CLASE 4 Tipificación HLA - Hospital Privado

TIPIFICACION HLA
Bioq. Eliana Palomino
Lab. De Histocompatibilidad
Hospital Privado

Tipificación HLA:
Estudio mediante el cual se determina cuales
de todas las variantes conocidas del locus
HLA están presentes en un individuo
determinado.

Muestra:
Extracción de sangre entera, anticoagulada con
EDTA.

Métodos de tipificación HLA
Serología
Linfotoxicidad medida por complemento: CDC
Biología molecular
PCR SSP (Primers de secuencia específica)
PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de
secuencia especifica)
LUMINEX
SBT (Tipificación basada en la secuencia)

Tipificación Serológica:
Principio: poner en contacto linfocitos
aislados del sujeto a estudiar con un panel de
aloanticuerpos o anticuerpos monoclonales
anti- HLA capaces de reconocer
determinadas especificidades antigénicas.

Tipificación serológica
•Se utiliza una suspensión de linfocitos viables
obtenidos a partir de sangre periférica, utilizando
Fycoll-Hypaque (densidad 1.077 g/mL)
•Separación de los L T y B con perlas
inmunomagnéticas
•Complemento de conejo
•Placas Terasaki con sueros caracterizados
•Placas con Terasaki anticuerpos monoclonales

Separación de los Linfocitos T y B con perlas inmunomagnéticas
PERLAS INCUBAR SEPARAR LAVAR

Citotoxicidad dependiente de Complemento
CDC

Ventajas y desventajas
Ventajas:
Técnica fácil ,no se requiere de equipamiento costoso
Se realiza en 3 hs
Utilizando sueros monoclonales se obtienen resultados aceptables de
bajo nivel de resolución
Desventajas
Se requieren mayores volumenes de sangre
Se requieren linfocitos viables
Dificultoso encontrar antisueros para los especificidades raras

Métodos de tipificación
HLA
Serología
LInfotoxicidad medida por complemento: CDC
Biología molecular
PCR SSP (Primers de secuencia específica)
PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica)
LUMINEX
SBT (Tipificación basada en la secuencia)

Secuencias target
HVR
HLA clase I
HVR
HLA clase II
HVR*
α 2
α 1
β 1
DQ -DP
α 3
β 2
m
β 2
α 1
α 2
– Para HLA de clase I, los exones 2 y 3 de los genes de la cadena pesada
(α1, α2)
– Para HLA de clase II, el exón 2 de la cadenas alfa y beta
Samaniego M, et al. Clin Transplant.2006;503

SSP-PCR
•Paneles de pares de primers de secuencias
específicas, cuyas secuencias discriminan las
diferentes variantes que puede presentar el locus.
•Cada reacción de PCR se realiza en un tubo
separado
•Cada tubo contiene un par de primers específicos y
un par de primers como control interno.

Amplificación por PCR
Electroforésis en gel de agarosa 2%
Visualización de los productos de amplif y confirmación del tamaño
(bp) de las reacciones +
La tipif HLA es deducida de acuerdo al pattern de reacciones + y -

HLA-DR
SSP-PCR
HLA-A*11
HLA-A*24
HLA-B*39
HLA-B*44
HLA-DR*13
HLA-DR:15

PCR-SSOP
Amplificación del locus HLA por medio de la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) con la
subsiguiente hibridación del producto amplificado
por medio de sondas de oligonucléotidos de
secuencia específica.

PCR - SSOP
• Amplificación:
Pares de primers que amplifican locus HLA específicos marcados c/
biotina
Primers genéricos
Primers group/allele específicos
•Hibridización: DNA amplificado se desnaturaliza y se hibridiza con
las sondas de secuencia complementaria a una temperatura y
condiciones estrictas de astringencia
•Resultados: Se incuba las tiras con conjugado estreptavidina y
peroxidasa que se une a la biotina y con el agregado de un sustrato
se visualizan las bandas
•La tipif HLA es deducida a partir del patrón de reacciones positivas
y negativas de la sondas

SSOP Reversa
Reporter
Strepavidin
Biotin
5’ 3’
Amplified
test DNA
3’ 5’
Probe
• Support Platforms
– Nylon membranes
– Nitrocellulose strips
– Microtiter plates
– Luminex® beads
– Microchips
• Reporter Molecules
– Fluorescent labels
– Enzyme + substrate

LUMINEX
LABType SSO

Fundamento: 100 beads ópticamente distinguibles por el luminex unidas a
sondas específicas que hibridizaran con el alelo específico en caso de estar
presente.
Using This Method and Two Dyes,
100 Individual Beads can be Resolved

LABTipe SSO
1) Amplificación con primers biotinilados.
2) Desnaturalización.
3) Hibridización con las beads.
4) Agrego SAPE (Estreptoavidina + ficoeritrina) para
amplificar la señal.
5) Lectura en Luminex.
6) La asignación de la tipificación de HLA se basa en el
patrón de reacción
comparado con patrones asociados a secuencias de
genes HLA publicadas

Description of LABType SSO
1. Amplification 2. Denaturation/Neutralization
Class I – 2/3
Class II - 2
primers
10 min
biotina
3. Hybridization 4. Labeling
5 min a 60ºC
washes

Probes are attached to color-coded beads
Probe 1
1
2
Probe 2
Probe 3
3
100

Biotin
Signal Detection
1. Add DNA
Biotin
DR15 Probe
DR16 Probe

2. Hybridize & Wash

3. Label with Stretavidin-PE
SAPE
Positive
Negative

4. Fluorescence Measurement
Fluorescence from
1. Reporter
2. Bead

SBT: Tipificación n basada en secuencia

SBT: Tipificación basada en
secuencia
El DNA se amplifica con
una mezcla de nucleótidos
marcados con 4 fluoróforos
(Didesoxinucleótidos)

•Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a
secuenciar.
•Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido
complementario del extremo de la cadena.
•desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.
•didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de
secuenciación.
Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero
cesa el incorporarse un didesoxinucleótido

electroforesis.
Identificados con un detector de fluorescencia
automatizado
Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante
electroforesis y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro
reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN

Resumen
SSP
Primers de secuencia específica
PCR/electroforésis en gel de
agarosa
Media
Rápida
SSOP
REVERSA
Sondas de oligonucléotidos
específicas a secuencia
PCR/hibridación de sondas con
producto de la PCR
Media/alta
+ prolongada
LUMINEX
Sondas de oligonucléotidos
específicas de secuencia unidas a
microesferas
PCR/hibridación de sondas con
producto de la PCR
Media o alta
Análisis múltiples con
sensibilidad de
Citometría de flujo
Análisis automatizado
estudian 96 indiv.con 100
diferentes sondas x locus
Rápido,> nº de muestras
SBT
Cebadores de sitio específicos a
grupo y mezclas de
establecimiento de secuencia con
un teminador de secuencia
marcado
PCR/establecimiento de
secuencia del producto de la
PCR
Alta
Alelos a nivel de secuencia exacta

HLA Alleles and Antigens
(IMGT)

Numero de antígenos y alelos nombrados por el
comité de nomenclatura HLA desde 1968 hasta
junio del 2010.

Assigned April 2010

Assigned April 2010
Las reglas para nombrar los antígenos HLA y alelos son establecidos por un Comité de Nomenclatura de la
WHO (World Health Organization)
(Marsh SG, et al. Immunol.2005 Humanos; 66:571 )

Assigned April 2010

Códigos NMDP( National Marrow Donor Program)

Resolución en HLA Typing
•Baja resolución molecular.
•Tipificación se resuelve o se reporta en un nivel de 2 digitos
•A*02-B*08-DRB1*03
•Equivalente a la tipif. serológica
•Resolución molecular intermedia
•Tipificación se resuelve o se reporta como un set de posibles alelos
•A*02DEKM, 24DEKN
•51 posibles A*02 allelos y 42 posibles A*24 allelos.
• Alta resolución molecular
•Tipificación se resuelve o se reporta como un único alelo
•A*01:02:01
Ventajas de los ensayos moleculares
• Mayor precisión y reproducibilidad
• No hay necesidad de linfocitos viables
• Opción para la automatización parcial o total