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condiciones se realizaron alrededor de 4 corridas y posteriormente se procedio a
cambiar la columna por una de mayor tamaiio que aceptara volumenes de muestra de
hasta 20mI para 10 cual se empaqueto una columna XK 26/20 con 70 ml de gel
prehinchado de SP Sepharose FF a un flujo de 10 ml/min, el volumen de muestra
aplicado fue de 20 ml del mismo LS#4 usado para el resto de los metodos. Este
escalado implic6 un cambio completo de todas las conexiones del AKTA explorer para
ponerlo listo para trabajos futuros a escala semindustrial e industrial.
Cada uno de los picos obtenidos en los diferentes metodos de purificaciones se
analizaron empleando :
Electroforesis SOS PAGE.
ELISA.
_ Prueba biol6gica en ratones (Loraine y Browm, 1954).
RESULTADOS Y DISCUSION
En el caso de los metodos 1 y 3 los resultados fueron muy similares en todos las
replicas que se hicieron de los mismos solo se diferenciaron en el tiempo de elucion de
la hormona que fue menor cuando se us6 el eM, 10 cual se explica porque esta matriz
es mas debil que la SP y por tanto la hormona se desprende con mucha mayor
facllidad ante cualquier cambio de fuerza ionica 0 de pH que sufra la matriz, pero el
rendimiento y comportamiento electroforetico de ambos picos de elucion fue muy
similar en ambos metodos, 10 cual nos permite concluir que cualquiera de las dos
matrices se pueden utilizar para aplicar el metoda de purificacion propuesto y que se
basa en un cambio de pH.
En el caso del metodo 2 se pUdo apreciar que en el cromatograma de corrida aparecia
un nuevo pico cuando se aplicaba el buffer de lavado pero el pass era en este caso de
menor tamaiio que en los metodos 1 y 3 mientras el pico de elusion de la hormona era
muy semejante al obtenido en los dos metodos anteriores en cuanto a su
comportamiento en las pruebas de control aplicadas, 10 cual nos /leva a concluir que
con este metodo no se lograba quitar mas contaminantes sino dividirlos en dos
fracciones, aunque nos mostro algo muy importante y es que al aplicar un cambio de
fuerza i6nica a la columna acompaiiada de una variaci6n de pH, la hormona se
desprende mas rapidamente por 10 que es posible disminuirle el tiempo de aplicaci6n
del buffer de eluci6n y de esta forma disminuir el tiempo de corrida lograndose ademas
un mayor rendimiento, esto es muy importante pues si el metodo es para un escalado
industrial las cantidades de muestra que se van a aplicar son muy grandes y el metodo
no debe ser tan extraordinariamente largo pues hace muy engorroso el trabajo.
Por otro lade al analizar el comportamiento de los cromatogramas en todos los
metodos se vi6 que no era necesario un cambio tan brusco de pH pues con solo uno
ligero la hormona se desprendia de una y otra matriz de ahi que se decidiera cambiar
el pH del buffer de eluci6n de 8.5 a 6.5.