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• Obtener un producto de calidad suficiente que pueda competir en el mercado internacional. • Empleo en los medios de diagn6stico. • Obtenci6n de un patr6n nacional purificado que se empleara para liberar nuestros lotes comerciales. En este sentido se ha venido trabajando desde hace algun tiempo por especialistas nuestros y de otros centros en el desarrollo de diferentes protocolos de purificaci6n de la PMSG, dentro de los cuales debemos mencionar el apoyo brindado por el Centro de Investigaciones BiomediGas (CIBIOMED) y el Centro de Inmunologia Molecular (CIM), donde se han obtenido resultados muy alentadores en vista de 10 cual se decidi6 extrapolar estos metodos y estandarizarlos en el equipo de purificaci6n AKTA explorer. De los resultados <strong>of</strong>recidos por estos dos metodos se logr6 disenar uno novedoso con muy buenos resultados que es el que se utilizara para hacer el escalado a nivel seminidustrial e industrial que es el objetivo final de nuestro trabajo. OBJETIVOS • Estandarizar el metodo de purificaci6n adecuado que brinde los mejores resultados para la obtenci6n de una PMSG de alta calidad. • t:valuar los resultados obtenidos con las diferentes tecnicas, empleando como herramientas los metodos de diagn6stico y electr<strong>of</strong>oreticos . MATERIALES Y METODOS Los metodos de purificaci6n de PMSG que utilizaron fueron: I. EI metodo de purificaci6n de PMSG desarrollado y estandarizado en CIBIOMED. como parte de la colaboraci6n que existe entre este centro y el nuestro (Mustelier y colaboradores, 1990), que utiliza cambio de pH en columnas de CM Sephadex. J Un metodo de gradiente de concentraci6n de sales con matriz de SP Sepharose Fast Flow que es el metodo en el que se ha venido trabajando en el CIM. 3. EI metodo 1 con cambio de pH pero con utilizando el intercambiador SP Sepharose Fast Flow que fue la empleada en el metodo 2. 4. Un metodo de cambio de pH y de los valores de concentraci6n de sales con columnas de SP Sepharose Fast Flow (Metodo novedoso). Todos estos metodos se estandarizaron en el equipo de purificaci6n de alta tecnologia AKTA explorer. Se disenaron 3 protocolos de purificaci6n para cada uno de ellos, donde se cambiaron algunos parametros de trabajo en el equipo tratando de optimizarlos y de cada protocolo se hicieron alrededor de 6 replicas.
A continuaci6n se describen cada uno de los metodos Metodo 1 Empleamos una columna CM Sephadex 1 ml de Pharmacia (Columna de la firma y de poca capacidad que solo permite su uso para pequenos volumenes de muestra). Volumen de muestra empleado de 500 ml. Tipo de muestra: Crudo de PMSG filtrada y c1arificada. Lote semanal #4. Buffer de corrida Acetato de Sodio 0.1 M pH 4.5. Buffer de eluci6n Acetato de Sodio 0.1 M pH 8.5. Metodo 2 Empleamos una columna Hi Trap SP 1 ml de Pharmacia (Columna muestra de la firma y de poca capacidad que solo permite su uso para pequenos volumenes de muestra). Volumen de muestra empleado de 500 ml. Tipo de muestra: Crudo de PMSG filtrada y clarificada. Lote semanal #4. Buffer de corrida: Acetato de Amonio 0.1 M pH 4.5. Buffer de lavado: Acetato de Amonio 0.1 M pH 4.5. Cloruro de Sodio 0.13 M Buffer de eluci6n: Acetato de Amonio 0.2 M pH 8.0. Metodo 3 Empleamos una columna Hi Trap SP 1 ml de Pharmacia (Columna muestra de la firma y de poca capacidad que solo permite su uso para pequenos volumenes de muestra). Volumen de muestra empleado de 500 ml. Tipo de muestra: Crudo de PMSG filtrada y c1arificada. Lote semanal #4. Buffer de corrida Acetato de Sodio 0.1 M pH 4.5. Buffer de eluci6n Acetato de Sodio 0.1 M pH 8.5. Metodo 4 Empleamos una columna Hi Trap SP 1 ml de Pharmacia (Columna muestra de la firma y de poca capacidad que solo permite su uso para pequenos volumenes de muestra). Volumen de muestra empleado de 500 ml. Tipo de muestra: Crudo de PMSG filtrada y c1arificada. Lote semanal #4. Buffer de corrida Acetato de Sodio 0.1 M pH 4.5. Buffer de eluci6n Acetato de Sodio 6 M pH 6.5. Se cambi6 la columna por una Hi Trap SP de 5ml tambien preempaquetada por la firma Pharmacia can el objetivo de aumentar el volumen de muestra a 2ml, bajo estas 34
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V. REFERENCES [ 1] Menendez, A; 1.
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[23]Pursley,1. R; M. C. Witbank; 1.
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