mide el ion acetato).
3. Especificidad (Ref. 1)
El método es específico para ácido acético.
Al analizar ácido acético comercial (ác. Acético glacial), se obtienen
resultados de > 100% (cuando se elaboran soluciones de ácido
acético, hay que tener en cuenta la volatilidad del ácido acético); en el
análisis de acetato de sodio anhidro comercial, se esperan resultados
< 100 % porque la sustancia absorbe agua.
4. Sensibilidad y límite de detección (Ref. 1.3)
La mínima diferencia en absorbancia para el procedimiento es de
0.005 unidades de absorbancia. Este valor corresponde a un volumen
máximo de v = 2.000 ml y medición a 340 nm de una concentración
de ácido acético de aprox. 0.1 mg/l de solución de muestra (si se
utiliza un v = 0.100 ml, esto corresponde a 1.5 mg/l de solución de
muestra).
El límite de detección de 0.15 mg/l deriva de la diferencia de
absorbancia de 0.010 (medida a 340 nm) y un máximo de volumen de
muestra de v = 2.000 ml.
5. Linealidad
La linealidad de la determinación es desde aproximadamente 0.3 ug
de ácido acético/ensayo (0.15 mg de ácido acético/l de solución de
muestra, volumen de muestra v = 2.000 ml) hasta 30 ug de ácido
acético/ensayo (0.3 g de ácido acético/l de solución de muestra,
volumen de muestra v = 0.100 ml).
6. Precisión
En una determinación por duplicado de una solución de muestra, se
puede obtener una diferencia de 0.005 a 0.010 unidades de
absorbancia. Con un volumen de muestra de v = 0.100 ml y medido a
340 nm, esto corresponde a una concentración de ácido acético
aprox. de 1.5-3 mg/l.
(Si la muestra se diluye durante la preparación de la misma, el
resultado se debe multiplicar por el factor de dilución F. Si la muestra
se pesa para su preparación, ej. usando 1 g muestra/100 ml = 10 g/l,
se puede obtener una diferencia de 0.015-0.03g/100 g).
En la literatura se han publicado los siguientes datos:
CV = 0.6-1.6 % soluciones de ácido acético
CV = 1.5-1.8 % vino blanco
CV = 1.7-2.1 % vino tinto
CV = 2.3-2.8 % yogur (Ref. 1.3)
Salchicha de cerdo cocida finamente picada:
x = 0.3 g/100 g r = 0.017 g/100 g s(r) = ± 0.006 g/100 g
R = 0.023 g/100 g s(R) = ± 0.008 g/100 g
Ketchup de tomate:
r = 0.05 g/100 g s(r) = ± 0.02 g/100 g
R = 0.07 g/100 g s(R) = ± 0.02 g/100 g
Pan:
x = 131.89 mg/100 g r = 7.53 mg/100 g
R = 21.12 mg/100 g
x = 204.55 mg/100 g r = 7.41 mg/100 g
R = 19.35 mg/100 g
s(r) = ± 2.66 mg/100 g
s(R) = ± 7.46 mg/100 g
s(r) = ± 2.62 mg/100 g
s(R) = ± 6.84 mg/100 g
(Ref. 2.1)
7. Interferencias / fuentes de error
Los ésteres de ácido acético se puede saponificar bajo las
condiciones del ensayo (ej. etilacetato en vino, ácido acetilsalicílico en
farma). El ácido acético formado por hidrólisis lenta es responsable de
las reacciones “creep” que deben tomarse en consideración cuando
se calculan los resultados (extrapolación de A 2 al tiempo de adición de
la solución de muestra).
8. Reconocimiento de interferencia durante el procedimiento del
ensayo
8.1 Si la conversión de ácido acético se ha completado en el tiempo
estipulado en “Procedimiento”, se puede concluir, en general, que no
han ocurrido interferencias.
8.2 Al completarse la reacción, la determinación puede reiniciarse con
el agregado de ácido acético ó acetato de sodio (cualitativa ó
cuantitativamente): si la absorbancia se altera posteriormente al
agregado del material estándar, esto también es una indicación que
no ha ocurrido interferencia.
8.3 Se pueden reconocer errores del operador ó interferencia en la
determinación por la presencia de sustancias contenidas en la
muestra, realizando una doble determinación utilizando dos
volúmenes diferentes de muestra (ej. 0.100 ml y 0.200 ml): las
diferencias en las mediciones de las absorbancias deben ser
proporcionales a los volúmenes de muestra utilizados.
Cuando se analizan muestras sólidas, se recomienda que se pesen
diferentes cantidades (ej. 1g y 2g) en recipientes de 100 ml. Las
diferencias de absorbancias medidas y los pesos de la muestra
utilizados deben ser proporcionales para volúmenes idénticos.
8.4 Se pueden reconocer posibles interferencias causadas por
sustancias contenidas en la muestra utilizando un estándar interno
como control: además de las determinaciones de la muestra, el blanco
y el estándar, se lleva a cabo otra determinación con la muestra y el
control juntos en el mismo ensayo. La recuperación se puede calcular
de la diferencia de absorbancias medidas.
8.5 Posibles pérdidas durante la determinación se puede reconocer
por medio de ensayos de recuperación: la muestra debe prepararse y
analizarse con y sin el agregado de material estándar. Dicha adición
debe recuperarse cuantitativamente dentro del rango del error del
método.
9. Riesgo de los reactivos
Los reactivos utilizados en la determinación de ácido acético no son
materiales riesgosos de acuerdo a las Regulaciones de Sustancias
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Peligrosas, las Leyes Químicas ó la Regulación 67/548/EEC de la
CEE y subsecuentes Guías de alteraciones, suplementos y
adaptaciones. Aún así, deben cumplirse todas las medidas de
seguridad generales que se aplican a todas las sustancias químicas.
Luego de su utilización, los reactivos deben desecharse con el
descarte del laboratorio, pero deben observarse siempre las
regulaciones locales. El material de empaque puede desecharse en
recipientes destinados al reciclado.
10. Información general sobre la preparación de muestra
Al llevar a cabo el ensayo:
Usar muestras líquidas límpidas, incoloras y prácticamente
neutras directamente ó luego de diluirlas de acuerdo a la tabla de
dilución, y usar un volumen hasta 2.000 ml.
Filtrar soluciones turbias;
Desgasear muestras que contengan dióxido de carbono (ej. por
filtración);
Ajustar muestras ácidas a un pH aproximado de 8-9 por el agregado
de una solución de hidróxido de sodio ó de potasio;
Ajustar muestras ácidas y levemente coloreadas a un pH
aproximado de 8-9 por el agregado de una solución de hidróxido de
sodio ó de potasio y posterior incubación durante 15 min;
Tratar las muestras “altamente coloreadas” que se usan sin diluir ó
en grandes volúmenes con carbón activado, polivinilpolipirrolidona
(PVPP) ó con poliamida, (ej. 1 g/100 ml);
Moler ú homogeneizar las muestras sólidas ó semisólidas, extraer
con agua ó disolver en agua y filtrar si es necesario; respectivamente
eliminar turbidez ó colorantes por clarificación de Carrez;
Desproteinizar muestras que contengan proteínas con ácido
perclórico; alternativamente clarificar con soluciones de Carrez;
Extraer muestras que contengan grasa con agua caliente (la
temperatura de extracción debe ser mayor que el punto de fusión de
la grasa involucrada). Enfriar para permitir que la grasa se separe,
colocar el recipiente en baño de hielo por 15 min y filtrar;
alternativamente clarificar con soluciones de Carrez luego de la
extracción con agua caliente.
Clarificación de Carrez:
Pipetear la muestra líquida en un recipiente de 100 ml conteniendo
aprox. 60 ml de agua bidestilada. Subsecuentemente agregar,
lentamente, 5 ml de solución de Carrez I hexaferrocianato de potasio
(II) (ferrocianuro), 85 mM = 3.60 g K4[Fe(CN)6] × 3 H2O/100 ml) y 5 ml
solución de Carrez-II (sulfato de zinc, 250 mM = 7.20 g ZnSO4 × 7
H2O/100 ml). Ajustar el pH a 7.5-8.5 con hidróxido de sodio (0.1 M; ej.
10 ml). Mezclar luego de cada adición. Llevar a volumen, mezclar y
filtrar.
11. Ejemplos de aplicación
Determinación de ácido acético en jugos de fruta
a) Jugos de fruta con alto contenido de ácido acético (por ej. en el
rango aprox de 0.3 g/l): Diluir la muestra con agua 1 + 1; usar 0.100
ml para el ensayo.
b) Jugos de fruta con bajo contenido de ácido acético (menos que
0.02 g/l):
Decolorar los jugos coloreados:
Agregar 1% (p/v) de carbón activado a la muestra, agitar por aprox.
30s y filtrar. Usar 0.500 ml para el ensayo (tomar en consideración la
alteración del volumen en el cálculo). En ciertas situaciones (cuando
se usan grandes volúmenes de muestra), ajustar los jugos ácidos a
pH 8.
Determinación de ácido acético en vino (Ref. 3.1)
Usar 0.100 ml de vino blanco sin diluir para el ensayo (este volumen
puede aumentarse hasta 2.000 ml, si es necesario).
Usar 0.100 ml de vino tino que contenga aprox. 0.2 g ácido acético/l
sin diluir para el ensayo y sin decolorar. Para vinos tintos que
contengan menos que 0.1 g ácido acético/l agregar 1% (p/v)de
poliamida ó PVPP, agitar por aprox. 1 min y filtrar. Ajustar una alícuota
de la gran muestra decolorada a pH 8 (papel indicador) con hidróxido
de sodio (0.1 M), diluir con agua para dar el doble del volumen. Usar
hasta 2.000 ml, si es necesario, para el ensayo (tomar en cuenta la
dilución y el volumen de muestra alterado para los cálculos).
Altas concentraciones de alcohol en la muestra pueden dilatar la
reacción del acetato. La absorbancia A 2 debe, por lo tanto, leerse
luego de 20 min.
filtrado a 20-25ºC y diluir de acuerdo a la tabla de dilución si es
necesario.
Determinación de ácido acético en cerveza (Ref. 3.4, 3.5)
Para remover el ácido carbónico, agitar aprox. 5-10 ml de cerveza por
30 s con varilla de vidrio ó filtrar. Se usa la muestra libre de CO 2
directamente en el ensayo sin más dilución.
Determinación de ácido acético en queso duro
Pesar 2 g de queso molido en un recipiente de 100 ml, agregar
alrededor de 70 ml de agua e incubar a 60ºC por 20 min. Agitar el
recipiente de tiempo en tiempo. Luego de enfriar a 20-25ºC, llevar a
100 ml con agua bidestilada. Para la separación de la grasa, colocar
el recipiente en un refrigerador por 20 min, filtrar, descartar los
primeros ml del filtrado. Usar la solución clara, que puede ser
levemente opalescente, ajustada a 20-25ºC para el ensayo.
Determinación de ácido acético en mayonesa ó yogur
Pesar 5 g de muestra en un recipiente de 100 ml. Agregar
aproximadamente 50 ml de agua bidestilada y calentar por 20 min en
baño de agua a 50-60ºC, agitar de tiempo en tiempo. Luego de enfriar
a 20-25°C, llevar a 100 ml con agua bidestilada. Para la separación de
la grasa, colocar el recipiente en un refrigerador por 20 min, filtrar,
descartar los primeros ml del filtrado. Usar la solución clara, que
puede ser levemente opalescente, ajustada a 20-25ºC para el ensayo.
Determinación de ácido acético en productos cárnicos
Pesar 10 g de salchicha molida y homogeneizar con 80 ml de ácido
perclórico (1 M) por 10 min usando un homogeneizador (Ultra Turrax
ó IKA), centrifugar, decantar el sobrenadante y filtrar. Descartar los
primeros ml del filtrado y pipetear 20 ml en un recipiente, ajustar a pH
10.0 con hidróxido de potasio (2M). Medir el volumen de KOH. Para
obtener una precipitación cuantitativa del perclorato de potasio
formado, colocar en baño de hielo ó refrigerador por 20 min, filtrar.
Usar la solución clara diluida, si es necesario (ver tabla de dilución),
para el ensayo. Cuando se calcula la dilución, tener en cuenta el
contenido de agua de la muestra. Para calcular el contenido (en g/100
g) de acuerdo a la fórmula mencionada (ver cálculos), se necesita el
contenido de la muestra en la solución de muestra. Cuando se usa la
preparación de muestra como se mencionó anteriormente y se
considera el contenido de agua de la muestra, el peso de la muestra
se calcula de acuerdo a la siguiente fórmula:
A x 1000 x d
Peso muestra = ----------------------------- (g/l de solución de muestra)
(b + a x w) x (d + e)
Donde:
a = muestra pesada en g
b = volumen de ácido perclórico en ml
d = volumen de sobrenadante para ajustar pH
e = volumen de KOH para ajustar pH a 8-10 en ml
w = contenido de agua de la muestra (%p/p) / 100
1000 = factor para g expresado en mg
(La gravedad específica de agua de la muestra a 20-25 ºC es aprox. 1
g/ml. Puede despreciarse para el cálculo).
12. Otras aplicaciones
El método puede ser utilizado para el análisis de papel, fármacos (ej.
soluciones de infusión, preparación de ácido acetilsalicílico),
emulsionantes (luego de la hidrólisis alcalina), así como el análisis de
muestras biológicas con fines de investigación.
Para detalles del muestreo, tratamiento y estabilidad de la muestra ver
Bergmeyer, H. U. & Möllering, H. (1974) in Methods of Enzymatic
Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 3, p. 1523-1525, Verlag
Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London; Holz,
G. & Bergmeyer, H. U. (1974) in Methods of Enzymatic Analysis
(Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 3, p. 1530, Verlag Chemie,
Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London; Lundquist, F.
(1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd
ed., vol. 3, p. 1534-1535, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press,
Inc. New York and London.
Determinación de ácido acético en vinagre
Diluir la muestra de acuerdo a la tabla de dilución y usar 0.100 ml para
el ensayo.
Determinación de ácido acético en aderezos ácidos y salsas
Separar los sólidos de la muestra y colocar la muestra en refrigerador
por 20 min para obtener la separación de las grasas. Filtrar, ajustar el
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Determinación de ácido acético en muestras de fermentación y
en medio de cultivo de células
Coloque la muestra (luego de centrifugar si es necesario) en un baño
de agua a 80ºC por 15 min (cubrir el recipiente por la volatilidad del
ácido acético) para detener las reacciones enzimáticas. Centrifugar y
utilizar el sobrenadante (diluido de acuerdo a la tabla de dilución si es
necesario) para el ensayo. Alternativamente se puede desproteinizar
con ácido perclórico. Ver los ejemplos mencionados anteriormente.
Homogeneizar medio gelatinoso de agar con agua y proseguir el
tratamiento como se ha descrito.
Referencias
1.1 Bergmeyer, H. U. & Möllering, H. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse
(Bergmeyer, H. U., Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 2, S. 1566-1574; Verlag Chemie, Weinheim,
and (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd. ed., vol. 3,
p. 1520- 1528, Verlag Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London
1.2 Bergmeyer, H. U. (1974) in Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer, H.
U., Hrsg.) 3. Aufl., Bd. 1, S. 119-125; Verlag Chemie, Weinheim and (1974) in Methods
of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 2nd ed., vol. 1, p. 112-117, Verlag
Chemie, Weinheim/Academic Press, Inc. New York and London
1.3 Beutler, H.-O. (1984) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H. U., ed.) 3rd
ed., vol. VI, pp. 639-645, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel
2.1 Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG; Untersuchung
von Lebensmitteln: Bestimmung von Essigsäure (Acetat) in Fleischerzeugnissen,
07.00-14 (November 1981); Bestimmung von Essigsäure (Acetat) in Wurstwaren,
08.00-16 (November 1981); Bestimmung der Essigsäure in Tomatenketchup und
vergleichbaren Erzeugnissen, 52.01.01-16 (November 1983); Bestimmung von
Essigsäure (Acetat) in Brot einschließlich Kleingebäck aus Brotteigen, 17.00-16 (Juni
1990)
2.2 Gombocz, E., Hellwig, E., Vojir, F. & Petuely, F. (1981) Deutsche Lebensmittel-
Rundschau, 77, 13-14
2.3 Brautechnische Analysenmethoden, Band III, S. 568-572 (1982),
Methodensammlung der Mitteleuropäischen Brautechnischen Analysenkommission
(MEBAK), herausgegeben von F. Drawert im Selbstverlag der MEBAK, Freising 2.4
Niederlande: Warenwet, Uitvoeringsvoorschriften (C II-6), Regeling
Onderzoekingsmethoden voor brood; Methode 16: De Bepaling van Calciumacetat
(Oktober 1986); Dit voorschrift betrijft een methode voor de bepaling van calciumacetat
in het in brood verwerkte meel
2.5 Deutsche Norm DIN EN ISO 11213 (April 1995) Modifizierte Stärke - Bestimmung
des Acetylgehaltes - Enzymatisches Verfahren (ISO 11213:1995) Deutsche Fassung
EN ISO 11213:1995 Modified Starch - Determination of acetyl content - Enzymatic
method
2.6 European Standard EN ISO 11213 (April 1995) Modified Starch - Determination of
acetyl content - Enzymatic method
2.7 International Federation of Fruit Juice Producers (IFU, Methods of Analysis, no. 66-
1996)
2.8 Deutsche Norm DIN EN 12632 (April 1999) Frucht- und Gemüsesäfte;
Enzymatische Bestimmung des Gehaltes an Essigsäure (Acetat);
Spektralphotometrische Bestimmung von NAD
2.9 Europäische Norm / European Standard EN 12632 (April 1999) , Frucht- und
Gemüsesäfte: Enzymatische Bestimmung des Gehaltes an Essigsäure (Acetat) -
Spektralphotometrische
Bestimmung von NAD (Fruit and vegetable juices - Enzymatic determination of acetic
acid (acetate) content - NAD spectrometric method)
2.10 Deutsche Norm DIN 10 370 (Juni 1998) Material zur Herstellung von
Umhüllungen für Zigarettenfilter, Zigaretten und andere Tabakerzeugnisse,
Bestimmung des Acetatgehaltes
3.1 Junge, Ch. & Spadinger, Ch. (1979) Die flüchtigen Säuren des Weines, Deutsche
Lebensmittel-Rundschau 75, 12-15
3.2 Müller, H. & Horbach, A. (1981) Bestimmung von Acetylendgruppen in Poly-_-
caprolactam durch Hydrolyse und enzymatische Essigsäure-Analyse, Die Angewandte
Makromolekulare Chemie 96, 37-41
3.3 Spicher, G. & Rabe, E. (1981) Die Mikroflora des Sauerteiges; XII. Mitteilung: Der
Einfluss der Temperatur auf die Lactat-/Acetatbildung in mit homofermentativen
Milchsäurebakterien angestellten Sauerteigen, Z. Lebensm. Unters. Forsch. 172, 20-
25
3.4 Piendl, A. & Wagner, I. (1983) Physiologische Eigenschaften der organischen
Säuren des Bieres; l. Acetat, Brauindustrie 68, 862-866
3.5 Klopper, W, J., Angelino, S.A.G.F., Tuning, B. & Vermeire, H.A. (1986) Organic
acids and glycerol in beer, J. Inst. Brew. 92, 225-228
3.6 Saalfeld, U. & Freund, W. (1999) Charakterisierung pulverisierter Sauerteige und
Möglichkeiten ihrer qualitativen Bestimmung im Brot - Teil II: Untersuchung der Acetat-
, Lactose-, Hexanal-, Calcium-, Kalium- und Natriumgehalte und der
Thiobarbitursäurereaktiven Substanzen, Deutsche Lebensmittel-Rundschau 95, 297-
304
Solución control de Ácido acético del ensayo
Concentración : ver etiqueta de la botella
La Solución control de ácido acético es una solución acuosa
estabilizada de ácido acético. Sirve como control del ensayo
enzimático para la determinación de ácido acético en alimentos y
otros materiales.
Aplicación:
1. Adición de la solución control de ácido acético a la mezcla de
reacción:
La solución control se utiliza en el ensayo en el lugar de la solución de
muestra.
2. Reiniciar la reacción, cuantitativamente:
Luego de finalizada la reacción con la solución de muestra y luego de
leída A 2 agregue 0.050 ml de solución control del ensayo. Lea la
absorbancia A 3 al finalizar la reacción (aprox. 20 min.). Se observa un
aumento de la absorbancia. No es posible realizar un cálculo debido a
la reacción de equilibrio precedente con L-MDH (3).
3. Estándar interno:
La solución control del ensayo puede utilizarse como estándar interno
para controlar el correcto funcionamiento del ensayo (errores
groseros) y para ver si la solución de muestra está libre de sustancias
interferentes.
Pipetear dentro
de la cubeta
Blanco Muestra Estándar Muestra +
estándar
Solución 1
Solución 2
Solución muestra
Control ensayo
Agua destilada
1.000 ml
0.200 ml
--
--
2.000 ml
1.000 ml
0.200 ml
0.100 ml
--
1.900 ml
1.000 ml
0.200 ml
--
0.100 ml
1.900 ml
1.000 ml
0.200 ml
0.050 ml
0.050 ml
1.900 ml
Mezclar, leer las absorbancias de las soluciones (A 0 ). Continuar como
se describe en el esquema de pipeteo bajo “Procedimiento”. Seguir
las instrucciones dadas en “Instrucciones para el desarrollo del
ensayo”·y en los pié de página.
La recuperación del estándar se calcula de acuerdo a la siguiente
fórmula:
2 x ∆A muestra + estándar - ∆A muestra
recuperación = ----------------------------------------------- x 100 (%)
∆A estánda
2013-10 4/4