Marcadores moleculares - LAC Biosafety

Marcadores molecularesDesde el punto de vista de un análisis derelación genética los marcadores molecularesson:‣Puntos específicos fijados a un cromosoma‣La herencia es completamente Mendeliana

GenéticaPrimera ley de Mendel?En un diploide los dosAlelos de un gen segregan en losgametos con igual frecuenciaindividuo: Aa gametos: A 50%, a 50%

gametos f1hembraPrimera ley de Mendel y frecuencias F2?F1 F1: Aa Aagametos f1 macho1/2A 1/2a1/2A 1/4AA 1/4Aa1/2a 1/4Aa 1/4aaF2:1/4AA 2/4Aa 1/4aa (codominante)3/4A- 1/4aa (A dominante)

F2: AA 1/4 Aa 2/4 aa 1/4 (codominante)A- 3/4 aa 1/4 (A dominante)No se puede distinguir AA o AaComo se interpreta esto con marcadores moleculares:AAAaaaDominanteAA Aa aaCo-dominante

Tipos de marcadores genéticos1. Marcadores morfológicos (Efecto combinado demuchos genes y el ambiente).Caracteres morfológicos son los más antiguos yampliamente usados.Son profundamente afectados por fluctuacionesambientales y por las etapas de desarrollo de la planta,así como por el vasto número de individuos a analizar.

Marcador morfológico

Visualización de losFragmentos Amplificados1 2 M 1 2 MPolimorfismo

Marcadores molecularesCualquier señal o traza molecular que nos permite estudiar un caracter(Fenotipo) o gen (Genotipo) asociado a este, y de herencia mendeliana(Marcador Genético) y detectada como secuencias de ADN o proteínasDetección de variabilidad a nivel de secuencias de ADN.Fuentes de origen de MM1. ADN cromosómico (genómico)ADN codificanteADN no codificanteADN altamente repetido2. ADN extracromosómicoADN mitocondrialADN de cloroplastosAFLP RAPD SSR

Procedimientos Generales en el uso de MM:1. Extracción de DNA2. Generación de polimorfismoEnzimas de restricciónReacción PCRCombinación de los 2 anteriores (enzimas derestricción y PCR)3. Electroforesis (horizontal, y/o vertical)4. Detección de los fragmentosSondas marcadasBromuro de etidio, UVQuimioluminiscenciatincion en plata5. Autoradiografía y/o fotografia6. Evaluación de los fragmentos7. Análisis estadístico

Aislamiento de DNAMoler hojas+ cloroformo Transferir sobrenadante+DNAEliminar isopropanol,Disolver en H20, TEProteina/polisacaridos‘CTAB’Marcos Malosetti, 2007 Wageningen University

ConceptosEnzimas de restricción (Endonucleasas): Son proteínasque reconocen secuencias cortas de nucleótidosespecíficas y cortan ADN en esas zonas.Pst IADN

Iniciadores (“Primers”): Es una secuencia corta de ácidodesoxirribonucleótido (ADN) que se ancla a una hebra delADN molde. El cual se requiere para la síntesis de ADN invitro (reacción de polimerización), ya que la ADN polimerasasolo no es capaz de iniciar la polimerización de ADN .RAPD 10-mer Set ARAPD 10-mer Set BTube A-01 5'-CAGGCCCTTC-3' Tube B-01 5'-GTTTCGCTCC-3'Tube A-02 5'-TGCCGAGCTG-3' Tube B-02 5'-TGATCCCTGG-3'Tube A-03 5'-AGTCAGCCAC-3' Tube B-03 5'-CATCCCCCTG-3'Tube A-04 5'-AATCGGGCTG-3' Tube B-04 5'-GGACTGGAGT-3'Tube A-05 5'-AGGGGTCTTG-3' Tube B-05 5'-TGCGCCCTTC-3'Tube A-06 5'-GGTCCCTGAC-3' Tube B-06 5'-TGCTCTGCCC-3'Tube A-07 5'-GAAACGGGTG-3' Tube B-07 5'-GGTGACGCAG-3'Tube A-08 5'-GTGACGTAGG-3' Tube B-08 5'-GTCCACACGG-3'Tube A-09 5'-GGGTAACGCC-3' Tube B-09 5'-TGGGGGACTC-3'Tube A-10 5'-GTGATCGCAG-3' Tube B-10 5'-CTGCTGGGAC-3'Tube A-11 5'-CAATCGCCGT-3' Tube B-11 5'-GTAGACCCGT-3'Tube A-12 5'-TCGGCGATAG-3' Tube B-12 5'-CCTTGACGCA-3'Tube A-13 5'-CAGCACCCAC-3' Tube B-13 5'-TTCCCCCGCT-3'Tube A-14 5'-TCTGTGCTGG-3' Tube B-14 5'-TCCGCTCTGG-3'Tube A-15 5'-TTCCGAACCC-3' Tube B-15 5'-GGAGGGTGTT-3'Tube A-16 5'-AGCCAGCGAA-3' Tube B-16 5'-TTTGCCCGGA-3'Tube A-17 5'-GACCGCTTGT-3' Tube B-17 5'-AGGGAACGAG-3'Tube A-18 5'-AGGTGACCGT-3' Tube B-18 5'-CCACAGCAGT-3'Tube A-19 5'-CAAACGTCGG-3' Tube B-19 5'-ACCCCCGAAG-3'Tube A-20 5'-GTTGCGATCC-3' Tube B-20 5'-GGACCCTTAC-3'

La reacción en cadena de la Polimerasa (PolymeraseChain Reaction - PCR): Es una técnica in vitro deamplificación enzimática del ADN. Mediante el cualse obtiene millones de copias de secuenciasespecíficas del genoma de un organismo.ciclos, consta de 3 pasos:1. Denaturación: es una denaturación termal de lamuestra de ADN, a 94- 95°C.2. Anclaje de iniciadores (Renaturación): latemperatura de la mezcla es enfriada hasta los 35-60°C.3. Síntesis (polimerización): La temperatura es elevadaa 70 - 85 °C, la temperatura óptima (72°C)

Los componentes de amplificación para la reacciónPCR son:•primers sintéticos, que son regionescomplementarias a las cadenas opuestasque flanquean a la región de ADN blancoque se desea amplificar.• Una secuencia blanco en una muestra deADN•Una enzima, la ADN Polimerasatermoestable que pueda resistir altastemperaturas de calentamiento (95° C amás).• Los cuatro deoxiribonucleótidos (dNTPs).• Un buffer para darle las condicionesadecuadas al sistema en conjunto.

2 x -2x, x= número ciclos

Preparación de gel para electroforesis

Electroforesis: Es el movimiento de una partícula cargada(ion) en un campo eléctrico. El movimiento se realiza enmedio líquido que está sostenida por sustancia sólida inerte,como papel o gel semisólido.

Sistema de marcadores DNABasados en hibridación*******probeDNARFLP, VNTR,oligonucleotide fingerprintingBasados en amplificaciónDNARAPD, DAF, AFLP, SSR,MP-PCR, ISSR, IRAP, REMAP,STS, SCAR, CAPSBasados en secuenciamiento ATTAGTCTTACCTAGGAATCGATTTAATCAGAATGGATCCTTAGCTAAEST, SNP,DNA microarrayGupta et al., 1999

Tipo de polimorfismoAlta resolucion:Al nivel de par de basesBaja resolucion:Al nivel de fragmentosde restriccion ofragmentos amplificados‣RFLP‣RAPD‣AFLP‣SCAR‣CAPS‣SSR‣i-SSR

DNA genómicoRFLP+ Enzimas de restricción = digestiónPapel toallaElectroforesis engeles de agarosaMembranaGelEsponjaSouthern BlotPerfil de polimorfismoobtenidoHibridacióncon sondaMembrana conDNA transferido

RFLPEsta técnica se vale de la capacidad que tienen las enzimas de restricción parapoder reconocer secuencias especificas a lo largo del genoma, de modo que unamutación puntual dentro del sitio de restricción resultará en la pérdida o gananciade una secuencia de reconocimiento, dando origen a un fragmento de restricciónde diferente longitud a la del original.Las mutaciones causadas por una inserción, deleción o inversiones en el DNAtambién llevan a variación en la longitud de los fragmentos de restricción.Los fragmentos del genoma generados por las enzimas de restricción sonseparados en un gel de agarosa para luego ser transferidos a un soporte sólidoque puede ser una membrana de nylon o nitrocelulosa.La transferencia de los fragmentos de DNA desde la matriz de agarosa hasta lamembrana se realiza por capilaridad.Una vez que se encuentran en el soporte sólido, el DNA digerido y separado,puede ser hibridizado con una sonda (DNA de una sola hebra) que debe estarmarcada para su fácil detección.La sonda se hibridará en el lugar donde encuentre la zona complementaria a susecuencia. Para hacer visible el lugar donde se ha hibridado la sonda, ésta debetener algún tipo de señal (marcaje)

Obtención de marcadoresRFLP.

RAPDRandom AmplifiedPolymorphic DNAAmplificación de ADN anónimo concebadores de secuencia arbitraria

RAPD: iniciaodores unicos , cortos y aleaoritosTemperatura de Hibridizacion: 36-42C

‣Consiste en la amplificación mediante PCR de un ADN anónimo,utilizando para ello un cebador de secuencia arbitraria‣Normalmente se usa un solo iniciador de 10 nucleótidos de longitud

RAPD:AMPLIFICA MULTIPLES REGIONES(MULTILOCI)

Correspondencia entre fragmentosamplificados y bandas en un gel_+

Los RAPDs son marcadores dominantesA1A1 2 3A2aAA Aa aaa3a

Ventajas‣ Requiere baja cantidad de DNA‣ Facil de obtener‣ Aplicabilidad a cualquier genoma‣ Bajo costoDesventajas‣ Problemas de reproducibilidad‣ Presencia de homoplasia en las bandas‣ Nivel de información limitada debido a sunaturaleza dominante (no se puede diferenciar unheterocigoto de un homocigoto, el locus se reducea un solo alelo)

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)Reaccion PCRPrimers deben encontrarsecuenciascomplementarias entre200 – 2500 pbTincion (bromuro deetidium)

RAPDReaccion PCRElectroforesisTinción y visualización de los fragmentos de amplificaciPolimorfismo con latécnica RAPD

AFLPsAmplified FragmentLength Polymorphism

Metodología de obtención de Marcadores AFLPADN GenómicoDigestiónEco RIMse ILigaciónEco adapterMse adapterPCR1:PreamplificaciónPcr2:AmplificaciónselectivaElectroforesisEco primerNEco primerNNNNMse primerNNNMse primerAutoradiografíaTinción Nitrato de plata

Principios de la técnica AFLPGAATTCTTAACTTAAGAATT1. Digestión delADN GenómicoEco RIMse IAATTCTTAAAdaptador Eco RIGAdaptador EcoRI: 5’-CTCGTAGACTGCGTACCCATCTGACGCATGGTTAA-5’AATTCNTTAAGNTATAATAdaptador Mse INTTANAATLiberación de fragmentos conterminales Eco RI y Mse I2. Ligación conadaptadores desecuencia conocidaAdaptador Msel: 5’-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5’

Primer EcoRI+1(E+1): 5’-GACTGCGTACCAATTCN5 TAATTCNTTAAGNPrimer Msel+1 (M+1): 5’-GATGAGTCCTGAGTAAN’NTTANAATG 53. Amplificación preselectivaAATTCTNNTTAAGANN5’ TTGAATTCTNNTTAAGANNAATTCTTGTTAAGAACNNCTTANNGAAT4. Amplificación selectivaNNCTTANNGAATAGG 5’TCCTTAAGGAATElectroforesis en geles de poliacrylamida

Obtención demarcadores AFLPPolimorfismo enArracacha, según lacombianción de losiniciadres E-AAC/M-CTT.

‣ ReproduciblesVentajas‣ Elevado número de bandas obtenidas por gel‣ No se necesita información previa para sudesarrollo (sondas o iniciadores específicos)Desventajas‣ Presencia de homoplasia en las bandas‣ Nivel de información limitada debido a sunaturaleza dominante

Raul Blas

SSRSimple Sequence RepeatSinónimosMicrosatélitesSTR - Short Tandem RepeatSTMS - Sequence Tagged Microsatelite SiteSSLP - Simple Sequence Length Polymorphism

¿Que son microsatélites?‣ Fragmentos de ADN formados por unidades repetitivasde secuencia simple.‣ Estas unidades o motivos se componen de 1 a 6 paresde bases y su grado de repetición es relativamente bajo.‣ Se utilizan un par de iniciadores (20 pb aprox) para suamplificaciónTTTTTTTTTT = T 10AGAGAGAGAGAG = AG 6CATCATCATCATCATCAT = CAT 6TAGTTAGTTAGTTAGTTAGTTAGT = TAGT 6MononucleotidoDinuclotidoTrinucleotidoTetranucleotido

ADNgenómico(TC) 14Microsatélite......CAGCCCGTAAATGTATCCATCATTAGCTTTCGATAAAGACCATCT C TCTCTCTC TCT CTC TCTCTC T CT CTGTGAAACCCAGTTGAATTAGAATTTTGAATTT............GTCGGGCATTTACATAGGTAGTAATCGAAAGCTATTTCTGGTAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACACTTTGGGTCAACTTAATCTTAAAACTTAAA......

OBTENCION DE MICROSATELITEShttp://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jec16/Image02.htm

Tipos de SSRPerfectos: (CA) nImperfectos: (CA) n – CCA – (CA) mn, m y r = número derepeticiones delmotivoCompuestas: (CA) n (TG) mCompuesta interrumpido: (CA)n –TG-(TG)mCompleja: (CA)n –TG-(TG)m (TA)rGT n los mas extendidos en genoma de mamíferosAt n la mas extendida en genoma de vegetalesGA n mas abundante en cebada y arroz

Marcadores microsatéliteEtapas de la técnica SSR incluyen:2. Electroforesis en gelesPoliacrilamida o agarosa (casosmuy limitados)1000 pb1. ReacciónPCR, con dosiniciadoresespecificos paraun locus SSRF1 F2 F3 F4 F5stop1 2 34 5 67 8 9Gene Amp enter 0 ceIBT100 pbM P 1P 21 2 3 4 5 6Huamani, 2008IIIIIIPCR en P 1, 3 y 6IIIIIIPCR en P 2, 2 y 5IIIIIIPCR en 1 y 4

DNA individuo 1AT 12ATATATATATATATATATATATATRegiónconservadaIniciador 1RegiónConservadaIniciador 2ATATATATATATATATATDNA individuo 2AT 9

Los SSR son marcadores codominantes11 2 3 4 52345

Extrategias de desarrollo de iniciadores SSR1. Clonamiento, secuenciamiento y diseño de iniciadores2. Identificación de primers microsatélite a partir demarcadores ISSR3. Búsqueda de marcadores SSR en la base de datos delGenbank.4. Transferibilidad de otras especies afines (empleo deiniciadores disponibles)

Ventajas‣ Poseen alta variabilidad en sus loci, apropiadopara los análisis de diversidad genética.‣ Se encuentran distribuidos por todo el genomapermitiendo hacer un buen muestreo genéticodel material en estudio.Desventajas‣Su caractierizacion es especifica por especie‣Su identificacion(descubrimiento) y hacerlousable es costoso. Requiere secuenciamiento delibrerias de DNA

Aplicacion de marcadores moleculares‣Analisis de la diversidad genetica‣Herencia y mapeo‣Genes candidatos‣Herramienta de seleccion: Seleccionasisitida por marcadores moleculares (MAS)Raul Blas, 2010

Fases sucesivas en la creación de unanueva variedad1. Gestion de recursos2. Cambios en los genotipos3. Selección (selección estabilizadora),4. Multiplicación del genotipo mejorado

Mejoramiento genetico de plantasBiologiaTecnologiaTiempoMaterialesPresupuestoPoblaciones naturales,variedades nativas, …Métodos demejoramientoGananciagenéticaIdiotipoObjetivosContexto:AgronomicoIndustrialAlimenticiosocial

Fases sucesivas en la creación de unanueva variedad1. Gestion de recursos genéticos2. Cambios en los genotipos3. Selección (selección estabilizadora),4. Multiplicación del genotipo mejorado

Selección asistida por marcadores moleculares– Molecular assisted selection (MAS)Es la selección indirecta por la presencia oausencia de un fenotipo o componente fenotípicodeseado, basado en la secuencia o patrones debanda de los marcadores moleculares ubicadasdentro o cerca de genes que controlan el fenotipo.La secuencia polimorfico o patron de banda delmarcador molecular es indicativo de la presencia oausencia de un gen específico o segmentocromosomal que es conocido y que lleva un alelodeseado.

Capel et al. (2000)

… Molecular assisted selection (MAS)Es la posibilidad de disponer de marcadoresligadas a los genes implicados en la variacion delos caracteres seleccionados.MAS tiene los siguientes objetivos:•Dirigir las recombinaciones para acumular enun mismo genotipo los genes o segmentoscromosomicos favorables•Facilitar la selección (selección eficaz)

Aspectos a considerar en MAS•Distancia genética (Mapas de ligamiento)‣Marcadores asociados con caracteres de interes (

Generación de un mapa genéticoMapa genético: Representacion de marcadores/genes en los cromosomas (orden + distancias)Requisitos:– poblaciones segregantes– Determinación de los genotipos de los marcadores– Estimación de las frecuencias de recombinación entretodos los pares de marcadores– Determinación de grupos asociados– Determinación el orden por grupo de asociación

Tamaño de la población‣ Determinado por el numero de semillas y de marcadoresdisponibles, es importante establecer el numero minimo deindividuos a utilizar para conocer la precision del calculo de lasfrecuencias de recombinacion que permitan construir un mapafiable.‣ Usualmente la progenie a evaluar se cosntitule de >100 individuosa fin de reducir el error estandar‣ Otros autores consideran suficiente un numero de 50 individuos

Poblacion de mapeo Los descendientes mas usados tienen como punto de partida dosparentales homocigotas, esto por cruzmiento produce f 1 todosidenticos y heterocigotas para todo los locus que han sido fijadosalelos diferentes en los parentales Se debe buscar parentales geneticamente bien alejadas para que elnumero de locus polimorficas no sean limitantes Tres tipos principales de poblacion de cartografia pueden serderivados de estos cruzamientos

Tipos de poblaciones para mapeoAAxBBF 1ABF 1 xBBXXXXXXduplicacionBC 1 F 1 F 2 RIL DHAB, BBAA, AB, BBAA, AB? BBAA, BBRetrocruza: BC1F1Poblacion segregante filial 2: F2Lineas endogamicas recombinantes: RILsLineas de haploides duplicados: DH

Determinación del ordenEjemplo: Par Frecuencia deRecombinación---- -------------A-B 0.1B-C 0.1A-C 0.2A B C+----------+----------+ No es posible otro orden!!!

Ejemplo con tres marcadoresTres marcadores• Tabla de conteo de recombinaciones• Marcador 1 Marcador 2 = 30• Marcador 1 Marcador 3 = 15• Marcador 2 Marcador 3 = 20014Marcador 1Marcador 3– Cuáles son las posibilidades?15 30 20M1 M2 M3 M1 M3 M2 M2 M1 M330 2015 20 30 1533 Marcador 2

Gebhart (2004)

Determinacion de sexo enplantasPhoenix dactylifera L

Ubicacion taxonomica:Family:PalmaceaeSub-family: CoryphyoideaeTribe:PhoeniceaeGenus: PhoenixEl genero Phoenix, presenta ~ 12 especies, incluida

CONVERTIR LOS MARCADORES AFLP A SCARSecuenciar el fragmento y elaborar iniciadores especificos

SCAR“Sequence-characterized amplified regions”AplicacionesBúsqueda de co-dominancia• Selección asistida• Análisis de asociación

Aplicabilidad de marcadores PVY-LBpara mejoramiento

Objectivos:Identificación de clones con el gen Ry adgy Ry stoparainmunidad a PVY.Identificación de clones con genes R demo R blbo QTLs (quegobiernen un alto porcentaje de la resistencia observada) pararesistencia rancha (tizón).

Material vegetalSe analizó en total 61 clones, mas 5 controles:‣36 clones avanzados resistentes y/otolerantes a TT y PVY:población B3población LTVRhibridos somaticos‣25 cultivares nativos (Huanuco) de adg, gon yphu:14 clones resistentes a LB11 clones susceptibles a LB

Métodos:Se utilizaron marcadores alelo-específicos (iniciadores-SCARs, CAPs) seleccionados en CIP and Max PlantInstitute:Identificación de clones con resistencia a PVYSe han identificado y validado 4 iniciadores:•Adg: RYSC3•stolon (M5, M6 y M17)

Primers and its sequences used in genotipes screeningMarker Ry-linked Primer Sequencepolymorphism nameRYSC3 3.3.3S 5’-ATA CAC TCA TCT AAA TTT GAT GG-3’Adg23R 5’-AGG ATA TAC GGC ATC ATT TTT CCG A-3’M5 MseI, Tru M5-m GCT GTT CAC AAT GGG AAC ATG GM5-p CAT ACA AAC TAC TTC TAC CAC GM6 Rsa I M6Rsa TCC GAA ATG TTT GGG CTG ACA TCM6Taq AAG GGA TCC AAA AAG GTG GTT CAM17 Pst I M17-m GAC TGC TTT CTC TCC ACG TGG CM17-1 GAT CAC AGA TGT TTT ACC TTC GAT G

ResultadosTamizado para PVYPerfil de amplificación para 14 clones (primer M5)M M MM= marcador de peso molecular (cada 100pb), laflecha indica el marcador con un peso molecular de400bp

... Tamizado para PVYPerfil de amplificación para 18 clones (primer M17)

Identificacion de genes pararesistencia a la rancha

Estrategia de trabajo para mapeo geneticoS. phurejaClon 618xF1S. circaeifoliumCIP-761030(6b.25; 6b.39)plantulas (~300)Analisis fenotipicoinvernaderocamposelectedclones92Analisis molecularAFLPSSRAnalisis de datos, mapeo

Procedimiento para la aplicacion de MM en laseleccion: MAS•Extraccion de DNA•PCR (amplificacion del marcador de interes)•Electroforesis•Visualizacion de DNA•Evaluacion de polimorfismo (lectura de geles)•Descarte de individuos sin alelo de interes•Plantas seleccionadas

Identificación de progenies hibridas

MM como herramienta en MejoramientoConfiabilidad y repetibilidadMarcadores con estrecho ligamiento a genes decaracteristicas importantesMuy importante para caracteristicas dificiles (aquellasque no pueden ser facil o confiablemente medidosusando metodologias tradicionales (e.g. resistencia anematodes…)Otros pueden no ser visibles o solo detectados enplantas madurasOtros son muy dificiles o costosas para el tamizadoLa posibilidad de manejar poblaciones demejoramiento de gran tamaño (en espacio reducido)

Limitaciones de la Tecnica MASMapa genetico denso para el cultivoMarcador ligado al gen (

Producción de semillas y uso de marcadoresmolecularesCaracterización de cultivaresPureza genética de cultivares

Identificación de variedadesDos cultivares de soya

Pureza genética

Conclusion:Marcadores moleculares pueden tener numerosas aplicaciones enlos diferentes fases de la seleccion:‣Optimizacion de la conservacion de recursos geneticos‣Seleccion de los parentales‣Identificacion de alelos interesantes‣Construccion de genotipos acumulando alelos interesantesFinalmente, los MM dispone al mejorador para gestionar yvalorizar la variabilidad genética

ConsideraciónLa selección asistida por marcadores y laselección fenotípica tradicional no son estrategiasexcluyentes y los programas de mejoramientogenético de mayor eficiencia se logran medianteuna combinación de ambas estrategias.