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CLASE 4 Tipificación HLA - Hospital Privado

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TIPIFICACION HLA

Bioq. Eliana Palomino

Lab. De Histocompatibilidad

Hospital Privado


Tipificación HLA:

Estudio mediante el cual se determina cuales

de todas las variantes conocidas del locus

HLA están presentes en un individuo

determinado.


Muestra:

Extracción de sangre entera, anticoagulada con

EDTA.


Métodos de tipificación HLA

Serología

Linfotoxicidad medida por complemento: CDC

Biología molecular

PCR SSP (Primers de secuencia específica)

PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de

secuencia especifica)

LUMINEX

SBT (Tipificación basada en la secuencia)


Tipificación Serológica:

Principio: poner en contacto linfocitos

aislados del sujeto a estudiar con un panel de

aloanticuerpos o anticuerpos monoclonales

anti- HLA capaces de reconocer

determinadas especificidades antigénicas.


Tipificación serológica

•Se utiliza una suspensión de linfocitos viables

obtenidos a partir de sangre periférica, utilizando

Fycoll-Hypaque (densidad 1.077 g/mL)

•Separación de los L T y B con perlas

inmunomagnéticas

•Complemento de conejo

•Placas Terasaki con sueros caracterizados

•Placas con Terasaki anticuerpos monoclonales


Separación de los Linfocitos T y B con perlas inmunomagnéticas

PERLAS INCUBAR SEPARAR LAVAR


Citotoxicidad dependiente de Complemento

CDC


Ventajas y desventajas

Ventajas:

Técnica fácil ,no se requiere de equipamiento costoso

Se realiza en 3 hs

Utilizando sueros monoclonales se obtienen resultados aceptables de

bajo nivel de resolución

Desventajas

Se requieren mayores volumenes de sangre

Se requieren linfocitos viables

Dificultoso encontrar antisueros para los especificidades raras


Métodos de tipificación

HLA

Serología

LInfotoxicidad medida por complemento: CDC

Biología molecular

PCR SSP (Primers de secuencia específica)

PCR SSOP Reversa (Sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica)

LUMINEX

SBT (Tipificación basada en la secuencia)


Secuencias target

HVR

HLA clase I

HVR

HLA clase II

HVR*

α 2

α 1

β 1

DQ -DP

α 3

β 2

m

β 2

α 1

α 2

– Para HLA de clase I, los exones 2 y 3 de los genes de la cadena pesada

(α1, α2)

– Para HLA de clase II, el exón 2 de la cadenas alfa y beta

Samaniego M, et al. Clin Transplant.2006;503


SSP-PCR

•Paneles de pares de primers de secuencias

específicas, cuyas secuencias discriminan las

diferentes variantes que puede presentar el locus.

•Cada reacción de PCR se realiza en un tubo

separado

•Cada tubo contiene un par de primers específicos y

un par de primers como control interno.


Amplificación por PCR

Electroforésis en gel de agarosa 2%


Visualización de los productos de amplif y confirmación del tamaño

(bp) de las reacciones +

La tipif HLA es deducida de acuerdo al pattern de reacciones + y -


HLA-DR

SSP-PCR

HLA-A*11

HLA-A*24

HLA-B*39

HLA-B*44

HLA-DR*13

HLA-DR:15


PCR-SSOP

Amplificación del locus HLA por medio de la reacción

en cadena de la polimerasa (PCR) con la

subsiguiente hibridación del producto amplificado

por medio de sondas de oligonucléotidos de

secuencia específica.


PCR - SSOP

• Amplificación:

Pares de primers que amplifican locus HLA específicos marcados c/

biotina

Primers genéricos

Primers group/allele específicos

•Hibridización: DNA amplificado se desnaturaliza y se hibridiza con

las sondas de secuencia complementaria a una temperatura y

condiciones estrictas de astringencia

•Resultados: Se incuba las tiras con conjugado estreptavidina y

peroxidasa que se une a la biotina y con el agregado de un sustrato

se visualizan las bandas

•La tipif HLA es deducida a partir del patrón de reacciones positivas

y negativas de la sondas


SSOP Reversa

Reporter

Strepavidin

Biotin

5’ 3’

Amplified

test DNA

3’ 5’

Probe

• Support Platforms

– Nylon membranes

– Nitrocellulose strips

– Microtiter plates

– Luminex® beads

– Microchips

• Reporter Molecules

– Fluorescent labels

– Enzyme + substrate


LUMINEX

LABType SSO


Fundamento: 100 beads ópticamente distinguibles por el luminex unidas a

sondas específicas que hibridizaran con el alelo específico en caso de estar

presente.

Using This Method and Two Dyes,

100 Individual Beads can be Resolved


LABTipe SSO

1) Amplificación con primers biotinilados.

2) Desnaturalización.

3) Hibridización con las beads.

4) Agrego SAPE (Estreptoavidina + ficoeritrina) para

amplificar la señal.

5) Lectura en Luminex.

6) La asignación de la tipificación de HLA se basa en el

patrón de reacción

comparado con patrones asociados a secuencias de

genes HLA publicadas


Description of LABType SSO

1. Amplification 2. Denaturation/Neutralization

Class I – 2/3

Class II - 2

primers

10 min

biotina

3. Hybridization 4. Labeling

5 min a 60ºC

washes


Probes are attached to color-coded beads

Probe 1

1

2

Probe 2

Probe 3

3

100


Biotin

Signal Detection

1. Add DNA

Biotin

DR15 Probe

DR16 Probe


2. Hybridize & Wash


3. Label with Stretavidin-PE

SAPE

Positive

Negative


4. Fluorescence Measurement

Fluorescence from

1. Reporter

2. Bead


SBT: Tipificación n basada en secuencia


SBT: Tipificación basada en

secuencia

El DNA se amplifica con

una mezcla de nucleótidos

marcados con 4 fluoróforos

(Didesoxinucleótidos)


•Como "molde" se utiliza una de las cadenas del fragmento de ADN que se va a

secuenciar.

•Como "cebador" para iniciar la síntesis, se necesita un corto oligonucleótido

complementario del extremo de la cadena.

•desoxinucleótidos de las cuatro bases: dAMP, dTMP, dGMP, dCMP.

•didesoxinucleótidos de una base en cada una de las cuatro reacciones de

secuenciación.

Al añadir la ADN-polimerasa, comienza la polimerización en el cebador, pero

cesa el incorporarse un didesoxinucleótido


electroforesis.

Identificados con un detector de fluorescencia

automatizado

Los fragmentos resultantes se separan por tamaño mediante

electroforesis y la sucesión de bandas de cada una de las cuatro

reacciones, comparándolas entre sí,dan la secuencia del ADN


Resumen

SSP

Primers de secuencia específica

PCR/electroforésis en gel de

agarosa

Media

Rápida

SSOP

REVERSA

Sondas de oligonucléotidos

específicas a secuencia

PCR/hibridación de sondas con

producto de la PCR

Media/alta

+ prolongada

LUMINEX

Sondas de oligonucléotidos

específicas de secuencia unidas a

microesferas

PCR/hibridación de sondas con

producto de la PCR

Media o alta

Análisis múltiples con

sensibilidad de

Citometría de flujo

Análisis automatizado

estudian 96 indiv.con 100

diferentes sondas x locus

Rápido,> nº de muestras

SBT

Cebadores de sitio específicos a

grupo y mezclas de

establecimiento de secuencia con

un teminador de secuencia

marcado

PCR/establecimiento de

secuencia del producto de la

PCR

Alta

Alelos a nivel de secuencia exacta


HLA Alleles and Antigens

(IMGT)


Numero de antígenos y alelos nombrados por el

comité de nomenclatura HLA desde 1968 hasta

junio del 2010.


Assigned April 2010


Assigned April 2010

Las reglas para nombrar los antígenos HLA y alelos son establecidos por un Comité de Nomenclatura de la

WHO (World Health Organization)

(Marsh SG, et al. Immunol.2005 Humanos; 66:571 )


Assigned April 2010


Códigos NMDP( National Marrow Donor Program)


Resolución en HLA Typing

•Baja resolución molecular.

•Tipificación se resuelve o se reporta en un nivel de 2 digitos

•A*02-B*08-DRB1*03

•Equivalente a la tipif. serológica

•Resolución molecular intermedia

•Tipificación se resuelve o se reporta como un set de posibles alelos

•A*02DEKM, 24DEKN

•51 posibles A*02 allelos y 42 posibles A*24 allelos.

• Alta resolución molecular

•Tipificación se resuelve o se reporta como un único alelo

•A*01:02:01

Ventajas de los ensayos moleculares

• Mayor precisión y reproducibilidad

• No hay necesidad de linfocitos viables

• Opción para la automatización parcial o total

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