1 - The Group of 77

MATERIALES :
PLACAS: Tipo NUNK - F comerciales de poliestireno de 96 pocillos.
RECUBRIMIENTO CON ANT/GENO: PMSG (Gonadotropina serica de suero
de yeguas gestantes) purificada en nuestro laboratorio por cromatografia de
intercambio i6nico con Carboximetil Sephadex C -50 como intercambiador a
partir de crudo de PMSG seco con acetona.
CONTROLES: plasma de yegua gestante de 25 UI como control positivo y
plasma normal de caballo como control negativo.
ANT/CUERPO: IgG anti PMSG purificada por cromatografia de afinidad con
Proteina G como matriz y obtenida en conejo mediante un esquema de
inmunizaci6n con PMSG purificada.
CONJUGAOO : Anti IgG de conejo obtenida en camero conjugada a la enzima
peroxidasa de rabano picante por el metodo del perhiodato (Nakane and Kawaoi
).
SUSTRATO: Soluci6n de buffer fosfato - citrato, OPD como crom6geno y
per6xido de hidr6geno al 30 %.
PASOS DEL ELISA:
1- Se recubre la placa con 100 )1.1 de PMSG purificada diluida en el buffer de
recubrimiento segun la diluci6n de trabajo. Incubamos durante 1 hora a 37°C
en camara humeda y luego realizamos 3 lavados con una soluci6n de
agualTween.
2- Bloqueamos la placa con 200)1.1 por pocillos de Gelatina al 3 %. Incubamos
durante 1 hora a 37°C en camara humeda y luego realizamos 3 pasos de
lavados como los anteriores.
3- Anadimos 50 )1.1 de muestras y/o controles por pocillos y luego de 15 minutos
de incubaci6n igual a los pasos anteriores, adicionamos el anticuerpo anti ­
PMSG, 50 )1.1 por pocillos diluido en suero de caballo al 5 % y luego de una
hora de incubaci6n como las anteriores lavamos nuevamente la placa 3 veces.
4- EI conjugado se anade segun la diluci6n de trabajo 100)1.1 por pocillo,
disuelto en suero de caballo al 5% y se incuba una hora a 37°C en camara
humeda. Luego se lava la placa segun procedimiento anterior.
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