Jorge Benavides - Estudio Caso Bioseguridad - LAC Biosafety

CURSO: “BIOSEGURIDAD Y BIOTECNOLOGIA MODERNA”
Estudio de caso en bioseguridad:
4. Papaya GM
Jorge Benavides Ranilla
Instituto Nacional de Innovación Agraria, INIA
La Molina

Papaya, es un fruto tropical con alto
contenido de vitaminas A y C.
Es un cultivo rentable por dar frutos
en el primer año.
Contiene papaina para uso
industrial y medicinal.

Origen de la Papaya
Domesticated
somewhere
between
southern Mexico
and
Guatemala
Cultivated
papaya
Taken into Asia
tropics in the 1600s
In Pacific
Islands
by 1800
Carica spp

1,000s mt
Producción mundial de
Papaya
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000
FAOSTAT, 1965 - 2000

Producción mundial de
Papaya
Region
País (1,000 TM)
Africa
Nigeria (748), Ethiopia (215), Congo
(210)
Asia India (700), Indonesia (484)
Americas Brazil (1,476), Mexico (745)
FAOSTAT database, 2000-2002

Los 10 paises mayores productores de papaya son:
Brazil, Mexico, Nigeria, Indonesia, India, Ethiopa,
Congo, Peru, China y Filipinas.
Exportan
Importan
Mexico y Brazil
USA (Hawaii) y
Filipinas
Brazil y Holanda
USA
Japon
Union Europea
Reference: FAO (FAOSTAT) 2005

La papaya en el Perú
• Ranking
-- Peru es el 8° productor a nivel mundial
– 9° in the area sembrada (11,736 has)
– 6° en volumen produced (175,428 TM)
• Usos
– 99.9% consumo interno
– 0.01% es exportado,
– En conserva (25.4 TM)
– Congelada (4.9 TM)
– Fresco (0.22 TM)
• Ingresos por la exportación:
– US $ 58 mil/año en 2009
–La exportacion de papaya es debido a la presencia de la
enfermedad por PRSV
• Papaya cultivada es susceptible a la infección de PRSV
• PERDIDAS: 40%

CARACTERISTICAS GENERALES DEL VIRUS PRSV
• Virus de la Mancha Anillada de la
Papaya
• Miembro de la familia de los
potyvirus
• Forma de bastón alargado, partículas
de 800-900 nm en longitud
• RNA lineal de una sola hebra de 12 kb
total, encapsulado por una proteína
de cubierta

DATOS SOBRE EL CULTIVO DE PAPAYO
A NIVEL NACIONAL:
La producción nacional de papaya fue de 0.18 millones de toneladas
métricas en una superficie cultivada de 11,736 Ha (MINAG, 2006):
Cuadro: Perú producción, superficie cosechada y rendimiento de papaya
según Región o SubRegion 2006
Región
Superficie
cosechada
(Ha)
Producción
Rendimiento
Nacional 11,736 175,428 14.95
Huanuco 2,333 32,543 13.95
Ucayali 3,757 70,884 18.87
Pasco 93 1,364 14.67
Loreto 632 7,308 11.56
San Martin 992 11,893 11.99
Cusco 744 11,748 15.79
Madre de Dios 179 1,763 9.85
Puno 268 2,663 9.94
Ayacucho 145 1,378 9.50
Junin 1,324 10,537 7.96
Apurimac 67 540 8.06
Fuente: Direcciones Regionales de Agricultura- Dirección de Información Agraria
Elaboración Ministerio de Agricultura. Dirección General de Información Agraria 2007

TM/ha
DATOS SOBRE EL CULTIVO DE PAPAYO
A NIVEL MUNDIAL:
La producción mundial de papaya fue de 5.4 millones de toneladas
métricas en una superficie cultivada de 340,594 Ha (FAO, 2001):
Rendimiento de Papaya por País - 2001
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Brasil
Mexico
China
Congo
Indonesia
Perú
Tailandia
India
Nigeria

PROBLEMÁTICA NACIONAL
Presencia del virus de la mancha anillada (PRSV-P), que ocasiona
pérdidas de 12000 TM/año (40%).
9 000 Ha de plantaciones infestadas equivalente a 25 000
productores afectados.
No se conocen genes de resistencia naturales.

SINTOMAS DEL PRSV
enrrollamiento de hojas
aclaramiento de nervaduras
Exudado de tallo y
debilitamiento del pedúnculo
= caída de frutos
Manchas circulares en el fruto
12

VIRUS TRANSMITIDO POR AFIDOS
13

Estrategias
• Mejoramiento tradicional
• Mejoramiento asistido por marcadores
MAS
• Tecnología de Post cosecha
• Mutaciones inducidas por metodos
químicos y físicos
• Ingeniería Genética

Fases de desarrollo de plantas
transgenicas
Laboratorio
Gene Discovery
Transformacion
Cultivo de tejidos
Invernadero
Campo
Comercializacion

Tecnología de papaya transgénica
Silenciamiento génico : gen RNA proteína
DNA
RNA evitando la expresión del gen (SGT)
RNA proteína
evitando que sea traducido (SGPT)
17

Silenciamiento a nivel del RNA
• dsRNA formación de RNAs pequeños
• este proceso se encuentra altamente conservado a
lo largo de la evolución.
ANIMALES: RNA de interferencia (RNAi)
HONGOS: “quelling”
PLANTAS: silenciamiento génico post-transcripcional
(PTGS)
18

Uso del silenciamiento del ARN
para la resistencia a virus
•La generación de construcciones de ARNdh son muy
eficientes en la inducción de silenciamiento del ARN
Secuencia viral
Secuencia viral
Promotor Intron Terminador
90-100% plantas resistentes
19

MODELO DE SILENCIAMIENTO GENICO
POST_TRANSCRIPCIONAL
VIRUS
ssRNA
Silenciamiento
del virus
Defensa
20

MODELO DE SILENCIAMIENTO GENICO
POST_TRANSCRIPCIONAL
21

Colecta de material de papayo contaminados
con PRSV en Junín

Madre mía
La Unión
Tulumayo
Sutulluy
Colecta de material de papayo
infectados con PRSV en
distintas localidades:
Chinchaivito
Región San Martín: la Unión y
Madre Mía
Región Huánuco: Tulumayo y
Chinchaivito
Región Ucayali: Sutulluy

Colecta de Material Infectado con el Virus PRSV
en Región Huánuco y San Martín

Mantenimiento en invernadero de plantas infestadas
con virus y aislamiento de variantes virales de PRSV

INFECCION MECANICA
PAPAYA
INFECTADA
CORTE DE HOJA
INFECTADA
PLANTA LIBRE DE VIRUS REALIZANDO
PEQUEÑAS LESIONES LOCALES
TAMPON FOSFATO
EXTRACTO DEL VIRUS
INFECCION DIRECTA

EVALUACION DE LOS PLANTONES DE
PAPAYO INFECTADOS

EXTRACCION DE ARN A PARTIR DE
HOJAS INFECTADAS
PLANTON DE PAPAYO
INFECTADO CON EL VIRUS
PRSV
CORTE DE HOJAS INFECTADAS
ALMACENAMIENTO EN NITROGENO
LIQUIDO

MUESTRAS TRAIDAS DE
INVERNADERO EN N2
LIQUIDO
MORTEROS PRE
ENFRIADOS
COLOCACION DE LAS
MUESTRAS EN MORTERO
TUBOS CON BUFFER
DE EXTRACCION
AGREGANDO N2 LIQUIDO A
LAS MUETRAS
POLVO FINO DEL TEJIDO
TRITURADO
TRITURACIÓN DEL
TEJIDO VEGETAL

CALIDAD DE ARN TOTAL A PARTIR DE
HOJAS DE PLANTAS DE PAPAYO
INFECTADAS CON PRSV
28S RNAr
18S RNAr
ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
AL 1%

Reacción de PCR
31

SINTESIS DE ADN COMPLEMENTARIO (ADNc)
Y AMPLIFICACION POR PCR DE LA PROTEINA
DE CUBIERTA
1.2kpb

Secuencia de la proteína de cubierta del PRSV (NCBI)

FORMATO DE MACROGEN PARA SECUENCIAMIENTO
Custom primers sent along with DNA samples.
Name
Sequence
Conc.(pmole/ul
)
Tm value
REP4 5´ GCTTCCGGAGCATCGATTGGAGCG 3´ 10 52
MB12A 5´ GACTCAACAAACACACAAGCGCA 3´ 10 52
Reaction Information 1
Total 42 sequencing reactions were ordered.
# Sample Name Name of Seq primer PCR Primers (F/R) DNA conc. (ng/ul)
1 CP010202 REP4 Leave blank if no PCR 30
2 CP010202 MB12A Leave blank if no PCR 30
3 CP010204 REP4 Leave blank if no PCR 18
4 CP010204 MB12A Leave blank if no PCR 18
5 CP020102 REP4 Leave blank if no PCR 18
6 CP020102 MB12A Leave blank if no PCR 18
7 CP010308 REP4 Leave blank if no PCR 18
8 CP010308 MB12A Leave blank if no PCR 18
9 CP020506 REP4 Leave blank if no PCR 18
10 CP020506 MB12A Leave blank if no PCR 18
11 CP020105 REP4 Leave blank if no PCR 15
12 CP020105 MB12A Leave blank if no PCR 15
13 CP010106 REP4 Leave blank if no PCR 15
14 CP010106 MB12A Leave blank if no PCR 15

CROMATOGRAMAS DE SECUENCIAS VIRALES

SECUENCIAS COMPLETAS DE
LA PROTEINA DE CUBIERTA
DE PRSV OBTENIDAS

ANÁLISIS POR BLAST DE LA SECUENCIA DE
AMINOACIDOS A PARTIR DE LA SECUENCIA
NUCLEOTIDICA CP010308

Secuenciamiento y análisis Filogenético
de las razas virales
43
100
72
52
63
CP020404
CP020101
CP020105
CP020102
CP010202
CP010204
80
CP010308
CP020204
CP010104
Región
Huánuco y
San Martín
Huánuco y San M
Junín
Región Junín
0.002

Mexico
Thailandia
China
Thailandia
Indonesia
Thailandia
Thailandia
Thailandia
China
Vietnam
Vietnam
Vietnam
Filipinas
Vietnam
China
Thailandia
Vietnam
Japon
Thailandia
Vietnam
Vietnam- China
Taiwan - Malasia
China
Vietnam
Asia
India
Sri Lanka
India
India
Pakistan
India
99
99
96
99
27
60
99
99
43
58
28
37
37
99
84
17
45
71
99
98
53
76
91
84
9
10
29
4
98
31
21
3
24
13
0
0
9
15
15
10
2
7
6
2
1
Venezuela
Perú
Mexico
Florida USA
Taiwan
Mexico
Mexico
Australia
Mexico
Jamaica
Florida USA
Mexico
Florida USA
Cuba
Venezuela
Mexico
Venezuela
Brasil
Vietnam
India
Mexico
América
Thailandia
China
Thailandia
Indonesia
Thailandia
Thailandia
99
99
99
99
99
99
99
52
99
13
79
71
14
75
4
35
63
1
3
79
1
0
2
9
0
0
1
0
35
0
27
1
0
4
94
84
17
45
99
53
76
29
98
0

Se realizó el diseño final del
constructo utilizando el
programa Vector NTI 10® de
invitrogen (Figura N°2), en las
cuales incluía los fragmentos
de interés, los sitios de corte
enzimático y el tamaño total
del plásmido, que resulto ser
de 9,724 pares de base.
Este diseño y la construcción
virtual del plásmido fueron
muy importantes para el
desarrollo físico del constructo

Todas las extracciones de ADN plasmídico fueron realizadas utilizando el
kit comercial de promega Wizard ® plus SV Minipreps DNA Purification
System y resuspendidas en 50ul de agua libre de nucleasa.

Transformación genética

Transformación bacteriana y análisis de plásmidos quiméricos
‣ Se han ligado las
secuencias de interés en
un vector comercial de
clonamiento pGEM-T
Bacteria E. coli dH5α
‣ El INIA cuenta con un equipo
Electroporador, que se esta utilizando para
Incorporar las secuencias de interés en un vector

‣ Actualmente ya se tiene una lista de los vectores y fragmentos que nos
proporcionaría el CIP:
• Vector pCAMBIA 2305.1
• Vector pCAMBIA 1305.1
• pCIP92
• pCIP90
• pCIP41

Aislamiento por PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa)
‣ Se han estandarizado las condiciones para obtener los fragmentos
de interés mediante la amplificación por PCR con secuencias
especificas; además se cuenta con técnicas de purificación a partir de
geles de agarosa.
Producto amplificado por PCR
Producto purificado a partir de
un gel de agarosa

‣ Además se cuenta con un cepario criopreservado a -70ºC de
los plasmídos utilizados para las actividades de transformación
genética.
El Analizador genético adquirido por el
CNBAF, permitió el secuenciamiento
parcial del constructor pINIA001
Incubadora con shaker para
cultivos bacterianos

In vitro
Se cuenta con un protocolo de medio de micropropagación de
plántulas de papayo in vitro.

Propagación del material vegetal
‣ Se cuenta con la variedad de papayo
PTM311 susceptibles al PRSV.
‣ Mediante un acuerdo con el IIAP se
realizó la transferencia del material vegetal
para su uso con fines de investigación.
Plántulas de papayo micropropagadas
Plántulas de papayo regeneradas
Cuarto de propagación con condiciones
optimas para la regeneración del material
vegetal

Germinación de semillas de papayo
‣ Se ha establecido un
protocolo de desinfección de
semillas para ser
introducidas in vitro.
‣ Se tiene un medio de
germinación in vitro.
‣ Las plántulas obtenidas
son utilizadas para la
transformación genética
Cámara germinadora
Semillas germinadas
después de 3 semanas
de introducidas

C3.- Desarrollar metodologías para la producción
de plantas de papayo resistentes al PRSV.
‣ Se están desarrollando eventos de transformación con
el gen GUS en hojas de papayo para estandarizar la
metodología de trabajo.

Transformación genética con el constructo
pINI001 en Papaya
La transformación
genética fue
mediada por A.
tumefaciens
Medio de regeneración
Medio selectivo de
regeneración de embriones

C4.- Elaborar protocolos de bioseguridad para la
experimentación en la producción de plantas de papaya
‣ Se realizó un taller con
especialistas de diferentes
instituciones a nivel
nacional e internacional,
para elaborar protocolos de
bioseguridad en el caso de
papaya transgénica.
Desarrollo de protocolos de bioseguridad en laboratorio,
invernadero y campo para la manipulación de plantas
transgénicas en el Perú
‣ Se tiene un informe
técnico de esta reunión, así
mismo se está a la espera
de la aprobación de las
“Normas internas de
seguridad de la
biotecnología del Instituto
Nacional de Innovación
Agraria”, producto del taller
realizado.

‣ Se ha incorporado el sexado de plantones de papayo con el fin de
incrementar las medidas de bioseguridad para evitar posibles escapes
mediante el flujo génico. Para lo cual se cuenta con secuencias
especificas que permiten seleccionar plántulas de papayo hembras, que
serán utilizadas en la transformación genética.
SDP2 – SDP3
M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20
H/M H/M F F F H/M F
CFW – CRV U10 M1 M 2 M3 M4 M5 M6
H/M H/M H/M F H/M F H/M
NAPF76 – NAPF77
U10 M1 M 2 M3 M4 M5 M6
H/M H/M H/M F H/M F H/M
Blga. Yenny Aquino encargada de
realizar pruebas de determinación de
sexo en papayo
SDP1 –SDP2
M1 M 2 M3 M4 M5 M6
H/M H/M F H/M F H/M

‣ Se ha remitido al Comité Interno de Bioseguridad del INIA los
protocolos y documentación solicitada para obtener la autorización de
trabajar con OVM´s en papayo.

Estandarización de protocolos para detección de
eventos transgénicos en papayo
Equipo de PCR en tiempo Real
‣ Se han establecido protocolos para la determinación de eventos transgénicos en
papaya.
‣ Así mismo una vez que se tenga la inserción del fragmento CP en el genoma de
la papaya, este será analizado utilizando sondas especificas.
‣ Para estos tipos de análisis el INIA cuanta con un equipo de PCR en tiempo
Real de ultima generación adquirido por el CNBAF

C5.- Fortalecimiento Institucional para el desarrollo
de ingeniería genética y la bioseguridad
‣ Capacitación en
bioinformática dirigida por
especialistas del CIP al
personal profesional del
INIA
Taller realizado en el CIP,
organizado por el proyecto
Papayo “Herramientas básicas
de bioinformática aplicada al
proyecto Papayo”

Infraestructura y equipos
‣ Se han adquirido equipos como la cámara de flujo vertical de
bioseguridad clase II, en donde se realiza actualmente los eventos
de transformación genética en papayo y en microorganismos como
E. coli y Agrobacterium thumefaciens.

Invernadero de Bioseguridad
‣ Actualmente se esta construyendo un
invernadero de bioseguridad, donde se
pondrán las plantas de papayos transgénicas
para su confinamiento y se realizaran las
pruebas de resistencia al virus PRSV.
Área para la construcción del
Invernadero de Bioseguridad

Equipos y kits comerciales adquiridos para el
proyecto papayo por intermedio del CIP.
Kits para
extracción y
purificación de
ácidos nucleicos
Mini centrifuga
Adquisición de
Micropipetas

El Proceso de la Tecnología de la Papaya Transgénica

Conclusiones
Los protocolos para el desarrollo del constructo pINIA001 resultaron ser eficientes a un 99%. Por lo
que al final se logro obtener el constructo pINIA001, el cual fue verificado con pruebas moleculares
de PCR y con enzimas de restricción.
La desinfección de semillas con el protocolo establecido resulto ser óptimo para la eliminación de
Hongos y bacterias a un 80%.
El medio de germinación fue eficiente a un 60 %, pero se logro obtener buena cantidad de
explantes a partir de las semillas geminadas.
Los callos transformados se mantienen viables en medio selectivo con kanamicina por lo que se
deduce que en estos se encuentra por lo menos parte del gen de resistencia nptII. Se espera tener
la regeneración total y la propagación de la planta para poder realizar las pruebas moleculares.
La transformación genética en papayo con embriones somáticos, resulta ser un proceso largo, por
tal motivo los resultados de la inserción del transgen no se pueden determinar hasta la
regeneración del callo.
Los primers y protocolos de PCR que fueron utilizados para verificar la inserción de los fragmentos
en el constructo, también son viables para la verificación de la inserción del transgen en los
explantes de papayo transformados.