MICROBIOLOGIA GENERAL Guia de Trabajos Prácticos

Instituto de Investigaciones BiotecnológicasUniversidad Nacional de General San MartínMICROBIOLOGIA GENERALGuia de Trabajos PrácticosSegundo cuatrimestre de 2010Profesores a cargo:Jefe de Trabajos Prácticos:Ayudantes:Dra. Nora Iñón de IanninoDr. Rodrigo SieiraDra. Mara RosetDr. Andrés CiocchiniDra. Inés MarchesiniLic. Juan Manuel SperaLic. Florencia IanninoLic. Lucas BukataLic. Mariela Del GiudiceLic. Claudia HerrmannLic. Soledad GuidolínColaboradores: Bqca. Berta CazzuloLiliana SfercoAgustina Chidichino

OBJETIVOS GENERALES1) Manipulación general en el laboratorio de microbiología.2) Introducción al mundo microbiológico: nomenclatura, diferenciación, observación.3) Conocimiento fundamentado de los requerimientos de los microorganismos y de las consecuencias desu desarrollo en el medio.4) Introducción a la metodología científica: planteamiento de objetivos, desarrollo experimental,elaboración de conclusiones, búsqueda bibliográfica, escritura de informes.CONDICIONES DE REGULARIDAD DE LA MATERIA1) Aprobación de los dos parciales teórico/prácticos con nota mayor o igual a cinco. Se podrá recuperarsólo uno.2) Aprobación de los trabajos prácticos, lo cual estará dado por:a. 80% de asistenciab. 80% de parcialitos aprobados. Los parcialitos se tomarán al comienzo de cada trabajo práctico y seevaluarán con las siguientes notas: D (desaprobado), R (regular), B (bien) y MB (muy bien). Aclaración:la acumulación de dos notas R equivalen a un parcialito desabprobado.Importante: Se permitirá desabprobar sólo 2 parcialitos, siendo obligatoria la recuperación de uno de losdos.c. Aprobación de los informes que deberán realizar y entregar al finalizar cada trabajo práctico.d. Aprobación monografías.APROBACION DE LA MATERIA DEL ALUMNO REGULAR1) En forma promocional con nota mayor o igual a siete en los dos parciales teórico/practicos y notamayor o igual a siete en los trabajos prácticos (esta nota estará dada por la evaluación de los parcialitos,informes, monografías y nota de concepto general).2) Examen final con nota mayor o igual a cinco.NORMAS DE SEGURIDADUno de los aspectos básicos del trabajo en el laboratorio de microbiología es saber mantener normas deseguridad mínimas para evitar infecciones con los microorganismos con los que se trabaja.En el curso propiamente dicho algunos microorganismos utilizados pueden ser potencialmente patógenos,así mismo se realizarán aislamientos de fuentes naturales pudiendo aparecer algún posible patógeno porlo que se pide seguir las siguientes reglas:

1) No se puede comer, beber, fumar ni maquillarse en el laboratorio, ni llevarse a la boca ningúnelemento que haya sido utilizado en el laboratorio (biromes, marcadores, dedos, etc.)2) Es obligatorio asistir al laboratorio con guardapolvo, preferentemente de mangas largas y con puño.Las personas de pelo largo deben concurrir con el mismo atado y/o recogido.3) Si un cultivo es volcado, informar inmediatamente al docente con el que se procederá a limpiar la zonacon una solución bactericida.3) El material contaminado (tips, pipetas, tubos), se descartará en envases provistos a tal efecto.4) No volcar los cultivos en las piletas.5) Una vez finalizada la clase lavarse las manos escrupulosamente con agua y jabón y con algúndesinfectante (lo mismo durante la clase si accidentalmente se tocó algún cultivo).BibliografíaMicrobiology. Prescott-Harley-Klein. Ed. Mc Graw-Hill.Microbiología. Brock-Madigan. Ed. Prentice-HallLibro de microbiología disponible en internet: http://141.150.157.117:8080/prokPUB/index.htm

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADESTrabajos prácticos y seminariosHorario: miércoles y viernes de 14 a 17 hs.Comienzo de trabajos prácticos: 13/8/10Fecha de entrega de monografías: 17/11/10T.P. Nº tema fecha Comisión A Comisión B1Normas de seguridad.Metodología general detrabajo. Técnicas de cultivo.Esterilidadvie 13/8mie 18/8Vie 20/8-Placas-Diluciones seriadas-Plaqueo de sol. yμorg.------------------Introducción-Teórica TP 1------------------Placas-Diluciones seriadas-Plaqueo de sol. yμorg.mie 25/8Problemas TP 18Armado de columna deWinogradsky (TP 8)2Características macro ymicroscópicas de cultivosbacterianos. Tinciones.Microscopíavie 27/8Asignación de temasde monografíasTeórica TP 2mie 1/9vie 3/9-Preparación defrotis-Tinciones.-Observación conmicroscopio.-----------------------------------Preparación defrotis-Tinciones.-Observación conmicroscopio.mie 8/9Problemas TP 23Crecimiento bacteriano.Curva de crecimiento.Recuento de viablesTeórica TP 3vie 10/9-Curva decrecimiento conglucosa-----------------

.mie 15/9 ------------------Curva decrecimiento conglucosa y lactosavie 17/9Análisis de resultados y problemas del TP 34 Aislamiento de bacterias.Medios de enriquecimiento,selectivos y difierenciales.Diversidad metabólicamie22/9vie24/914:00 hs-Largar cultivos enmedios deenriquecimiento.15:30 hs -----------------14:00 hsTeórica del TP 4------------------Largar cultivos enmedios deenriquecimiento.-Pasar a medioselectivo. -----------------15:30 hs ------------------Pasar a medioselectivo.mie 29/9 Análisis de resultados y problemas del TP 4mie 6/10Consultas pre-parcialvie 8/10PARCIAL TEORICO/PRACTICO5 Metabolismo bacteriano.Pruebas bioquímicas ydeterminación de géneros.Resistencia a antibióticos.mie 13/10 Teórica TP 5.vie 15/10-IMViC y Kligler-Catalasa/Oxidasa-Antibióticos-Motilidadmie 20/10 -----------------------------------IMViC y Kligler-Catalasa/Oxidasa-Antibióticos-Motilidadvie 22/10 Análisis de resultados y problemas del TP 56 Protozoos. Metodologíageneralo de trabajo. Cultivo.Microscopía.mie 27/10Feriadovie 29/10 TP 6

7 Genética bacteriana.Transformación. Mutación.Transposición ycomplementación funcional.mie 3/11-Conj. Agro pgm-Conj. Agro wt-----------------vie 5/11 ----------------- -Conj. Agro pgm-Conj. Agro wtmie 10/11-Estría pgm-Dilución y plaqueo wt.-----------------vie 12/11 ----------------- -Estría pgm-Dilución y plaqueo wt.Discusión de resultados y problemas del TP 78 Diversidad microbianaInteracciones entremicroorganismos quecoexisten en un mismo hábitatPRESENTACIÓN DEMONOGRAFÍASmie 17/11vie 19/11mie 24/11Columna de Winogradsky (TP 8)Observación de resultados.COMISIÓN ACOMISIÓN Bvie 26/11SEGUNDO PARCIALTEORICO/PRACTICO

TP Nº 1 METODOLOGÍA GENERAL DE TRABAJOObjetivo 1: Aprendizaje de la técnicas básicas que se utilizan para el cultivo de microorganismos.a) Preparación de medios de cultivo. Uso de balanzas, mediciónde pH.b) Técnicas de esterilización.c) Trabajo en condiciones de asepsia. Preparación de placas dePetri, tubos con medio de cultivosólido y líquido.d) Técnicas de siembra en cultivo líquido y en cultivo sólido:estriamiento, punción, rastrillado,volcado.Objetivo 2: Detección de contaminantes, presencia de microorganismos en el medio ambiente.a) Observación de la presencia de microorganismos en nuestroambiente.b) Control de trabajo en condiciones de asepsiac) Control de asepsia.Desarrollo:1) Para realizar trabajos en condiciones de asepsia se deberá limpiar el area de trabajo (mesada) con lasustancia desinfectante provista por el docente, acto seguido se deberá encender el mechero bunsen.2) Se prepararán placas de Petri con agar nutritivo fundido y mantenido a 45-50ºC. Volcar el medio encondiciones de asepsia (20-30 ml/placa) y esperar a que solidifique. Luego secar las placas invertidas enestufa a 42ºC.3) Se prepararán tubos de ensayo con agar nutritivo fundido por volcación (10 ml/tubo). Se taparán con latorunda de algodón, se dejaran enfriar y se secarán en estufa a 42ºC.4) Se harán diluciones seriadas de agua previamente autoclavada: 1/10, 1/100, 1/1000, y se sembrarán0,1ml de cada dilución en distintas placas de Petri por la técnica del rastrillado.5) Con un hisopo se tomarán muestras de distintos lugares: mesada, mano, etc. y se aplicará sobre unaplaca de medio nutritivo sólido.f) Se comparará el crecimiento que resulta de apoyar en un medio de cultivo sólido la yema del dedoantes y después de un lavado con etanol 70%.Las placas y tubos sembrados se cultivarán 24-48 h a 37ºC. Se deberán observar las coloniasdesarrolladas teniendo en cuenta las siguientes características macroscópicas:

FORMA TAMAÑO COLOR BORDE ELEVACION SUPERFICIE

CUESTIONARIO T.P. 11) Defina los siguientes términos: Desinfección, Desinfectante, Antisepsia, Germicida, Bactericida,Bacteriostático, Bacteriolítico.2) Discuta la siguiente afirmación:La muerte de una población bacteriana, del mismo modo que el crecimiento de la misma, es por logeneral exponencial o logarítmica, es decir, la población se reduce en una fracción constante a unintervalo de tiempo constante. Este proceso se representa en el siguiente gráfico:Min. de tratamientoPor lo tanto, dado que la destrucción de la población es logarítmica, es teóricamente imposible eliminar atodos los microoganismos de una población por más que se incremente la extensión de tiempo usada en eltratamiento.3) Describa cómo funciona un autoclave. Qué condiciones se deben cumplir para esterilizar por calorhúmedo? Cuales son las tres cosas que uno debe hacer al operar un autoclave para que el proceso seaseguro?4) Qué métodos usaría para esterilizar: pipetas de vidrio y placas de petri, agar nutritivo, soluciones deantibióticos, paquetes de placas de petri plásticas, solución de glucosa 2M, solución de glucosa 0,2M,interior de una cabina de flujo laminar, aceite mineral, material quirúrgico.5) ¿ Qué características de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para la elección de un métodode esterilización ?.6) ¿ Por qué se requiere mayor tiempo de esterilización en horno que en autoclave ?. ¿ Cuál es el agenteesterilizante en cada caso ?.7) ¿ Cómo decontaminaría un erlenmeyer de vidrio donde fue crecido un cultivo de Bacillus subtilis y unoutilizado para crecer Escherichia coli ?.7) Un tubo conteniendo medio M9 + 0,5 % de glucosa fue autoclavado y posteriormente incubado a 37°C durante 72 horas. Al cabo de dicho tiempo se detectó crecimiento de microorganismos.a) ¿Qué parámetros debería controlar para que el proceso de esterilización se lleve a cabo de maneraadecuada?.b) Una vez solucionado el inconveniente, ¿Cómo determinaría si dicho caldo nutritivo está efectivamenteestéril?.8) ¿ Cómo realizaría un control de esterilización y un control de esterilidad ?.

TP Nº 2CARACTERÍSTICAS MACRO Y MICROSCÓPICAS DELDESARROLLO BACTERIANO.Objetivo: entrenamiento en la preparación de extendidos y en distintas técnicas de coloración.Observación de distintas morfologias y agrupamientos bacterianos.1. Coloración de Gram.Gram halló una técnica basada principalmente en la coloración de las células con cristal violeta. Medianteesta técnica, aquellas células capaces de mantener el colorante violeta luego de un proceso dedecoloración son consideradas Gram+ y las que no lo retienen y por lo tanto pueden ser coloreadas porun segundo colorante de contraste, son Gram-. Dado que se trata de células su visualización es pormicroscopía.Desarrollo:A) FIJACIONSe tomará una ansada de cada colonia a analizar crecida en agar nutritivo y se la resuspenderá en una gotade agua colocada sobre un portaobjeto limpio, desengrasado y previamente rotulado. Se dejarán secar alaire estos materiales junto a la llama del mechero y posteriormente se los fijará por calor, pasando elpreparado por encima de la llama SIN QUEMARLOS.B) TINCION:1-Cubrir el portaobjeto con la solución de Cristal Violeta y dejar en contacto 1 minuto.2-Volcar el colorante y lavar con agua corriente.3-Cubrir con la solución de Lugol (1 minuto).4-Lavar con agua corriente.5-Decolorar por arrastre con la solución decolorante(alcohol/acetona). (5 segundos).6- Lavar con agua para parar la acción del decolorante.7-Contrastar con la solución de Safranina por 1 minuto.8-Lavar suavemente con agua corriente y dejar escurrir el porta en posición vertical.9-Una vez seco el material teñido, se lo examinará usando aceite de inmersión bajo el microscopio ópticocon el aumento de 100x.Se deberán reconocer las características morfológicas y tintoriales de las distintas bacterias provistas. Sedeberá informar el agrupamiento, forma, coloración según la siguiente guia:FORMA: cocos (esféricas), bacilos (bastones, cilindros), cocobacilos (bastones cortos, ovoidales), vibrios(bacilo en forma de coma), espirilos (bacilos en forma de tirabuzón).AGRUPAMIENTO: aislado (individual), diplos, tetradas, cadenas, racimos, empalizadas

2. Coloración de esporas. Técnica Schaeffer-Fulton.Esta técnica permite distinguir las esporas del cuerpo vegetativo del microorganismo y determinar sulocalización y forma.Desarrollo:1) Preparar el extendido del microorganismo y fijar por calor.2) Cubrir todo el porta con solución de verde de Malaquita al 5% en agua.3) Calentar a la llama hasta que emita vapores y seguir el calentamiento durante 3 minutos SINPERMITIR QUE SE SEQUE EL COLORANTE. Si esto ocurriera agregar mas sobre el preexistente y nosobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.4) Lavar con agua y cubrir con solución de SAFRANINA, dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua ,secar y observar al objetivo de inmersión6) INFORMAR: morfologia, color y tipo de espora.CUESTIONARIO T.P. 21) Describa en detalle la composición y estructura del peptidoglicano, pared Gram (+) y pared Gram (-).2) En la coloración de Gram, cuál es el colorante de Gram y cuál el de contraste? Qué es el mordiente?3) Usted debe realizar coloración de gram para una serie de especímenes. Comienza a realizar lacoloración y en el último paso se da cuenta de que le falta la solución de safranina. Decide de todosmodos no perder mas tiempo y observa los preparados al microscopio. Puede dar con certeza un informedistinguiendo cuáles especímenes son Gram (-) y cuáles Gram (+)?4) Qué clase de imágenes proveen y con qué propósitos suelen ser usados los microscópios de campoclaro, de campo oscuro, de contraste de fase, de epifluorescencia, electrónicos de transmisión yelectrónicos de barrido?5) Por qué en la tinción de endosporas por el método de Schaeffer-Fulton el colorante verde de malaquitano se pierde en el paso de lavado?6) ¿ Podría utilizar un colorante básico como primer colorante en la tinción de esporas ?.7) ¿ Por qué no se tiñen las células alcohol -ácido resistentes por la coloración de Gram?.8) ¿ Qué características debe tener un colorante para ser empleado en una tinción negativa?.9) Las tinciones de Gram, esporas y Ziehl Neelsen permiten determinar diferencias estructurales encélulas de distintos géneros. ¿Cuáles son esas diferencias y cuál es el paso de cada coloración que laspone en evidencia ?. ¿ Qué tipos de colorantes se utilizan en cada caso ?.10) Bacillus subtilis presenta color violeta al microscopio óptico luego de una tinción de Gram y colorrosado al efectuarse una coloración de esporas. ¿ Por qué motivo el cristal violeta en el primer caso y lasafranina en el segundo tiñen la bacteria de esa manera ?.10) Indique cual o cuales de las tinciones realizadas en los trabajos prácticos ponen en evidenciadiferencias estructurales de la pared bacteriana. Explique brevemente.

TP Nº 3CURVA DE CRECIMIENTO Y RECUENTO DE VIABLESCrecimiento BacterianoComo todos los seres vivos las bacterias crecen, se multiplican y mueren, pero además tienen la ventajade conservar su viabilidad por largos períodos de tiempo, y luego reiniciar su ciclo celular cuando lascondiciones del medio se revierten favorablemente.Independientemente del lugar donde se encuentre, una sola célula bacteriana dará lugar a una población através de un crecimiento rápido; sin embargo, este proceso está autolimitado dado que una de lasconsecuencias es la alteración misma del entorno. Del análisis de los resultados experimentales obtenidosa partir de cultivos líquidos bacterianos, se pudo obtener la gráfica del ciclo de vida. Este constabásicamente de cuatro etapas o fases a saber: latencia o fase lag, crecimiento logarítmico (tambiénllamado exponencial), fase estacionaria y de muerte.Se pretende que los alumnos puedan identificar y analizar el crecimiento bacteriano utilizando variastécnicas de uso frecuente en el laboratorio microbiológico.Objetivos:1) Analizar el crecimiento bacteriano teniendo en cuenta la densidad óptica y el recuento de colonias delcultivo a distintos tiempos de incubación.2) Graficar los datos experimentales a fin de obtener la curva de crecimiento para cada cultivo.Desarrollo:Se trabajará a partir de cultivos de Escherichia coli desarrollados a 37ºC en medio TB con agitación .1) Separar en forma aséptica cada 30 minutos una alicuota de 2 ml del cultivo en estudio. (Luego detomar la muestra retornar inmediatamente el erlenmeyer a las condiciones de incubación).2) Leer la turbidez que presentan las muestras (o sus diluciones) a una longitud de onda de 600 nmutilizando un espectrofotómetro. Calcular la DO/ml de cultivo.3) Hacer diluciones seriadas y sembrar de cada una 0,1 ml en una placa de Petri con medio LB. Incubar a37ºC una noche y luego hacer un recuento de colonias y calcular el número de unidades formadoras decolonia (UFC)/ml de cultivo. Elegir la placa en donde el número de colonias este entre 50 y 200.La curva de crecimiento bacteriano para cada cultivo se hará sobre papel semilogarítmico. Se graficaránlas UFC/ml en función del tiempo y los datos de absorbancias para cada tiempo.

CUESTIONARIO T.P. 31) Calcule la tasa de crecimiento medio (k) y el tiempo de generación medio (g) de un cultivo que seincrementa desde 5 x 10 2 hasta 1 x 10 9 células en 10 hs.2) Si el tiempo de generación media para un cultivo es de 180 min. y se inicia el cultivo con 3 x 10 3células, cuantas bacterias habrá despues de 24 hs de cultivo en fase exponencial? Cuántas generacioneshabrán transcurrido?3) Discuta la siguiente afirmación: ”en una colonia todas las células crecen a la misma velocidad”.4) Usted necesita obtener un cultivo con 5 x 10 9 células totales. Como conoce la tasa de crecimientomedio y el tiempo de generación, realiza sus cálculos y se da cuenta de que requiere 12 horas de cultivopara llegar a dicha masa partiendo de un stock con 10 3 células/ml. Descongela el stock con la semillaestandarizada e inocula el cultivo, se va a su casa a descansar y a las 12 horas regresa al laboratorio.Retira el cultivo de la incubadora y estima el número de células en 2 x 10 7 . Qué es lo que ha ocurrido?5) Se dispone de 6 ml de un cultivo bacteriano con 8,4 x 10 8 UFC/ml. ¿Qué diluciones debería realizarpara contar aproximadamente 40 colonias por placa, si se siembra 0,1 ml de dicha dilución ?6) Partiendo de un cultivo bacteriano que tiene 4 x 10 8 UFC/ml : ¿Cómo procedería para obtener 80colonias en una placa de agar nutritivo ? Indique los volúmenes a utilizar.7) ¿Qué dilución debería realizar para obtener 2 ml de una suspensión de bacterias que contenga 2 x 10 5UFC totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 10 9 UFC/ml ?.8) Un cultivo bacteriano de 10 ml tiene un recuento de 250 UFC cuando se plaquea 0,1 ml de la dilución10-4. Si 2 ml de ese cultivo se inoculan en 100 ml de medio fresco para realizar una curva de crecimiento:¿Cuál es la concentración bacteriana inicial ? ¿Qué diluciones realizaría del mismo para contar 100colonias si sembrara 0,1 ml ?9) Un fabricante de yogurt afirma que sus productos contienen 4 x 10 6 bacterias lácticas viables /ml. ¿Quémétodo de recuento utilizaría para corroborar ese número? Describa el protocolo, condiciones ymateriales que utilizaría para realizar dicha determinación.10) Enumere las ventajas y desventajas de los siguientes métodos de recuento de bacterias: i) turbidez, ii)recuento en placa, iii) conteo directo al microscopio.11). Para un cultivo exponencial de Escherichia coli se realiza una curva de calibración de recuento enplaca vs. turbidez (D.O. leída a 600 nm). A partir de la misma se establece una relación UFC./ml porunidad de D.O. de 4 x 10 7 .a) ¿Qué ventajas tiene realizar una curva de calibración de recuento vs. turbidez?b) ¿Qué diluciones debería realizar para contar 100 colonias en una placa de agar nutritivo sembrada con0,1 ml de un nuevo cultivo de E. coli con una D.O. de 0.5.12) Un investigador dispone de una curva de calibración de DO vs UFC/ml para E. coli en caldo nutritivo¿Podría utilizar la misma curva para uncultivo de: Bacillus megaterium y otro de Micrococcus luteus?Justifique su respuesta.13) ¿A qué se llama crecimiento diauxico? Dibuje una curva de crecimiento diauxica indicando lasdistintas fases de crecimiento.14) a)Explique la causa del crecimiento diauxico de E. coli en un medio de crecimiento que contienecomo fuente de carbono glucosa y lactosa en una relación 1:3 respectivamente.

) Correlacione temporalmente el crecimiento de la población bacteriana anterior con los eventos queocurren a nivel molecular en la regulación del operón lac.15) ¿ Cómo interpreta las siguientes curvas de crecimiento de E. coli en un medio de cultivo que contienecomo fuente de carbono glucosa y sorbitol ?

TP Nº 4AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOSDIVERSIDAD METABÓLICAMedios de enriquecimiento, selectivos y diferenciales:Para aislar un microorganismo de la naturaleza se debe conocer previamente los requerimientosnutricionales del mismo y las condiciones ambientales propicias para su desarrollo.Los alumnos deberan buscar en la bibliografia las características metabólicas y el hábitat de losmicroorganismos que se van a aislar.En base a los estudios realizados sobre el metabolismo y los requerimientos nutricionales de las bacterias,se han desarrollado medios de cultivo para facilitar el trabajo en el laboratorio cuando se parte demateriales que supuestamente tendrían más de una especie bacteriana. Así tenemos medios que permiten:a) favorecer el crecimiento de un microorganismo sobre otros, es decir "enriquecerlo" con respecto a unaespecie; b) "seleccionar" el crecimiento de determinadas bacterias, inhibiendo el de otras; y c) poder"diferenciar" colorimétricamente las distintas especies bacterianas .Metodologia general de trabajo:1) Inocular la muestra (agua, tierra, alimentos) en un caldo de enriquecimiento que puede ser selectivo ono, para favorecer el crecimiento del organismo de interes2) Incubar a temperatura y tiempo adecuados3) Tomar una muestra del caldo ya crecido y estriar en medio solido selectivo con el objeto de inhibir laflora acompañante del microorganismo que se desea aislar. Este medio puede a su vez ser diferencial(diferencia a una determinada cepa o especie en base a alguna caracteristica de la colonia).4) Incubar a temperatura y tiempo adecuados.5) Observar el crecimiento de las colonias y hacer repique a agar nutritivo para realizar coloracion deGram. Posteriormente se identificaran los microorganismos en base a pruebas bioquimicas.Microorganismos a usar: Echerichia coli, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylococcusaureus,Streptococcus spp. Lactobacillus spp., Pseudomonas aeruginosa, Azotobacter spp.Aislamiento de E. coli1-Tomar 10 ml de muestra de agua y sembrar caldo Mc Conkey 2X2-Incubar 48 hs a 37ºC.3-Observar crecimiento (formacion de gas en campana de Durham y viraje del indicador a amarilloindica probable presencia de E. coli).4-Tomar muestra con el ansa y estriar en agar Mac Conkey y agar EMB 5-Observar colonias conbrillo verde metalico en EMB y rojas en Mac Conkey .

Aislamiento de Staphylococcus aureus1-Agregrar 10 g de ricota a un erlenmeyer con agua peptonada estéril. (1/1000 peptona de caseina enagua destilada)2-Agitar e incubar 2 h a temperatura ambiente.3-Mezclar caldo cerebro-corazon con 13% de NaCl con el agua peptonada con ricota en partesiguales.4-Incubar 48h a 37ºC.5-Si hay crecimiento, tomar una muestra con ansa y estriar enagar manitol salado y agar azida.6-Incubar 48 h a 37ºC.5-Observar crecimiento.Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa1-Sembrar 0,5 ml-1ml de agua en caldo M9 (2X)2-Incubar 48 h a 42 grados.3-Si hay crecimiento (turbidez) tomar muestra con el ansa y estriar sobre agar cetrimida.4-Incubar 48 h a 37 grados.5-Observar crecimiento de colonias con pigmento verde.Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis1-Agregar 10 g de arroz a 50ml de PBS esteril2- Agitar durante 10 min.3- Calentar a 80 C durante 5 min.4- Tomar 1ml de sobrenadante y pasarlo a caldo nutritivo.5-Incubar 48 h a 37ºC.6-Estriar en agar Mossel con emulsión de yema de huevo (selectivo y diferencial).7-Incubar 48 h a 37 ºC.8-Observar el crecimiento de colonias con halo rosa-púrpura con precipitado blanco espeso (cereusmanitol-,lecitinasa +) y colonias con halo amarillo (subtilis, manitol +,lecitinasa -).Aislamiento de Lactobacillus spp.1-Realizar diluciones seriadas de yogurt en Sn fisiologica estéril y sembrar 0,1ml de cada una en agarMRS.2-Incubar 48h a 37ºC en microaerobiosis3-Calcular el recuento de bacterias viables lácticas y observar los distintos fenotipos de coloniascrecidos en agar MRS 2.4-Seleccionar 2 fenotipos distintos y estriarlos en agar Rogosa.5-Incubar en condiciones de microaerobiosis a 37ºC.Aislamiento de Azotobacter y otras fijadoras de nitrogeno atmosferico.1-Agregar 10 g de tierra a 10 ml de agua esteril2-Agitar y dejar decantar3-Inocular 2 ml a caldo Fred y Waksman4-Incubar 48 h a 28ºC con agitacion5-Si hay crecimiento tomar una muestra con ansa y estriar agar Fred y Waksman

Medios a utilizar:CALDO NUTRITIVOExtracto de Carne 3,0 gPeptona de Carne 5,0 gAgua destilada c.s.p. 1 lpH= 7,0±0,2Para el AGAR NUTRITIVOagregar 15 g de AgarCALDO MAC CONKEYPeptona de Caseína 20,0 gLactosa10,0 gBilis de Buey desecada 5,0 gPúrpura de Bromocresol 0,01 gAgua destilada c.s.p. 1lpH= 7,4±0,2AGAR-AZIDA:Brain Heart InfusionAzida sodicaAgarAgua c.s.p.37 g0,3 g15 g1 lAGAR MAC CONKEYPeptona de Caseína 17,0 gPeptona de Carne 3,0 gCloruro de Sodio 5,0 gLactosa10,0 gSales biliares1,5 gRojo neutro0,03 gCristal violeta 0,001 gAgar13,5 gAgua c.s.p.1 lpH= 7,1±0,1CALDO CEREBRO-CORAZONInfusión de cerebro12,5 gInfusión de corazón5,0 gProteosa Peptona10,0 gD(+) Glucosa2,0 gNaCl5,0 gDi- Sodio hidrogenofosfato 2,5 gAgua c.s.p. 1 lCALDO TIOGLICOLATOPeptona de CaseínaExtracto de LevaduraL(+) CisteinaD(+) GlucosaNaClTioglicolato de SodioResarzurina sódicaAgua c.s.p.15,0 g5,0 g0,5 g5,5 g2,5 g0,5 g0,001 g1 lCALDO M9 2XNH 4 Cl1,0 gNa 2 HPO 46,0 gK 2 HPO 43,0 gNaCl0,5 gGlicerol o Asparragina 5,0 gAgua c.s.p.1lSulfato de Magnesio 1M 1mlCloruro de Calcio 0,01 M 10ml(AUTOCLAVAR APARTE)CALDO MRS (de Mann, Rogosa y Sharpe)Peptona Universal10,0 gExtracto de Carne5,0 gExtracto de Levadura5,0 gD(+) Glucosa20,0 gDi-potasio hidrogenofosfato2,0 gTween 801,0 gDi amonio hidrogenocitrato2,0 gAcetato de sodio5,0 gSulfato de Magnesio0,1 gSulfato de Manganeso0,05 gAgua c.s.p.1 lAGAR CETRIMIDA:Peptona de GelatinaMgCl 2CetrimidaglicerinaSO4K2AgarAgua c.s.p.20 g1,4 g0,3 g10 ml10 g13,6 g1 lCALDO LB (Luria, Bertani)Triptona10,0 gExtracto de Levadura5,0 gNaCl10,0 gAgua c.s.p.1 lPara el AGAR LB agregar 12 g de AGAR.

MEDIO MINIMO CON AMILOSAK2HPO43gNaH2PO4. H 2 O 1,14gNH4Cl1gMgSO4. 7 H2O0,3 gKCl0,15 gCaCl2 0,01gCl3FetrazasAmilosa2gAgua c.s.p.1 l

CUESTIONARIO T.P. 41) Defina los siguientes conceptos: medio definido, medio complejo, medio diferencial, medio deenriquecimiento, medio selectivo, cultivo puro.2) A cuál de estas categorias corresponden los medios descriptos en la guía de T. P.: medio definido,medio complejo, medio diferencial, medio de enriquecimiento, medio selectivo.3) Qué función cumple la emulsión de yema de huevo en el agar Mossel, las sales biliares en el agar MacConkey, la azida sódica en el agar Azida y el cetiltrimetilammonium bromide en el agar Cetrimida?4) Describa los pasos y la composición de los medios que utilizaría para aislar un microorganismo capazde utilizar benceno como fuente de carbono y energía. Donde recogería las muestras?5) Dados los siguientes elementos nutricionales: glucosa, peptonas, extracto de carne, bases nitrogenadas,NH 4 Cl, Na 2 HPO 4 , KCl, MgCl 2 , NaCl, FeCl 3 , CuCl 2 , CoCl 2a) ¿Cuales elegiría para formular un medio de enriquecimiento y un medio mínimo?.b) En el caso del medio de enriquecimiento, indique la función de cada elemento elegido. ¿Qué otro tipode compuestos agregaría para obtener un medio de enriquecimiento selectivo para gram negativos?6) Diseñe un protocolo para aislar cuatro microorganismos, presentes en una muestra de agua, que reunenlas siguientes características:Microorganismo A: Aerobio estricto, forma esporas, bacilo Gram positivo, glucosa positivo,licuefacción de la gelatina positivo.Microorganismo B: Anaerobio facultativo, cocobacilo Gram negativo, glucosa positivo.Microorganismo C: Anaerobio facultativo, cocobacilo Gram negativo, glucosa positivo, lactosapositivo.Microorganismo D: Aerobio estricto, bacilo Gram negativo, glucosa positivo.7) Contando unicamente con el equipo de laboratorio (microscopio, autoclave, mechero, ansa, material devidrio) y las siguientes drogas: agar, manitol, asparragina, peptona, sales biliares, cloruro de sodio, aguadestilada y colorantes para efectuar tinciones diferenciales, esquematice la marcha analítica para obtenercultivos puros a partir de una mezcla de microorganismos que incluye Staphylococcus aureus, Bacilluscereus, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.8) ¿ Qué tipos de medios son el agar manitol salado y el agar Mossel?. ¿ Para qué sirven cada uno de susconstituyentes?. ¿ Podría reemplazar el manitol por otro azucar y el rojo fenol por rojo neutro?.9) Diseñe un medio que le permita diferenciar microorganismos Gram negativos que degradan la maltosacon producción de ácido de los que no lo hacen.10) Discuta las siguientes afirmaciones:a- Para determinar la carga bacteriana de una muestra debe realizarse un enriquecimiento previo.b- Un enriquecimiento selectivo se realiza en medio líquido pues hay libre competencia por losnutrientes.

c- El paso de aislamiento selectivo y/o diferencial puede hacerse en medio líquido.d-La premisa fundamental en un protocolo de aislamiento es conseguir un cultivo puro.11) La composición del caldo nutritivo es: extracto de carne, peptona y cloruro de sodio en agua a pH 7.La composición del caldo Mc Conkey es: peptona, lactosa, sales biliares, púrpura de bromocresol ycloruro de sodio en agua a pH 7. ¿ Cuál es la función de cada uno de los componentes en cada medio?.12) ¿ Cuál de los siguientes medios utilizaría para enriquecer selectivamente en un microorganismorespirador anaeróbico, metabolismo no fermentativo, Gram negativo ?. Medio A: medio basal mínimo,glucosa, NH4Cl, tioglicolato de sodio.Medio B: medio basal mínimo, glucosa, NO3Na, tioglicolato de sodio.13) Los principales componentes del agar Rogosa utilizado en el aislamiento de Lactobacillus son:glucosa, extracto de levadura, extracto de carne, peptonas, acetato de sodio, tween 80 (pH 5,5). Expliquecuál es la función de cada uno de ellos y por qué la incubación se realizó en anaerobiosis.14) Discuta los siguientes enunciados y justifique:a) Cualquiera de los siguientes medios podría ser utilizado para diferenciar aquellos microorganismoscapaces de fermentar la lactosa:Medio 1 Medio 2 Medio 3 Medio 4Peptona carne Peptona carne NH4Cl NH4ClLactosa Extracto carne Lactosa LactosaRojo fenol Lactosa Rojo fenol GlucosaAgua Rojo fenol Agua Rojo fenolAgar Agua Agar AguaAgarb) Especies del género Bacillus pueden ser aisladas en placas de agar Mc Conkey.c) Bacillus cereus y Staphylococcus aureus pueden ser diferenciados en una placa de agar Mossel al cualno se le adicionó yema de huevo ni polimixina B15) En el estudio de la esporulación de Bacillus cereus, cuya espora es oval y central, se observaron almicroscopio bacilos con esporas terminales características de Bacillus subtilis. Diseñe un medio decultivo que le permita diferenciar ambos microorganismos.

TP Nº 5PRUEBAS BIOQUÍMICASLa utilización de medios selectivos y diferenciales, las tinciones de Gram, características de las colonias ymotilidad en el estudio de una determinada bacteria nos brinda una gran información sobre el génerobacteriano con el que se está trabajando.Una vez aislada una bacteria determinada, se le pueden realizar una serie de pruebas que evalúan suactividad bioquímica. Esto permite hacer una identificación final de la especie en cuestión, es decir seestudian ciertos sistemas enzimáticos que son únicos de cada especie y que sirven como marcadodres deidentificación.En el laboratorio, esos sistemas enzimáticos se detectan inoculando la colonia bacteriana bien aislada yfresca (24-48 hs de crecimiento) en una serie de medios de cultivo que contienen sustratos específicos eindicadores químicos para detectar cambios de pH o presencia de subprocuctos específicos.Objetivos: a) Identificar distintas especies pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. b)Diferenciar distintas especies de Pseudomonas. c) La diferenciación entre Estafilococos y Estreptococos.Desarrollo:Se someterán cultivos (de 24-48 hs), de las distintas colonias aisladas a distintas pruebas bioquímicas1) Prueba de la OxidasaEsta prueba sirve para detreminar la presencia de la enzima citocromo oxidasa en preparaciones demicroorganismos. Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus,Staphylococcus y Micrococcus (-) de Pseudomonas y Aeromonas (+).Se debe partir de cultivos puros de bacterias crecidos en agar nutritivo 18-24 hMetodología:A) Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro.B) Aplicar la colonia sobre el disco embebido en el reactivo de Kovacs para Oxidasa(naftol+dimetilparafenilendiamina) extendiendo bien el material..C)-Esperar 5-10 seg y observar la coloraciónPrueba Positiva: la tira vira a color azul por oxidación del compuesto a azul de indofenolPrueba Negativa: no hay modificación2) Prueba de la CatalasaEsta prueba es para detectar presencia de la enzima catalasa enpreparaciones de microorganismos.Diferencia Streptococcus (-),Clostridium (-), de Staphylococcus (+), Bacillus (+) y Micrococcus(+).Metodología:A) Colocar una gota de agua en un portaobjeto limpio.B) Colocar una ansada de la colonia a probar sobre la gota y mezclar (no dejar secar).C) Agregar 2 gotas de Agua oxigenada.

Resultado positivo: formación de burbujas debido a laproducción de O 2 a partir del H 2 O 2 por acción dela enzima.3) Prueba del agar hierro-dos azucares de KliglerPermite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono especificoincorporado a un medio de crecimiento básico asi como la produccion de gas y acido sulfhidrico.Se suele utilizar para la identificacion de distintas especies de la familia Enterobacteriaceae.Metodología:1- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por puncion y por estría en el mismo tubo deagar hierro de Kligler.2- Incubar a 37ºC durante 18-24 h3- Observar entre las 18 h y las 24 h de cultivo (ni antes ni despues)Resultados:El uso de un hidrato de carbono implica la liberacion al medio de productos acidos capaces de serdetectados por un indicador de pH. Si el microorganismo en cuestion es incapaz de usar el H de C,consume entonces las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el mismo. Al interpretarlosd datos de la prueba debe tenerse en cuenta los siguientes aspectos:A)Utilizacion del hidrato de carbono:*Si el microorganismo en estudio solo fermenta glucosai) en superficie:reaccion alcalina, color rojoii) en profundidad: reaccion acida, color amarillo*Si el microorganismo es capaz de fermentar tanto glucosa como lactosa:i) en superficie: reaccion acida, color amarilloii) en profuindidad: reaccion acida, color amarillo*Si el microorganismo no es capaz de fermentar glucosa ni lactosa (no enterico)i) en superficie: reaccion alcalina, color rojoii) en profundidad: si es aerobio entonces no hay crecimiento ni cambio de color; si esfacultativo entonces hay reaccion alcalina y color rojo* Si el microorganismo no es capaz de fermentar lactosa pero si de oxidarlai) en superficie: reaccion acida en tiempos cortos (color amarillo) luego reaccionalcalina y color rojo.ii) en profundidad: no hay crecimiento ni cambio de color.B) Produccion de gas• Si el microorganismo en estudio es aerogenico, la produccion de H 2 y CO 2se manifiestan por la formacion de burbujas y/o el desprendimiento de delagar del fondo del tubo, dejando un area clara• Si el microorganismo en anaerogenico, entonces no hay liberacion de gases2• Si el microorganismo produce este acido, el mismo reaccionara con el hierroformando un precipitado de SFe insoluble (color negro)• Si no produce el acido no habra reaccion

4) Pruebas del IMViC (INDOL-ROJO METILO-Voges Proskauer-Citrato)Estas cuatro pruebas son muy utiles para distinguir bacterias coliformes entre si.Producción de INDOLMide la capacidad del microorganismo de producir indil a partir de triptofano por acción de laenzima triptofanasa.Metodología:1) Inocular tubos con agua de triptona con una ansada de cultivo puro crecido 18-24 h enagar nutritivo. Dejar un tubo sin inocular como testigo.2) Incubar a 37 por 48 h.3) Colocar sobre el tubo unas gotas de reactivo del indol de Kovacs (alcohol amílico,paradibenzaldehido acido). Dejar reposar hasta aparición de anillo rojo en superficie.prueba positiva: formación de anillo rojo en fase alcoholica (compuesto quinónico derivado delindol)prueba negativa: anillo amarillo en superficie.VOGES PROSKAUER y Rojo de MetiloEstas dos pruebas permiten detectar el tipo de fermentación (butilenglicólica o acido mixta) querealiza el microorganismo. La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad dealgunos organismos de producir acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir de la frementaciónbutilenglicólica de la glucosa. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter (+). Escherichia coli yotras especies de Klebsiella (-). La prueba del Rojo Metilo sirve para comprobar la capacidad deun organismo de producir y mantener estables los productos terminales acidos d elafermentación (ácido mixta) de la glucosa. Escherichia coli (+) y Klebsiella, Enterobacter (-).Metodología:1- Inocular tubos conteniendo caldo MR-VP con una ansada de cultivo frescocrecido en agar nutritivo.2- Incubar a 37 por 48 h3- Dividir el contenido del tubo en dos partes iguales4- Para determinar presencia de acetoína (Voges) agregar a 1 ml de cultivo 0.6 mlde Reactivo de Barrit y 0,2 ml de KOH al 40%.5- Agitar suavemente y dejar reposar 5-10 min.Prueba positiva: color rosado-rojo en la superficie que se intensificará al cabo de unas horas(presencia de acetoína).Prueba negativa: sin cambio de color (amarillo) en la superficie.6-Para detreminar Rojo Metilo, agregar al segundo tubo unas 5 gotas de indicador rojo de metiloal 0,1%.Prueba positiva: si el cultivo continua siendo de color rojo, entonces el pH esta por debajo de4,4. Hay fermentación ácido-mixta.Prueba negativa: color amarillo en la superficie, pH=6.

Aprovechamiento de Citrato (Medio Citrato de Simmons)Esta prueba permite determinar la capacidad del microorganismo para utilizar citrato como únicafuente de carbono.Salmonella, Arizona, Citrobacter,Klebsiella y Enterobacter (+)E. coli, Shigella, Edwarsiella, Yersinia, Actinobacillus (-)Metodología:1-Inocular placas con agar citrato de Simmons con una ansada de cultivo fresco crcido enagar nutritivo.2-Incubar a 37ºC por 48 h3-Observar si hay desarrollo de colonias.5) Prueba de motilidad.Este ensayo permite detectar la presencia de flagelo en el microorganismo que se estudia.Cada tipo de microorganismo aislado se le hará la prueba de motilidad, sembrándolas POR PUNCION enun medio sólido blando con agar al 0.4% a fin de detectar las bacterias con motilidad positiva y negativa.Se utilizaran cepas controles.6) Sensibilidad a antibióticosLos antibióticos son sustancias químicas producidas por ciertos microorganismos que son activas contraotros microorganismos. Distintos antibióticos tienen distinta forma de acción sobre distintos componentesde los microorganismos (pared celular, síntesis de proteínas, síntesis de ARN, etc). A su vez, losmicroorganismos crean mecanismos de resistencia a los antibióticos que también pueden ser de diversotipo (alteración de la permeabilidad al mismo, alteracíon del blanco, desarrollo de vías alternativas,inactivación del antibiótico)Objetivo: Se determinará sensibilidad a antibióticos de los distintos microorganismos aislados en lasclases anteriores. Se utilizará el sistema de monodiscos.Metodología:Se mezclan 0,1 ml de cultivo bacteriano de 24 hs en caldo nutritivo, con 3 ml de agar blandonutritivo(0,7% de agar) mantenido a 40ºC. Se vuelca la mezcla en placas, previamente preparadasy solidificadas de agar nutritivo (1,5%de agar). Se deja solidificar y luego se coloca, sobre lasuperficie de cada placa, los discos de papel de filtro estériles embebidos en los diferentesantibióticos a ensayar.Se incuban las placas a 37 ó 28ºC según de donde provino el aislamiento.La clase siguiente se determinará el grado de sensibilidad de cada microorganismo usado,midiendo el diámetro de los halos de inhibición.CUESTIONARIO T. P. 51) Defina el concepto de especie bacteriana. ¿En qué difiere del concepto de especie animal?2) Mencione tres tecnicas clasicas utilizadas para clasificar bacterias.3) ¿Como cree que afectaría a la clasificación bacteriana la adquisición de plásmidos, transposones oprofagos?

4) ¿Es útil la prueba de la catalasa para distinguir entre que dos generos bacterianos?5) ¿Qué permiten diferenciar las pruebas de fermentación?6) ¿Para qué se utiliza el test del IMViC?7) Para el test MR:¿Qué proceso esta siendo evaluado?¿Qué indicador se utiliza?¿Qué color indica un resultado positivo?6) Para el test VP:¿Qué proceso esta siendo evaluada?¿Qué indicador se utiliza?¿Qué color indica un resultado positivo?¿Qué relacion existe entre MR y VP?8) Para la prueba del citrato¿Qué proceso se detecta?¿Qué indica un resultado positivo?9) Los productos terminales de la degradacion del trp son indol y pirúvico. ¿Por qué se evalua lapresencia de indol en vez de pirúvico como indicador de actividad triptofanasa?10) Diga si es verdadero o falsoa) En el agar EMB y en el agar Fe de Kligler se pueden diferenciar microorganismos que realizanfermentación ácido-mixta de aquellos que realizan fermentación butilenglicólica.b) Las pruebas bioquímicas Rojo de Metilo y Voges-Proskauer, pueden realizarse en cualquiera de lossiguientes medios:i) Extracto de carne, peptona de carne, agua.ii) Peptona, glucosa, buffer fosfato, agua.11) ¿ Qué resultados espera obtener en las pruebas bioquímicas de agar hierro de Kligler yoxido/fermentación de lactosa como única fuente de carbono, para microorganismos con las siguientescaracterísticas metabólicas:?.a) Aerobio estricto que no utiliza la lactosa como fuente de carbonob) Anaerobio facultativo que no utiliza la lactosa como fuente de carbonoc) Anaerobio facultativo que utiliza la lactosa como fuente de carbono

12) A partir de una muestra de agua del Río de la Plata, se obtienen cultivos puros de 5 microorganismos(A, B, C, D, E). A cada uno de ellos se le realizan las pruebas de agar hierro de Kligler, Rojo de Metilo yVoges Proskahuer, obteniéndose los siguientes resultados:Kligler Rojo de Metilo Voges ProskahuerA Ac/Ac con gas +B Alc/SC sin gas -C Alc/Ac sin gas +D Alc/Ac con gas -+E Ac/Ac con gas -+A partir de los resultados obtenidos: a) ¿ Qué características metabólicas puede inferir para cada uno delos microorganismos aislados ?.b) ¿ De qué otra forma podría determinar la capacidad de utilizar la lactosa por parte de los cincomicroorganismos ?.13).Discuta las siguientes afirmaciones;a) El color rojo de las colonias en agar McConkey se debe a los productos ácidos generados por lafermentación de la lactosa.b) Si en la prueba de O/F tanto en el tubo abierto como en el cerrado se observó crecimiento con virajedel indicador al amarillo (ácido) indica que el microorganismo oxidó y fermentó la glucosa del medio.c).Los resultados de las pruebas de Rojo de Metilo y Voges Proskauer a diferencia de la prueba de agarhierro Kligler son independientes del tiempo de lectura.d) La aparición de un producto coloreado en la primera parte de la prueba de reducción del nitrato seconsidera positiva.e) Para el enriquecimiento de Staphylococcus aureus es suficiente incubar la muestra 2 horas en aguapeptonada.14) En una placa sembrada a partir de un cultivo de E. coli se observa una presunta contaminación conPseudomonas aeruginosa. Indique por lo menos 3 pruebas bioquímicas y los resultados esperados de lasmismas que le permitirían comprobar que se trata de estos dos microorganismos.

ANTIBIOTICOS1) Diseñe un protocolo para determinar la concentración inhibitoria mínima de un antibiótico para undeterminado microorganismo. Este protocolo ¿ es aplicable en el caso de un bacteriostático, unbactericida lítico y un bactericida no lítico?2) Para obtener un cesped de un microorganismo se siembra con hisopo una placa conteniendo: agar,glucosa, NH4Cl, MgSO4, K2HPO4 y se aplican distintos discos de papel embebidos con diferentescantidades de un determinado antibiótico. Luego de 48 horas de incubación se observa un halo deinhibición alrededor del disco que contiene 5 µg de antibiótico. Cuando se hace lo mismo pero utilizandoun medio que contiene agar, triptona y extracto de levadura, se observa un halo de inhibición del mismotamaño que el anterior recién alrededor del papel que contiene 50 µg del antibiótico. ¿ Discuta al menosdos posibles explicaciones para estos resultados.3) Diseñe un protocolo experimental para comprobar que una bacteria A libera al medio un compuestocon actividad antibiótica. ¿ Cómo determinaría si dicho compuesto es bactericida o bacteriostático ?.4) Se dispone de dos cultivos bacterianos: uno en estado de crecimiento estacionario y otro en estado decrecimiento exponencial. Si se agrega la misma concentración de penicilina en ambos cultivos ¿ Queresultados esperaría obtener ?. Grafique y explique.5) Se inoculan caldos nutritivos con Staphylococcus aureus y se incuban a 37 °C, tomando alícuotas adistintos tiempos para medir número de células viables y D.O. A los 120 minutos (fase log) se agregan acada cultivo diferentes agentes: a) penicilina, b) cloranfenicol, c) agua. A los 240 minutos, los cultivos secentrifugan a baja velocidad, se resuspenden en un volumen igual de medio fresco y se continúa laincubación. Esquematice las curvas de crecimiento esperadas en cada caso (número de células viables yD. O.). Justifique.6) ¿ Qué efecto espera obtener si se agrega en forma combinada un bacteriostático y un antibiótico deacción sobre síntesis de pared a un cultivo bacteriano en crecimiento exponencial ?.7) En un antibiograma, una cepa de E. coli presenta un halo de inhibición 3 veces mayor para elantibiótico A que para el antibiótico B. ¿ Qué conclusión se puede extraer de esta prueba ?. Justifique.8) Se dispone de tres sustancias obtenidas por síntesis química con presunta actividad antimicrobiana parabacterias gram negativas.a) ¿Cómo determinaría cual de las tres presenta mayor actividad?.b) ¿Qué parámetros debería tener en cuenta en el ensayo experimental?.c) ¿Cómo determinaría su mecanismo de acción?.9) a) A qué se debe la aparición de colonias dentro de la zona de inhibición del crecimiento en un ensayode concentración inhibitoria mínima?

) Qué resultados esperaría obtener al comprobar la CIM de las bacterias que forman estas colonias enrelación a las que crecen por fuera del halo de inhibición? Cómo la calcularía?

T.P. 6

TP Nº7GENETICA BACTERIANALa transferencia de material genético en bacterias se da básicamente mediante tres procesos conocidoscomo: transformación, transducción y conjugación.En la transformación, las bacterias permiten la entrada de ácidos nucleicos directamente del medioexterno; cuando esto sucede se dice que las bacterias son “competentes”. En la naturaleza, bajo ciertascondiciones, algunos microorganismos puedan alcanzar el estado de competencia e incorporar materialgenético extraño, por ejemplo: Bacillus spp. (bacilo Gram positivo capaz de esporular), Haemophilus spp.(cocobacilo Gram negativo) y Neisseria spp. (bacilo Gram negativo). Sin embargo, en el laboratorio sepueden tratar las células de un cultivo bacteriano para que sean competentes. El método más común es eldel tratamiento con Cloruro de Calcio, este compuesto químico actúa a nivel de la membrana en Gramnegativos facilitando la entrada del ácido nucleico. También se puede lograr el mismo objetivo medianteun shock eléctrico, en este caso se deben procesar las células de un cultivo bacteriano para que sean“electrocompetentes” y disponer de un aparato llamado electroporador.Comisión A y BObjetivos:Día 21) Transformar células competentes de Escherichia coli con un plásmido recombinante.2) Transformar las mismas células competentes pero con el plásmido vector.3) Hacer los controles necesarios (se discutirán en el práctico).4) Preparar las placas de Petri con los medios y reactivos que se necesitarán.Día 35) Discutir los resultados obtenidos experimentalmente.6) Discutir problemas teóricos relacionados al trabajo práctico.Desarrollo:Transformación2) Tomar del freezer un tubo eppendorf conteniendo las células competentes y descongelar en hielo.3) Agregarle el plásmido.4) Dejar 30 min. en hielo.5) Poner el tubo 45 seg. en un baño de agua de 42 grados C (sin agitar).6) Volver al hielo y mantener 2 min.7) Pasar el contenido del tubo eppendorf a un tubo de ensayo conteniendo 0.9 ml del medio SOC (atemperatura ambiente).8) Incubar 45-60 min. a 37grados C, con agitación.9) Tomar 100μl del cultivo e inocular esparciendo en una placa de LB con los reactivos necesarios paraseleccionar a las “transformantes”. Incluir los controles adecuados. (Guardar el resto del cultivo).10) Incubar las placas 18 hrs. a 37 grados C.

CAMBIOS GENÉTICOSEl genoma de una bacteria puede sufrir cambios debidos a mutaciones o a la incorporación de un ADNexógeno, muchas veces trayendo como consecuencia un cambio en el fenotipo de la bacteria. Mutación:Se le llama así al cambio heredable en la secuencia de bases del ácido nucleico del organismo.La incorporación del ADN exógeno dentro de una bacteria puede a su vez ser por transducción(transporte de ADN por bacteriófagos), transformación (incorporación de fragmentos de ADN a bacteriascompetentes) o por conjugación (transferencia de ADN entre dos bacterias por contacto físico entre ellas).Objetivo:Producción de cambios en el genotipo de una bacteria por:a) conjugación y complementación funcionalb) transposición y generación de mutantes por inserciónDesarrollo:Comisión Aa) Complementación funcional de una mutante por conjugación biparentalBacteria receptora: cultivo de la mutante pgm de Agrobacterium tumefaciens, carente de la enzimafosfoglucomutasa. Esta mutante es incapaz de transformar Glu-6-P en Glu-1-P, por lo tanto es incapaz degenerar ADP-Glu y UDP-Glu, los dadores de glucosas activadas para la síntesis de todos los polisacáridosestructurales y de reserva que contengan glucosa. Esta mutante es pleiotrópica y por carecer delexopolisacárido tiene un fenotipo DARK al iluminar con UV placas conteniendo calcofluor. Esta mutantees resistente al antibiótico Kanamicina.Bacteria donadora: un cultivo de Escherichia coli S17.1, que contiene el plásmido pCC15, el cual lleva lasecuencia completa del gen pgm de A. tumefaciens. Esta cepa es resistente al antibiótico Carbenicilina,dicha resistencia es portada en el plásmido pCC15. PROCEDIMIENTO. Se toman 1 ml de cada cultivolíquido (dadora y receptora) y se centrifugan en un mismo tubo Eppendorff. Una vez centrifugados selava con 1 ml de medio LB.Se centrifuga nuevamente, se resuspende en 30 µl de LB y se deposita sobre una placa de LB sólido, sinantibióticos. Se incuba a 28 o C por una noche.Al día siguiente se plaquea por rastrillado la mezcla de conjugaciónen el medio selectivo: Medio LB-Kanamicina (50 µg/ml)-Carbenicilina (100 µg/ml)-Calcoflúor 0,02%.Se plaquean también en el mismomedio, la cepa receptora ydonadora por separado como control.Incubar 48 hs a 28 °C.Observar la reversión del fenotipo DARK a BRIGHT al iluminar la placa con luz UV.

Comisión B:b)Mutación por inserción del transposón Tn5.Un cultivo silvestre de Agrobacterium tumefaciens será sometido a conjugación con la cepa E. coli S17.1λpir portando el vector suicida pUTminiTn5Km.Este paso de conjugación permitirá movilizar el vector pUTminiTn5 Km desde E. coli a A. tumefaciens.Dado que el vector pUTminiTn5 Km es SUICIDA, es decir, es incapaz de replicar autonomamente encualquier contexto genético excepto cuando esta presente el gen pir, el vector no podrá soportarreplicación en A. tumefaciens y se perderá en las sucesivas divisiones de la bacteria. Sin embargo eltransposón miniTn5 podrá transponer hacia el genoma de A. tumefaciens antes que el vector que lo portase pierda. Este evento de transposición lo podremos evidenciar facilmente dado que el miniTn5 porta ungen marcador que confiere resistencia a kanamicina. En consecuencia todas las colonias de A.tumefaciens capaces de crecer en placas conteniendo kanamicina son potenciales receptoras deltransposón. Para contraseleccionar las E. coli dadoras se agregará cloranfenicol dado que esta cepa essensible y la A. tumefaciens receptora es naturalmente resistente.PROCEDIMEINTO-Tomar 1 ml de cultivo líquido de A. tumefaciens (silvestre, fenotipo Bright) y 1ml de E. coli S17.1 λpirpUTminiTn5Km y mezclarlos en tubo eppendorf.-Centrifugar 10 min.-Eliminar el sobrenadante y lavar con 1ml de medio LB fresco. Volver a centrifugar.-Eliminar el sobrenadante y resuspender el pellet en 35 µl de LB fresco.-Tomar el material resuspendido y colocarlo en el centro de una placa de LB. Incubar a 28 °C toda lanoche.-Levantar el botón bacteriano y plaquear por rastrillado en medio de selección conteniendo LB-Kanamicina 50µg/ml-Cloramfenicol (20 µg/ml)-Calcofluor 0,02%. Como control plaquear en el mismomedio selectivo la cepa dadora y la receptora.-Incubar a 28 °C grados 48 hs.-Observar la aparición de colonias de A. tumefaciens resistentes a kanamicina. Observar la presencia decolonias mutantes DARK.