transgenesis y clonacion en reproducción porcina - Universidad de ...

TRANSGENESIS Y CLONACION EN REPRODUCCIÓN PORCINAANGELA MILENA CORTES TOROUNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.AFACUTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIASVICE-RECTORIA DE INVESTIGACIONESCARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIABOGOTÁ2008

TRANSGENESIS Y CLONACION EN REPRODUCCIÓN PORCINAANGELA MILENA CORTES TOROTrabajo de gradoRequerido para optar al titulo deMédicos Veterinarios ZootecnistasDirector: Doctor David Pineda. MV. Patólogo Genital. Docente dereproducción U.D.C.A.UNIVERSIDAD DE CIENCIAS APLICADAS Y AMBIENTALES U.D.C.AFACUTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIASVICE-RECTORIA DE INVESTIGACIONESCARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIABOGOTÁ20082

Nota de aceptación__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________Firma del director_____________________________Firma del codirector_____________________________Firma del jurado_____________________________Firma del juradoBogotá, mayo 20083

CONTENIDOpág.INTRODUCCION 81. OBJETIVOS 101.1 OBJETIVO GENERAL 101.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 102. MARCO TEORICO 112.1 FISIOLOGÍA DE LA FECUNDACIÓN PORCINA 112.1.1 El ovocito 112.1.2 El espermatozoide 172.1.3 El oviducto 202.1.4 Desarrollo embrionario preimplantacional 222.2 PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS 252.2.1 Fecundación in Vitro 252.2.2 Maduración in vitro 302.2.3 Cultivo de Embriones 332.3 TRANSGENESIS Y CLONACION 392.3.1 Transgénesis en animales 392.3.2 Clonación 553. METODOLOGIA 764. IMPACTO ESPERADO 775. CONCLUSIONES 78BIBLIOGRAFIA 804

LISTA DE TABLASTabla 1. Animales transgénicos 40Tabla 2. Mamíferos transgénicos. 41Tabla 3. Producción de mamíferos transgénicos en diferentes especies. 52Tabla 4. Trasplantes de órganos de animales a humanos. 53pág.Tabla 5. Principales Tipos de Celulares Utilizados en las Técnicas deClonación 58Tabla 6. Factores que Afectan las Tasas de Gestación en La Partición deEmbriones 61Tabla 7. Cronología de la clonación mediante transferencia Nuclear ySeparación de blastómeros 63Tabla 8. Principales ventajas de la partición o división de Embriones 68Tabla 9. Comparación entre la clonación por separación de Blastómeros y latransferencia nuclear 695

RESUMENEsta monografía se basa en la recopilación de información de biotecnologías enla reproducción animal como es la transgénesis y la clonación en porcicultura parael mejoramiento genético de esta especie.Desde el principio de los tiempos, el hombre ha intentado modificar lascaracterísticas de los animales domésticos intentando incrementar tecnologíasque mejoren condiciones de los animales de compañía, de producción, de trabajo,mediante la selección de los más aptos y el cruzamiento de ejemplares quepresentan mejores características: mayor producción de carne y leche o másfuerza y resistencia tanto a enfermedades, medio ambiente y consanguinidad.El enorme avance de la investigación biotecnológica en los últimos años hafavorecido el desarrollo de técnicas que permiten introducir, eliminar o modificar deforma específica un gen, o determinados tipos genes, en el genoma de unorganismo para producir seres vivos (animales, plantas y microorganismos) connuevas y mejores características. Este tipo de técnicas se denominas ingenieríagenética y los seres vivos que así se obtienen son los llamados organismosmodificados genéticamente. La ingeniería genética incluye un conjunto demétodos que permiten aislar y fraccionar el DNA, y ensamblar los fragmentosobtenidos con otras moléculas de DNA.Por tal motivo, la clonación como la transgénesis representan una de lastecnologías de gran interés mundial en la actualidad, debido a su aplicabilidadtanto en los animales como en los seres humanos.El sector porcino caracterizado por un alto nivel tecnológico de alta competitividaden el mercado ha impulsado un gran proceso de modernización del sector,optimizando todos los recursos y factores que intervienen en la producciónporcina. Estas importantes transformaciones en los sistemas de producciónintensiva, hacen a la industria porcina sea muy receptiva al uso de las nuevastecnologías de la reproducción, de modo que se puedan reducir costos y seincremente la eficacia en la producción.En un futuro se podría llegar a diseñar genéticamente, gracias a la tecnologíatransgénica, las características productivas del animal, de modo que se contaracon cerdos con un crecimiento más rápido, menor cantidad de grasa en la canal,mejores índices de conversión o mayor resistencia a enfermedades.6

Por lo tanto, el interés que despierta la tecnología de la reproducción, tanto en elárea de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afán por el desarrollode nuevos adelantos así como la puesta en marcha de las existentes. Uno de losavances tecnológicos que más rápidamente se han desarrollado en esta décadaha sido la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos.El objetivo del trabajo se basa en revisar literatura en las diferentes biotecnologíasde la reproducción animal haciendo un enfoque en la clonación y transgénesis enel área de porcicultura.7

INTRODUCCIONEn los últimos años, la biotecnología de la reproducción en los animalesdomésticos ha experimentado un gran crecimiento, aportando nuevas técnicasque han repercutido en el desarrollo de innovadoras vías de investigación en elcampo de la medicina humana, así como de la industria animal. La biotecnologíade la reproducción incluye un conjunto muy diverso de técnicas, entre las que seencuentran: inseminación artificial (IA), transferencia de embriones,crioconservación de gametos y embriones, citometría de flujo para el sexaje deespermatozoides, producción in vitro de embriones (PIV), transferencia nuclear ymicroinyección de construcciones de ADN (Transgénesis y Clonación). Algunas deestas tecnologías, como es el caso de la IA, están ampliamente implantadas enporcino; sin embargo, el desarrollo de nuevas tecnologías de la reproducción enporcinos está todavía retrasado respecto al bovino, a pesar del tremendo progresoque ha experimentado en estos últimos años (Niemann y Rath, 2001).Debido a las semejanzas fisiológicas que comparte con los humanos, el cerdo seconsidera la especie de elección como potencial donante xenógrafo y comoproductor de proteínas de interés farmacéutico secretadas por la leche deanimales transgénicos, obtenidos mediante microinyección de ADN en elpronúcleo del zigoto. Además, recientemente se ha conseguido clonar con éxitocerdos producidos por transferencia del núcleo de células somáticas de animalesadultos al citoplasma de ovocitos maduros (Polejaeva et al., 2000). Debido a quelas técnicas de producción de cerdos clonados y transgénicos requieren ovocitosmaduros y zigotos, respectivamente, existe un creciente interés en la producciónde ovocitos maduros y embriones porcinos a gran escala, mediante técnicas demaduración y fecundación in vitro (MIV/FIV), con el fin de ser empleados en elcampo de la investigación básica y biomédica.Por ende, desde sus primeros inicios el hombre ha seleccionado plantas ydomesticado animales mediante el cruzamiento selectivo de individuos con el finde transferir los caracteres deseados. La principal limitante de este proceso radicaen la incompatibilidad sexual observada cuando los organismos son muydivergentes genéticamente, lo que impide esta transferencia entre especies. Laingeniería genética permite romper esta barrera posibilitando la incorporación degenes desde otras especies que de otra forma sería imposible con los métodos demejoramiento tradicional. De esta forma los organismos genéticamentemodificados o más comúnmente denominados transgénicos son organismos vivos8

(plantas, animales o bacterias) manipulados genéticamente mediante la inserciónde un gen que habitualmente no formaba parte de su repertorio genético. Lafinalidad de esto es proporcionar a la planta o animal nuevas característicasproductivas y hacerlos más eficientes y competitivos (Clark, 2002).A pesar de que actualmente es de baja eficiencia, muestra que constituye unaalternativa en la solución de los problemas reproductivos. En la medida en que setenga mayor comprensión de sus deficiencias, en un futuro muy cercano permitiráseleccionar y reproducir animales de interés económico y ecológico a gran escala.Actualmente se requieren grandes cantidades de material biológico de alta calidadpara obtener resultados positivos lo que incrementa el costo de la técnica (Singla ycol 1997)Por otra parte, el sector porcino, caracterizado por un alto nivel tecnológico,supone un porcentaje muy importante de la actividad agraria europea. Estemercado tan competitivo ha impulsado un gran proceso de modernización delsector, optimizando todos los recursos y factores que intervienen en la producciónporcina. Estas importantes transformaciones en los sistemas de producciónintensiva, hacen a la industria porcina muy receptiva al uso de las nuevastecnologías de la reproducción, de modo que se puedan reducir costos y seincremente la eficacia en la producción. En un futuro se podría llegar a diseñargenéticamente, gracias a la tecnología transgénica, las características productivasdel animal, de modo que se contara con cerdos con un crecimiento más rápido,menor cantidad de grasa en la canal, mejores índices de conversión o mayorresistencia a enfermedades.Por lo tanto, el interés que despierta la tecnología de la reproducción, tanto en elárea de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afán por el desarrollode nuevas tecnologías así como la puesta en marcha de las existentes. Uno de losavances tecnológicos que más rápidamente se han desarrollado en esta décadaha sido la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos, la transgénesis y laclonación. Se han puesto a punto los procedimientos necesarios para laproducción a gran escala de embriones: obtención de ovocitos recogidos dematadero, maduración (MIV) y fecundación (FIV) en el laboratorio. Además, deldesarrollo de la ingeniería genética en la utilización de diferentes especies ademásde los cerdos en pro del desarrollo de alternativas terapéuticas para el ser humanoutilizando como mediadores a los animales a través de la transgénesis y laclonación.9

1. OBJETIVOS1.1 OBJETIVO GENERALRealizar una revisión de literatura actualizada sobre la importancia de la clonación,transgenesis y desarrollo embrionario in Vitro en la reproducción porcina.1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar los factores que afectan la calidad de los ovocitos y su importanciaen la producción in Vitro de embriones porcinos para así establecer losprocesos de fecundación in Vitro, así como determinar los factores y efectos deeste mismo en la viabilidad del ovocito y del espermatozoide. Identificar las técnicas de clonación de embriones utilizadas en porcicultura parareproducir animales genéticamente idénticos. Conocer las ventajas y desventajas de las técnicas de clonación, paradeterminar la viabilidad del donador y determinar con esto su valor genético,además de, determinar la importancia de los xenotrasplantes como alternativaen la producción de órganos para transplantes en humanos. Reconocer la importancia de los animales transgénicos en salud publica comoen reproducción porcina y su aporte a la generación de modelos para el estudiode enfermedades que afectan a los humanos.10

2. MARCO TEORICO2.1 FISIOLOGÍA DE LA FECUNDACIÓN PORCINAEl diseño de un sistema de producción con uso de biotecnologías en áreas deproducción in vitro de embriones, transgénesis y clonación precisa de unconocimiento previo de los sucesos que acontecen en el proceso de fecundaciónin vivo y de las condiciones ambientales a las que van a estar sometidos losgametos masculino y femenino dentro del aparato reproductor de la hembra en lasdiferentes fases de dicho proceso. Como apuntó Yanagimachi (1988): “la madrenaturaleza ha hecho su trabajo durante millones de años, mientras que nosotroshemos comenzado a imitarla hace muy poco; por lo tanto, hay muchas cosas queaún debemos aprender de ella”.2.1.1 El ovocito Ovogénesis. Durante el desarrollo fetal, las células germinales primordiales delovario van a sufrir un proceso de diferenciación. Primero se transforman enovogonias por sucesivas divisiones mitóticas, las cuales dan lugar a los ovocitosprimarios al iniciarse la primera división meiótica.La meiosis es un tipo de división celular exclusiva de las células germinales(ovogonias y espermatogonias) y su objetivo es doble: la reducción a un númerohaploide de cromosomas y la recombinación de la información genética (Polanskiy Kubiak, 1999). Antes de sufrir la meiosis, las células germinales replican su ADNy contienen en ese momento 4 copias de ADN y un número 2n de cromosomas,como cualquier célula diploide; mientras que entre las dos divisiones meióticas lareplicación de ADN queda suprimido, lo que asegura que los gametos resultantessean haploides. La meiosis consiste en dos divisiones: en la primera, las doscélulas hijas pasan a tener 1n cromosomas y 2 copias de ADN; y en la segunda,las 2 células resultantes contienen 1n cromosomas y 1copia de ADN. Así, con lameiosis se obtienen 4 células hijas haploides y genéticamente diferentes, en elcaso del macho; mientras que en la hembra sólo da lugar a una célula, pues lasdos divisiones meióticas son asimétricas, y en cada una se forman una célulagrande y otra pequeña abortiva (corpúsculo polar). De este modo, se minimiza lapérdida de productos almacenados en el ovocito, necesarios para el posteriordesarrollo embrionario temprano.En las hembras, toda la población de ovocitos entra en meiosis sincrónicamenteen la vida fetal. La primera división meiótica progresa hasta que el ovocito alcanzael estadio de diploide difuso de la profase I (estado dictiato), donde se produce la11

primera detención de la meiosis, justo antes o poco después del nacimiento. Apartir de este momento, el ovocito comienza a ser rodeado por célulaspregranulosas, las cuales forman una membrana basal alrededor de ellas,quedando formado el compartimento folicular. La primera parada de la meiosis semantiene hasta momentos antes de la ovulación o de la atresia folicular (Tsafriri etal., 1983), y es importante para asegurar que el ovocito disponga de tiemposuficiente para crecer antes de la fecundación, de modo que sea capaz demantener el proceso de la embriogénesis.Esta interrupción se mantiene mediante un sistema de control múltiple en el queestán implicados el adenosil monofosfato cíclico (AMPc) (Schultz, 1991; Mattioli,1994; Dekel, 1999), la hipoxantina (Stromstedt y Byskov, 1999; Dekel, 1999) y elfactor inhibidor de la maduración del ovocito (Dekel, 1999), entre otros factores(Thibault et al., 1987), y cuya finalidad es mantener inactivo al factor promotor dela maduración (MPF). Se ha comprobado que el MPF es un regulador universal(desde las levaduras hasta el hombre) de la transición de la fase G2 a metafasetanto en la mitosis como en la meiosis, por lo que se ha propuesto llamarle factorpromotor de la metafase, manteniendo las mismas siglas. El MPF (Dekel, 1996)está constituido por una proteinkinasa (p34cdc2) y una ciclina. Aunque no estámuy claro el mecanismo por el que el AMPc regula la detención meiótica, pareceser que su acción en el ovocito viene mediada por la proteinkinasa A que, a travésde una cascada de reacciones bioquímicas no conocidas, previene ladefosforilación de la proteinkinasa p34cdc2, manteniendo al MPF en un estadoinactivo (Dekel, 1999)En este estadio, los ovocitos se caracterizan por tener un núcleo prominente,denominado vesícula germinal (VG) (Franchi et al., 1962), y por estar rodeadospor una capa de células epiteliales (foliculares), lisas no proliferativas, conocidascomo células pregranulosas, que ejercen un efecto inhibidor sobre la meiosis y elcrecimiento folicular. En el momento del nacimiento, la mayoría de los ovocitoshan alcanzado este estadio y se encuentran formando los folículos primordiales,siendo la única fuente de gametos femeninos en el animal sexualmente maduro. Crecimiento del folículo y del ovocito. El ovocito y el folículo sufren un periodode crecimiento, que se caracteriza por ser una fase de intensa síntesis proteica yde almacenamiento de macromoléculas (Moor el al., 1990). El folículo primordialse transforma en folículo primario, donde el ovocito está rodeado por una capaunilaminar de células granulosas cuboides, derivadas de las pregranulosas. En elfolículo primario se produce un aumento del volumen del ovocito, sin divisióncelular del mismo, y una hiperplasia e hipertrofia de las células de la granulosa,dando lugar al folículo secundario (un folículo preantral multilaminar). En el ratónse ha identificado un factor de diferenciación del crecimiento, conocido como GDF-9, necesario en el inicio del crecimiento folicular al estimular la multiplicación delas células de la granulosa, y que solamente se expresa en el ovocito (Stromstedt12

y Byskov, 1999; Dong et al., 1996). El crecimiento folicular va acompañado de laformación de una capa de células de la teca vascularizada alrededor de lamembrana basal.Al alcanzar las células de la granulosa un número elevado, y en respuesta a laFSH, se forma la cavidad antral repleta de fluido folicular (Canipari, 1994). Tras laformación del antro, las células de la granulosa se diferencian en dossubpoblaciones: por una parte, las células de la granulosa que revisten la pareddel folículo y forman un epitelio estratificado en contacto con la lámina basal; y porotra, las células del cumulus oophorus que forman varias capas de célulascilíndricas alrededor del ovocito (Canipari, 1994). Cuando el folículo ha formado lacavidad antral, pasa a llamarse folículo terciario, antral o de Graaf, y alcanza undiámetro aproximado de 2,2 mm (Motlik et al., 1984).El crecimiento del ovocito va unido a un aumento en el número de orgánuloscitoplasmáticas, como mitocondrias, aparato de Golgi y ribosomas, y a laformación de los gránulos corticales a partir del complejo de Golgi (Stromstedt yByskov, 1999). Toda esta maquinaria celular, indicativa de una elevada actividadmetabólica, permite la síntesis y almacenamiento de ARN, proteínas y enzimas y,en las últimas etapas del crecimiento, el desarrollo de la red de microtúbulos yfilamentos. También durante la fase de crecimiento se forma la zona pelúcida(ZP), una cubierta extracelular glicoproteica que rodea a los ovocitos mamíferos.La capa de células del cúmulus más próxima a la ZP se conoce con el nombre decorona radiata.En esta etapa de crecimiento se van a establecer unas comunicaciones entre elovocito y las células del cúmulus, mediante unos procesos citoplasmáticos de lascélulas de la corona radiata que cruzan la ZP y conectan con el oolema, conocidoscomo uniones tipo gap (Gilula et al., 1978). Las células de la granulosa también seinterconectan mediante uniones tipo gap (Albertini y Anderson, 1974). Esteentramado de uniones intercelulares posibilita el intercambio de moléculas entre elovocito, las células de la granulosa y la circulación sanguínea, con una finalidadnutritiva y reguladora, constituyendo el proceso de “cooperación metabólica”(Canipari, 1994). Las células somáticas proporcionan nucleósidos, aminoácidos yfosfolípidos, además de mantener un balance iónico y una estabilidad en el ARNmen los ovocitos (Hunter, 2000). Esta cooperación es bidireccional, de modo que losovocitos porcinos secretan un factor de expansión del cúmulus (Nagyova et al.,1997), además de un(os) factor(es) soluble(s) que regula(n) la esteroidogénesis delas células del cúmulus (Coskun et al., 1995), suprime(n) la luteinización ypromueve(n) la proliferación de células de la granulosa en cultivo (Brankin et al.,1999). No se han identificado estos factores solubles, aunque entre los candidatosestarían varios factores de crecimiento, incluido el GDF-9.13

Los folículos dominantes serán seleccionados de entre los folículos antrales paracontinuar su crecimiento (Stromstedt y Byskov, 1999). La selección de los folículosque producirán ovocitos maduros listos para ovular en cada ciclo estral estádeterminada por la expresión de receptores para la hormona luteinizante (LH) y lahormona folículo estimulante (FSH) en sus células de la granulosa (Espey, 1999).Por ejemplo, en los folículos antrales pequeños, cuyas células de la granulosa noposeen receptores para la LH, la reanudación de la meiosis inducida por estagonadotropina no se podrá producir; por lo tanto, los folículos seleccionadosdeberán disponer de estos receptores. Los receptores para la FSH, sólo presentesen la hembra en las células de la granulosa, aumentan de número en la fase decrecimiento (Stromstedt y Byskov, 1999). Al actuar sobre las células de lagranulosa, la FSH va a desencadenar la expresión de una batería de genes quecodifican factores de crecimiento, enzimas y proteínas involucradas en laesteroidogénesis y péptidos que regulan la liberación de gonadotropinas; loscuales se van a sintetizar y acumular en el fluido folicular (Stromstedt y Byskov,1999). Además las células de la teca, estimuladas por la LH, van a sintetizarandrógenos que, posteriormente, serán transformados en estradiol por las célulasde la granulosa (Stromstedt y Byskov, 1999). Los folículos dominantes tienen unmayor número de receptores para la FSH y son más sensibles a ella que el restode folículos antrales, por lo que van producir grandes cantidades de estradiol einhibina. El estradiol y la inhibina van a regular negativamente la secreción de FSHy, al disminuir su concentración, los folículos menos sensibles a la FSHdegeneran, sufriendo el proceso de atresia (Stromstedt y Byskov, 1999).Justo después del pico preovulatorio de LH, los folículos seleccionados comienzanuna rápida expansión como resultado de la acumulación de fluido folicular en elantro. Las altas concentraciones de gonadotropinas en el fluido folicular cambianel patrón de síntesis de esteroides de las células de la granulosa y la teca (Espey,1999), y preparan al ovocito para la reanudación de la meiosis y la maduración. Maduración del ovocito. La maduración del ovocito, dividida en maduraciónnuclear y citoplasmática, hace referencia a todos los cambios nucleares,citoplasmáticos y de membrana que sufre el ovocito, con el fin de prepararse paraser fecundado con éxito y desarrollarse posteriormente.El estímulo que desencadena el inicio de la maduración del ovocito es el aumentopreovulatorio en los niveles de gonadotropinas, en especial de LH. Además de lareanudación de la meiosis, el pico de la LH desencadena otras transformacionesdentro del folículo, como alteraciones en la esteroidogénesis folicular y cambios enel complejo cúmulus-ovocito (COCs) (Moor et al., 1990; Motlik et al., 1986). Larespuesta inmediata de las células de la granulosa a la interacción con la LH es laactivación de la adenilato ciclasa y la generación de AMPc.14

Por tanto, la reanudación de la meiosis viene precedida por un aumento en elAMPc; lo que parece estar en contradicción con su actuación en el manteniendodel bloqueo meiótico en el ovocito. La explicación es que el AMPc desempeña unpapel doble en la regulación de la meiosis. Los niveles basales de AMPcproducidos por las células somáticas en los folículos antrales pequeños sontransferidos de manera continua al ovocito, a través de las uniones tipo gap, paramantenerlo en la parada meiótica, pues el ovocito no es capaz de producir AMPc alos niveles necesarios. Sin embargo, a partir de la formación de receptores para laLH en las células del cúmulus y granulosa del grupo de folículos dominantes,éstos pueden responder al pico preovulatorio de la LH produciendo grandescantidades de AMPc. Las elevadas concentraciones de AMPc en los folículosdominantes median en la acción de la LH sobre la conexina 43, una proteína queforma parte de las uniones tipo gap ováricas. Mediante reacciones de fosforilación/defosforilación, se producen cambios en la conformación de la conexina 43 queinducen una inmediata reducción de las comunicaciones intercelulares en dichosfolículos y, por tanto, en la cooperación metabólica entre sus células (Gilula et al.,1978; Séller y Schultz, 1980). Este fenómeno, conocido como expansión omucificación del cúmulus (Eppig, 1979), se produce 16 horas después del pico degonadotropinas. Bajo esas condiciones, el flujo de AMPc desde las células delcúmulus hacia el ovocito desciende por debajo del umbral requerido para inhibir laactivación del factor promotor de la maduración (o de la metafase) (MPF) y elovocito reanuda la meiosis (Dekel, 1999). Esto explica porqué se produce unareanudación espontánea de la meiosis al extraer los ovocitos de los folículos ycultivarlos in vitro, incluso en ausencia de hormonas, como consecuencia delrápido deterioro de la integridad morfológica de las células foliculares (Moor yCrosby, 1987) que conlleva una disminución en el flujo de AMPc hacia el ovocito(Motlik et al., 1986).La maduración nuclear comienza tras la reanudación de la meiosis. El paso de VGa metafase II (MII) conlleva: la disolución de la membrana nuclear conocida como“rotura de la vesícula germinal”, la formación del huso meiótico y la condensaciónde la cromatina en cromosomas homólogos que se alinean en el huso, alcanzandoentonces el estadio de metafase I; para continuar con la segregación de los dosgrupos de cromosomas homólogos, dando lugar a la extrusión del primercorpúsculo polar (CP) y al paso del ovocito al estadio de MII. La maduraciónnuclear finaliza cuando el ovocito completa la primera división meiótica con laformación del primer CP, alcanzando el estadio de MII, unas 36-40 horas despuésdel pico de LH (Hunter, 1988), tras lo cual se produce la segunda detención de lameiosis.El MPF en forma activa es necesario para la rotura de la VG, la condensación dela cromatina, y su actividad alcanza un pico en metafase I y II, para decrecer enanafase I y II (KiKuchi et al., 1995), lo que indica que su inactivación también esnecesaria para esta progresión. Por otra parte, la reorganización de los15

microtúbulos y la apropiada orientación del huso durante la MI parece estarmediada por las MAP kinasas (MAPK), cuya actividad también está inhibida dealgún modo por el AMPc y aumenta con la reanudación de la meiosis. A diferenciadel MPF, la actividad de las MAPK permanece elevada en los estadios deanafase.La maduración citoplasmática, en cambio, es un término más amplio que abarcauna serie de acontecimientos no directamente relacionados con la progresión de lameiosis pero que preparan al ovocito para la fecundación y el desarrolloembrionario posteriores (Abeydeera, 2002).En el citoplasma del ovocito se produce una redistribución de las mitocondrias yde los gránulos corticales (GC) (Thibault et al., 1987; Cran, 1985). Tras la roturade la VG, las mitocondrias migran para situarse en una posición perinucleardurante la maduración (Thibault et al., 1987; Cran, 1985), siendo este movimientomitocondrial necesario para la progresión de la maduración (Moor et al., 1990).Los GC son un tipo especial de lisosomas primarios, formados a partir delcomplejo de Golgi y del retículo endoplásmico, compuestos por glicoproteínas yenzimas hidrolíticas. Los GC migran hacia la periferia del ovocito, aumentan denúmero al final del periodo de maduración (Cran, 1985) y se sitúan debajo de lamembrana plasmática formando una monocapa (Crang y Cheng, 1986);circunstancia que será fundamental para el bloqueo de la poliespermia.Además, la maduración citoplasmática implica una reprogramación de la síntesisproteica. Parte del ARNm que había sido almacenado durante la fase decrecimiento comienza a transcribirse, sintetizándose nuevas proteínas que seránesenciales en la progresión de la meiosis, la regulación de la penetraciónespermática y la descondensación de la cabeza del espermatozoide (Moor et al.,1990). Entre estas proteínas, el factor de crecimiento del pronúcleo masculino, queserá esencial para la formación del pronúcleo masculino tras la penetración delespermatozoide. Ovulación. El pico preovulatorio de LH, inducido por el estradiol producido porlos folículos preovulatorios, desencadena finalmente la ovulación (Stromstedt yByskov, 1999). La LH también estimula la luteinización de las células de la paredde los folículos ovulados, es decir su transformación de productoras de estrógenosa productoras de progesterona, que será la principal hormona esteroideaproducida por el cuerpo lúteo tras la ovulación (Geisert, 1999).En la especie porcina, la ovulación suele tener lugar 30-40 horas después delinicio del estro, tomando el pico preovulatorio de LH como día 0 del ciclo estral, ydura de 1 a 3 horas (Geisert, 1999). Sin embargo, según otros autores (Du MesnilDu Buisson, et al., 1970) el comienzo de la ovulación es posterior (38-42 h),debido a que tanto el inicio como la duración de la ovulación pueden variar16

ampliamente (Flowers y Esbenshade, 1993). Los folículos preovulatorios tienen untamaño de 7 a 11 mm de diámetro y, momentos antes de la ovulación, sus tensasparedes se vuelven pendulantes y flácidas como consecuencia de unadisminución de la presión intrafolicular y los complejos cúmulus-ovocito (COCs) sedesligan de la pared folicular (Hunter, 1967; Hunter, 1988).El número de ovocitos liberados durante la ovulación es variable, oscilando entre10 y 24 (Geisert, 1999); y se encuentran en estadio de MII con el primer CPseparado y rodeados por las células del cúmulus y por líquido folicular viscoso.2.1.2 El espermatozoide. En los mamíferos, el espermatozoide es la únicacélula diseñada para abandonar el organismo y así poder completar su funciónbiológica de unión al ovocito maduro durante la fecundación, formando el zigoto.Muchos de sus rasgos físicos y bioquímicos han evolucionado de modo que seasegure el paso a través del tracto reproductivo masculino y femenino, laprotección del ADN de la cabeza espermática durante este tránsito, la penetraciónde las envolturas del ovocito, y la fusión con la membrana plasmática del ovocito.Las especiales características presentes en el espermatozoide incluyen: ungenoma haploide, un contenido de ADN nuclear altamente condensado ytranscripcionalmente inactivo, proteínas nucleares específicas (protaminas ensustitución de las histonas) relacionadas con la compactación de este materialgenético, un compartimento acrosomal con enzimas hidrolíticas localizado en laparte anterior de la cabeza espermática y de vital importancia en la fecundación,un axonema equipado para proporcionar movilidad con característicasestructurales no vistas en los flagelos de otras células eucariotas o procariotas, yuna membrana plasmática que presenta una polaridad extrema en la distribuciónde sus proteínas y lípidos (Millette, 1999).De este modo, el espermatozoide queda estructurado en cabeza y cola. Lacabeza, que en el caso del cerdo es de forma oval, contiene el acrosoma y elnúcleo; mientras que la cola, dividida en cuello, pieza intermedia y pieza principal,contiene el axonema y una funda de mitocondrias localizada en la porciónintermedia rodeando al axonema (Robl y Fissore, 1999). Espermatogénesis. La espermatogénesis es el proceso de transformacióngradual desde célula germinal hasta espermatozoide y consta de tres fases:proliferación, división reductora (o meiosis) y diferenciación (o espermiógenesis).La espermatogénesis tiene lugar en los túbulos seminíferos de los testículos, cuyoepitelio consta de dos tipos de células: las células germinales y las célulassomáticas o de Sertoli (Hess, 1999). A diferencia de los ovocitos, losespermatozoides son producidos a partir de la pubertad y durante el resto de lavida, en la mayoría de los machos (Robl y Fissore, 1999).17

En la fase de proliferación, las células germinales masculinas se transforman enespermatogonias por sucesivas divisiones mitóticas. En la fase de meiosis, lasespermatogonias sufren dos divisiones meióticas que, como se explicó en elapartado son simétricas y dan lugar a 4 células hijas haploides y genéticamentediferentes, dos de ellas portadoras del cromosoma sexual X y las otras dos del Y,llamadas espermátidas. Finalmente, las espermátidas sufren una fase prolongadade diferenciación, conocida como espermiogénesis, en la que experimentan unconjunto de modificaciones que les llevan a convertirse en una célula altamenteespecializada, el espermatozoide.Durante esta metamorfosis celular, los principales cambios estructurales que sufrela espermátida son: elongación del núcleo y condensación de la cromatina,formación del acrosoma a partir del aparato de Golgi, formación de una larga colaque contiene el axonema (formado a partir del complejo centriolar) y mitocondriasen su región intermedia, y pérdida del contenido citoplasmático no necesario(Hess, 1999; Oko y Clermont, 1999). Una vez completado el proceso, losespermatozoides son liberados a la luz del túbulo seminífero (Robl y Fissore,1999). Maduración final del espermatozoide- Epidídimo. Los espermatozoides abandonan el testículo y pasan a través delepidídimo hasta el conducto deferente. Los espermatozoides testiculares, aunqueya transformados en células altamente especializadas, no son todavía capaces defecundar, sino que aún deben experimentar una maduración final, que va a tenerlugar durante su transporte a través del epidídimo. A lo largo de su trayecto por elepidídimo, se producen una serie de transformaciones en el espermatozoide quele otorgan la capacidad de interaccionar con los gametos femeninos y fecundarlos(Yanagimachi: 1988, 1994). Este proceso se conoce como “maduraciónepididimaria”.Uno de los principales cambios que experimenta el espermatozoide es eldesarrollo de la capacidad de movimiento progresivo; ya que al abandonar eltestículo, los espermatozoides presentan una movilidad nula o muy débil, debido,en parte, a una falta de maduración de su membrana plasmática (Yanagimachi,1994). Durante la maduración epididimaria, los lípidos de la membrana de losespermatozoides sufren diferentes alteraciones físicas y químicas (Wolf et al.,1988), y se producen cambios en el patrón de distribución de las proteínasintramembranosas (glicoproteínas) (Suzuki, 1990). Asimismo, se altera ladistribución de los antígenos de la membrana acrosomal externa (Phillips et al.,1991), que podría preparar al espermatozoide para la posterior fusión entre lamembrana acrosomal externa y la plasmática que tendrá lugar durante la reacciónacrosómica. (Yanagimachi, 1994).18

El epidídimo presenta una elevado nivel de síntesis de colesterol, que estransferido a la membrana espermática (Suzuki, 1990); por lo que se ha sugeridoque el colesterol sea una de las moléculas claves en la alteración de lascaracterísticas de la mebrana plasmática de los espermatozoides durante sumaduración (Parks y Hammerstedt, 1985). La estabilización de la membrana por elcolesterol puede ser beneficiosa para el transporte de los espermatozoides através de los diferentes, y a menudo hostiles, microambientes dentro del tractofemenino antes de alcanzar al ovocito (Yanagimachi, 1994). Algunosespermatozoides alcanzan su capacidad fecundante mucho antes (o en unaregión más proximal del epidídimo) que otros; aunque es en la cola del epidídimo,el principal reservorio de espermatozoides, donde la gran mayoría de ellosadquiere su completa capacidad fecundante (Yanagimachi, 1994). En el cerdo, eltransporte de los espermatozoides por el epidídimo dura 10 días, pudiendopermanecer de 4 a 7 días almacenados en la cola del epidídimo antes de sereyaculados (Geisert, 1999).- Eyaculación. Durante la eyaculación, los espermatozoides entran en contactocon las secreciones de las glándulas accesorias del aparato genital masculino,que constituyen el plasma seminal. El semen eliminado por la uretra consiste, portanto, en una suspensión de espermatozoides en plasma seminal.En este proceso, los espermatozoides entran en contacto con unos factoresdecapacitantes presentes en el plasma seminal. Estos factores, conocidos comofactores de decapacitación o estabilizadores del acrosoma, se presentan en elespermatozoide en forma de glicoproteínas de superficie. Los factoresestabilizadores del acrosoma evitan la capacitación prematura de losespermatozoides, de modo que éstos no adquieran la capacidad fecundante finalmientras migran por el tracto genital femenino, antes de haber llegado al lugardonde se llevará a cabo la fecundación (Töpfer-Petersen et al., 1995).La eyaculación del verraco se produce en tres fases o fracciones: una fracciónpreespermática, clara y constituida por plasma seminal libre o pobre enespermatozoides; seguida por una fracción rica o espermática, de aparienciacremosa debido a su elevada concentración espermática; y una fracción pobre opostespermática, de color blanquecino o transparente, compuesta por plasmaseminal y una baja concentración de espermatozoides.Durante la eyaculación, sobretodo al final, se secretan unos corpúsculosgelatinosos o “tapioca” procedentes de las glándulas de Cowper, que van a formarun tapón para sellar el cérvix de la hembra, evitando en la monta natural el reflujodel voluminoso eyaculado del verraco (200-300 ml, aproximadamente) (Geisert,1999).19

2.1.3 El oviducto. El oviducto de los mamíferos proporciona el microambientenecesario para la captura, transporte y maduración de los ovocitos ovulados; eltransporte, almacenamiento y capacitación de los espermatozoides; lafecundación y finalmente, las primeras divisiones del embrión (Hunter, 1988). Estemicroambiente apropiado se debe tanto a las características especiales de lasuperficie celular del oviducto como al fluido oviductal. Anatomía e histología del oviducto. El oviducto se divide anatómicamente entres segmentos principales: el infundíbulo, la ampolla y el istmo. El infundíbulotermina en unas fimbrias que conectan con el ovario para facilitar la captura delovocito en el momento de la ovulación y está abierto hacia la cavidad peritonealpor el ostium tubárico. El istmo conecta con el útero a través de la unión úterotubárica (UUT) (Beck y Boots, 1974).La arquitectura histológica del oviducto es muy sencilla, con una mucosa noglandular (endosálpinx), cubierta por un epitelio pseudoestratificado derevestimiento compuesto por células ciliadas y no ciliadas (o secretoras); doscapas de músculo liso, una externa longitudinal y una interna circular (miosálpinx);y una cubierta serosa (mesosálpinx) que se continúa con la serosa peritoneal(Rodríguez-Martínez et al., 1985).El espesor de las capas mucosa y muscular no es homogéneo a lo largo deloviducto. Mientras que el grosor de la capa muscular interna disminuye hacia lazona del ostium, los pliegues longitudinales de la capa mucosa adquieren mayorcomplejidad, formando incluso pliegues secundarios y terciarios. También varía laproporción de células ciliadas y secretoras a lo largo del oviducto, siendo en lasfimbrias y el infundíbulo más abundantes las células ciliadas, y disminuyendo a lavez que se incrementan las células secretoras hacia el istmo (Hafez, 1972; Leese,1983). Esta especial distribución determina la presencia de compartimentos en lasuperficie del oviducto con características específicas, que proporcionan elambiente ideal para soportar los procesos reproductivos que van a tener lugar(Boatman, 1997). Fluido oviductal. El fluido oviductal (FO) está constituido principalmente por unamezcla compleja de sustancias derivadas del plasma sanguíneo, a través detrasudación selectiva, y de proteínas oviductales específicas (Beier, 1974; Harper,1988; Leese, 1988). El FO está compuesto por proteínas, enzimas, aminoácidos,compuestos energéticos, hormonas y electrolitos (Romar, 2001). La composicióndel FO varía en las distintas fases del ciclo ovárico. Estas variaciones estáncontroladas por las hormonas ováricas esteroides (Cox y Leese, 1997). Tambiénse observan variaciones en las características fisicoquímicas del FO, tales como elvolumen, pH, osmolaridad, etc. Además, la composición y características del FOno son homogéneas en todo el oviducto, sino que varían según la región,constituyendo diferentes microambientes (Biggers y Borland, 1976).20

Transporte del ovocito. En el momento de la ovulación, el extremo fimbriado deloviducto abraza al ovario, capturando el contenido de los folículos ovulados, esdecir, los ovocitos rodeados por un espeso agrupamiento de células del cúmulus(Hunter, 1989) y con una pequeña cantidad de fluido folicular viscoso. Los ovocitosse disponen en la ampolla oviductal, donde se forman agregados entre los COCs,de ahí son transportados hacia el lugar de la fecundación, en la unión ampularístmica, proceso que dura unos 30-45 minutos (Hunter, 1989).En el transporte de los ovocitos intervienen las ondas de contracción peristálticadel miosálpinx, el continuo batido hacia el útero de los cilios que revisten laampolla y los movimientos del mesosálpinx (Hunter, 1989). Durante el transportede los ovocitos, parece que se produce una maduración final del ovocitosecundario debido al cambio de microambiente que experimenta al pasar delfolículo al oviducto (Hunter, 1989).En el oviducto los ovocitos se denudan, es decir, pierden el revestimiento decélulas del cúmulus mediante la propia acción mecánica y por la acción enzimáticade la hialuronidasa de las cabezas de los espermatozoides (Harper, 1988). Losovocitos permanecen en el lugar de la fecundación durante 24-48 horas y aquéllosque han sido fecundados pasan al útero en estadio de embriones de 4 células(Harper, 1989), mientras que los no fecundados degeneran en el útero porreblandecimiento y degeneración de la zona pelúcida. Transporte del espermatozoide. El transporte de los espermatozoides a travésdel tracto genital femenino se divide en tres etapas: 1ª) un rápido transportetransuterino inmediatamente después de la deposición del semen, 2ª) lacolonización de un reservorio de espermatozoides en la UUT y en el inicio delistmo (Hunter, 1995), y 3ª) una lenta liberación de espermatozoides desde elreservorio hacia el lugar de la fecundación, en la unión ampular ístmica, enrelación con la ovulación (Barrat y Cooke, 1991).De los miles de millones de espermatozoides depositados en la cerda durante lacubrición o IA, sólo de cien a doscientos mil colonizan el reservorio de la UUT en1-2 horas (Hunter, 1984). En él, los espermatozoides contactan con los cilios porsu región apical (Rodríguez-Martínez et al., 1990; Mburu et al., 1997),permaneciendo la mayoría de ellos viables (Mburu et al., 1997). La detención delos espermatozoides en el reservorio se ve favorecida por la presencia de unagran cantidad de secreciones mucosas muy viscosas (Rodríguez-Martínez et al.,1998a), ricas en mucopolisacáridos y glicoproteínas específicas, unido a lareducción de la luz del oviducto en la UUT y el istmo provocada por el edema de lalámina propia (Hunter, 1984). Además, parece que existe una unión selectiva deespermatozoides al epitelio (Mburu et al., 1997), teniendo mayor afinidad aquéllosno capacitados (Fazelli et al., 1999). Mientras los espermatozoides permanecen21

en el reservorio, se produce una disminución de su metabolismo, y por tanto de sumovilidad, debido a las especiales condiciones físico- químicas que se dan en estelugar (Smith, 1998).Las funciones que va a desempeñar el reservorio espermático son las de: prevenirla poliespermia, gracias a la retención de espermatozoides que evita que unnúmero elevado llegue a la zona de fecundación; y modular la capacitaciónespermática, mediante un mecanismo de retraso (Smith, 1998). Queda pordeterminar si el retraso de la capacitación es debido a las secrecionesintraluminales y/o a la unión de los espermatozoides a la membrana apical de lascélulas epiteliales del istmo (Murray y Smith, 1997).2.1.4 Desarrollo embrionario preimplantacional Vínculos materno – embrionario. Durante los primeros estadios de la gestación,las interacciones maternas embrionarias en porcino tienen una gran importancia,ya que en esta especie, como en otros ungulados domésticos, el periodopreimplantacional es bastante prolongado. La importancia de esta estrecharelación entre el desarrollo embrionario y el ambiente uterino queda patente en lasincronía necesaria entre el estadio del embrión y del útero en las transferencia deembriones. Periodo pre–eclosion División embrionaria. La fecundación tiene lugar en el oviducto, en la uniónampular ístmica. La primera división se produce de 17 a 19 horas tras la ovulación(Hunter, 1974). Los embriones se mantienen en el estadio de 2 células sólo de 6 a8 horas; sin embargo el estadio de 4 células se prolonga durante 20-24 horas(Flint, 1981), por lo que la mayoría de los embriones entran en el útero en esteestadio (Harper, 1988; Davis, 1985). Según Hunter (1974), los embriones y losovocitos no fecundados pasan al útero 46- 48 horas tras la ovulación, aunque estaentrada se puede prolongar hasta 3 días después de la ovulación.Tras ese periodo de 2 días en el que los embriones son retenidos en el oviducto,las concentraciones crecientes de progesterona van a causar la dilatación deloviducto y, como resultado, el paso de los embriones hacia el útero (Dziuk, 1985).La retención de los embriones en el oviducto permite que el ambiente uterino sufrauna serie de modificaciones, tales como el paso de granulocitospolimorfonucleares a través del epitelio uterino durante el estro (Stroband et al.,1986). El oviducto secreta sustancias que podrían modificar la composición de laZP (Hedrick et al., 1987), y además afectar a la tasa de división (Fukui et al., 1988)o a la viabilidad embrionaria (Gandolfi y Moor, 1987). Asimismo, el ambiente22

oviductal también provoca una demora en la digestión enzimática de la ZP de losembriones e influencia su función de barrera selectiva (Broemann et al., 1988).El útero va a ser el compartimento en el que se desarrollarán los embrionesporcinos desde el estadio de 4 células hasta el nacimiento (Stroband y Van derLende, 1990). La pared uterina está constituida por la serosa, el miometrio y elendometrio; y este último está formado por una túnica propia y dos tejidosepiteliales: el epitelio luminal y las glándulas, que reposan sobre la túnica propia(Stroband y Van der Lende, 1990). El útero no es un simple saco en el que losembriones flotan más o menos libres, sino que su pared está plegada de tal modoque los pliegues opuestos se entrelazan y la luz uterina queda reducida a unespacio angosto. Las células epiteliales del útero sufren cambios en su altura a lolargo del ciclo estral (Sidler et al., 1986), al igual que también se ven modificadoslos pliegues de la pared (Sidler et al., 1986). Por otra parte, es posible que losembriones también cambien su propio microambiente uterino al liberar hacia elútero esteroides, que se encuentran a altas concentraciones en los embrionestempranos, los cuales actuarían sobre la permeabilidad vascular local y laliberación de proteínas endometriales; ya que la síntesis y secreción de proteínasuterinas está modulada por el estrógeno y la progesterona (Simmen et al., 1988).El concepto de que los embriones no están flotando en un ancho lumen uterino,sino que se encuentran en un espacio limitado entre los pliegues de la pared damás credibilidad a las consideraciones sobre el potencial de los embrionesjóvenes de cambiar su propio microambiente uterino.El epitelio y endotelio endometrial funcionan como una barrera de intercambioselectivo entre la circulación sanguínea y la luz uterina (McRae, 1988). Además, elfluido uterino de los mamíferos, incluido el cerdo, parece ser que contiene factoresestimulantes e inhibidores de la síntesis de ADN embrionaria (Flint, 1981). En unestudio realizado en ovino, en el que se transfirieron asincrónicamente embriones,aquéllos que estaban retrasados en relación con el útero se desarrollaron másrápido, mientras que los que estaban adelantados respecto al estadio uterino lohicieron más lentamente (Wilmut et al., 1985), lo que indica la importancia delambiente uterino. Parece ser que el ambiente uterino cambiante va a influir en eldesarrollo embrionario y la viabilidad de los embriones.El estadio de mórula de 8-16 células se alcanza alrededor del día 4, tomando elmomento de la ovulación como día 0 (Stroband y Van der Lende, 1990). Duranteel proceso de división, las organelas citoplasmáticas son escasas y estánconcentradas alrededor del núcleo, mientras que las inclusiones de vitelo llenanlas zonas periféricas del citoplasma. Las mitocondrias, que son globulares durantelos primeros estadios de división, se elongan en el estadio de mórula, lo quesugiere un incremento en su actividad metabólica. Los nucleolos se observan apartir de las 8 células y su desarrollo se acompaña de un incremento en el númerode ribosomas. Todo ello indica la activación del genoma embrionario, es decir, el23

punto a partir del cual el genoma embrionario comienza a sertranscripcionalmente activo y pasa a ser el que controla el desarrollo del embrión(Exley y Carol, 1999); y corresponde en el cerdo al inicio de la síntesis de ARN enel estadio de 4 células (Freitag et al., 1988). Antes de esta activación genómica, eldesarrollo embrionario está controlado por proteínas y ARN maternos, sintetizadosy almacenados en forma inactiva por el ovocito (Exley y Carol, 1999). El bloqueoen el estadio de 4 célula, que supone un obstáculo para el cultivo in vitro,corresponde al momento de la activación del genoma embrionario, y es análogo alque sufren los embriones ovinos en 8-16 células o los bovinos en 8 células. Formación del Blastocisto. A partir del estadio de mórula compactada, losblastómeros internos se diferenciarán en la masa celular interna, que a su vezdará lugar al futuro embrión verdadero; mientras que los blastómeros externos setransformarán en el trofoblasto, que será el origen de parte de los anejosembrionarios y que participará especialmente en la formación de la placenta(Johnson, 1981).Durante el proceso de compactación, los blastómeros exteriores forman una capade células polarizadas en estrecho contacto (Dulcibella, 1977). Más tarde seforman entre estas células vecinas unos complejos de unión, que incluyen unionesherméticas y desmosomas, y a partir de aquí el trofoblasto queda formado(Borland, 1977; McLaren y Smith, 1977). Las células del trofoblasto tienenpermeabilidad selectiva, lo cual va a favorecer el transporte de sodio y agua quecontribuirá a la formación del blastocele (Borland, 1977); momento a partir del cualel embrión alcanza el estadio de blastocisto.Los blastómeros internos, sin embargo, se diferenciarán más tarde.En el cerdo las primeras señales de compactación se observan en el día 4, en elestadio de 8 células (Hunter, 1974), la diferenciación entre las células oblastómeros interiores y exteriores comienza a partir de las 12-16 células enadelante y los primeros complejos de unión aparecen en el estadio de mórulacompactada alrededor del día 5 (Barends et al., 1989). El estadio de blastocisto sealcanza en el día 5-6 y el número de células en el momento de la formación delblastocele es normalmente de 16-32 (Papaioannou y Ebert, 1988).Durante la formación del blastocele, las células del trofoblasto están biendesarrolladas y polarizadas, contienen un número creciente de mitocondrias yalgunas hebras de retículo endoplásmico y aparato de Golgi, y presentannumerosas microvellosidades orientadas hacia la luz uterina; mientras que lascélulas de la masa celular interna presentan formas desiguales, no muestranpolaridad y sus organelas apenas están desarrolladas. Sin embargo, ambos tiposcelulares contienen grandes glóbulos de vitelo y algunas gotas lipídicas en esteestadio.24

Antes de la eclosión, los blastocistos sufren un fenómeno de expansión, de modoque ocupan por completo el espacio perivitelino. La media de células en losblastocistos porcinos expandidos es de 65-120. La proporción de células queconstituyen la masa celular interna en este estadio es como máximo del 25% deltotal de células del embrión (Papaioannou y Ebert, 1988). Eclosión y periodo post – eclosión. Hasta el momento de la eclosión, la ZPdesempeña una importante función en la regulación osmótica (Bronson yMcLaren, 1970), la contención de los blastómeros en el embrión (Modlinski, 1970)y la mejora de la supervivencia del ovocito y el embrión en el oviducto y en el útero(Dumont y Brummett, 1985). La rotura de la ZP en los embriones porcinos seproduce en el día 6-7, y este proceso parece ser independiente del número decélulas del blastocisto, al menos en estudios realizados in vitro (Niemann et al.,1983). No se conocen con exactitud los factores que causan la lisis de la ZP, peropodrían estar involucrados fenómenos mecánicos, enzimas embrionarias ofactores uterinos. En el momento de la eclosión, los blastocistos porcinoscontienen prostaglandina E (Stone et al., 1986), que podría estar implicada en laregulación del transporte de agua. Este efecto mecánico del agua, como ocurre enlos embriones bovinos (Betteridge y Flechon, 1988), podría colaborar en la roturade la ZP, previa a la eclosión del blastocisto.Tras la eclosión, los blastocistos porcinos permanecen en la luz del útero hasta eldía 13 (Dantzer, 1985), lo que constituye un periodo preimplantacional muy largosi se le compara con el de los humanos o los animales de laboratorio. El diámetrode los blastocistos recién eclosionados es de 0.2 mm aproximadamente.Entre la eclosión y la implantación, el desarrollo embrionario es peor soportado porlos sistemas in vitro que en estadios más tempranos. Por ejemplo, la elongación yexpansión de los blastocistos eclosionados, al ser dependiente de factoresuterinos, no tiene lugar in vitro. Hay, por lo tanto, una palpable evidencia de lainterrelación entre los embriones y el útero durante este periodo posterior a laeclosión. Pero no nos vamos a extender más en este estadio, pues el desarrolloembrionario in vitro se da por concluido tras la eclosión de los blastocistos.2.2 PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES PORCINOS2.2.1 Fecundación in Vitro. La fecundación in vitro (FIV) se ha definido como launión o cocultivo de espermatozoides capacitados y ovocitos maduros de formaque la penetración espermática ocurra fuera del tracto genital femenino (Martínezet al., 1989). La producción in vitro de embriones (PIV) es un proceso más amplioque comprende: la obtención y maduración in vitro (MIV) de los ovocitos, lacapacitación in vitro de los espermatozoides, el cocultivo de ambos gametos o25

FIV, y el cultivo in vitro de los embriones resultantes (CE) hasta alcanzar el estadiode blastocisto.En 1974, Motlik y Fulka (1974) consiguieron fecundar in vivo ovocitos porcinos quehabían sido madurados in vitro y, cuatro años más tarde, Iritani et al. (1978)lograron la primera MIV-FIV en porcino, utilizando espermatozoides incubados entractos reproductivos aislados de hembras. Nagai et al. (1984) fueron los primerosen capacitar in vitro espermatozoides porcinos con éxito. Un año después, Cheng(1985) obtuvo el nacimiento de crías a partir de ovocitos porcinos madurados invivo y fecundados in vitro y, finalmente, Mattioli et al. (1989) lograron producirlechones a partir de ovocitos MIV y FIV.La posibilidad de predecir la capacidad fecundante de un eyaculado mediante losanálisis in vitro es un problema que hasta la fecha no ha sido resueltoadecuadamente (Hammerstedt, 1996). Algunos autores proponen como causa dela inconsistencia de los resultados conseguidos, la evaluación de un númerorelativamente reducido de células, la gran influencia de la subjetividad delobservador y la alta variabilidad que presentan muchos análisis seminales(Graham y cols., 1980; Evenson y cols., 1994; Saacke y cols., 1994). Además, elnúmero de espermatozoides aplicados en cada inseminación es un factor muyimportante a la hora de evaluar la fertilidad y su relación con los parámetros decalidad seminal (Saacke, 1984; Saacke y cols., 1988; Fearon y Wegener, 2000). Factores que afectan la capacidad espermática y /o fecundación in vitro Procedencia de los espermatozoides. En muchos laboratorios, el semeneyaculado no congelado es la principal fuente de espermatozoides utilizada comorutina en los estudios de FIV porcina (Abeydeera, 2002). El semen refrigerado, esdecir, semen fresco eyaculado diluido en medio de conservación y mantenido a15-16ºC, también ha sido empleado para la FIV porcina por diversos autores(Grupen et al., 1997; Grupen y Nottle, 2000). El empleo de semen refrigeradopermite la utilización de verracos no alojados en las proximidades del laboratoriodonde se va a realizar la fecundación in vitro, sin necesidad de que el sementenga que ser congelado.Al utilizar semen congelado procedente de un sólo eyaculado a lo largo de unmismo experimento se elimina la variabilidad entre eyaculados (Abeydeera y Day,1997a; Wang et al., 1991). Sin embargo, se ha demostrado que al emplear semencongelado para la FIV, el proceso de capacitación y de pérdida espontánea delacrosoma se acelera en los espermatozoides congelados-descongelados (Wanget al., 1995); y que tras la descongelación, los espermatozoides sufren un rápidodescenso de la movilidad (Nagai et al., 1988). Además, el protocolo de FIV que26

funciona bien para el semen congelado de un macho, puede no dar buenosresultados con otros verracos, por lo que para cada lote determinado de semencongelado se ha de ajustar el protocolo de FIV.Al evaluar el porcentaje de espermatozoides móviles tras la descongelación ydilución final, observaron que el de los espermatozoides de epidídimo congelados(72%) era similar al de los eyaculados frescos (76%) y mejor que el de loseyaculados congelados (40%); observando menor variabilidad entre verracos en elcaso de los espermatozoides epididimales. Así mismo, las tasas de divisiónembrionaria fueron mejores al utilizar espermatozoides de epidídimo (60%) queeyaculados (15% con frescos y 16% con congelados). Preincubación espermática. La composición del medio en el que se preincubaa los espermatozoides afecta a los parámetros de la fecundación (Nagai et al.,1984; Funahashi y Day, 1993). En ausencia de PFF (Nagai et al., 1984), se vioque la preincubación estimulaba la capacitación e incrementaba las tasas depenetración y poliespermia. Al añadir PFF durante la preincubación, Funahashi yDay (1993) observaron que se estimulaba la capacitación y la pérdida espontáneadel acrosoma, de modo que durante la FIV se reducía la proporción deespermatozoides capacitados y la incidencia de poliespermia. La preincubacióndurante 90 minutos en medio TCM199m con 0,4% de BSA enriquecido con 0,1% y1% de PFF reducía significativamente los niveles de poliespermia (36% y 32%,respectivamente), comparado con la no adición (77%), manteniendo las mismastasas de penetración. Pero al aumentar la concentración de PFF a un 10%, laproporción de ovocitos penetrados se reducía hasta el 37% debido a un marcadoincremento de reacciones acrosómicas espontáneas durante la preincubación(Funahashi y Day, 1993b). Sin embargo, la sustitución en el medio depreincubación de la BSA por 10% de FCS bloqueaba el efecto beneficioso del PFFsobre la poliespermia. Según Cran y Cheng (1986), la presencia de FCS durantela FIV reduce la disponibilidad de calcio en el medio, de modo que la reaccióncortical no puede ser inducida. Concentración espermática. La concentración de espermatozoides presentesdurante el cocultivo con los ovocitos afecta a la penetración y la poliespermia(Abeydeera y Day, 1997a); ya que a mayor concentración de semen, se va acapacitar un mayor número de espermatozoides. Sin embargo, la reducción de laconcentración espermática suele venir acompañada de unas bajas tasas depenetración. Los protocolos de FIV deben diseñarse de modo que durante elcocultivo, los ovocitos estén expuestos a un número adecuado deespermatozoides capacitados, manteniendo así un equilibrio entre la penetración yla poliespermia; ya que si el número es inferior, la tasa de penetración se veráreducida, mientras que si es demasiado elevado, se incrementará la poliespermia.27

En este diseño también se han de tener en cuenta las variaciones en la calidad delsemen, debidas tanto a diferencias individuales entre los verracos como a losdaños causados por los procesos de congelación del semen (Nagai, 1996), asícomo diferencias en la composición del medio de FIV (Kidson et al., 2001;Martínez-Madrid et al., 2001; Funahashi y Nagai, 2001), pues todo ello puedemodificar el patrón de capacitación; por lo que la concentración espermática va atener que ser ajustada para cada situación concreta. Tiempo de cocultivo de los ovocitos en el semen. Al igual que ocurre con laconcentración espermática, una vez se ha alcanzado el nivel máximo depenetración, la extensión de la duración del cocultivo sólo va a dar lugar a unincremento en la tasa de poliespermia (Abeydeera, 2001); por lo que serecomienda que el tiempo de cocultivo no exceda de aquél en el que la mayoría deovocitos han sido penetrados.En un trabajo realizado por Abeydeera y Day (1997a), se evaluaron varios tiemposde cocultivo (3, 6, 9 y 12 h), comprobándose que la prolongación del cocultivo porencima de las 6 h no incrementaba la tasa de penetración (81% a las 6h vs 81% y88% a las 9 y 12 h), pero sí la poliespermia (39% vs 59% y 70%,respectivamente). La coincubación por un periodo de 3 h dio una tasa depoliespermia muy adecuada (14%), pero se acompañó de una penetraciónexcesivamente baja (31%).La duración óptima del cocultivo de los ovocitos con el semen va a depender delas condiciones a las que sean sometidos los espermatozoides. Por ejemplo, lostratamientos de lavado, centrifugación o selección previos a la FIV (Matás et al.,2002), así como las diferencias en la composición del medio de fecundación(Funahashi y Nagai, 2001), pueden dar lugar a variaciones en el estado decapacitación de los espermatozoides que, según Funahashi y Nagai (2001),podrían influir en el tiempo que precisan éstos para penetrar al ovocito. De modoque el tiempo óptimo de cocultivo va a depender de las características de cadaestudio. Sistema de cocultivo de espermatozoides-ovocitos. En un reciente trabajo,Grupen y Nottle (2000) propusieron una sencilla modificación en el sistema decocultivo de los gametos durante la FIV, con la que lograron mayores tasas depenetración (80% vs 57%) y un incremento en el desarrollo hasta blastocisto (30%vs 8%), comparado con el sistema convencional. El protocolo de cocultivoconvencional (control) consistía en la incubación de los ovocitos con losespermatozoides a una concentración constante de 0.5-1x105 spz/ml durante 5 h.En el sistema modificado, los ovocitos fueron expuestos a la misma concentraciónde espermatozoides que en el control durante 10 min y, a continuación, setransfirieron junto con los espermatozoides unidos a su superficie a una segunda28

gota con medio de FIV libre de espermatozoides, donde se incubaron durante 5 hmás.A mayor tiempo de exposición de los ovocitos con los espermatozoides a laconcentración total, sería de esperar un incremento en la tasa de penetración; sinembargo, en este experimento ocurre lo contrario. Una posible explicaciónapuntada por Abeydeera (2002) es que, como en el sistema modificado losespermatozoides muertos o dañados se quedan en la primera gota, las especiesreactivas del oxígeno generadas por su degradación, que dañarían a los ovocitosy los espermatozoides viables a lo largo de las 5 h de incubación, no les van aafectar. Medios de fecundación in vitro. En la FIV de ovocitos porcinos se han empleadodiferentes medios de fecundación, según el equipo de trabajo y/o el propósito delestudio; siendo los más utilizados el medio TCM-199 (Tissue Culture Medium;Yoshida et al., 1990; Funahashi et al., 1994a; Nagai y Moor, 1990; Funahashi yDay, 1993b), el medio BO (Brackett and Oliphant Médium; Wang et al., 1995;Kikuchi et al., 1993; Nagai et al., 1988), la solución KRBm (Krebs RingerBicarbonato modificada) (Naito et al., 1988), el medio TBM modificado(Trisbuffered Médium; Abeydeera y Day, 1997a, 1997b) y el medio TALPmodificado (Tyrode-albumin-lactate-piruvate Medium; Rath et al., 1999). Es difícilestablecer una comparación entre los medios de fecundación según los resultadosobtenidos en diversos trabajos, pues los protocolos empleados por cada equiponunca son exactamente iguales. Asimismo, las variaciones en la composición delos medios afectan a más de un componente, por lo que las diferencias en losresultados no pueden ser atribuidas a un solo factor.Comparado con los medios TCM199, BO o la solución KRBm, el medio TBMm(Abeydeera y Day, 1997a) contiene una mayor concentración de Ca2+ (7.5 mM) yno presenta iones bicarbonato, entre otras diferencias. En dos estudios diferentes,la misma concentración de Ca2+ añadida al medio BO (Mori et al., 1996) o alTBMm (Abeydeera y Day, 1997b) tuvo un comportamiento diferente sobre lapenetración y poliespermia. Al utilizar el medio BO (Mori et al., 1996), la mayortasa de penetración se alcanzó con 1,125 y 2,25 mM de CaCl2, aumentandotambién la poliespermia en el segundo caso; mientras que al elevar laconcentración de CaCl2 a 4,5 mM, se redujo tanto la tasa de penetración como lade poliespermia. Sin embargo, al emplear el medio TBMm (Abeydeera y Day,1997b), el porcentaje de penetración y de poliespermia aumentó a la vez que seincrementó la concentración de CaCl2, siendo máximas para 7,5 y 10 mM deCaCl2. Además de la diferente composición en calcio y bicarbonato entre el medioBO y el TBMm, otros factores diferenciales en cada uno de los trabajos fueron elpH del medio de FIV (7,6 vs 7,2-7,3), el tiempo de cocultivo de ovocitos yespermatozoides (4 vs 12 h), la concentración espermática (5x104 vs 1x106spz/ml) y la fuente de espermatozoides (fresco vs congelado). Estas diferencias en29

la metodología han podido contribuir en las variaciones obtenidas en losresultados. Esto es sólo un ejemplo de la gran variabilidad que existe en losprotocolos de FIV empleados por cada equipo y para cada estudio, que hace muydifícil su comparación.Por otra parte, Rath et al. (1999) estudiaron el efecto de dos medios modificadosrespecto al TALP, que se diferenciaban en que el primero contenía CaCl2 comofuente de calcio, mientras que el segundo presentaba lactato cálcico; en que elcontenido de NaH2PO4 en el segundo era un 24% superior que en el primero; yen el empleo de dos antibióticos diferentes: kanamicina y amikacina. Con elsegundo medio modificado se obtuvo una tasa de división mayor (43% vs 18%), yse sugirió que la presencia de una mayor concentración de fosfato junto con ladisponibilidad de calcio podían ser los responsables de la mejora.Lo descrito anteriormente hace suponer, en relación con el medio de FIVempleado, que la fecundación de los ovocitos porcinos va a depender no sólo decada uno de los componentes que constituyen el medio en cuestión, sino tambiénde la interrelación entre ellos.2.2.2 Maduración in vitro. El proceso de maduración del ovocito se suele dividiren maduración nuclear y citoplasmática. El ovocito maduro a nivel nuclear puedeser claramente identificado como aquél que reanuda la meiosis y alcanza elestadio de MII; mientras que la maduración citoplasmática, término que abarcauna serie de acontecimientos no directamente relacionados con la progresión de lameiosis pero que van a preparar al ovocito para la fecundación y el desarrolloembrionario posteriores (Abeydeera, 2002), se ha de estimar de un modoindirecto.El ovocito que no ha completado su maduración citoplasmática no es capaz dereaccionar de manera correcta con la cromatina del espermatozoide penetrado einducir los cambios moleculares necesarios para la formación del PNM, pues esteproceso está controlado por el factor de crecimiento del pronúcleo masculino, quese sintetiza durante la fase final de la maduración del ovocito. El GSH, sintetizadotambién durante la maduración del ovocito, es un factor citoplasmático necesariopara la descondensación de la cromatina espermática y, por tanto, para laformación del PNM (Perreault et al., 1988; Yoshida, 1993).Esto explica la estrecha relación que existe en el porcino entre la maduracióncitoplasmática y la formación del PNM (Moor et al., 1990); y por esta razón, tantoel porcentaje de formación de PNM como el contenido intracelular de GSH de losovocitos (Day et al., 2000) pueden ser tomados como indicadores de lamaduración citoplasmática del ovocito. Asimismo, se ha demostrado una altacorrelación entre el contenido de GSH del ovocito al final de la MIV y la incidenciade formación de PNM tras la FIV (Funahashi et al., 1994). Al mismo tiempo, el30

GSH está involucrado en la protección del ovocito contra el fenómeno deapoptosis, inducido por la presión oxidativa generada bajo las condiciones decultivo in vitro (Tatemoto et al., 2000).El fallo en la maduración citoplasmática de los ovocitos MIV puede deberse adeficiencias inherentes a los propios ovocitos y/o condiciones subóptimas decultivo (Abeydeera, 2002). Para resolverlo es preciso realizar una buena seleccióny manipulación de los ovocitos, así como mejorar el sistema de MIV. Factores que afectan a la calidad de los ovocitos Condiciones de transporte de los ovarios al laboratorio. La duración ytemperatura del transporte de los ovarios desde que son recogidos en el mataderohasta que se comienzan a procesar en el laboratorio puede influir en la calidad delos ovocitos. Walters y Graves (1998) compararon el efecto de varias temperaturas(5, 16, 25, 30 y 37ºC) y tiempos (2, 6, 10, 14 y 26 h) de transporte en la posteriormaduración de ovocitos porcinos. Al incrementarse el tiempo de transporte seredujo la maduración de los ovocitos, en todas las temperaturas valoradas. Lostransportes de más de 5 h de duración o a temperaturas inferiores a 25ºCcomprometieron seriamente la maduración de los ovocitos. Presencia de cuerpos lúteos y folículos quísticos en el ovario. Ocampo et al.(1993) han apuntado que la presencia de cuerpos lúteos en los ovarios afecta a lacalidad de los ovocitos recuperados, por lo que es conveniente no utilizar ovarioscon cuerpos lúteos en los protocolos de PIV de embriones porcinos. Así mismo, esrecomendable desechar aquellos ovarios que presentan folículos quísticos. Tamaño del folículo. El tamaño del folículo determina la capacidad de desarrollodel ovocito. Los ovarios porcinos contienen folículos antrales con una amplia gamade diámetros, que se clasifican como pequeños (menores de 3 mm), medianos(entre 3-7 mm) y grandes (de más de 7 mm). Los ovocitos utilizados en laproducción de embriones de cerdo se suelen recuperar de folículos de tamañomedio.Yoon et al. (2000) utilizaron ovocitos porcinos aislados de folículos de mayor (de 3a 8 mm) y menor (

Método de recuperación de los ovocitos. Aunque la recuperación de ovocitospor disección de los folículos es más laboriosa que por aspiración, asegura larecuperación de ovocitos exclusivamente de folículos no atrésicos (Ding et al.,1992a). Cuando se compararon los estadios de vesícula germinal en ovocitosobtenidos de ovarios de matadero y recuperados tanto por punción de los folículosseleccionados como por aspiración folicular, se observó que los ovocitosrecuperados por punción se encontraban detenidos en el estadio de VG1 enmayor proporción que los aspirados (Ebihara et al., 1993). Esto sugiere que con elmétodo de aspiración también se recuperan ovocitos de folículos cuyas célulasfoliculares no son adecuadas para mantener el arresto meiótico en VG1,permitiendo al ovocito reanudar la meiosis.En nuestro laboratorio, hemos observado que la aspiración de folículos con jeringade 10 ml conectada a aguja de 18G provoca una denudación mecánica de lascélulas del cúmulus que rodean al ovocito, cuya presencia va a ser fundamentalen el proceso de maduración del ovocito. Sistema de maduración in vitro de los ovocitos: condiciones de cultivo y mediosde maduración. Las condiciones físicas específicas del ambiente en el que semaduran los ovocitos (osmolaridad, pH y composición iónica del medio;temperatura y tensión de CO2 y O2 el incubador; volumen de cultivo; y tiempo deincubación), así como la mayor o menor definición del medio de maduraciónutilizado (suero, células somáticas, etc.) van a influir en la maduración de losovocitos (Holm y Callesen, 1998). Condiciones de cultivo. La duración del cultivo durante la MIV de los ovocitosporcinos oscila desde 36 horas (Yoshida et al., 1993b) hasta 48 h (Naito et al.,1988), pasando por 40 h (Funahashi y Day, 1993c) y 44 h (Wang et al., 1997a).Según Ka et al. (1997) un cultivo de 36 h es suficiente para completar los procesosde maduración nuclear y citoplasmática, mientras que Yamauchi et al. (1996)apuntan que el periodo óptimo de cultivo es de 42-44 h.La temperatura de incubación más utilizada, tanto en la MIV, la FIV y el CE es de38,5ºC ó 39ºC. En un reciente estudio, Abeydeera et al. (2001) analizaron el efectode dos temperaturas, 35 y 39ºC, y de dos duraciones de cultivo, 44 y 68 h, durantela MIV de ovocitos porcinos sobre la maduración nuclear, la fecundación y eldesarrollo embrionario posterior. El cultivo a 35ºC durante 44 h redujosignificativamente la tasa de maduración nuclear (12% vs 79%), comparado con laincubación a 39ºC durante el mismo tiempo. La extensión del cultivo a 35ºC hasta68 h aumentó la tasa de maduración nuclear a 58%, mientras que en el caso delcultivo a 39ºC, se incrementó la activación espontánea de los ovocitos. Respectoal desarrollo embrionario hasta blastocisto, el tratamiento que dio mejor resultadofue el cultivo a 39ºC durante 44 h (31%), comparado con el cultivo a 35ºC (13%) y32

a 39ºC (3%) durante 68 h. Aunque se confirmó que la temperatura y el tiempoóptimos de cultivo durante la MIV son 39ºC y 44h, respecto a 35ºC y 68h, laextensión del tiempo de incubación a una menor temperatura permitió alcanzartasas aceptables de desarrollo embrionario.La atmósfera de cultivo empleada como rutina en los protocolos de PIV deembriones porcinos es de 5% de CO2 y 95% de humedad. La utilización deincubadores con baja tensión de oxígeno (5-7%), no es frecuente en porcino. Medios de maduración. Para la maduración in vitro de ovocitos porcinos se hanempleado distintos medios de cultivo, según el grupo de trabajo o el propósito delestudio. Los medios se pueden clasificar en sencillos o complejos, dependiendode la cantidad de productos incluidos en su composición. Ejemplos de mediossencillos ampliamente utilizados en la MIV de ovocitos porcinos son el medioWhitten (Funahashi et al., 1994b), el medio KRB (Krebs Ringer Bicarbonato) (Naitoet al., 1988), y el medio NCSU23 (North Carolina State University) (Abeydeera etal., 1998b, 1998c), que se suelen preparar en el propio laboratorio. Entre losmedios complejos más utilizados están el TCM199 (Tissue Culture Medium 199)(Zheng y Sirard, 1992) y el Waymouth (Yoshida et al., 1993b), que debido alelevado número de componentes, se suelen adquirir en preparados comerciales.A su vez, los medios de cultivo se dividen en definidos o indefinidos, conforme altipo de suplementos que contengan. La tendencia actual es, en la medida de loposible, la eliminación de suplementos no definidos, pues contienen factoresdesconocidos que dificultan la identificación de los mecanismos involucrados en laregulación de los procesos en estudio (Abeydeera, 2002). Además, en el caso desuplementos como el PFF, el FCS o las células somáticas, entre otros, se haobservado mucha variabilidad entre lotes y entre laboratorios, que impide laestandarización de los protocolos y la repetibilidad de los experimentos.Pero la presencia de determinados suplementos no definidos en los medios, comoel PFF (Yoshida et al., 1990, 1992) o el cocultivo con células somáticas(Abeydeera et al., 1998b), ha mejorado de forma notable los rendimientos de latécnica, que compensan las desventajas de su utilización. En la actualidad seestán tratando de identificar y purificar los factores activos, presentes en lossuplementos no definidos, responsables de estos efectos beneficiosos.2.2.3 Cultivo de Embriones. En los primeros estudios sobre cultivo in vitro (CE)de embriones porcinos, no se logró sobrepasar el estadio de 4 células a partir deembriones de una célula obtenidos in vivo (Davis, 1985). Este bloqueo en 4células coincide con la transición del control genético de la madre al embrión(Jarrell et al., 1991). Además, el estadio de 4 células se prolonga durante 24 h invivo, y es la fase en la que se produce el paso de los embriones porcinos deloviducto al útero (Davis, 1985).Posteriormente se consiguió superar el bloqueo en 4 células gracias al uso de33

Oviductos de ratón en cultivo (Kriser et al., 1989), al cocultivo con célulasepiteliales (Archibong et al., 1989) o al enriquecimiento con fluido oviductal(Archibong et al., 1989) durante el CE. En cambio, el cultivo in vitro de embrionesrecogidos de hembras donantes a partir del estadio de 4 células hasta blastocistosi se podía llevar a cabo en un medio de cultivo simple basado en el medio Krebs-Ringer bicarbonato (Davis, 1985), sin necesidad de cocultivo.En estudios más recientes, más del 70% de los embriones porcinos obtenidos invivo y cultivados in vitro se han desarrollado hasta el estadio de blastocisto endiferentes medios: medio Whitten’s modificado (Beckmann y Day, 1993), medioNCSU23 (North Carolina State University 23; Petters y Wells, 1993), medio IowaState University (Youngs et al., 1993) y medio BECM-3 (Beltsville Embryo Culture3; Dobrinsky et al., 1996). Sin embargo, al comparar la eficacia de estos mediospara soportar el desarrollo embrionario de embriones MIV-FIV se encontró unamplio rango (desde 5% a 30%) en la proporción de blastocistos obtenida concada uno de ellos (Abeydeera et al., 1999a).Por otra parte, la transferencia embrionaria de zigotos MIV-FIV al oviducto dehembras receptoras y su posterior recogida, por lavado retrógrado, 5 días mástarde dio lugar a blastocistos con un número de células notablemente más elevado(106-136 vs 10- 21) que los controles cultivados in vitro (Funahashi et al., 1994d).Asimismo, al cultivar in vitro e in vivo embriones de 1-2 células obtenidos in vivo,los blastocistos desarrollados in vivo también presentaban un mayor número decélulas (55 vs 25) que los cultivados in vitro (Machaty et al., 1998).Según Bavister (1995), el ambiente de cultivo utilizado para el desarrollo de losembriones preimplantacionales, incluso en ausencia de efectos visibles, puedeafectar profundamente a los procesos que acontezcan tras la implantación.Asimismo, el cultivo in vitro afecta a la expresión génica de los embriones, tanto enestadios tempranos como avanzados del desarrollo, aunque su efectos seobserven a largo plazo (Duranthon y Renard, 2002). Incluso siendo compatible conel desarrollo a blastocisto, las modificaciones en la concentración salina del mediode cultivo pueden provocar importantes alteraciones en la expresión dedeterminados genes (Ho et al., 1994). Del mismo modo, la adición al medio decultivo de aminoácidos (Ho et al., 1995), factores de crecimiento (Babalola ySchultz, 1995) o suero (Wrenzycki et al., 1999) puede afectar a la transcripcióngénica maternal y embrionaria. En general, el desarrollo de los embriones encultivo es más lento que in vivo, dando lugar a blastocistos con un menor númerode células unido a una progresiva pérdida de viabilidad y a un metabolismoreducido (McKiernan y Bavister, 1994).Según lo expuesto hasta este momento, se podría afirmar que el limitadodesarrollo hasta blastocisto de los embriones porcinos MIV-FIV-CE y su menorcalidad, comparada con los obtenidos in vivo, no se debe a un fallo puntual en elsistema de PIV de embriones, sino a la combinación de una maduración34

citoplasmatica inadecuada o incompleta, una elevada poliespermia, unaformulación inadecuada de los medios de cultivos y unas condiciones de cultivoembrionario subóptimas. Condiciones del cultivo de embriones Tensión de oxígeno. Las condiciones convencionales de incubación de losembriones durante el CE son las mismas que las empleadas para la MIV y la FIV,es decir, 5% de CO2 en atmósfera saturada de humedad a una temperatura de38,5-39ºC.Sin embargo, Berthelot y Terqui (1996) afirmaron que el desarrollo de embrionesporcinos obtenidos in vivo y cultivados en NCSU23 modificado (sin glucosa peroenriquecido con lactato, piruvato, vitaminas y mayores niveles de glutamina,NaHCO3 y BSA) a baja tensión de O2 era óptimo. En contraste con estosresultados, Machaty et al., (1998) no observaron mejora en el desarrollo hastablastocisto al comparar el cultivo de embriones obtenidos in vivo en NCSU23 bajotensión reducida (5%) de O2 o en condiciones convencionales (20% O2). Noobstante, estos trabajos no son comparables, al haber diferencias en el medio decultivo empleado.Recientemente, Machaty et al. (2001) han observado un incremento en eldesarrollo a blastocisto y en el número de células al cultivar mórulas MIV/FIV bajotensión reducida (5%) de O2. La explicación propuesta para esta mejora es que lainhibición parcial de la fosforilación oxidativa a partir del estadio de mórula tieneefectos beneficiosos sobre el desarrollo y el número de células de los blastocistos.Fischer y Bavister (1993) indicaron que el nivel de O2 en la cavidad uterina eramenor que en el oviducto. Esta menor tensión de oxígeno podría ser en parteresponsable del cambio en la vía de producción de ATP (adenosil trifosfato) defosforilación oxidativa a glicólisis en el momento de la compactación/blastulación.Como en condiciones in vivo, los embriones porcinos alcanzan los cuernosuterinos antes del estadio de mórula compacta (Davis, 1985), podríamos pensarque una reducción en la fosforilación oxidativa en beneficio de la glicólisis seríapositiva en el estadio de peri-compactación.Se ha propuesto el establecimiento de un CE secuencial: en atmósferaconvencional (20% O2) hasta el estadio de mórula y a partir de ahí bajo tensiónreducida (5%) de O2. Relación: embriones/volumen de medio. Se ha demostrado que el cultivo deembriones en volúmenes reducidos de medio o en grupos incrementasignificativamente el desarrollo a blastocisto, así como el número de células de losblastocistos en varias especies: ratón (Paria y Dey, 1990), mujer (Lane y Gardner,1992), vaca (Palma et al., 1992) y oveja (Gardner et al., 1994). Además, el cultivo35

de embriones en volúmenes reducidos aumenta la viabilidad del embrión tras latransferencia embrionaria (Lane y Gardner, 1992). Asimismo, la disminución de larelación volumen de cultivo/embrión estimula el desarrollo de la masa celularinterna de los blastocistos sin afectar el número de células del trofoblasto, enembriones de ratón (Gardner et al., 1997) y vaca (Ahern y Gardner, 1998). Sinembargo en un estudio reciente realizado sobre embriones humanos (Rijnders yJansen, 1999), no se observó ninguna mejora en el desarrollo embrionario alcultivar en grupo o al reducir el volumen de cultivo.En el porcino, los estudios en los que se valoró el efecto del volumen de cultivosobre el desarrollo de los embriones se realizaron hace más de dos décadas. Enel más reciente, de 1982 (Menino y Wright, 1982), se comparó el efecto de dossistemas de cultivo: en microgota de 50 µL en placas de Petri de cristal y en 4 mlen tubos Falcon de plástico, con unos 28-29 embriones por placa o tubo, sobre eldesarrollo de embriones de 1 célula obtenidos in vivo; alcanzándose un mayoríndice de divisiones completadas en cultivo con el sistema de 4 ml de medio,aunque sin apreciarse diferencias significativas en el porcentaje de mórulas y deblastocistos entre los dos sistemas. Mientras que en dos estudios previos (Pope yDay, 1977; Davis y Day, 1978), el desarrollo embrionario de embriones de 1 célulaobtenidos in vivo fue superior en los cultivados en microgotas frente al cultivo entubos.Una de las hipótesis propuestas para el efecto beneficioso del cultivo en grupo y/oen pequeño volumen de medio es la producción de factores autocrinos y/oparacrinos por parte del embrión en cultivo (Paria y Dey, 1990; O’Neill, 1998), queestimularían el desarrollo del propio embrión que los genera y el de los embrionesvecinos. Según esto, el cultivo en volúmenes grandes daría lugar a la dilución delos factores beneficiosos producidos por el embrión, de tal modo que laconcentración presente en el medio de cultivo no sería suficiente para ejercer elefecto (Gardner, 1994).Entre los posibles factores autocrinos y/o paracrinos implicados se han descrito lossiguientes: factores con propiedades mitogénicas o de diferenciación, como losfactores de crecimiento PDGF (Platelet-derived Growth Factor) (Thibordeaux et al.,1995) e IGF II (Insulin-like Growth Factor II) (O’Neill, 1997); y factores antiapoptóticoso de supervivencia, como el TGFβ (Transforming Growth Factor β)(Brison y Schultz, 1997) y el PAF (Platelet-activating Factor) (O’Neill, 1998), loscuales actuarían reduciendo los niveles de apoptosis dentro de la masa celularinterna del embrión (Colon y Raff, 1999).Paria y Dey (1990) sugirieron que el efecto de estos factores de crecimiento o desupervivencia producidos por el embrión de ratón empezaba a ser operativo apartir del estadio de 8 células o mórula, momento en el que comienzan adetectarse en la superficie del embrión receptores para el factor de crecimientoepidérmico (EGF); mientras que, recientemente, O’Neill (1998) ha propuesto que36

los factores de supervivencia autocrinos sólo son requeridos por el embrión deratón antes o durante el estadio de 2 células.Otra de las hipótesis, ofrecida por Bavister (1995), es que el incremento en elnúmero de embriones por unidad de volumen podría resultar beneficioso debido,simplemente, a un agotamiento por parte de los propios embriones de sustanciasembriotóxicas o inhibidoras en el medio, o por una disminución en la pérdida decompuestos endógenos importantes, como aminoácidos, entre otras posibilidades.Según este autor, el efecto del tamaño de la gota de cultivo sobre el desarrolloembrionario va a depender, entre otros factores, de la composición del medio decultivo y de las condiciones físicas empleadas.Para apoyar esta hipótesis, Bavister comparó dos trabajos en los que se estudió elefecto del número de embriones por unidad de volumen, en embriones dehámster. En uno de ellos (Schini y Bavister, 1988), al aumentar el número deembriones por microlitro de medio de 0,24 a 35 se incrementó ampliamente elporcentaje de embriones de 2 células que se dividieron al menos una vez (de 1%a 34%). El medio de cultivo empleado contenía glucosa y fosfato, que bloquean eldesarrollo de los embriones de hámster en cultivo; lo cual hace pensar que lamejora se debió, en parte, a un consumo de estos compuestos por los embriones,que redujo su concentración en el medio. En cambio, en el otro trabajo descrito(McKiernan y Bavister, 1994) se empleó un medio sin glucosa ni fosfato, noencontrándose diferencias en el desarrollo a mórula y a blastocisto al cultivar 2, 4u 8 embriones por gota de medio. Medios de cultivo de embriones. Como hemos visto, el desarrollo hasta elestadio de blastocisto de embriones obtenidos in vivo se logró con éxito (>70%) envarios medios de cultivo. Sin embargo, al comparar la eficacia de estos mediossobre el CE de embriones MIV-FIV, se observó un amplio rango de resultados(Abeydeera et al., 1999a). El medio con el que se obtuvo el mejor desarrolloembrionario fue el NSCU23 (30% de blastocistos) seguido por el medio Iowa StateUniversity (14%) y el BECM-3 (12%), siendo el medio Whitten el que dio peoresresultados (5%). Se puede afirmar que, hasta la fecha, el NCSU23 es el medio deelección para el cultivo de embriones MIV-FIV, mientras que para el cultivo deembriones obtenidos in vivo también son adecuados los otros 3 medios citados.De todos modos, la capacidad de los embriones de desarrollarse en un medio decultivo determinado no indica necesariamente que este medio le proporcione unambiente beneficioso o deseable; sino que podría reflejar simplemente sucapacidad para tolerar las condiciones artificiales, quizás a expensas de suviabilidad (Bavister, 1995). Por lo tanto, el diseño del medio de cultivo es crucialpara el posterior desarrollo embrionario pre- y postimplantacional. En la actualidadhay dos tendencias a la hora de formular los medios de cultivo: una tendencia máspragmática, cuyo principal objetivo es la producción de embriones viables, quepuede emplear medios de cultivo no definidos para este fin; y otra tendencia, cuya37

meta es el conocimiento de los requerimientos básicos de los embriones encultivo, para lo cual es fundamental el empleo de medios cuya composición estétotalmente definida (Bavister, 1995). Morfología y calidad de los embriones producidos in Vitro. A pesar de losnotables avances en la PIV de embriones porcinos, la morfología de los embrionesPIV, incluidos los blastocistos, difiere de la de los embriones obtenidos in vivo(Wang et al., 1999a). Asimismo, el número de células que constituyen losblastocistos PIV es menor que la de los obtenidos in vivo (Papaioannou y Ebert,1988).Wang et al. (1999a) evaluaron la morfología y los filamentos de actina deembriones producidos in vitro e in vivo, y comprobaron que in vivo los blastocistospresentaban una masa celular interna más prominente y que los blastómeros delos embriones tempranos tenían un aspecto más definido que los de losproducidos in vitro. Asimismo, sugirieron que las divisiones anómalas y el bajonúmero de células en los blastocistos, que aparecen en los embriones PIV, sepodía deber a las alteraciones observadas en la distribución de los filamentos deactina en el citoplasma, ya que éstos están involucrados en el proceso de divisióncelular. Valoración de la capacidad de desarrollo embrionario. El parámetro por el quese valora la capacidad de desarrollo de los embriones MIVFIV- CE en la mayoríade laboratorios es el desarrollo hasta el estadio de blastocisto. Por otra parte, unmayor número de células en el blastocisto se considera un signo de calidadembrionaria, ya que, como hemos visto, el número de células de los blastocistosobtenidos in vivo suele superar al de los embriones PIV. También se ha empleadoel parámetro del porcentaje de blastocistos eclosionados en cultivo como indicadorde la calidad embrionaria, aunque este hecho no está comprobado.Sin embargo, hemos visto que el sistema de producción in vitro ocasionaalteraciones en el embrión, que pueden llegar a ser compatibles con el desarrolloa blastocisto (Duranthon y Renard, 2002). Por lo tanto, la prueba definitiva que vaa medir la viabilidad embrionaria es el establecimiento de gestaciones y elnacimiento de crías vivas tras la transferencia de los embriones a una hembrareceptora. Actualmente, el éxito alcanzado en las transferencias de embriones PIVsegún diferentes autores ha sido muy variable, y como mucho sólo el 20% ó 30%de los embriones sobrevive tras la transferencia (Abeydeera, 2002).Desgraciadamente, la transferencia de embriones tiene un costo elevado, tanto entiempo como económico, que no hacen posible su ejecución de manera rutinaria.La división embrionaria a las 48 h es un parámetro bastante subjetivo, debido a ladificultad de distinguir entre un embrión dividido correctamente y otro fragmentado38

o dividido partenogenéticamente, sólo mediante criterios morfológicos. En unestudio en el que se analizaron las alteraciones en la división se observó que, delos embriones producidos in vitro, sólo el 73% de los embriones de 2 células, el26% de 3 células, el 49% de 4 células y el 26% de 5 a 8 células eranmorfológicamente normales (con un núcleo por blastómera), presentando el restouna división citoplasmática y nuclear asincrónica, que dio lugar a embrionesfragmentados o con blastómeras bionucleadas; mientras que en los embrionesobtenidos in vivo no se observó ninguna alteración en la división (Wang et al.,1999a).2.3 TRANSGENESIS Y CLONACION2.3.1 Transgénesis en animales. Desde sus primeros inicios el hombre haseleccionado plantas y domesticado animales mediante el cruzamiento selectivode individuos con el fin de transferir los caracteres deseados. La principal limitantede este proceso radica en la incompatibilidad sexual observada cuando losorganismos son muy divergentes genéticamente, lo que impide esta transferenciaentre especies. La ingeniería genética permite romper esta barrera posibilitando laincorporación de genes desde otras especies que de otra forma sería imposiblecon los métodos de mejoramiento tradicional. De esta forma los organismosgenéticamente modificados o más comúnmente denominados transgénicos sonorganismos vivos (plantas, animales o bacterias) manipulados genéticamentemediante la inserción de un gen que habitualmente no formaba parte de surepertorio genético. La finalidad de esto es proporcionar a la planta o animalnuevas características productivas y hacerlos más eficientes y competitivos (Clark,2002).El gen a ser introducido consiste básicamente de una construcción de ADN quecontiene una región promotora y la región codificante para la proteína de interés,los que se insertan en el genoma en forma artificial mediante alguna de lastécnicas disponibles como se detalla más adelante. Esta región de ADN esdenominada comúnmente transgen y puede provenir de otro animal de la mismaespecie o desde una bacteria o planta. El lugar del animal donde se expresa eltransgen está dirigido por la región promotora o las regiones reguladoras de laregión promotora. Así por ejemplo, si se utiliza el promotor del gen de la ß-Lactoglobulina se podría dirigir la expresión y secreción de una proteínarecombinante exclusivamente en la leche del animal.Hasta muy recientemente, la tecnología para generar animales de granjamodificados genéticamente involucraba la microinyección pronuclear, en la cualpequeñas cantidades del ADN de interés (transgen) eran inyectadas en elpronúcleo de un embrión al estado de dos células. Aunque ampliamente aceptaday utilizada en forma rutinaria en muchos laboratorios, ha habido muy pocoprogreso para mejorar su eficiencia, la que se mantiene en el orden 0.1-5%,39

dependiendo de la especie considerada (Wall y col., 1997). Al mismo tiempo quela microinyección pronuclear se estaba desarrollando, en animales de granja, lascélulas madre embrionarias (ES cells) estaban siendo desarrolladas y utilizadaspara experimentos de recombinación homóloga en el ratón. Esta tecnología hasido tremendamente eficiente para explotar la capacidad de las células encontribuir a la línea germinal y realizar recombinación homóloga con ADNexógeno, permitiendo la introducción de cambios precisos en el genoma delanimal (para revisión ver Hooper, 1992). Sin embargo, a pesar de los esfuerzos demuchos laboratorios, no se han descrito aún células madre embrionarias en otrasespecies distintas al ratón (Stice, 1998), lo que ha frenado muchas aplicacionespotenciales de esta tecnología en animales de granja. Esta situación se revirtiórecientemente después del nacimiento de Dolly, el primer animal obtenido portransferencia nuclear de una célula adulta (Wilmut y col., 1997). Sin embargoPolly, la primera oveja transgénica obtenida por transferencia nuclear (Schnieke ycol., 1997), y George y Charlie, los primeros terneros transgénicos obtenidos de lamisma forma (Cibelli y col., 1998), son los que han marcado el curso de lasinvestigaciones en este campo y conducirán el camino en el futuro. Hoy en día, latransferencia nuclear se ha convertido en una alternativa real a la microinyecciónpronuclear debido a que permite un acortamiento del tiempo entre la obtención deun animal transgénico fundador y el establecimiento de un rebaño transgénico.Además, la transferencia nuclear abrió las puertas a la recombinación homólogade animales de granja que había sido restringida sólo al ratón mediante latecnología de células madre embrionarias. Esto posibilita la eliminación de genesendógenos en animales de granja (gene knock out) y/o la inserción de genesespecíficos en regiones transcripcionalmente activos del genoma, favoreciendoaltos niveles de expresión de la proteína de interés.En la tabla 1, se indican algunas especies en las que se han obtenido animalestransgénicos:Tabla 1. Animales transgénicosANIMALES TRANSGÉNICOSMAMÍFEROS AVES PECESRatónRataConejoVacunoCerdoOvejaCabraPolloCodornizSalmónTruchaTilapiaCarpaPez gatoMedakaDorada( revisiones por Clark et al., 1987; Chen y Powers, 1990; Bialy, 1991; Sangh, 1994;Velander et al.,1997)40

Por su especial importancia, en lo que sigue solamente se hará referencia a laobtención y utilización de animales transgénicos en especies de mamíferos devalor económico. Mamíferos transgénicos. Como se indicaba anteriormente, las investigacionesllevadas a cabo a principio de los años ochenta no fueron más que el lanzamientode una serie ininterrumpida de avances, tanto en la investigación básica como enla utilización práctica de los animales transgénicos. En el cuadro adjunto seincluyen los principales hitos relacionados con la obtención y desarrollo de losmamíferos transgénicos:Tabla 2. Mamíferos transgénicos.MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS: ANTECEDENTES Y CRONOLOGÍA1938: Spemann propone experimento de transferencia nuclear1949: Hammond mantiene embriones de ratón en cultivo in vitro1961: Tarkowski obtiene ratones quiméricos agregando embriones1966: Lin describe la técnica de microinyección de embriones de ratón1980: Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones transgénicos pormicroinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón1981 Gordon y Ruddle obtienen ratones transgénicos por microinyección deADN en el pronúcleo de cigotos de ratón1981: Evans y Kaufman obtienen células embrionarias totipotentes de ratón1982: Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediantetransgenes de la hormona del crecimiento de la rata1983 Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediantetransgenes de la hormona de crecimiento humana1983: McGrath y Solter desarrollan una nueva técnica para experimentos detransferencia nuclear en ratón1985: Hammer y col. obtienen animales de granja transgénicos (conejos,ovejas, cerdos) con el transgén de la hormona del crecimiento humano1987: Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout porrecombinación homóloga1989 Clark y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano del factorIX de coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en elpronúcleo del cigoto1991 Wright y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano de la -1-antitripsina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo decigotos1991 Ebert y col. obtienen cabras transgénicas con el gen AtPH humano(activador tisular de plasminógeno) mediante microinyección de ADNen pronúcleo de cigoto1991 Krimpenfort y col. obtienen vacas transgénicas con el gen humano dela lactoferrina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de41

cigotos1993: Nagy y Rossant obtienen ratones quiméricos por co-cultivo deembriones1993: Schedl y col. obtienen ratones transgénicos con cromosomasartificiales de levaduras1994: Brinster y col. obtienen ratones transgénicos por transplante deespermatogonias1996: Campbell y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear decélulas embrionarias en cultivo1997: Wilmut y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear decélulas diferenciadas fetales y adultas en cultivo1997: Schnieke y col. obtienen ovejas clónicas transgénicas por transferencianuclear a partir de células fetales diferenciadas1998: Cibelli y col. obtienen vacas clónicas transgénicas por transferencianuclear a partir de células fetales diferenciadas1999 Baguisi y col. obtienen cabras transgénicas por transferencia nuclear1999 Yanagimachi y col. obtienen ratones transgénicos mediante la coinyecciónde cabezas de espermatozoides y ADN exógeno( revisiones por Clark et al., 1987; Chen y Powers, 1990; Bialy, 1991; Sangh, 1994;Velander et al.,1997) Métodos de transformación genética en animales Transformación genética mediante el uso de vectores retrovirales. Contrario ala percepción de muchos, los primeros animales transgénicos fueron producidoshace ya casi 30 años mediante la microinyección de ADN viral (SV40) en lacavidad del blastocele de embriones de ratón (Jaenish y Mintz, 1974). Lospróximos intentos involucraron embriones de ratón infectados con el retrovirusMoloney de la leucemia murina (MoMuLV), lo que resultó en la transmisión establehacia la línea germinal (Jaenish, 1976). Esto se logró reemplazando genes que noson esenciales para el virus por genes heterólogos, aprovechando así lacapacidad de los virus de infectar un amplio espectro de células y con una graneficiencia. Una de las grandes desventajas de este método radica en que laintegración del ADN se produce en diferentes etapas del embrión en desarrollo, loque implica que el ADN no se integra en todas las células somáticas o en la líneagerminal y por lo tanto no hay transmisión del transgen a la descendencia.Además, los animales generados por este método tienen a menudo más de unsitio de integración, lo cual ocurre cuando más de una célula del embrión esinfectada por el virus (Palmiter y Brinster, 1985). Esto implica que las líneas deratones transgénicos deben ser cruzadas para segregar los diferentes lociconteniendo el transgen y poder así aislar líneas con un sitio de inserción único.Finalmente, los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN42

foráneo que puede ser acomodado, alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita muchosexperimentos especialmente con secuencias genómicas humanas que puedensuperar ampliamente este tamaño. Transformación genética mediante microinyección pronuclear. En la década del80 ocurrió un importante avance en la tecnología de animales transgénicos quemarcó el curso de la investigación en este campo por al menos dos décadas.Gordon y colaboradores describieron una técnica donde el ADN desnudo fueinyectado en el pronúcleo de un ovocito de ratón recientemente fertilizado, el queposteriormente se transfirió a hembras receptoras sincronizadas (Gordon y col.,1981). Este experimento demostró que era posible usar un plásmido recombinantecomo vector para transferir genes foráneos directamente hacia el embrión. El ADNinyectado de esta forma se integró en el genoma y pudo ser heredado por ladescendencia de los animales transgénicos fundadores. La inyección deembriones al estado de una célula fue clave para obtener una integracióntemprana del transgen, permitiendo al ADN foráneo contribuir en el genoma detodas las células somáticas y la línea germinal. En ciertos casos la integración deltransgen también ocurrió después de la primera división del zigoto, lo que resultóen animales fundadores mosaicos. Estos animales mosaicos aún transmiten eltransgen a la descendencia pero lo hacen a una frecuencia menor al 50%.Desgraciadamente, la eficiencia para generar animales transgénicos utilizandoesta tecnología es baja, particularmente en animales de granja. La eficiencia de lainyección pronuclear está controlada por una serie de factores como quedarademostrado por los trabajos de Brinster y colaboradores, quienes entregaronvaliosa información sobre la integración de los transgenes y permitieron establecerque la concentración y la forma (circular o linear) del ADN eran los factores máscríticos para una eficiente integración (Brinster y col., 1985). No se encontrarondiferencias significativas cuando el pronúcleo femenino o masculino era utilizadopara la inyección, aunque este último es preferido por ser más grande. Por otrolado, el cruzamiento de ratones híbridos (por ejemplo C57BL x SJL) fue másexitoso en la producción de animales transgénicos que las líneas cosanguíneas(C57Bl x C57Bl). El descubrimiento de la inyección de pronúcleos como un nuevométodo para modificar el genoma de los animales revolucionó la forma en que losinvestigadores pudieron analizar la expresión de los transgenes y pavimentó elcamino para la generación de los primeros animales transgénicos de granja haceya 18 años (Hammer y col., 1985). Desde entonces, la tecnología ha sidoimplementada con éxito en la mayoría de los animales domésticos como enconejos (Buhler y col., 1990), ovejas (Wright y col., 1991), cabras (Ebert y col.,1991), vacas (Krimpenfort y col., 1991) y cerdos (Wall y col., 1991). Sin embargo,además de los problemas asociados con la integración de los transgenes hayineficiencias asociadas con la recolección, cultivo de los huevos fertilizados ytransferencia de los embriones hacia las hembras receptoras. Otros factores comoel largo período de gestación y el bajo número de animales por generación,sumado al costo extra de cuidado de los animales, han contribuido a la lenta43

adopción de estas tecnologías, especialmente en los países menos desarrollados.Los primeros estudios realizados en animales de granja se enfocaron hacia el usode genes que controlan la productividad del animal, por ejemplo genes de lahormona del crecimiento para incrementar la tasa de crecimiento y la eficiencia deconversión (Pursel y Rexroad, 1993). Estos estudios mostraron los problemas dela inyección pronuclear con relación al control de los niveles de expresión deltransgen. Se encontró una gran variación de expresión en las líneas de animalestransgénicos generados, siendo ésta en general muy pobre, especialmente si notodos los elementos reguladores del transgen eran incluidos en la construccióngenética (plásmido). Esto llevó a que muchos investigadores dedicaran mayoresesfuerzos a entender la forma en que los transgenes se insertan en el genoma delanimal y los factores que afectan la expresión de los mismos. Esto explica por quéla mayoría de los experimentos dirigidos a alterar la composición de la leche hansido realizados principalmente en el ratón, aunque existen algunas notablesexcepciones tales como la secreción de proteínas de valor terapéutico como elfactor IX de la coagulación en la leche de ovejas (Wright y col., 1991), el activadorde plasminógeno de tejido en la leche de cabras (Ebert y col., 1991) y la lisozimahumana en la leche de bovinos (Krimpenfort y col., 1991). Sin embargo, dada labaja eficiencia de esta tecnología (Clark y col., 1994), sumado a los costosinvolucrados, es que ha habido una búsqueda constante por nuevas alternativas.Así, la manipulación de las células madre embrionarias de ratón (ES cells)apareció como una potencial solución para muchos de los problemas encontradoscon la técnica de microinyección pronuclear. Transformación genética mediante recombinación homóloga en células madreembrionarias (ES cells). El aislamiento de células madre embrionarias de ratón,en 1989, abrió nuevas posibilidades para estudiar la función génica en animalestransgénicos (Thompson y col., 1989). Las células madres embrionarias seobtienen desde el macizo celular interno de blastocistos y se pueden mantener encultivos sin perder su estado indiferenciado gracias a la presencia en el medio decultivo de factores inhibitorios de la diferenciación. Estas células pueden sermanipuladas in vitro vía recombinación homóloga, permitiendo así alterar lafunción de genes endógenos. Las células así modificadas pueden ser entoncesreintroducidas en blastocistos receptores contribuyendo eficientemente a laformación de todos los tejidos en un animal quimérico incluyendo la línea germinal(Evans y Kaufman, 1981; Martin, 1981). Esta tecnología posibilita modificacionesgenéticas muy finas en el genoma del animal, tal como la introducción de copiasúnicas de un gen. La incorporación de una copia única de un gen en un sitiopredeterminado del cromosoma tiene las ventajas de permitir controlar el númerode copias del transgen y se puede controlar la inserción de este en un sitiofavorable (transcripcionalmente activo) para su expresión tejido-específica.Utilizando esta tecnología ha sido posible anular la función de genes endógenosdel ratón mediante la integración de un marcador de selección, lo que ha permitido44

la generación de varios cientos de ratones llamados knock out que han servidocomo modelos de enfermedades genéticas en humanos y como modelos paraanalizar la función de genes endógenos (Melton, 1994; Shastry, 1998; Kolb y col.,1999; Wallace y col., 2000). Lamentablemente, la generación de animalesmodificados genéticamente a través de esta ruta ha sido limitada sólo al ratón,fundamentalmente por la imposibilidad de aislar células madre embrionarias deotras especies que conserven la capacidad de totipotencialidad que caracteriza aestas células (Clark y col., 1992; Niemann y Reichelt, 1993; Cibelli y col., 1998).Aunque células parecidas a las células madre embrionarias (ES-like cells) hansido descritas en otras especies (lo que ha contribuido a la formación de vacas ycerdos quiméricos a partir de ellas), en ningún caso se ha demostrado que puedantransmitir las modificaciones a su descendencia, lo cual ha impedido elestablecimiento de líneas de animales transgénicos a través de esta ruta(Niemann y Reichelt, 1993; Cibelli y col., 1998). Transformación genética mediada por semen. En 1989 Lavitrano y col.describieron la producción de ratones transgénicos mediante inseminaciónartificial, utilizando semen que había sido incubado con ADN exógeno. Aunqueatractivo por su simplicidad, este procedimiento ha sido muy cuestionado por supoca reproducibilidad, ya que a pesar de los esfuerzos de los principaleslaboratorios del mundo estos experimentos no pudieron ser repetidos en el ratón(Brinster y col., 1989). Más recientemente, el mismo grupo clama haber producidocerdos transgénicos con una muy alta eficiencia de 54-60% (Lavitrano y col.,1997); sin embargo, la integridad del transgen no fue analizada y otros estudiosdemuestran que el ADN internalizado por esta ruta sufre re-arreglos yrecombinación con el ADN genómico, lo que dificulta la formación de líneas deanimales transgénicos con niveles de expresión estable (Zoraqi y Spadafora,1997). Transformación genética mediante transformación de células somáticas ytransferencia nuclear (clonación). La transferencia nuclear se describió porprimera vez en 1952 en anfibios y consiste en extraer el material genético de unovocito para posteriormente introducirle el material genético de una célula delanimal a clonar. Los trabajos pioneros de Briggs y King (1957) demostraron quelos núcleos de células al estado de blastocisto eran capaces de dirigir el desarrolloembrionario normal de ovocitos reconstituidos y generar una rana adulta a partirde estas células. En la década de los ochenta se realizaron exitosamentetransferencias nucleares en la mayoría de los mamíferos como conejos (Stice yRobl, 1988), cerdos (Prather, y col., 1989), bovinos (Prather y col., 1987) y ovejas(Willadsen, 1986; Smith y Wilmut, 1989). Estos experimentos se realizaron pormedio de la disociación de blastómeros embrionarios (células embrionarias nodiferenciadas) y su posterior transferencia nuclear. Sin embargo, los intentos porrealizar transferencia nuclear con células más diferenciadas fueron infructuosos, loque llevó a pensar que el ADN de células diferenciadas no podía reprogramarse,45

surgiendo entonces el dogma de que el proceso de diferenciación celular erairreversible. Este dogma se derrumbó el 27 de febrero de 1997, fecha en que IanWilmut y sus colegas del Instituto Roslin, en Edimburgo, Escocia, explicaron en larevista Nature cómo habían creado a la oveja Dolly. Dolly fue el resultado de lafusión de un núcleo procedente de una célula mamaria extraída de una ovejaadulta con un óvulo al que previamente se le había extraído el material genético(proceso conocido como enucleación). El equipo escocés demostraba así que lascélulas adultas y especializadas podían ser reprogramadas. La etapa clave deeste proceso fue la coordinación del ciclo celular de la célula receptora y el de lacélula donante de núcleos que se logró mediante la deprivación de suero de estasúltimas (Campbell y col., 1996; Wilmut y col., 1997). La deprivación de suero,previo a la transferencia nuclear, induce a las células a salir del ciclo decrecimiento y entrar en un estado de arresto celular o quiescencia (G0/G1 en elciclo celular), que se ha propuesto potenciaría el desarrollo embrionario,permitiendo a los factores en el ooplasma reprogramar el núcleo donante(Campbell y col., 1996). Siguiendo los hallazgos de Campbell y Wilmut muchosgrupos han reproducido exitosamente estos experimentos (Schnieke y col., 1997;Wells y col., 1997; Baguisi y col., 1999; Zakhartchenko y col., 1999a; Reggio y col.,2001), con la excepción de un grupo en Estados Unidos, quienes hanrecomendado el uso de células proliferando activamente, esto es, células en G1en el ciclo celular en vez de deprivadas de suero (Cibelli y col., 1998). Sinembargo, ninguno de estos estudios comparó directamente la eficiencia de ambostratamientos para producir animales clonados y estudios recientes, utilizandofibroblastos fetales, han demostrado que la inducción del estado de quiescenciaen las células mejora significativamente el desarrollo a la etapa de blastocistocomparado con células proliferativas, aunque no se evaluó la tasa de éxito de latransferencia de estos embriones en receptoras sincronizadas (Hill y col., 2000;Zakhartchenko y col., 1999b). Problemas de la transgénesis. La introducción de una nueva informacióngenética (el transgén) dentro del genoma de un organismo puede presentaralgunos problemas en relación a dónde y cuándo expresar el transgén, tal comose indica a continuación:- Integración múltiple (en tándem o no)- Lugar de integración indeterminado (efecto de posición)- Metilación y falta de expresión- Mosaicismo (germinal y somático)- Expresión específica/ectópica- Expresión variable- Expresión variable dentro de líneas (variegación)46

En cualquier caso, el ideal sería poder dirigir con total precisión el lugar deintegración del transgén. Así, por ejemplo, en 1999 se obtuvieron en el RoslinInstitute de Edinburgo las ovejas transgénicas “Cupid” y “Diana” a partir de laclonación de cultivos celulares modificados mediante recombinación homóloga(“gene targeting”).- Potenciales usos de la tecnología de transferencia nuclear y recombinaciónhomologa en producción animal- Clonación de animales elite. Además de proporcionar una ruta para lageneración de animales transgénicos, la transferencia nuclear podría utilizarsepara realizar la imagen más popular de la clonación, esto es, la producción decantidades ilimitadas de animales genéticamente idénticos. La posibilidad demultiplicar razas de animales seleccionados podría aumentar la eficiencia de laproductividad pecuaria. Sin embargo, la principal ventaja de la clonación no seríaen los programas de selección, sino en la diseminación más rápida del progresogenético desde rebaños elite hacia los productores. Hasta la fecha esto se havenido realizando mediante la inseminación artificial, la cual suministra sólo lamitad de los genes. Con la clonación, los productores que pudieran pagar esteservicio recibirían embriones que serían clones de las vacas más productivas delos rebaños elite, con lo que incrementarían la performance de sus rebaños en tansólo una generación. En este escenario las empresas venderían embrionesclonados de la misma forma en que hoy comercializan el semen. Estos embrionestendrían la ventaja de un transporte más fácil de los genotipos entre países,evitándose los inconvenientes de la cuarentena. Un potencial riesgo de estapráctica estaría en la posibilidad de pérdida de diversidad genética; sin embargo,esto se podría evitar restringiendo la venta de un número limitado de clones decada genotipo a cada productor. Aunque los rebaños de algunos productorespudieran consistir sólo de animales clonados, el hecho de que estos fueran clonesde diferentes animales elite incrementaría la diversidad genética en estos predios.- Conservación genética. Aunque la transferencia nuclear se asocia en la mentede la gente con una pérdida de la diversidad genética, esta técnica tambiénproporciona nuevas alternativas para la conservación genética. Con una cada vezmás creciente presión comercial, muchas razas indígenas o criollas adaptadas alas condiciones locales (a modo de ejemplo la raza Overo Negro en nuestro país)están siendo reemplazadas por razas comerciales sujetas a sistemas intensivosde producción. Estas razas locales pueden contener importantes genes queconfieran resistencia a enfermedades y resistencia a las condiciones climáticas(frío/calor). Hay, por tanto, una urgente necesidad por prevenir su extinción. Losmétodos actuales de conservación consisten en almacenar semen o embrionescongelados, procesos que son largos y costosos. Como consecuencia, el futuro desólo unas pocas razas está asegurado. La tecnología de clonación puede47

proporcionar una forma más simple y efectiva de conservar estas razas, porcuanto muestras de sangre, biopsias de piel o incluso pelo pueden ser utilizadascomo fuentes de células que podrían ser crecidas brevemente en el laboratorio,mantenidas y congeladas mediante su almacenamiento en nitrógeno líquido paraser luego utilizadas en experimentos de transferencia nuclear. El mejor ejemplodel potencial de esta tecnología lo demuestran los recientes experimentos endiversas especies en peligro de extinción mediante transferencia nuclearinterespecies (Lanza y col., 2000; Kitiyanant y col., 2001; Loi y col., 2001; Lee ycol., 2003).- Eliminación de genes (gene knock out). La posibilidad de recombinaciónhomóloga (gene targeting) en células somáticas previo a la transferencia nuclearha captado la atención de las principales compañías biotecnológicas que deseancapitalizar los frutos de esta tecnología (Pollock y col., 1999; Reggio y col., 2001).La modificación genética que conduce a la pérdida de función de un gen, o máscomúnmente conocida como gene knock out, ha sido utilizada extensivamente enel ratón para obtener un mayor entendimiento de la función génica y como modelopara ciertas enfermedades (Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).Actualmente existe una gran carencia de órganos para trasplantes humanos queno es cubierta por las donaciones. El trasplante de órganos de animales haciahumanos (xenotrasplantes) podría ser la solución. Sin embargo, existen muchasbarreras de rechazo entre especies que limitan su uso. La principal barreraconsiste en el fenómeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia deanticuerpos naturales contra epítopes del disacárido galactosa 1-3 galactosapresente en las superficies celulares de mamíferos, pero que estarían ausentes enlas superficies celulares de humanos y monos (Gallili y col., 1985). Este es uno delos principales usos donde la tecnología de recombinación homóloga acoplada contransferencia nuclear está siendo explotada. La reciente generación de cerdostransgénicos en los que se eliminó el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitiríala producción de animales que carecen del epítope responsable del rechazohiperagudo, es una clara demostración del poder de esta tecnología (Phelps y col.,2003).Otra de las aplicaciones de esta tecnología está en la creación de animalesresistentes a ciertas enfermedades. Las enfermedades ocasionadas por prioneshan tenido un enorme impacto económico en algunos países de Europa y lautilización de productos animales para su uso en humanos es una preocupaciónconstante. Este es el caso de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) o máscomúnmente conocida como enfermedad de las vacas locas que sería la causa deuna nueva forma de enfermedad de Creuzfeldt Jacob en humanos denominadavCJD (Hill y col., 1997). Experimentos realizados en ratones (Prusiner y col., 1993)y más recientemente en ovejas (Denning y col., 2001), demuestran que es factibleeliminar el gen para los priones (PrP) mediante recombinación homóloga y que losanimales producidos son resistentes al Scrapie. Dado que las ovejas y vacas48

están siendo utilizadas para producir proteínas humanas de uso farmacológico yque estos animales poseen genes funcionales PrP, sería apropiado producirpoblaciones de animales resistentes a estos priones.La tecnología de recombinación homóloga ha sido ampliamente utilizada en elratón para producir varios modelos de enfermedades humanas. Sin embargo,debido a las diferencias fisiológicas sería más apropiado disponer de modelosanimales que se asemejen más al humano. Este es el caso del modelo parafibrosis quística creado en el ratón, donde se eliminó el gen Cftr (Cystic fibrosistransmembrane responder). Este modelo no presentó las características típicas dela enfermedad en humanos debido a las diferencias en la fisiología del pulmón delratón (Davidson y col., 1995). La eliminación del gen Cftr en la oveja se esperaríaprodujera un modelo animal para fibrosis quística más exacto debido a lassimilitudes de la fisiología pulmonar entre ovejas y humanos (Harris, 1997).Las modificaciones en los animales que pudieran influir rasgos de producción talescomo el crecimiento y la eficiencia de alimentación son uno de los principalesobjetivos en el mejoramiento animal. Ratones en donde el gen de la miostatina seeliminó mediante recombinación homóloga desarrollaron mayor musculaturaesquelética que los controles no modificados (McPherron y col., 1997). Además, elfenotipo de doble musculatura de algunas razas bovinas, por ejemplo BelgianBlue, ha sido asociado a modificaciones (mutaciones naturales) del gen de lamiostatina (Grobet y col., 1997). Por lo tanto, la eliminación de este gen enbovinos, ovejas y cerdos podría producir animales con mayor masa muscular, locual sería de enorme importancia económica. Tal es así que actualmente existeuna empresa biotecnológica en USA (http:// www.prolinia.com) cuyo objetivo esproporcionar la clonación a los mejoradores de razas registradas, para luegomediante ingeniería genética proveer a estas razas elite de característicasdeseables como la mutación para el gen de la miostatina.Otra característica productiva que se podría mejorar a través de esta tecnología esla leche. La leche aporta cerca del 30% de las proteínas consumidas en los paísesdesarrollados. Por esta razón, la lactancia ha sido objeto de diversos estudios enel campo de genética, fisiología y nutrición. La recombinación homóloga podría serutilizada para reemplazar genes de las proteínas de la leche de los animales degranja con la respectiva contraparte de los genes humanos para utilizarlos comofuentes de proteínas. Por ejemplo, la seroalbúmina humana es utilizadaampliamente para el tratamiento de quemaduras y como reemplazo de fluidoscorporales en cirugía. La escala de requerimiento de esta proteína (~ 600toneladas al año) la hacen un muy buen candidato para su producción a escalacomercial en la leche de vacas transgénicas. Desafortunadamente, laseroalbúmina bovina es muy similar a la humana, lo que genera problemas parasu purificación. Una solución sería reemplazar el gen bovino con su contrapartehumana, así la proteína bovina sería eliminada sin alterar o comprometer la49

viabilidad del animal. Otro ejemplo lo constituye la ß-Lactoglobulina que estápresente sólo en la leche de rumiantes y no tiene una función conocida en elproceso de secreción de leche (Clark y col., 1998). Su presencia confiere algunaspropiedades de elaboración indeseadas y se cree es la responsable de la mayoríade las alergias a la leche bovina, situación que afecta a una considerable parte dela población mundial. Por lo tanto, la eliminación de esta proteína podríaproporcionar nuevas propiedades tecnológicas a la leche (Richardson, 1985).Además, su eliminación no sólo ayudaría con el problema de las alergias, sino quetambién, debido a la compensación que se produciría en la concentración de lasotras proteínas de la leche, probablemente incrementaría la concentración decaseínas, lo que tendría un efecto directo para la industria quesera. De la mismaforma, la sobreexpresión de caseínas en la leche se esperaría que alterarasignificativamente las propiedades tecnológicas de la misma como fuerademostrado recientemente por Brophy y col., (2003) y la expresión de proteasaspodría generar resistencia a enfermedades de gran impacto en el sector lecherocomo la mastitis (Kerr y col., 2001).- Aplicaciones de la transgénesis. La biotecnología incluye “cualquier técnica queutilice organismos vivos o parte de los organismos para fabricar o modificarproductos, mejorar plantas, animales o desarrollar microorganismos para usosespecíficos” (Rodríguez-Villanueva, 1986).La potencialidad de la biotecnología estriba en producir cantidades ilimitadas de: Substancias de las que nunca se había dispuesto con anterioridad Productos que se obtenían en pequeñas cantidades Abaratamiento de los costes de producción Mayor seguridad en los productos obtenidos Nuevas materias primas, más abundantes y menos carasDentro de este contexto general, la Biotecnología ha incorporado la transgénesisanimal con los fines que se indican a continuación: Mejora de caracteres productivos Resistencia a enfermedades Modelos animales de enfermedades humanas (por ejemplo, ratones knockout) Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de proteínas de altovalor (proteínas terapéuticas): Las “granjas farmacéuticas” o “granjasmoleculares” Donación de órganos: Xenotransplantes- Las granjas farmacéuticas. La Biotecnología ha aplicado estas técnicasexperimentales de transgénesis y ya hoy se están estableciendo las primeras50

granjas farmacéuticas en las que se crían ovejas, cabras, vacas o cerdostransgénicos que producen en su leche proteínas terapéuticas humanas (Velander et al., 1997).La manipulación genética de un mamífero doméstico transgénico consiste, enprimer lugar, en preparar el fragmento de ADN que contiene el gen humano,uniéndolo a otro fragmento de ADN correspondiente a un elemento regulador(promotor) procedente de un gen que promueve la síntesis de una proteína de laleche (por ejemplo, la -lactoglobulina, la caseína, etc.). De esta manera seasegura que el gen humano sólo se expresará en las células de las glándulasmamarias del animal transgénico (oveja, cabra, vaca, cerdo) obtenido tras lainyección del ADN manipulado en el pronúcleo masculino de un cigoto producidopor fecundación in vitro. Sin embargo, actualmente, la utilización de la técnica declonación por transferencia de núcleos de células genéticamente modificadasresulta más ventajosa. Con esta última técnica, los investigadores del RoslinInstitute de Edinburgo obtuvieron por vez primera en 1997 ovejas transgénicasprocedentes de núcleos de fibroblastos fetales a los que se les había introducidoel gen humano que codifica para el factor IX de coagulación de la sangre(Schnieke et al., 1997). Los resultados de estos autores demostraron además quela utilización de la técnica de clonación de los núcleos modificados genéticamentees mucho más eficaz que la técnica original de microinyección de ADN en lospronúcleos de los cigotos.Posteriormente, con estas técnicas se ha conseguido que la leche de las hembrastransgénicas contenga también otras proteínas terapéuticas humanas (-1-antitripsina, proteína C, factor VIII de coagulación, antitrombina III, etc.) quepueden luego ser fácilmente separadas de las restantes proteínas propias delanimal. Además es importante señalar que el animal transgénico no se veperjudicado en su desarrollo porque el gen humano sólo se expresa en las célulasde las glándulas mamarias debido al regulador específico al que se le ha asociadoy, por tanto, en las restantes células del animal no se sintetiza la proteína humanaal estar silenciado el gen humano. En consecuencia, el animal doméstico ha sidoconvertido en un gran biorreactor sin perjuicio aparente para él.Las primeras granjas farmacéuticas fueron establecidas por compañíasbiotecnológicas como Pharmaceutical Proteins Ltd (PPL) en Escocia (1500ovejas), Genzyme Transgenics en Estados Unidos (1000 cabras), Gene PharmingEurope en Holanda (vacas), etc. Otros grupos de investigación son partidarios dela utilización de las granjas de cerdos transgénicos dado su corto tiempo degestación (cuatro meses), el intervalo generacional (un año) y el mayor tamaño delas camadas (10 a 12 lechones), teniendo en cuenta además que una cerdalactante produce unos 300 litros de leche al año.51

Las cifras económicas demuestran la importancia futura de las granjasfarmacéuticas: el mercado de proteínas terapéuticas, que actualmente se obtienenprincipalmente mediante fermentación o cultivo celulares, se estima en unos 7.600millones de dólares anuales y se calcula que podrá llegar a ser de 18.500 millonesde dólares el año 2000 (ver Postel-Vinay y Millet, 1997 para una versióndivulgadora de los experimentos de clonación y de animales transgénicos).Las cifras expresadas parecerían justificar las enormes inversiones que esnecesario hacer para obtener animales transgénicos, tal como se indica en elcuadro adjunto:Tabla 3. Producción de mamíferos transgénicos en diferentes especies.Animales transgénicosproducidosEspecie % % embrionesMesesparaCoste en $estimado deProteínaproduciddescendencia inyectados y obtener la cada animal a en latransferidos F2 transgénico leche(porlactación)Ratón 17,3 2,6 7,5 $ 121 1 gConejo 12,8 1,5 17 1 KgPorcino 9,2 0,9 38 $ 25.000Ovino 8,3 0,9 52 $ 60.000 100 KgBovino 3,6 0,7 100 $ 546.000 1.000 KgFuente: A. Sánchez Bonastre, 1999De la última columna del cuadro anterior se deduce el valor económico de losrebaños de animales transgénicos. Indicaremos a continuación algunasrealizaciones prácticas:- Xenotrasplantes. Desde que el Doctor Christian Barnard hiciera su primertrasplante de corazón, la técnica de trasplante de órganos se ha generalizado enla práctica médica, habiendo alcanzado altísimos niveles de perfección. Sinembargo, uno de los retos pendientes es el de la oferta y la demanda:desgraciadamente muchos pacientes mueren antes de tener acceso al trasplantedeseado. Por ello la posibilidad de recurrir a especies animales como donantes de52

órganos se planteó hace ya muchos años. De hecho, entre los años 1964 y 1995se han realizado 32 xenotrasplantes de riñón, corazón, hígado y médula óseaprocedentes mayoritariamente de chimpancé y mandril con un resultado negativoen todos los casos, tal como se indica en el cuadro adjunto:Tabla 4. Trasplantes de órganos de animales a humanos.TRASPLANTES DE ÓRGANOS DE ANIMALES A HUMANOSDonante Órgano Supervivencia Número de Autor AñotrasplantesChimpancé Riñón Un paciente,12 Reemtsma 1964nueve mesesMono mico Riñón 10 días 1 Reemtsma 1964Mandril Riñón 4 días y medio 1 Hitchcok 1964Mandril Riñón Un paciente, dos 6 Starzl 1964mesesChimpancé Corazón Extirpado 1 Hardy 1964Chimpancé Hígado Un paciente, 14 3 Starzl 1969-74díasMono Corazón Fracasó (sin1 Yacoub 1975datos)Mandril Corazón Rechazo agudo 1 Barnard 1977Chimpancé Corazón 4 días 1 Barnard 1977Mandril Corazón 3 semanas 1 Bailey 1985Mandril Hígado 70 días 1 Starzl 1992Cerdo Hígado 34 horas 1 Nakowka 1992Mandril Hígado 26 días 1 Starzl 1993Mandril Médula El paciente vive, 1 Deeks e 1995ósea pero eltrasplantefracasóIldstatFuente: Unidad de trasplantes del Total: 32Hospital General de Massachussetts,USALa utilización de órganos procedentes de monos tenía la lógica de su proximidadevolutiva con la especie humana, pero la diferencia de tamaños de los órganosentre las especies suponía un serio inconveniente. Por eso se pensó en el cerdocomo posible donante. Por otro lado, una causa importante del fracaso de losxenotrasplantes es el rechazo hiperagudo que se produce cuando el organismohumano reconoce la presencia del órgano de otra especie. De ahí surgió la ideade utilizar cerdos transgénicos como posibles donantes.53

Respecto a la utilización de cerdos transgénicos como reservorio de órganos paraposibles trasplantes (xenotrasplantes) de corazón, riñón o hígado a pacienteshumanos hay que ser todavía muy cauto en relación con las expectativas creadas.El primer paso que se ha dado ha consistido en la obtención de cerdostransgénicos capaces de expresar el antígeno regulatorio del complementohumano, evitando así el rechazo hiperagudo (Dr. David J.G. White, en Cambridge,en 1992). No obstante, quedan por resolver aún numerosos interrogantes, entreellos la posibilidad de que se transmitan al hombre infecciones virales de origenanimal (Le Tissier et al. 1997). De ahí la importancia que tendría la posibleutilización de cerdos transgénicos ante la demanda creciente de órganos y lascorrespondientes listas de espera. Para una revisión de los xenotrasplantes verLanza et al. (1997) y Cooper et al. (1997).- Aspectos bioéticos. En un contexto bioético quizá podría ser conveniente haceruna valoración general sobre lo que significa la introducción de genes humanos enorganismos no humanos. Habría que distinguir dos situaciones diferentes: laprimera, cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano sehace en beneficio del propio hombre, y la segunda cuando la transferencia del genhumano al organismo no humano se hace exclusivamente en beneficio (operjuicio) de este último.Desde el punto de vista bioético, la situación creada por la obtención demamíferos transgénicos portadores de genes humanos para la obtención deproteínas terapéuticas humanas no es esencialmente nueva ya que, desde losprimeros tiempos de la ingeniería genética molecular, se han introducido geneshumanos en células bacterianas para obtener proteínas humanas (insulina,hormona de crecimiento, interferón, etc.). Tanto en el caso de las bacterias comode los animales transgénicos que se convierten en factorías naturales(biorreactores) de proteínas humanas, la valoración ética es positiva. En esteúltimo caso es importante señalar además que, al quedar restringida la expresióndel gen humano a las células de la glándula mamaria, la fisiología y desarrollo delanimal no se ven alterados y por tanto se evita cualquier daño a éste, quedandoprotegidos así los derechos de los animales.En el segundo caso planteado, cuando la transferencia del transgén humano serealiza con el único propósito de influir en el desarrollo del animal, la valoraciónética puede ser negativa si se producen anomalías importantes en su fisiología,como ocurrió en los cerdos que habían incorporado el gen humano de la hormonadel crecimiento. Finalmente, en este contexto ¿podría decirse que algún genhumano concreto – en definitiva, un trozo de ADN – merecería un tratamiento ovaloración ética diferente al resto? La respuesta lógica sería negativa, so pena decaer en una sacralización del ADN humano.¿Cuál es la valoración ética de los xenotrasplantes? En primer lugar, habría quetener la garantía suficiente de que no hay problemas de transmisión viral. Aún54

sentada esta premisa, hay que reconocer que a muchas personas les repugna, enprincipio, la idea de que alguien pueda llevar un órgano animal. Sin embargohabría que recordar que desde hace mucho tiempo se realiza la implantación deválvulas de cerdo a personas con ciertas insuficiencias cardiacas y todo el mundoha aceptado esta práctica médica. Por otro lado, la existencia de prótesis dematerial inerte (plástico, metales, etc.) podría ser igualmente rechazado y no lo es.Ciertamente, desde el punto de vista ético parece que no habría razón pararechazar los xenotrasplantes en la medicina del futuro, siempre que se solucionentodos los aspectos técnicos – que son muchos – que aún quedan por resolver.2.3.2 Clonación. Después de la exitosa clonación de ovinos, bovinos y caprinosnumerosos laboratorios intentaron clonar cerdos. A pesar de los esfuerzos, enesta especie los resultados no fueron buenos inicialmente. Esto motivo quenumerosos grupos hayan continuado con la producción de cerdos transgénicospor microinyección pronuclear. Así se han generado cerdos con un incremento dela conversión alimenticia, originados por la introducción de la construccióncompuesta por metalotioneina + hormona del crecimiento (Nottle et al,.1999).Recientemente también se han obtenido cerdos destinados a aumentar laasimilación del fósforo y reducir la concentración de este elemento en las heces,mediante la expresión de la fitasa bacteriana en la glándula salivar de cerdos, estotendría beneficios al reducir la polución ambiental. La fitasa es una enzima quedesdobla el ácido fítico liberando el fósforo del mismo (Golovan et al., 2001).También se ha alterado la leche de los cerdos para incrementar la salud y eldesarrollo de los lechones esto se ha logrado sobreexpresando alfa-globulinabovina (Wheeler et al 2001). Estas técnicas de modificación genética se realizaronen estos trabajos basadas en la introducción del DNA foráneo por microinyecciónen la cigotas. Esta metodología es altamente ineficiente (1-2% de inserciónestable) y produce un alto grado de mosaiquismo debido a la inserción tardíadurante el desarrollo embrionario temprano.El primer cerdo producido por clonación de células somáticas fue producido en elaño 2000 (Polejaeva et al) desde esta fecha se han hecho importantes progresos.Entre ellos la producción del los primeros cerdos por incorporación de genes alazar (Park et al., 2000; Lai et al., 2001 y 2002). Si bien esta modificación aumentala eficiencia en la obtención de animales transgénicos, la integración del transgencontinúa siendo al azar, por lo cual la expresión del mismo es esencialmenteimpredecible. Para solucionar este problema se han estado reclonando losanimales con expresión adecuada (Salamone et al., 2004) para tener animales deproducción predecible, pero aun son necesarias futuras mejoras.La técnica de recombinación homóloga permite la modificación precisa de losgenes existentes, evita los problemas derivados de los efectos posiciónales y deinactivación por inserción y permite además la inactivación de genes específicosasí como el reemplazo de un gen por otro. La utilización de la técnica de55

ecombinación homóloga permite aplicaciones sumamente atractivas en el campode la producción animal (Piedrahita, 2000). En cerdos la transgénesis en sitioespecifico o recombinación homologa ha sido lograda exitosamente (Day et al.,2002; Lai et al., 2002; Ramsoondar et al., 2003; Sharma et al., 2003).Los cerdos son fisiológicamente similares a humanos y ha habido intenso interésen utilizarlo para transplante de órganos, así como, para modelo deenfermedades. La producción de órganos y tejidos animales humanizados paraser utilizados en transplante ha despertado también un interés enorme. Estoimplicará la expresión de ciertas proteínas humanas y el silenciamiento dealgunas proteínas de origen animal. Esto puede lograrse creando cerdos porrecombinación homologa mediante el llamado “knockout de la alfa-1,3-galactosiltransferasa”. La obtención de productos para transplantes es probableque se requieran sucesivas modificaciones genéticas.La expresión de proteínas de valor biológico especialmente de interésfarmacológico usando como biorreactores animales transgénicos, ha demostradoser un sistema muy eficiente de producción en numerosas especies. Laslimitaciones han sido el nivel de expresión, modificaciones post-transcripcionalesy el efecto biológico de las proteínas exógenas sobre el animal que las produce.Una vez que el animal fundador ha sido obtenido también es una limitante llegara tener un buen número de animales a escala comercial. En el porcino se haseleccionado las vesículas seminales como órgano de expresión de dichasmoléculas. Las ventajas que tienen dichas glándulas incluyen el hecho que elsemen luego de producida la pubertad, es generado constantemente y por lotanto también el fluido seminal, además se puede colectar en una forma noinvasiva, no dolorosa y que no requiere gran entrenamiento. Un cerdotransgénico puede producir por muchos años y ser reemplazado porreproducción simple en forma no muy costosa. El plasma seminal es unasecreción externa y una vez producida no es reabsorbida, es mas, el exceso desecreción prostática es eliminada por uretra a través de la orina. Esto permitiríaexpresar moléculas con fuerte actividad biológica y estaría ofreciendo ventajasfrente a la glándula mamaria donde ya se ha observado la reabsorción linfáticade proteínas secretadas. Por otro lado ha sido demostrado que en ratones a losque se le incorporo el transgen de la hormona del crecimiento para serexpresado en vesículas seminales, no se incrementan los niveles en sangre dedicha hormona cuando se llega a la pubertad. Incluso cuando se expresanniveles de 500 ug/ml en el fluido seminal (Sirad et al., 2002). Además losespermatozoides son muy sensibles a cambios de pH y a las proteasas y elfluido seminal esta preparado para proteger a los espermatozoides a través deanti-proteasas, esto es interesante porque probablemente sería posibleaprovechar esta característica para preservar proteínas frágiles. Las proteínasestán en el plasma seminal en forma soluble y no forman micelas como en laleche donde las proteínas pueden ser atrapadas en las mismas. Los56

espermatozoides pueden ser centrifugados y el plasma seminal diluido ypurificado usando todo tipo de columnas sin problemas de formación decoágulos.Los cerdos son una especie con una eficiencia reproductiva importante, unmacho heterocigoto puede inseminar unas 50 cerdas por mes utilizandoinseminación artificial y cada una de estas puede dar origen a 10 lechones, 5 delos cuales serán machos y 2-3 transgénicos, originando un grupo de 150lechones en 5 meses, por lo que al año habría un numero suficiente de machospara empezar a producir a escala industrial.A la pregunta ¿cuales serán sus aplicaciones agropecuarias en nuestro sistemade producción? La respuesta es que nuestra capacidad de imaginación einnovación es insuficiente. La aplicación más inmediata será la multiplicación deanimales de elite. La utilización de animales clonados facilitara la producción ydifusión de animales transgénicos. Por ejemplo, existe interés en Europa enreemplazar el gen PrP que torna a los bovinos susceptibles al virus de la vacaloca por otro que le otorgue mayor resistencia. Numerosas compañías ya hanproducidos animales transgénicos y clonados especialmente expresando nuevasproteínas en leche de valor farmacéutico (Baguisi et al., 1999, Salamone et al.2005). Hay proyectos que intentan producir cerdos modificados genéticamentepara producir semen de un solo sexo, o utilizar cerdos como modelo paraenfermedades humanas como la arteriosclerosis, etc. (Forsberg, 2005). Todoesto indica la enorme potencialidad de esta técnica y el futuro desarrollo quepueda alcanzar en la especie porcina.- Técnicas de clonación de embriones. Con base en los conceptos de laclonación descritos anteriormente, se observa que existen tres técnicas que hansido utilizadas en animales de granja o de laboratorio para producir embrionesgenéticamente idénticos. Dos de ellas cabrían en el concepto de la clonación enun sentido horizontal: la partición o división de embriones por microcirugía, y laseparación y cultivo de blastómeros aislados por métodos enzimáticos omecánicos (Agca y col 1998; Rexroad y Powell 1997). La tercera entra en elconcepto de la clonación en un sentido vertical: la transferencia nuclear a partir decélulas somáticas de adulto o embrionarias (Campbell y col 1996) o deblastómeros de embriones (Prather y col 1987; Savoir y col 1997; Tanaka y col1997) entre otras células (Tabla 5).57

Tabla 5. Principales Tipos de Celulares Utilizados en las Técnicas deClonación.METODOLOGIATIPOS CELULARESa) Partición de Embriones Mórulas o blastocitostempranos o tardíos (15,38).b) Separación y cultivo deblastómeros aisladosc) Transferencia nuclear Blastómeros de embriones endiferentes etapas, desde 2células hasta mórulacultivándose in Vitro fuera odentro de la zona pelúcida(65,66,67). Partenogenotes (ovocitosactivados químicamente paradividirse) para reagregarblastómeros. (52,68). Como carioplastos (célulasdonadoras de núcleos). Como citoplastos (célulasreceptoras de núcleos) Blastómeros obtenidos deembriones con diferentesetapas de segmentación(desde 2 células hastablastocitos) (52,69) Células somáticas deembriones (fotroectodermo omasa celular interna o MCI,fibroblastos fetales células deriñón, piel, músculo, gandulamamaria, y células cúmulo oespermatogenias de animalesadultos(3,4,15,39,44,54,70,71,72) Ovocitos enucleados Cigotos Embriones de 2 blastómeros(19,54,71)- Partición o división de embriones. En la década de los 70 se pensaba que losembriones en fases tempranas de la segmentación no sobrevivirían después deuna microcirugía. Fue en los años ochenta cuando se demostró que las mórulas yblastocistos de los animales domésticos eran capaces de desarrollarse despuésde una partición y producir nacimientos viables (Rorie y Godke 1987). Actualmente58

la partición de embriones permite la producción de gemelos idénticos al dividir elembrión original por métodos microquirúrgicos. Las evidencias experimentalesindican que existe una relación inversa entre el número de secciones que se lehagan al embrión y el porcentaje de éxito. Las tasas de producción de gemelosmonocigóticos van desde poco mas de 30% en bovinos y ovinos (Edwards yBeard 1998; Herman y col 1998; Williams y col 1983) siendo hasta casi 70% enbovinos, con porcentajes de gestación superiores a 60% (14) e incluso, en algunoscasos, equivalentes a 100% (Williams y col 1983).El número de células que tenga el embrión no solo limita el número de segmentosen que pueda dividirse, sino que también tiene incidencia sobre otros aspectos.Típicamente se utilizan embriones en etapa de mórula o blastocisto (Baker 1985;Seidel 1993). Esta estrategia permite utilizar una de las secciones para otros finesexperimentales como la determinación del sexo del embrión, mientras que el restose cultiva o congela para después transferirse a hembras receptoras previamentesincronizadas para mantener la gestación (King y col 1992; Schmidt y col 1992;Palma y col 1995).Los embriones en etapa de blastocisto son seccionados de manera que se dividanen dos partes iguales tanto la masa celular interna (MCI como el trofoectodermo).Es recomendable emplear soluciones que deshidraten ligeramente al embrión (porejemplo, sacarosa 200mM), con lo que se reduce el daño al trofoectodermodurante su partición. Una vez cortadas, las mórulas compactas y los blastocistosno necesariamente deben ser introducidos a zonas pelúcidas, teniendo unasobrevivencia aceptable al ser transferidas en hembras receptoras; aunqueexisten informes que indican tasas de supervivencia de 15% en medios embriones(demi-embriones) sin zona pelúcida y de 35% cuando se transfieren con zonapelúcida. En este último caso las tasas de gestación van de 55% a 65% enbovinos (Baker 1985). Willadsen y Godke en 1995, obtuvieron tasas de gestaciónde 80% en bisecciones de embriones de ovino indistintamente si tenían zonapelúcida o no. En la tabla 6 se muestran algunos de los factores principales queafectan las tasas de éxito con esta técnica.- Separación y cultivo de blastómeros aislados. En algunas especies, como losequinos, se ha utilizado la separación de blastómeros de embriones previos a suimplantación para efectuar estudios de diagnóstico de enfermedades genéticas.En ellos se ha determinado la viabilidad de los embriones analizados después desu transferencia en hembras receptoras, encontrándose tasas de gestación de21% (Huhtinen y col 1997).En humanos la separación y cultivo de blastómeros aislados también han sidoutilizados en estudios de biopsias de embriones en diferentes etapas desegmentación con la finalidad de dar alternativas a los estudios de diagnósticoprenatal, evaluando a su vez el desarrollo embrionario in vitro con el propósito deque se seleccionen los mejores embriones capaces de desarrollarse en59

lastocistos y congelarlos mientras se evalúan sus blastómeros aislados (Geber ycol 1995; Pierce y col 1997; Geber y Sampaio 1999).La técnica de separación de los blastómeros implica la remoción de la zonapelúcida, ya sea por métodos químicos, mecánicos o enzimáticos, paraposteriormente obtener los blastómeros mediante aspiración, extrusión odisminución de sus interacciones en soluciones libres de Ca2+ y Mg2+ (Savoir ycol 1997; Saito y Niemann 1991; Cheong y col 1993; Reicheit y Niemann 1994).Los blastómeros de rata aislados en la etapa de dos células, son capaces deformar embriones completos (Matsumoto y col 1989). En el ratón se han obtenidogemelos idénticos removiendo la zona pelúcida de embriones de dos células ycultivándolos separadamente previo a su transferencia (Williams y col 1984). Enotras especies, el éxito del experimento se ha determinado como dependiente dediversos factores. Así, por ejemplo, en porcinos y ovinos la baja eficiencia en laobtención de fetos se debe a la baja sobrevivencia in vivo.En embriones libres de zona pelúcida en fases previas a la compactación(Williams y col 1984). Esta tasa de nacimientos puede aumentarse si se utilizanembriones encapsulados en gel de azarosa (Herman y col 1998; Lehn-jensen y col1983). De manera que algunas estrategias para suplir a la zona pelúcida son elempleo de capsulas artificiales de azarosa (Willadsen 1979) o de alginato de sodio(Eaton y col 1990; Adaniya y col 1993), o matrices extracelulares como lafibronectina y laminina (Saito y niemann 1991; Wilton y Trounson 1989).EI número de células que forman al embrión separado constituye otro factorimportante en la probabilidad de éxito. Willadsen en 1989, demostró que la tasa degestación en ovinos y bovinos se reducía conforme se hacían grupos de célulasde números menores. La mayor tasa de gestación que obtuvo este autor fue del66% al utilizar embriones de dos células o dos grupos de células provenientes deembriones de hasta ocho células. Cuando utilizó embriones de cuatro células opares de células de embriones de ocho células, la tasa de gestación se redujo a50%. Cuando se utilizaron los blastómeros individuales provenientes de embrionesde ocho células, la tasa de gestación fue de sólo 5%. En todos los casos en losque se separaron las células embrionarias, el número de células formando elblastocisto se reducía linealmente con el número de "divisiones" a la que erasometido el embrión. Un dato importante de este estudio es que cuando seutilizaron las células individuales de los embriones de ocho células, el desarrollode la MCI se veía fuertemente comprometido al extremo de formarse sólovesículas sin la presencia de este grupo de células.60

Tabla 6. Factores que Afectan las Tasas de Gestación en La Partición deEmbrionesFACTORESCONSIDERACIONESCalidad morfológica Mejores de grado 1 a 2 (14)Fase de segmentación de embrionesNumero se secciones en las que sedivide el embriónPresencia de zona pelúcidaSistema de cultivo de los embrionespartidosNumero de demi-embrionestrasferidos a hembras receptorasPreservaciónSexoMejores resultado (30) y con mayortasa de gestación (16) en blastocitocon mórulaLos medios embriones (demiembriones)sobreviven mejor en elútero que los 4 embriones (14), los 4embriones carecen de MCI funcional,viabilidad reducida (30)Resultados controversiales, necesariaen algunos casos (66) o con escasadiferencia (16)Mejor en oviducto ligados que in VitroRelación directa entre el numero dedemi-embriones trasferidos y la tasade gestaciónMenor probabilidad de supervivenciade demi-embriones congelados (14,23)Afectado por la manipulación y elcultivo de embriones, mayor pérdidade embriones femeninos (20)Aparentemente, en los blastómeros aislados se promueve más fácilmente laapoptosis y se afecta preferentemente a las células de la MCI. Este procesocontribuye a la incidencia de abortos debido a que la poca cantidad de células dela MCI reduce la viabilidad fetal (Chan y col 2000).En monos esta misma técnica ha sido aplicada a partir de embriones de ochocélulas, en la que se separan los blastómeros mientras son mantenidos en medio61

libre de Ca 2+ y Mg 2+ ,y luego se reagrupan por pares que se introducen en zonaspelúcidas para que puedan desarrollarse hasta la fase de compactación y asítransferirlos a hembras receptoras. El 8% de los embriones tratados brindaroncrías vivas (Chan y col 2000).- Transferencia nuclear. Una técnica que incrementa el potencial de desarrollode los blastómeros aislados de embriones de ocho células o de etapas mastardías de la segmentación es la transferencia nuclear (Willadsen 1989). Estatécnica permite la producción de individuos genéticamente idénticos originados apartir de un solo donador de núcleos (Romo 1994). Implica la inserción pormétodos químicos, físicos, biológicos o mecánicos del núcleo de una céluladonadora que puede ser tomada de varios tejidos a la cual se le llama carioplasto,con un ovocito activado y carente de núcleo, o con un huevo fertilizado al que se lehayan extraído los pronúcleos (Edwards 1998; Wlladsen 1989; Meng y col 1997;Bromhall 1975). Contrariamente a lo que pudiera pensarse, el desarrollo de estametodología es más bien antiguo, si bien hasta hace poco ha acaparado el interésno sólo de la comunidad científica, sino del público en general. En la tabla 7 semuestra una cronología de los eventos más importantes en la obtención deorganismos clonados por transferencia nuclear.Es importante destacar que tanto el citoplasma que recibirá al núcleo transferidocomo el propio núcleo deben tener características fisiológicas específicas para quese realice con éxito tanto la transferencia nuclear como el desarrollo posterior de lacélula reconstituida y, eventualmente, el desarrollo del nuevo organismo. La célulaque contiene al núcleo que será transferido (carioplasto) debe tener característicasparticulares que permitan cierto porcentaje de éxito antes de ser colocado en elespacio perivitelino adyacente a la membrana del ovocito (citoplasto) y se fusione.Experimentalmente el uso de citocalacina B para bloquear la polimerización demicrofilamentos, y de colchicina para la de los microtúbulos, permiten controlar losmovimientos del citoesqueleto en el carioplasto, provocar una elasticidad de lamembrana plasmática y favorecer así la enucleación mediante el uso demicropipetas, sin romper la membrana plasmática (Edwards 1998; Prather y col1987; Cheong y col 1993; McGrath 1983; Prather 1990; Yong 1998).Si se utiliza un embrión en segmentación como carioplasto, también requerirá dela micromanipulación para obtener sus blastómeros. Uno de estos últimos setransfiere dentro del ovocito en metafase II desprovisto previamente de su núcleo,y se fusiona con él. Mediante este proceso, el ovocito se activa y da inicio a sudesarrollo como un nuevo embrión. En algunas especies la sola transferencia delcarioplasto inicia la activación del ovocito (Edwards 1998; Prather 1990; Bromhall1975; McLaren 1984).62

Tabla 7. Cronología de la clonación mediante transferencia Nuclear yseparación de blastómerosAÑO1938195219671970198119841987199219931996199719972000EVENTOHans Speman divide un cigoto de salamandra con un cabello; mantieneal núcleo en una de sus mitades que continua su segmentación. Alretirar la barrera, uno de los nuevos núcleos llega al interior de la mitadque carecía de él y se segmenta hasta convertirse en otro embrión.Robert Briggs y Thomas King demuestran que los núcleos deblastocistos de rana (rana pipiens), son capaces de desarrollarrenacuajos al ser transferidos a ovocitos enucleados.Di Bernardino observa que los núcleos aislados de embriones en etapade gástrula, desarrollan renacuajos anormales.Se efectúan algunos experimentos parcialmente exitosos con núcleos decélulas intestinales de sapos. Estos clones se desarrollan hasta alcanzarel estado de renacuajos, sin llegar a adulto.Primer reporte al nacimiento de ratones provenientes de la transferenciade núcleos de células somáticas en ovocitos enucleados, al intentarrepetir estos experimentos otros investigadores no pudieron lograrlo.Clonación de ovinos utilizando núcleos de blastómeros de embrionespor fusión con virus Sendai o campo eléctrico con ovocitos enucleados.Ovejas al término de su desarrollo.Nacimientos de dos terneros a partir de cigotos reconstituidos connúcleos de blastómeros de embriones electrofusionados con ovocitosenucleados.Cultivo in vivo en oviductos de oveja hasta blastocisto y transferencia auna vaca receptora hasta que llegaron al término de su desarrollo.Uso de color ante Hoechst para monitorear el proceso de enucleaciónde ovocitos de bovino. Nacimiento de 32 terneros.Electrofusión de núcleos de ratón a partir de blastómeros de embrionesen estado de 2 ,4 y 8 células con ovocitos, con nacimiento de críasvivas.Nacimiento de ovejas vivas partiendo de ovocitos enucleados portransferencia de núcleos de células epiteliales de embriones de 9 díasde gestación mantenidas en etapa Go.Nacimiento de “Dolly” utilizando el núcleo de células derivadas deglándula mamaria de oveja adulta arrestada en la fase G por reducciónde suero en el medio.los núcleos fueron electrofusionados a ovocitosenucleados. La tasa de éxito es inferior al 1 %.Nacimiento de “Neti” y “Dite” dos monos Rhesus obtenidos porelectrofusión de núcleos derivados de fertilización in vitro y ovocitosmadurados in vitro, enucleados y activados con cicloheximida. Tasa deéxito de 3,77%.Obtención de cerdos clonados mediante electrofusión y microinyecciónde núcleos. Tasa de éxito inferiores al 8 %.63

La primera etapa de esta metodología es la obtención del citoplasma adecuadopara que sirva de aceptor del núcleo. A los ovocitos en metafase II se les retira elnúcleo, en el caso de huevos fertilizados, se les extraen los pronúcleos enmicroscopía de contraste de fases. Para confirmar que el material cromosómicohaya sido totalmente extraído, se aplican tinciones de ADN en el citoplasma delovocito. El colorante más utilizado para esta etapa es el Hoechst 33258 paravisualizar la ausencia de contenido nuclear en los ovocitos enucleados, bajo luzultravioleta durante períodos de menos de diez segundos, sin efectos negativos enel desarrollo de los embriones reconstituidos (Yong 1998; Stice y col 1993; LeBourhis y col 1998).Respecto a las características del carioplasto, entre mas diferenciada esté lacélula somática, menor será la probabilidad de éxito en la transferencia nuclear.Para que una célula sea totipotencial requiere que su núcleo sea capaz dedesarrollarse en un nuevo embrión (Solter 1996). Para ello los genes que danlugar al desarrollo de un organismo completo deben estar presentes aún cuandono todos sean expresados (Casas y col 1998). Algunos de los genes que debenexpresar las células totipotentes son el gen Tnap, los factores de transcripción, losgenes Oct 3/4, el proto-oncogen ckit, y la ADN metiltransferasa Mt (Urven y col1993).La experiencia con múltiples tipos celulares tanto embrionarios como de tejidosdiferenciados ha demostrado que el uso de núcleos de blastómeros obtenidos deembriones de dos células es mas eficiente que los de ocho células; asimismo, losnúcleos de blastómeros de las células de la MCI son mas eficientes que los de lascélulas de la granulosa, por ende, las células embrionarias son mas efectivas quelas células de individuos adultos (Edwards 1998). A su vez, los núcleos de lascélulas de la MCI son más efectivos que los de las células del trofoectodermo(McLaren 1984). Cheong et al (1993) encontraron que al utilizar núcleos deblastómeros de embriones de dos, cuatro y ocho células que se hallaran en la fasetemprana del ciclo celular (fase G 1 de la segunda división), como donadores denúcleos para ser transferidos, los de dos células daban 78% de blastocistos y 29%de ratones nacidos vivos a partir de los embriones reconstituidos, mientras que losde cuatro células daban 71% de blastocistos y 22% de ratones nacidos vivos, y losde ocho células daban 46% y 17% respectivamente. En resumen, los núcleosobtenidos de embriones en las fases tempranas de la segmentación tienen laventaja sobre los provenientes de células diferenciadas en que los primerosrevierten con facilidad los cambios que sufren previo a su diferenciación; mientrasque los últimos deben revertir los cambios que ya han sufrido durante más de 30ciclos de divisiones celulares.Es por ello que una transferencia nuclear eficiente, con un desarrollo a término delhuevo manipulado, dependerá de la reprogramación adecuada del núcleodonador. Las macromoléculas del tipo del ARN mensajero y las proteínas64

almacenadas en el ovocito sólo soportan el desarrollo embrionario durante untiempo relativamente corto. Entre más corto sea este período, se requerirá menortiempo para la reprogramación. Conforme el embrión sufre cambios mayores ycrece, sus células requerirán mayor tiempo y será probable que estareprogramación no se lleve a cabo adecuadamente. En algunas especies, laactivación de la transcripción del genoma reintroducido ocurre hasta el estadoprevio al blastocisto, por 10 que depende de la transcripción del ARN materno. Enembriones productos de una fertilización normal, este proceso se lleva a cabo adiferentes tiempos en diferentes especies: a partir del estado de dos células enratones y caprinos; de cuatro células en porcinos; y en el paso de ocho a dieciséiscélulas en embriones de ovinos y bovinos (Prather y col 1987). En la transferencianuclear, la compatibilidad entre el citoplasma recipiente y el núcleo donador, espoco entendida aún y toma parte en la reprogramación del núcleo donado (Solter1996).Dentro de los cambios que deben revertir los núcleos de las células de adultodurante la transferencia nuclear está la metilación del ADN que es esencial para eldesarrollo embrionario. El genoma del ovocito está poco metilado, mientras que enel embrión comienza a incrementarse esta metilación. Esto ultimo afecta laexpresión de los genes, la inactivación del cromosoma X, la diferenciación celular,y el imprinting (Kokalj-Vokac 1998). Otros cambios asociados son la activación delas histonas y modificaciones en otras proteínas nucleares. Si estos cambios no serevierten, durante el crecimiento ocurrirían modificaciones genéticas de losnúcleos adultos, tales como la mutagénesis somática, los errores mitóticos, lasdeleciones y trisomías (Edwards 1998).Con el propósito de revertir los cambios en las células diferenciadas y asíincrementar las tasas de éxito en la fusión y en el desarrollo de embrionesreconstituidos por medio de la transferencia nuclear, es importante lasincronización de los ciclos celulares de las células donadoras de núcleos y de losovocitos receptores (Meng y col 1997; Solter 1996; Serrano y col 1997). Merchanten 1996, le llama a este proceso sincronización nucleocitoplásmica.Como es ampliamente conocido, durante la vida fetal y hasta la pubertad, elovocito de los mamíferos se encuentra detenido en la etapa de diploteno de laprofase de la meiosis I y sus cromosomas se condensan poco antes de que ocurrala ovulación por acción de las gonadotropinas. Este estímulo promueve que elovocito reasuma su programa de división formándose el ovocito secundario con suprimer cuerpo polar, eliminando así la mitad de su material genético. En losmamíferos adultos, el crecimiento del ovocito es continuo y termina en laovulación, cuando es depositado en el oviducto en donde madura e inicia susegunda división meiótica (meiosis II), en la cual se vuelve a detener, solo queesta vez hace en la metafase II. El ovocito arrestado en metafase II continuará sudivisión únicamente si es activado por el espermatozoide durante la fertilización,65

en cuyo caso culminará su segunda división meiótica y formará el segundo cuerpopolar (Merchant 1997; Loi y col 1998; Wassarman 1999).Durante la maduración y la activación, el citoplasma del ovocito modifica suspropiedades en la medida en que la célula es liberada del arresto en la metafase IIy es activada con la fertilización mediante una serie de descargas de calcio quepromueven la reacción cortical. Una vez ocurrida la fertilización, la transcripcióndel ARN materno comienza a controlar el desarrollo en las primeras divisionesmitóticas hasta la activación del genoma embrionario. Cuando se efectúa unatransferencia nuclear, la transcripción del genoma materno del ovocito dirige alnúcleo donado mientras que éste es capaz de asumir el control de las fasesembrionarias tempranas por sí mismo (Edwards 1998).AI igual que en las células que se dividen, el ciclo celular del ovocito se encuentracontrolado mediante dos factores proteínicos: el factor promotor de la mitosis de lamaduración (MPF) formado por una ciclina y la cinasa dependiente de ciclina, y elfactor citostático (CSF) que es esencialmente el mismo MPF pero asociado a unaproteína que inhibe la acción de la cinasa. Cuando la proteína inhibidora de laciclina se degrada, la célula es capaz de sintetizar ADN, si el inhibidor no sedegrada, la célula primeramente es incapaz de entrar a la fase S del ciclo y, enconsecuencia, puede condensar de manera prematura su material genético.Cuando las concentraciones del MPF se elevan, se inducen algunas alteraciones,tales como la desintegración o rompimiento de la envoltura nuclear (DEN), lacondensación prematura de los cromosomas (CPC) y la reorganización delcitoesqueleto (Campbell y col 1996; Meng y col 1997).Para que los eventos ocurran apropiadamente después de la transferencianuclear, los niveles de MPF deben descender o ser bajos. De otro modo laincidencia de daño cromosómico y aneuploidías puede ser alta (Meng y col 1997;Yong 1998). Si la transferencia nuclear se hace cuando el ovocito tiene bajosniveles de MPF (siete a diez horas después de su activación), no sólo sepresentarán menos problemas de aneuploidías, sino que además se mantendráintacta la envoltura nuclear y los cromosomas no se condensaránprematuramente, por lo que continuarán su ciclo de replicación-condensación demanera normal, favoreciendo la sincronización nucleocitoplásmica y con ello eldesarrollo del cigoto así reconstituido (Merchant 1997).Si se fusionan células en G con células en G, el material genético de estas últimassufre una condensación prematura como si estuviera lista a iniciar los movimientosclásicos de la división celular (mitosis). Si la fusión es entre células en etapa S yG, la síntesis del material genético se completa y el contenido de cromosomas enel producto es aberrante, pues no sólo hay más sino que incluso las células hijassufren la falta de uno o varios de ellos, mientras que la otra presenta más de unpar de copias de un cromosoma (trisomías) (Serrano y col 1997). Los núcleos66

donadores que se encuentren en la fase del ciclo G resultan en un mejordesarrollo que los que están en fases S o G, ya que es más sencillo reprogramarun genoma que está abierto para sufrir una replicación, además de que losfactores citoplásmicos tienen mayor acceso al genoma cuando las célulasdonadoras están en dichas fases (Wilmut y col 1997). Los núcleos se inducen aentrar en un estado de quiescencia (G) cultivando las células donadoras o enmedios con cantidades reducidas de suero. De esta manera se coordinan losciclos celulares del carioplasto y citoplasto.Ahora bien, para la fusión de carioplastos y citoplastos se han utilizado estímuloseléctricos, virales y químicos. La fusión eléctrica y la fusión viral se han utilizadoen roedores, lepóridos y ovinos. La fusión eléctrica se ha usado además enbovinos y en monos rhesus (Meng y col 1997; Prather 1990). La fusión inducidapor el virus Sendai tiene el inconveniente de que los núcleos transferidos nosobreviven o los embriones reconstituidos no logran segmentarse. Las tasas deéxito en la fusión por virus son de 30% en ovinos, siendo de tan solo 8% enbovinos (Prather 1990; Bromhall 1975), por que este tipo de estímulo ya no seutiliza. Una vez efectuada la fusión, los factores presentes en el citoplasma delovocito enucleado y activado serán los que reprogramen al núcleo, confiriéndole lahabilidad para regular el desarrollo embrionario hasta que llegue a término(Edwarsd 1998; McLaren 1984). Este desarrollo embrionario puede llevarse acabo in vitro, o in vivo en oviductos de ovino (Wlladsen 1989; Prather 1990).Todavía existe gran variabilidad de resultados con estas técnicas, con tasas deéxito en la electrofusión de blastómeros obtenidos a partir de embriones de ochocélulas del 90% en ovinos, 74% en bovinos, 84% en lepóridos y 87% en porcinos(Prather 1990), y tasas de gestación de 0% a 54% (1) o hasta de 78% en bovinos.En esta última especie, las tasas de segmentación de los embriones reconstituidosvarían según el sexo de los mismos: 73% para embriones hembras, 63% paraembriones machos (Le Bourhis y col 1998).Existe un informe interesante en bovinos que describe la transferencia nuclearutilizando ovocitos de vacas Holstein (Bos taurus) con núcleos de células aisladasde embriones Brangus (5/8 Angus, Bos taurus y 3/8 Brahman, Bos indicus).En otraetapa del estudio, utilizaron blastómeros de embriones de ocho a dieciséis célulasde ovino que se fusionaron con ovocitos enucleados de caprino, desarrollándosehasta el estado de ocho células al ser cultivados in vivo en oviducto de ovino. Loanterior demuestra que es factible obtener un clon a partir de dos célulasprovenientes de diferentes especies animales y cultivarlo in vivo en el aparatoreproductor de una especie no homóloga (Willadsen 1989).- Ventajas y desventajas de las técnicas de clonación. La clonación a partir decélulas de animales adultos tiene algunas ventajas y desventajas dependiendo de67

la técnica que se trate (Cuadros 4 y 5), aunque en general todas tendrían laventaja de que al conocerse las características del donador permitirían seleccionara los individuos con alto valor biológico o productivo si las característicasseleccionadas dependen solo de factores genéticos, lo que no es tan probable porel efecto de las condiciones ambientales, de manera que se desconoce hasta quégrado es un clon realmente idéntico a su donador (Lisker y Tapia 1997).Tabla 8. Principales ventajas de la partición o división de Embriones Solo se obtienen de uno a cuatro embriones monocigóticos, y solo la mitadde ellos llegan al término en su desarrollo (21,73). Los demi-embriones obtenidos con esta técnica no resisten lacriopreservación. Reducción de las tasas de gestación posteriores a la transferencia enhembras receptoras (21). Dificultad de separar con exactitud dos mitades que sean exactamenteiguales entre sí, por lo que los individuos monocigóticos no son 100%idénticos (30).Una de las consideraciones que deben hacerse cuando se planea la clonación portransferencia de núcleos tornados de células de adultos, es que éstos reflejan laedad biológica del donador. Esto último parece ser trivial, sin embargo tieneimportancia si se analiza lo ocurrido con las regiones terminales de loscromosomas. En estas regiones se encuentra ADN de secuencia altamenterepetida y en forma general, por tripletes o tétradas de nucleótidos repetidos,dichas secuencias se conocen como microsatélites. Experimentalmente se hadeterminado que el número de repeticiones que debe tener es importante para lafunción celular. Durante el envejecimiento, cada vez que la célula se divide elnúmero de estas repeticiones se hacen menores y permiten que se desarrollenenfermedades propias de la edad adulta aún en organismos "jóvenes" (Marshall2000).Sin embargo, Lanza et al. (2000), observaron que en bovinos clonados portransferencia nuclear a partir de células somáticas envejecidas in vitro, ocurría unaumento en la duración de la vida replicativa de la célula así como en la longitudde sus teloneros. Así mismo, las células somáticas que han estado expuestas acarcinógenos químicos y radiaciones durante períodos prolongados, en estesentido, es posible que hayan acumulado mutaciones que pueden manifestarsedurante la gestación, como malformaciones congénitas o predisposiciones adiversas enfermedades en los recién nacidos (Lisker y tapia 1997).68

Tabla 9. Comparación entre la clonación por separación de Blastómeros y latransferencia nuclearSEPARACION DE BLASTOMEROS TRANSFERENCIA NUCLEARVENTAJAS Obtención de individuos 100%idénticos genéticamente entre Obtención de copias genómicasde individuos superiores.sí. Facilidad de obtención deblastómeros aislados. No requiere métodosespecializados para obtener loscarioplastos, citoplastos o lafusión entre ellos. En la separación y lareagregación de blastómeros,los blastocitos obtenidos dequíntuples y séptuples puedenutilizarse para establecercélulas totipotenciales. Necesita determinarse el medioóptimo para el desarrolloembrionario in vitro para cadaespecie utilizada. Puede requerir de la utilizaciónde zonas pelúcidas o desustitutos de ellas. Bajas tasas de éxito en críasnacidas que se reducen alutilizar embriones en fasesavanzadas de la segmentación. Tasas de aborto elevadasdespués de transferir embrionesclonados en hembrasreceptoras.DESVENTAJAS Los clones no son 100%idénticos genéticamente debidoa la participación del ADNmitocondrial- Los clones muestran diversosgrados de alteración. Requiere de metodología yequipos sofisticados paraobtención de cariplastos,citoplastos y su fusión. Requiere de una adecuadasincronización nucleoplásmica. Bajas tasa de éxito en críasnacidas.Con la clonación queda todavía un buen número de problemas a resolver, comoson la eficiencia de la técnica de transferencia nuclear, que actualmente es muybaja y demasiado costosa para aplicarla comercialmente de manera rutinaria, ya69

que aún en el estudio mas conocido de esta técnica se obtuvo una eficiencia de0.36% (Wilmut y col 1997). Considerando que el patrón de desarrollo de loscigotos es muy diverso, la adaptación de las técnicas a otras especies precisa aúnde una extensa investigación para cada una de ellas (Merchant 1997).- Aplicaciones de la clonación de embriones. En el ámbito científico, la clonaciónha abierto un nuevo campo de experimentación para abordar problemasfundamentales sobre los mecanismos que controlan la diferenciación celular en elinicio del desarrollo (Merchant 1997). También es útil en los estudios de fisiología,embriología, genética y crianza animal (Herman y col 1998; Williams y col 1984).Los individuos genéticamente idénticos pueden ser de sumo valor para losexperimentos controlados en los que se evalúen los efectos ambientales, talescomo nutrición, instalaciones y medicamentos. La transferencia de genomasidénticos en diferentes tipos de citoplastos permitiría evaluar las interaccionesentre citoplasma y núcleo (Williams y col 1983; Prather 1990).Los clones transgénicos y los derivados de células primordiales pueden serincluidos en la investigación de terapias celulares o genéticas, principalmente si setrabaja con primates no humanos, ya que esto último salvaría la distanciaexistente entre las especies de roedores comúnmente utilizadas en loslaboratorios para desarrollo y prueba de fármacos de uso en humanos. En enerode 2001, el grupo de Gerald Schatten dio a conocer el nacimiento de un simio quetiene insertado el gene de la proteína verde fluorescente (GFP), de tal suerte quesus células pueden ser utilizadas con relativa facilidad para estudios encaminadosa determinar los efectos nocivos de fármacos que puedan ser semejantes a losobtenidos en humanos, por lo que los estudios de fases terminales pueden sermas rápidos y con un modelo mas cercano evolutivamente, en lugar del riesgo queimplica hacer la extrapolación del modelo de roedor o conejo, comúnmente usadoen la investigación farmacológica.Asimismo, los clones con fechas distintas de nacimiento (considerando que de unmismo grupo de clones unos sean transferidos directamente y otros seancongelados para transferirlos con posterioridad) tienen aplicación en el análisisfenotípico de los individuos clonados antes de que sean propagados y en latransferencia seriada de células totipotentes para dirigir la edad celular mas allá delas expectativas de vida (Mclaren 1984). Además, los clones implantados en unamisma hembra subrogada podrían probar los efectos epigenéticos que incluyan elambiente materno (Chan y col 2000).- Clonación de embriones por generación múltiple. La última meta de losproyectos de clonación de embriones es producir gran número o un númeroilimitado de individuos idénticos a partir de un individuo original. Lo anterior ha sidollevado a cabo a través de la clonación por generación múltiple también conocido70

como reclonación, que utiliza embriones clonados por transferencia nuclear comodonadores de núcleos para producir la próxima generación de embrionesidénticos. De manera que si el primer ciclo de transferencia nuclear produce 10embriones clonados viables, el siguiente ciclo posiblemente resultaría en 100embriones clonados en la segunda generación (Singla y col 1997; Stice y col1993).A este respecto, desde la década de los 80, se han reportado resultados exitososen los procedimientos de reclonación, pudiéndose obtener seis generaciones deembriones (Willadsen 1989) y terneros de tercera generación a partir deembriones en diferentes estados de segmentación, obtenidos por transferencianuclear. Asimismo, la multiplicación en serie de embriones mediante la clonaciónha incrementado el número de progenie producida de un embrión donadordeterminado. Mediante ciclos repetidos de transferencia nuclear, se han obtenidogestaciones de clones de tercera generación y se han producido embriones enetapa de blastocisto de clones de quinta generación. Los límites de la clonación enserie aún no han sido definidos. Las tasas de gestación de los embriones enestado de mórula o blastocisto producidos por clonación en serie no difieren de lastasas de gestación de los clones derivados de embriones frescos (Singla y col1997; Stice y col 1993).Se ha visto que los blastómeros provenientes de embriones clonados portransferencia nuclear en etapas mas tempranas de la segmentación, tienenmayores probabilidades de fusionarse a los citoplastos que los provenientes deembriones clonados en etapas mas tardías de la segmentación, y que esto varelacionado con el tamaño del blastómero que se va a transferir. Las tasas deéxito en la reclonación difieren con relación en el tiempo de cultivo y el númerogeneracional del clon; por ejemplo, cuatro días de cultivo in vivo en oviductos deovino da lugar a tasas de fusión de 68% en embriones reconstituidos de bovino,respecto del 57% obtenidos tras cinco días de cultivo in vivo. Sin embargo, losclones de cinco días de cultivo pueden producir 4.5 generaciones de clones,mientras que los de cuatro días solo 3.6. La tasa de éxito en la fusión se reduce deuna generación a otra, ya que de una línea clonada se han obtenido 11 clones enla primera generación, 16 en la segunda, 20 en la tercera y solo 7 clones en lacuarta generación (Stice y col 1993).Yong y Yuqiang (1998), lograron obtener crías de caprino de la primera a la sextageneraciones, de las cuales tres pares fueron gemelos monocigóticos, tres seriesfueron de triples monocigóticos, dos series de cuádruples monocigóticos, tresseries de quíntuples y una serie de heptaples monocigóticos.Los abortos y las tasas de gestación pueden diferir entre reclines y la primerageneración de embriones clonados por transferencia nuclear. Willadsen (1989),informa que la segunda o posteriores generaciones de bovinos y ovinos, tienen71

tasas de gestación mas bajas que la primera generación de embriones clonados, yque las tasas de aborto se incrementan a partir de la segunda generación.Con el estudio profundo y el adecuado control de las deficiencias actuales de laclonación, en un futuro la clonación en serie permitirá a su vez, la clonación deanimales transgénicos que contengan genes selectos. De ahí se deduce que laclonación ofrece una enorme oportunidad para la ganancia genética, el incrementoen la eficiencia de la producción de alimentos de origen animal y los programas deinvestigación (Singla y col 1997).- Aspectos comerciales de la clonación de embriones. Cuando la clonación seaplica a los embriones de alto valor, la habilidad para producir varios nacimientospor cada embrión ofrece suficiente ventaja económica para recuperar los costosinvolucrados, sobre todo si se utilizan procedimientos de sexado de embriones, demanera que los nacimientos de individuos clonados sean de sexo predeterminado.Esto pondría un limite en el número de embriones de sexo masculino transferidos,lo cual reduciría el número de transferencias requeridas o permitiría obtener unapoblación de pie de cría efectiva con el mismo número total de transferencias(Nicholas 1983). Sin embargo, la eficiencia con la que se cuenta actualmente aúnno permite una producción de embriones en masa a un costo accesible para laproducción de animales comerciales (Singla y col 1997). Es necesario que seincrementen significativamente las tasas de éxito para que el mercado de losembriones clonados pueda hacerse realidad. Actualmente en el mundo existe unlaboratorio que ofrece la clonación de embriones por transferencia nuclear, a lacual los ganaderos pueden enviar sus embriones para recibir clones por 100dólares cada uno (Romo 1994).Otra limitante es que los pesos de los individuos clonados al nacimiento sonanormales. Estos procedimientos dan lugar a una mayor incidencia de distocias,aunque posterior al nacimiento las tasas de crecimiento no se afectan por esteprocedimiento. No se conoce explicación biológica sobre este aspecto (Singla ycol 1997). Es necesario incrementar la eficiencia de este procedimiento paraeliminar el problema de gigantismo fetal que se ha encontrado en algunosbecerros producidos por transferencia nuclear (Roma 1994). En ovinos no se haobservado alteración en los pesos al nacimiento de los individuos clonados, perosí un alargamiento en la duración de la gestación que es influenciado por elgenotipo fetal (Wilmut y col 1997).Es clara la necesidad de investigación básica, utilizando especies de las que setenga un conocimiento adecuado para los fines de la investigación. Este tipo deestrategias, por su accesibilidad y bajo costo, podrían ser llevadas a cabo enanimales de laboratorio, explorando mas la técnica en los ámbitos celular ymolecular, de manera que la solución a los problemas de las tasas de gestación ypesos al nacimiento podría obtenerse de los experimentos a partir de estasespecies (Singla y col 1997).72

- Aplicación de la clonación en la conservación de especies. La recientedemostración de la capacidad para clonar mamíferos adultos, ha propiciado unavariedad de nuevas ideas de investigación para los interesados en las especies enpeligro de extinción.La clonación tiene el potencial de minimizar la pérdida de recursos genéticos, aligual que rescatar la pérdida de material genético; por lo que permitiría expandir elnúmero de tasas incluidos en los programas de supervivencia de especies, porqueharía posible la criopreservación de embriones clonados; aunque habría quepensar con cuidado, en las especies animales que podrían ser utilizadas como lasreceptoras de los embriones de especies en peligro de extinción que vayan a serclonados, y considerando: que los tipos de placentación son diferentes para cadaespecie; que la transferencia embrionaria interespecífica sólo funciona en lasespecies en las que es posible crear híbridos; que hay especies silvestres que nose reproducen en cautiverio, y también que el comportamiento materno de lashembras receptoras hacia las crías nacidas a partir de embriones clonados deespecies no homólogas a ellas, podría afectar la supervivencia de los clones,etcétera (Ryder 1997).El grupo Lanza et al. (2000) efectuaron la primera clonación de una especie enpeligro de extinción: un gaur asiático a quien llamaron «Noé», obtenido por latransferencia de núcleos utilizando células de piel (fibroblastos) de gaur macho yovocito enucleado de vaca doméstica, y cuyo embrión reconstituido fue transferidoen una vaca doméstica. Actualmente esperan el nacimiento del gaur clonado yseñalan que están en planes de ser clonadas especies tales como el antílopebongo, el tigre de Sumatra y el panda gigante. Asimismo, se cuenta con célulaspreservadas de una especie ya extinta, la cabra bucardo de montaña, de España,en la que se esta pensando aplicar la clonación. Consideraciones éticas de la clonación. Hasta ahora se ha hablado sobrealgunas consideraciones que deben ser cuidadosamente estudiadas con respectoala clonación de animales, tanto para el abasto como para la conservación deespecies en peligro de extinción; queda solamente mencionar las probablesconsecuencias que esta técnica tendría si fuera aplicada a los seres humanos.En 1984 McLaren consideraba que la transferencia nuclear podría ser aplicada enlos seres humanos; señalaba que para las parejas que tuvieran el riesgo detransmitir defectos genéticos a su progenie, si se recuperaran varios ovocitos deuna mujer, se enuclearan y se les transfiriera un núcleo de la MCI de alguno desus propios embriones; unos cuantos podrían ser congelados mientras que losremanentes genéticamente idénticos podrían ser evaluados para defectosgenéticos por análisis cromosómico, análisis de ADN 0 por métodos bioquímicos.73

De esta forma se aseguraría a la pareja que cualquier embrión transferido al úteromaterno del stock que fuera congelado, estaría libre de defectos genéticos.A este respecto existen opiniones tanto en favor como en contra. Por ejemplo, en1997 el Consejo Bioético de Estados Unidos de América (Nacional BioethicsAdvisory Comisión 1997), señaló la preocupación existente acerca del posibledaño físico provocado por la manipulación del ovocito, núcleo y embriones, asícomo del daño psicológico en cuanto al sentido de la individualidad y la autonomíapersonal de los individuos clonados. Mencionan la preocupación ética sobre ladegradación de la calidad de la familia y el parentesco en el caso de que lospadres quisieran tener un control excesivo sobre las características de sus hijos.Lisker y Tapia (1997) opinan que la clonación de embriones humanos tendríautilidad en la investigación siempre y cuando los embriones no fueran implantadosen el útero de mujeres, y que tuviera la finalidad de incrementar el conocimientoen biología celular y los mecanismos de expresión genética, ya que no debenponerse obstáculos al avance en la investigación científica. Aunque hacenhincapié en la importancia de discutir y resolver todos los problemas éticos ylegales que plantea la clonación de nuestra especie.A finales del 2000 las autoridades inglesas aceptaron la aplicación de la clonaciónpor transferencia nuclear en humanos, pero con una temporalidad finita de solo 2semanas y con una idea de aplicación exclusiva para la obtención de tejidos quepuedan ser utilizados para transplante. Una alternativa en este sentido es laestrategia definida por los trabajos de Onishi et al. (2000), y de Polajaeva et al.(2000) en los cuales se obtuvieron cerdos clonados por transferencia nuclear ycuya similitud en cuanto a tamaño de órganos y capacidades de aspectoinmunológico son muy similares a la de los humanos.Hottois (1998) considera que se le está dando mayor prioridad alas reaccionessimbólicas de la clonación que al análisis de sus técnicas. Opina que no hay razónpara enjuiciar la clonación, ya que desde el punto de vista de una pareja conproblemas de esterilidad total, 0 que hayan perdido a un hijo, 0 de una pareja en laque ambos cargan genes letales, la clonación no implicaría la reproducción enmasa de clones sino de tan solo uno 0 quizás dos, y que ello no afectaría laautonomía de los clones. Además, recuerda que la identidad biológica entre losclones, y entre ellos y su donador no sería total, ya que existen diferencias ligadasal ADN mitocondrial (que permanece en los ovocitos receptores) y alas laselección natural, son reintegrados al juego con lo que eventualmente puedenobtenerse individuos en cuyos embarazos se manifiesten nuevamente estosgenes letales.Por otro lado, Bryan (1998) trata de aproximar el que sería el sentir de loshumanos como individuos clonados con el de los gemelos monocigóticos quenacen de manera natural. Explica que en virtud de que aún cuando estos últimos74

son idénticos genéticamente, siempre hay uno que nace primero que el otro y que,por 10 tanto los medios uterino y extrauterino influyen para producir no soloapariencias sino también personalidades diferentes en cada uno. En el aspectopsicológico, señala como ventaja que los gemelos monocigóticos tienen facilidadpara relacionarse y comprenderse mutuamente dada su identidad biológica; perocomo desventajas, que tienen mayores riesgos de nacer prematuramente 0 detener altas tasas de muerte perinatal.Por último, Edwards y Beard (1998) señalan que la bisección 0 separación deembriones y la transferencia nuclear actualmente aplicadas en animales, podríanconsiderarse para su aplicación en humanos en la próxima década75

3. METODOLOGIA Revisión de literatura. Revisión de antecedentes investigativos o de trabajos realizados sobre el temaen nuestro país. Revisión de antecedentes investigativos internacionales, así como deorganismos de referencia. Consulta a través de revistas de investigación o publicaciones científicas deltema. Consulta en bases de datos y bibliotecas internacionales acerca de temas oinformación relacionada. Envió de e-mails a investigadores internacionales que han trabajado sobre eltema, para así realizar una recopilación de información importante. Elaboración de un proyecto de investigación tipo monografía en donde seplasme toda la información obtenida y se realice una descripción clara yprecisa de la fecundación, producción y del desarrollo embrionario como el dela transferencia de embriones en reproducción y producción porcina que estasiendo implementada a nivel experimental en el continente Europeo.76

4. IMPACTO ESPERADOEsta monografía aportara elementos básicos e indispensables como base para eldesarrollo e implementación de nuevos trabajos investigativos, así como, ser unafuente de información para los sistemas de producción porcina en donde sepretende dar a conocer la existencia de nuevas biotecnologías reproductivas yproductivas viables que pueden llegar a ser una solución a los problemas de tipogenético y reproductivos que están presentando hoy en día nuestros sistemasPorcícolas en el país.77

7. CONCLUSIONESLa combinación de las tecnologías anteriormente nombradas (producción in Vitrode embriones, transgénesis y clonación) hacen posible actualmente realizarmodificaciones genéticas muy precisas en el genoma del animal y han contribuidoa incrementar la eficiencia del proceso de generación de animales transgénicoscomo clonados de granja. Aunque en una primera etapa las modificacionesgenéticas afectarán solamente a genes simples, a medida que la tecnologíaavance y se haga más eficiente es posible vislumbrar un mayor rango demodificaciones que irán desde cambios en unos pocos pares de bases hasta lareingeniería de grandes segmentos cromosómicos. Muchas aplicacionesrequerirán de modificaciones genéticas múltiples, lo que puede significar unproblema para los animales de granja dado su largo período generacional. Por lotanto, el real desafío será desarrollar células que mantengan su capacidad detotipotencialidad para transferencia nuclear después de múltiples eventos derecombinación homóloga.Esto permitirá realizar más de una modificación genética en el animal y acortará eltiempo necesario para establecer estos cambios al estado de homocigosis.Aunque por el momento muchas de las aplicaciones de esta tecnología estánorientadas principalmente a la industria farmacéutica, es posible vislumbrar querasgos tan complejos de manipular como una mayor eficiencia en la conversión dealimentos y la resistencia a enfermedades, entre otras, serán más fácilmenteabordadas gracias a esta tecnología.Por lo tanto, el interés que despierta la tecnología de la reproducción, tanto en elárea de la medicina como en la industria porcina, aumenta el afán por el desarrollode nuevas tecnologías así como la puesta en marcha de las existentes. Sinembargo, aunque la clonacion, transgenesis y la producción in Vitro de embrionesa partir de ovocitos madurados, fecundados y cultivados in Vitro es hoy unarealidad, el rendimiento de estas técnicas es todavía inapropiado para obtener losbeneficios anteriormente mencionados pero al iniciar con los primeros peldaños anivel investigativo de estos temas, podemos dar comienzo a una secuencia deinvestigaciones experimentales a nivel nacional que pueden aportar grandeshallazgos y resultados para la medicina veterinaria, la medicina humana, ademásde contar con las garantías de obtener siempre el propósito que busca elproductor, un sistema optimo, que le brinde los mejores resultados en cuantoproducción y productividad, sin afectar la rentabilidad, sostenibilidad ysustentabilidad del sistema.Es claro y evidente que el uso de biotecnologías y sobre todo estos dos tipos detécnicas en la producción porcina son prácticamente unos términos nuevos, en78

comparación con la implementación de técnicas como la IA, la cual se ha usadodesde hace muchos años, debemos tener en cuenta que la implementación denuevas tecnologías, empiezan y parten de una idea, y es así como surgió la de IA,ahora el gran salto que esta dando en estos tiempos la ingeniería genética nos dapinceladas del futuro; de un futuro que podemos tomar en las manos en busca denuevas repuestas y soluciones a las nuevas problemáticas mundiales que nosafectan a todos; es claro que la implementación de estas biotecnologíasrepresentan altos costos de producción, pero a medida de las investigaciones y delos resultados que estas aporten van a dar respuesta y luz a su uso masivo ymundial por ser alternativas productivas y mundiales y a su vez a optimizar elrendimiento y rentabilidad de los sistemas productivos porcinos, es ahora dondedebemos aportar nuestro grano de arena a la investigación, para que en futuropodamos cosechar los frutos de nuestros esfuerzos.79

BIBLIOGRAFIAABEYDEERA, LR. 2002 In vitro production of embryos in swine. Theriogenology;57: 257-273ABEYDEERA, LR.2001 In vitro fertilization and embryo development in the pig. JReprod Fértil; 58 (Suppl): 159-173ADANIYA, G.K., RAWLINS, R.G., QUIGG, J.M., ROBLERO, L., MILLER, I.F.,ZANEVELD, L.J.D.1993: First pregnancies and livebirths from transfer of sodiumalginate encapsulated embryos in a rodent model. Fert. Steril. 59: 652-656, 1993.AGCA, Y., MONSON, R.L., NORTHEY, D.L., PESCHEL, D.E., SCHAEFER, D.M.,RUTLEDGE, J.J. 1998: Normal calves from transfer of biopsed, sexed and vitrifiedIVP bovine embryos. Theriogenology 50: 129- 145.ALBERTINI, DF. Y ANDERSON, E. 1974. The appearence and structure ofintercellular connections during the ontogeny of the rabbit ovarian follicle withparticular reference to gap junctions. J Cell Biol; 63: 234-250BAGUISI, A., E. BEHBOODI, D. MELICAN, J. POLLOCK, M. DESTREMPES, C.CAMMUSO, J. WILLIAMS, S. NIMS, C. PORTER, P. MIDURA, M. PALACIOS, S.AYRES, R. DENNISTON, M. HAYES, C. ZIOMEK, H. MEADE, R. GODKE, W.GAVIN, E. OVERSTROM, Y. ECHELARD. 1999. Production of goats by somaticcell nuclear transfer. Nat Biotechnol. 17: 456-61.BAKER, R.D.1985: Commercial splitting of bovine embryos.Theriogenology 23: 3-12, 1985.BARRAT, CLR. Y COOKE, ID. 1991 Sperm transport in the human femalereproductive tract-a dynamic interaction. Int J Androl; 14: 394-411BECK, LR Y BOOTS LR. 1974. The comparative anatomy, histology andmorphology of the mammalian oviduct. In: The oviduct and its functions. Ed:Jonhson AD and Foley CW. Academic Press, New York, USA.BOATMAN, DE. 1997. Responses of gametes to the oviductal environment. HumReprodBRIGGS, R., T. KING. 1957. Changes in the nuclei of differentiating endodermalcells as revelead by nuclear transplantation. J. Morphol. 100: 269-312.80

BRINSTER, R., E. SANDGREN, R. BEHRINGER, R. PALMITER. 1989. Nonsimple solution for making transgenic mice. Cell. 59: 239-41.BRINSTER, R., H. CHEN, M. TRUMBAUER, M. YAGLE, R. PALMITER. 1985.Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice bymicroinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci. U S A. 82: 4438-42.BROMHALL, J.D.1975: Nuclear transplantation in the rabbit egg. Nature 258:719-721,1975.BROPHY, B., G. SMOLENSKI, T. WHEELER, D. WELLS, P. L’HUILLIER, G.LAIBLE. 2003. Cloned transgenic cattle produce milk with higher levels of betacaseinand kappa-casein. Nat Biotechnol. 21: 157-62.BRYAN, E.M.1998: A spare or an individual? Cloning and the implications ofmonozygotic twinning. Hum. Reprod. Update 4: 812- 815, 1998.BUHLER, T., T. BRUYERE, D. WENT, G. STRANZINGER, K. BURKI. 1990.Rabbit beta-casein promoter directs secretion of human interleukin-2 into the milkof transgenic rabbits. Biotechnology. 8: 140-3.CAMPBELL, K., J. MCWHIR, W. RITCHIE, I. WILMUT. 1996. Sheep cloned bynuclear transfer from a cultured cell line. Nature 7: 64-6.CAMPBELL, K.H.S., MCWHIR, J., RITCHIE, W.A., WILMUT, I. 1996: Sheepcloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 380: 64-66.CANIPARI, R.1994 Cell-cell interactions and oocyte growth. Zygote; 2: 343-345CASAS, E., BETANCOURT, M.1998: Clonación: una alternativa en la producciónanimal. En: Biología de la Reproducción J. Velásquez Moctezuma, editor. México,DF Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa, pp. 83-499, 1998.CHAN, A.W.S., DOMINKO, T., LUETJENS, C.M., NEUBER, E., MARTINOVICH,C., HEWITSON, L., ET AL. 2000: Clonal propagation of primate offspring byembryo splitting. Science 287: 317- 19,2000.CHEONG, H. T., TAKAHASHI, Y., KANAGAWA, H.1993: Birth of mice aftertransplantation of early cell-cycle stage embryonic nuclei into enucleated oocytes.Bioi. Reprod. 48: 958-963, 1993.CIBELLI, J., S. STICE, P. GOLUEKE, J. KANE, J. JERRY, C. BLACKWELL, F.PONCE DE LEON, J. ROBL. 1998. Cloned transgenic calves produced fromnonquiescent fetal fibroblasts. Science 22:1256-8.81

CLARK, A. 2002. Generation of transgenic livestock by pronuclear injection.Methods Mol. Biol. 180: 273-87.CLARK, A., S. ALI, A. ARCHIBALD, H. BESSOS, P. BROWN, S. HARRIS, M.McCLENAGHAN, C. PROWSE, J. SIMONS, B. WHITELAW. 1998. The molecularmanipulation of milk composition. Genome. 31: 950-5.CLARK, A.J., A. COWPER, R. WALLACE, G. WRIGHT, J. SIMONS. 1992.Rescuing transgene expression by co-integration. Biotechnology. 10: 450-4.CLARK, A.J., P. BISSINGER, D. BULLOCK, S. DAMAK, R. WALLACE, C.WHITELAW, F. YULL. 1994. Chromosomal position effects and the modulation oftransgene expression. Reprod Fertil Dev. 6: 589-98.COSKUN, S.; UZUMCU, M.; LIN, Y.; FRIEDMAN, CI. Y ALAK, BM. 1995.Regulation of granulosa cell steroidogenesis by the porcine oocyte and preliminarycharacterization of oocyteproduced factor(s). Biol Reprod; 53: 670-675CRAN, DG. 1985. Qualitative and quantitative structural changes during pig oocytematuration. J Reprod Fertil; 74: 237-245CRAN, DG. Y CHENG, WTK. 1986. The cortical reaction in pig oocytes during invivo and in vitro fertilization. Gamete Res; 13: 241-251DAVIDSON, D., J. DORIN, G. MCLACHLAN, V. RANALDI, D. LAMB, C.DOHERTY, J. GOVAN, D. PORTEOUS. 1995. Lung disease in the cystic fibrosismouse exposed to bacterial pathogens. Nat. Genet. 9: 351-7.DAVIS, DL 1985. Culture and storage of pig embryos. J Reprod Fertil; 33 (Suppl):115-124DENNING, C., P. DICKINSON, S. BURL, D. WYLIE, J. FLETCHER, AJ. CLARK.2001. Gene targeting in primary fetal fibroblasts from sheep and pig. Cloning StemCells 3: 221-31.EATON, N.L., NIEMEYER, G.P., DOODY, M.C.1990: The use of an alginic acidmatrix to support in vitro development of isolated murine blastomeres. J. In vitroFert. Embryo Transf. 7: 28-32, 1990.EBERT, K., J. SELGRATH, P. DITULLIO, J. DENMAN, T. SMITH, M. MEMON, J.SCHINDLER, G. MONASTERSKY, J. VITALE, K. GORDON. 1991. Transgenicproduction of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk:generation of transgenic goats and analysis of expression. Biotechnology.9: 835-8.82

EDWARDS, R.G., BEARD, H.K. 1998: How identical would cloned children be? Anunderstanding essential to the ethical debate. Hum Reprod. Update 4:791-811.EVANS, M., M. KAUFMAN. 1981. Establishment in culture of pluripotential cellsfrom mouse embryos. Nature. 9: 154-6.GALLILI, U., B. MACHER, J. BUEHLER, S. SHOHET. 1985. Human natural antialpha-galactosylIgG. II. The specific recognition of alpha (1-3)-linked galactoseresidues. J. Exp. Med. 162: 573.GEBER, S., SAMPAIO, M.1999: Blastomere development after embryo biopsy: anew model to predict embryo development and to select for transfer. Hum.Reprod.14: 782-786, 1999.GEBER, S., WINSTON, R.M.L., HANDYSIDE, A.H. 1995: Proliferation ofblastomeres from biopsed cleavage stage human embryos in vitro an alternative toblastocyst biopsy forpreimplantation diagnosis.Hum. Reprod. 10: 1492-1496, 1995.GORDON, J., F. RUDDLE. 1981. Integration and stable germ line transmission ofgenes injected into mouse pronuclei. Science 214: 1244-6.GROBET, L., L. MARTIN, D. PONCELET, D. PIROTTIN, B. BROUWERS, J.RIQUET, A. SCHOEBERLEIN, S. DUNNER, F. MENISSIER, J. MASSABANDA, R.FRIES, R. HANSET, M. GEORGES. 1997. A deletion in the bovine myostatin genecauses the doublemuscled phenotype in cattle. Nat. Genet. 17: 71-4.HAMMER, R., R. BRINSTER, R. PALMITER. 1985. Use of gene transfer toincrease animal growth. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 50: 379-87.HARRIS, A. 1997. Towards an ovine model of cystic fibrosis. Hum. Mol. Genet. 6:2191-4.HEYMAN, Y., VIGNON, X., CHESNÉ, P., LE BOURHIS, D., MARCHAL, J.,RENARD, J.P.1998: Cloning in cattle: from embryo splitting to somatic nucleartransfer. Reprod. Nutr. Dev. 38:595603, 1998.HILL, A., M. DESBRUSLAIS, S. JOINER, K. SIDLE, I. GOWLAND, J. DOEY, P.LANTOS. 1997. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature 389: 448-450.HILL, J., Q. WINGER, C. LONG, C. LOONEY, J. THOMPSON, M. WESTHUSIN.2000. Development rates of male bovine nuclear transfer embryos derived fromadult and fetal cells. Biol. Reprod. 62: 1135-40.83

HOOPER, M. 1992. Embryonal stem cells: introducing planned changes into thegermline. H.J. Evans, ed. Harwood Academic Publishers, Switzerland. pp. 117.HOTTOIS, G.1998: Is cloning the absolute evil? Hum. Reprod. Update 4: 87-90,1998.HUHTINEN, M., PEIPPO, J., BREDBACKA, P.1997: Successful transfer ofbiopsed equine embryos. Theriogenoiogy 48: 361-367, 1997.JAENISH R., B. MINTZ. 1974. Simian virus 40 DNA sequences in healthy adultmice derived from preimplantation blastocist injected with viral DNA. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 21: 1250-1254.JAENISH, R. 1976. Germline integration and Mendelian transmission of theexogenous Molonkey leukaemia virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260.KERR, D., K. PLAUT, A. BRAMLEY, C. WILLIAMSON, A. LAX, K. MOORE, K.WELLS, R. WALL. 2001. Lysostaphin expression in mammary glands confersprotection against staphylococcal infection in transgenic mice. Nat. Biotechnol 19:66-70.KING, W.A., PICARD, L., BOUSQUET, D., GOFF, A.K.1992: Sex-dependent lossof bisected bovine morulae after culture and freezing. J.Reprod. Fertil. 96:453-459,1992.KITIYANANT, Y., J. SAIKHUN, B. CHAISALEE, K. WHITE, K. PAVASUTHIPAISIT.2001. Somatic cell cloning in Buffalo (Bubalus bubalis): effects of interspeciescytoplasmic recipients and activation procedures. Cloning Stem Cells 3: 97-104.KOKALJ- VOKAC, N., ZAGORAC, A., PRISTOVNIK, M., BOURGEOIS, C.A.,DUTRILLAUX, B.1998: DNA methylation of the extraembryonic tissues: an in situstudy on human metaphase chromosomes. Chrom. Res. 6: 161-166, 1998.KOLB, A., R. ANSELL, J. MCWHIR, S. SIDDELL. 1999. Insertion of a foreign geneinto the betacasein locus by Cre-mediated site-specific recombination. Gene. 227:21-31.KRIMPENFORT, P., A. RADEMAKERS, W. EYESTONE, A. VAN DER SCHANS,S. VAN DEN BROEK, P. KOOIMAN, E. KOOTWIJK, G. PLATENBURG, F.PIEPER, R. STRIJKER. 1991. Generation of transgenic dairy cattle using in vitroembryo production. Biotechnology 9: 844-7.LANZA, R., J. CIBELLI, F. DIAZ, C. MORAES, P. FARIN, C. FARIN, C. HAMMER,M. WEST, P. DAMIANI. 2000. Cloning of an endangered species (Bos gaurus)using interspecies nuclear transfer. Cloning. 2: 79-90.84

LANZA, R.P., CIBELLI, J.B" BLACKWELL, C., CRISTOFALO, V.J., FRANCIS,M.K., BAERLOCHER, G.M., ET AL.2000: Extension of cell lifespan and telomerelength in animals cloned from senescent somatic cells. Science 288: 665-669,2000.LANZA, R.P., DRESSER, B.L., DAMIANI, P. 2000: Cloning Noah's Ark. Sci. Am.283: 67-71, 2000.LAVITRANO, M., A. CAMAIONI, V. FAZIO, S. DOLCI, M. FARACE, C.SPADAFORA. 1989. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs:genetic transformation of mice. Cell. 57: 717-23.LAVITRANO, M., M. FORNI, V. VARZI, L. PUCCI, M. BACCI, C. DI STEFANO, D.FIORETTI, G. ZORAQI, B. MOIOLI, M. ROSSI, D. LAZZERESCHI, A.STOPPACCIARO, E. SEREN, D. ALFANI, R. CORTESINI, L. FRATI. 1997.Sperm-mediated gene transfer: production of pigs transgenic for a human regulatorof complement activation. Transplant Proc. 29: 3508-9.LAVOIR, M.C., KELK, D., RUMPH, N., BARNES, F., BETTERIDGE, K.J.,KING,W.A.1997: Transcription and translation in bovine nuclear transfer embryos. Biol.Reprod. 57:204-213, 1997.LE BOURHIS, D., CHESNE, P., NIBART, M., MARCHAL, J., HUMBLOT, P.,REENARD, J.P., ET AL.1998: Nuclear transfer from sexed parent embryos incattle: efficiency and birth of offspring. J. Reprod. Fert. 113: 343-34,1998.LEE, B., G. WIRTU, P. DAMIANI, E. POPE, B. DRESSER, W. HWANG, B.BAVISTER. 2003. Blastocyst development after intergeneric nuclear transfer ofmountain bongo antelope somatic cells into bovine oocytes. Cloning Stem Cells. 5:25-33.LEHN-JENSEN, H., WILLADSEN, S.M.1983: Deep-freezing of cow "half' and"quarter" embryos. Theriogenoiogy 19: 49-54, 1983.LISKER, R., TAPIA, R. 1997: Clonación en humanos. Ciencia 48: 5-13.LOI, P., G. PTAK, B. BARBONI, J. FULKA, P. CAPPAI, M. CLINTON. 2001.Genetic rescue of an endangered mammal by cross-species nuclear transfer usingpost-mortem somatic cells. Nat Biotechnol. 19: 962-4.LOI, P., LEDDA, S., FULKA, J., CAPPAI, P., MOOR, R.M.1998: Development ofparthenogenetic and cloned ovine embryos: effect of activation protocols. Biol.Reprod. 58: 1177-1187, 1998.85

MARSHALL, E.2000: In contrast to Dolly, cloning resets telomere clock in cattle.Science 288: 586-587, 2000.MATEOS JADEA JOAQUIN, fisiología animal, facultad de veterinaria, universidadde Murcia, España. Vol. 16, (1), 2001MATSUMOTO, K., MIYAKE, K., UTSUMI, K., IRITANI, A.: Production of identicaltwins by separating two-cell rat embryos. Gamete Res.22: 257-263, 1989.MCCREATH, K., J. HOWCROFT, K. CAMPBELL, A. COLMAN, A. SCHNIEKE, A.KIND. 2000. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from culturedsomatic cells. Nature. 405: 1066-9.MCGRATH, J., SOLTER, D.1983: Nuclear transplantation in the mouse embryo bymicrosurgery and cell fusion. Science 220: 1300-1302, 1983.McLAREN, A.1984: Methods and success of nuclear transplantation in mammals.Nature 309: 671-672, 1984.MELTON, W. 1994. Gene targeting in the mouse. Bioassays. 16:633-8.MENG, L., ELY, J.J., STOUFFER, R.L., WOLF, D.P.1997: Rhesus monkeysproduced by nuclear transfer. Bioi. Reprod. 57: 454-459, 1997.MERCHANT, H. 1997: Clonación en mamíferos: bases biológicas e implicacionesteóricas, prácticas y éticas. Ciencia 48:49-57.MUCCI, J F, ALLER,G G , KAISER , F.HOZBOR , R H , ALBEIRO .2006.Producción in vitro de embriones bovinos: suplementación de los medios decultivos con suero. Balcarce Argentina. Arch. Med. Vet. 38, No 2, 2006NATIONAL BIOETHICS ADVISORY COMMISSION. 1997: Report on cloning bythe US Bioethics Advisory Commission: ethical considerations. Hum. Reprod.Update 3: 629-641, 1997.NICHOLAS, F.W.1983: Increased rates of genetic change in dairy cattle by embryotransfer and splitting. Anim. Prod. 36: 341-353, 1983.NIEMANN, H., B. REICHELT. 1993. Manipulating early pig embryos. J ReprodFertil Suppl. 48: 5-94.ONISHI, A., IWAMOTO, M., AKITA, T., MIKAWA, S., TAKEDA, K., A WATA, T.,HANADA, H., ET AL.2000: Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei.Science 289: 1188-1190, 2000.86

OSHIMA, Y., T. SAKAMOTO, I. YAMANAKA, T. NISHI, T. ISHIBASHI, H.INOMATA. 1998. Targeted gene transfer to corneal endothelium in vivo by electricpulse. Gene Ther. 5: 1347-54.PALMA, G.A., WENNIGERKIND, H., MODI, H., BREM, G.1995: Biotecnologíasaplicadas en la reproducción bovina estado actual y aplicaciones futuras. Rev. Arg.Prod. Anim. 15: 159-165,1995.PALMITER, R., R. BRINSTER. 1985. Transgenic mice. Cell. 41: 343-5.PHELPS, C., C. KOIKE, T. VAUGHT, J. BOONE, K. WELLS, S. CHEN, S. BALL,S. SPECHT, I. POLEJAEVA, J. MONAHAN, P. JOBST, S. SHARMA, A.LAMBORN, A. GARST, M. MOORE, A. DEMETRIS, W. RUDERT, R. BOTTINO,S. BERTERA, M. TRUCCO, T. STARZL, Y. DAI, D. AYARES. 2003. Production ofalpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science 299: 411-4.PIERCE, K .. E, MICHALOPOULOS, J., KIESSLIN, A.A., SEIBEL, M.M.,ZILBERSTEIN, M. 1997: Preimplantation development of mouse and humanembryos biopsed at cleavage stages using a modified displacement technique.Hum. Reprod. 12: 351356, 1997.POLAJAEVA, LA., CHEN, S-H., VAUGHT, T.D., PAGE, R.L., MULLINS, J., BALL,S., ET AL.2000: Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells.Nature 407: 86-90, 2000.POLLOCK, D., J. KUTZKO, E. BIRCK-WILSON, J. WILLIAMS, Y. ECHELARD, H.MEADE. 1999. Transgenic milk as a method for the production of recombinantantibodies. J. Immunol. Methods. 231: 147-57.PRATHER, R., F. BARNES, M. SIMS, J. ROBL, W. EYESTONE, N. FIRST. 1987.Nuclear transplantation in the bovine embryo: assessment of donor nuclei andrecipient oocyte. Biol. Reprod. 4: 859-66.PRATHER, R., M. SIMS, N. FIRST. 1989. Nuclear transplantation in early pigembryos. Biol. Reprod. 41: 414-8.PRATHER, R.S., BARNES, F.L., SIMS, M.M., ROB, J.M., EYESTONE, W.H.,FIRST, N.L.1987: Nuclear transplantation in the bovine embryo: assessment ofdonor nuclei and recipient oocyte. Biol. Reprod. 37:859-866,PRATHER, R.S., FIRST, N.L.1990: Cloning of embryos. J. Reprod. Fert. Suppl. 40:227-234, 1990.PRUSINER, S., D. GROTH, A. SERBAN, R. KOEHLER, D. FOSTER, M.TORCHIA, D.87

REICHELT, B., NIEMANN, H.1994: Generation of identical twin piglets followingbisection of embryos at the morula and blastocyst stage. l. Reprod. Fert. 100: 163-172, 1994.REXROAD, C.E., POWELL, A.M.1997: Culture of blastomeres from in vitromatured,fertilized, and cultured bovine embryos. Molec Reprod. Dev. 48:238-245,ROMO, S. 1994: Biotecnología reproductiva: avances en ganado bovino. BoletínTécnico Internacional. Schering-Plough División Veterinaria, I-8.RORIE, R.W., GODKE, R.A.1987: Bisection of bovine embryos. In:Embryotechnologies to domestic animals T. Greve, editor. Codenhagen. 1-9, 1987.RYDER, O.A., BENIRSCHKE, K. 1997: The potential use of "cloning" in theconservation effort. Zoo. Biol. 116: 295-300.SAITO, S., NIEMANN, H.1991: Effects of extracellular matrices and growth factorson the development of isolated porcine blastomeres. Bioi. Reprod. 44: 927-936,1991.SCHMIDT, M., SMITH, S.D., AVERY, B., PURWANTARA, B., GREVE, T. 1992:Blastomere content of cultured/frozen bovine demiembryos. ActaVet. Scand. 33:363-367, 1992.SCHNIEKE, A., A. KIND, W. RITCHIE, K. MYCOCK, A. SCOTT, M. RITCHIE, I.WILMUT, A.COLMAN, K. CAMPBELL. 1997. Human factor IX transgenic sheep produced bytransfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 19: 2130-3.SEIDEL, G.E.1993: Production of genetically identical sets of mammals: cloning?J. Exp. 2001. 228:347-354, 1993.SERRANO, H., GARCÍA -SUÁREZ, M.D.1997: De niños probeta y animalesclonados. Cemanáhuac 36: 1-4, 1997.SHASTRY, B.S. 1998. Gene disruption in mice: models of development anddisease. Mol. Cell. Biochem. 1: 163-79.SINGLA, S.K., MANIK, R.S., MADAN, M.L. 1997: Application and commercialaspects of embryo cloning in cattle and buffaloes-a review. Indian J. Dairy Sci. 50:75-82.88

SMITH, L., I. WILMUT. 1989. Influence of nuclear and cytoplasmic activity on thedevelopment in vivo of sheep embryos after nuclear transplantation. Biol. Reprod.40: 1027-35.SOLTER, D.1996: Lambing by nuclear transfer. Nature 380: 24-25,1996.STICE, S. 1998. Opportunities and challenges in domestic animal embryonic stemcell research. In: Animal Breeding: Technology for the 21 st Century. AJ. Clark, ed.Harwood Academic Press, Switzerland, pp 64-71.STICE, S., J. ROBL. 1988. Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbitembryos. Biol Reprod. 39: 657-64.STICE, S.L., KEEFER, C.L.1993: Multiple generational bovine embryo cloning.Bioi. Reprod. 48: 715-719,1993.angelacortes83047@hotmail.comTANAKA, H., KANAGAWA, H. 1997: Influence of combined activation treatmentson the success of bovine nuclear transfer using young and aged oocytes. Anim.Reprod. Sci. 49:113-123, 1997.THOMPSON, S., A. CLARKE, A. POW, M. HOOPER, D. MELTON. 1989. Germline transmission and expression of a corrected HPRT gene produced by genetargeting in embryonic stem cells. Cell 56:313-21.URVEN, L.E., WENG, D.E., SCHUMAKER, A.L., GEARHART, J.D., MCCARREY,J.R.1993: Differential gene expression in fetal mouse germ cells. Biol. Reprod. 48:564-574, 1993.WASSARMAN, P.M.1999: Zona pellucida glycoprotein mZP3: a versatile playerduring mammalian fertilization. J. Reprod. Fert. 116: 211- 216,1999.WILLADSEN, S.M., GODKE, R.A.1984: A simple procedure for the production ofidentical sheep twins. Vet. Rec. 114: 240-243, 1984.WILLADSEN, S.M.1979: A method for culture of micromanipulated sheep embryosand its use to produce monozygotic twins. Nature 277: 298, 1979.WILLADSEN, S.M.1989: Cloning of sheep and cow embryos. Genome 31: 956-962, 1989.WILLIAMS, T.J., ELSDEN, R.P., SEIDEL, G.E.1983: Bisecting bovine embryos:methods, applications and success rates. Proceedings of the Animal Conferenceon Artificial Insemination and Embryo Transfer in Beef Cattle. Denver, CO, USApp. 45-51,1983.WILLIAMS, T.J., ELSDEN, R.P., SEIDEL, G.E.1984: Pregnancy rates withbisected bovine embryos. Theriogenology 22: 521-531, 1984.89

WILMUT, I., SCHNICKE, A.E., MCWHIR, J., KIND, A.J., CAMPBELL, K.H.S.1997:Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 385: 810-813, 1997.WILTON, L.J., TROUNSON, A.O.1989: Biopsy of preimplantation mouse embryos:development of micromanipulated embryos and proliferation of single blastomeresin vitro. Bioi. Reprod 40: 145- 152,1989.YONG, Z., YUQIANG, L.1998: Nuclear-cytopla smic interaction anddevelopment of goat embryos reconstructed by nuclear transplantation: productionof goats by serially cloning embryos. Biol. Reprod. 58: 266-269, 1998.ZAKHARTCHENKO, V., G. DURCOVA-HILLS, M. STOJKOVIC, W.SCHERNTHANER, K. PRELLE, R. STEINBORN, M. MULLER, G. BREM, E.WOLF. 1999b. Effects of serum starvation and re-cloning on the efficiency ofnuclear transfer using bovine fetal fibroblasts. J. Reprod. Fertil. 115: 325-31.ZAKHARTCHENKO, V., R. ALBERIO, M. STOJKOVIC, K. PRELLE, W.SCHERNTHANER, P. STOJKOVIC, H. WENIGERKIND, R. WANKE, M.DUCHLER, R. STEINBORN, M. MUELLER, G. BREM, E. WOLF. 1999a. Adultcloning in cattle: potential of nuclei from a permanent cell line and from primarycultures. Mol. Reprod. Dev. 54: 264-72.ZORAQI, G., C. SPADAFORA. 1997. Integration of foreign DNA sequences intomouse sperm genome. DNA Cell Biol. 16: 291-300.90