proteómica - Severo Ochoa - Universidad Autónoma de Madrid

II JORNADAS BIENALES DE JÓVENESINVESTIGADORES EN PROTEÓMICALa organización de las Jornadas y la edición de este número especial hancorrido a cargo de los siguientes investigadores:Ana María Maldonado Alconada (Universidad de Córdoba)Sira Echevarría Zomeño (Universidad de Córdoba)Raquel González (Universidad de Córdoba)Jesús Vázquez (CBM-SO, UAM, Madrid)Montse Carrascal (CSIC-UAB, Barcelona)Ángel García (Universidad de Santiago de Compostela)Marina Gay (CSIC-UAB, Barcelona)Antonio Marcilla (Universidad de Valencia)Salvador Martínez (CNB-CSIC)Pablo Martínez-Acedo (CBM-SO-UAM )Antonio Martínez-Ruiz (Hospital de La Princesa, Madrid)Angela Moreno (IAS-CSIC, Córdoba)Pedro Navarro (CBM-SO-UAM)Ana Oleaga (CSIC, Salamanca)Miren J. Omaetxebarría (Universidad País Vasco)Aida Pitarch (Universidad Complutense Madrid)Manuel Rodríguez (Universidad de Córdoba)Eva Rodríguez-Suarez (CIC-Biogune)Cristina Ruíz (INIBIC –A Coruña)Luis Valledor (Universidad de Oviedo)Federico Valverde (CSIC Sevilla)

6 PROTEÓMICA. Revista de la Sociedad Española de ProteómicaEditada por: Sociedad Española de ProteómicaPeriodicidad: Semestral (dos números por año, enero-febrero y julio-septiembre).Contenidos: se publicarán artículos originales, comunicaciones breves, artículos de revisión, artículos dedifusión, tutoriales, opiniones, notas, resumen de tesis doctorales, y comentarios sobre cualquier aspectorelacionado con la proteómica. Se priorizarán artículos originales sobre aspectos metodológicos o de aplicaciónal estudio de sistemas biológicos. Incluye información sobre nuestra Sociedad, personas, grupos einstituciones que la componen.Idioma: será el castellano, aunque se admiten contribuciones en otras lenguas, preferentemente inglés.Distribución: España y Latinoamérica, aunque pretendemos que tenga un carácter internacional mediantela distribución a otros países. Se enviarán, sin coste alguno, a los socios de la SEProt, Unidades y Servicios,así como a instituciones y organizaciones públicas o privadas miembros de la sociedad o con actividadrelevante en el campo de la proteómica.Publicación: habrá una versión impresa, y una versión “on-line” que aparecerá en la página web de la SE-Prot y de la Universidad de Córdoba.Editores responsables: Jesús V. Jorrín Novo y Jesús VázquezComité editorial: Juan Pablo Albar, Juan J. Calvete, Montserrat Carrascal, Ignacio Casal, Fernando Corrales,Ángel García, Concha Gil, Ana María Maldonado Alconada, Antonio Martínez Ruiz, Lucía Monteoliva,Ángela Moreno, Eliandre de Oliveira. Manuel Sánchez del Pino y Fernando VivancoCorrespondencia Editorial:Jesús V. Jorrín NovoDpto de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales, Ed. SeveroOchoa (C6), 14071 Córdoba. E-mail: bf1jonoj@uco.esInstrucciones a los autores:http://www.cbm.uam.es/seprot/Envío de los manuscritos:Mediante correo electrónico (bf1jonoj@uco.es).I.S.S.N.: 1888-0096Depósito Legal: CO-1005-07Edita: SEPROT (Sociedad Española de Proteómica)www.cbm.uam.es/seprotImprime:Argos Impresores S.L. Córdoba.

7EditorialJesús V. Jorrín Novo17Las II Jornadas para Jóvenes Investigadores en Proteómica, Córdoba 2010Jesús Vázquez, Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, RaquelGonzález181. BIOINFORMÁTICAMesa redonda sobre herramientas en bioinformáticaSalvador Martínez-Bartolomé, Pedro Navarro, Alex Campos, Marco Trevisán-Herraz,Juan Antonio Vizcaíno, Alberto MedinaAlberto Medina, Salvador Martínez-Bartolomé, J. Pablo AlbarOpen-source bioinformatics solutions for the analysis of mass spectrometry-basedproteomics data: pipelines and quantitationAlexandre R. CamposJava API for MIAPE generationEmilio Salazar, Miguel A. López, Salvador Martínez-Bartolomé, Alberto Medina, J.Pablo Albar ProteomeXchange consortiumJuan Antonio Vizcaíno, Florian Reisinger, Richard Côté, Henning HermjakobProteopathogen, una base de datos de proteínas para el estudio de la interacciónCandida albicans – hospedadorVital Vialás, Rubén Nogales-Cadenas, César Nombela, Alberto Pascual-Montano,Concha GilBioinformatics tools for inferring immune-related functions from proteomic dataGema Sanz, Ángeles Jiménez, Ángela Moreno, Juan J. Garrido20212225262830M. Alba Sorolla, Isidre Ferrer, José Lucas, Joaquim Ros, Elisa Cabiscol32 síndrome coronario agudo

8 Andrés F. Parguiña, Isaac Rosa, Lilián Grigorian-Shamagián, Elvis Teijeira-Fernández, Jana Alonso, Rosa Agra, José Ramón González-Juanatey, Ángel García ProteoMinerAntonio Rosal, Sonia García-Rodríguez, Esther Zumaquero, Pilar Navarro, MercedesZubiaur, Jaime SanchoThe MIDAS TM Qtrap TM technologyAntonio SernaMultiplexing . Scheduled MRM AlgorithmAntonio Serna Arturo Roca-Rivada, Jana Alonso, Omar Al-Massad; Luisa María Seoane, FelipeCasanueva, María PardoClaudio Diema, Alex Campos, Núria Omeñaca, Eliandre de Oliveira, Joan Guinovart,Jacques Borg, Marta Vilasecalaser microdissectionFernando de la Cuesta, Gloria Alvarez-Llamas, Irene Zubiri, Aroa Sanz- Maroto,Alicia Donado, Luis. Rodriguez-Padial, Angel Garcia-Pinto, María González-Bardera,Fernando Vivanco librerías de fagos T7 impresas en microarraysIngrid Babel, Rodrigo Barderas, Victor Moreno, Ivan Cristobo, Gabriel Capellá,Ignacio CasalmembraneIrene Zubiri, Gloria Álvarez-Llamas, Fernando de la Cuesta, María González-Barderas,Fernando Vivanco Iván Cristobo, María Jesús Larriba, Vivian De los Ríos, Ingrid Babel, Rodrigo Barderas,Alberto Muñoz, Ignacio Casal35373840404345464849

9Juan Casado-Vela, Eva Rodriguez-Suarez, Ibon Iloro, Amagoia Ametzazurra, NereAlkorta, Juan A. García-Velasco, Roberto Matorra, Begoña Prieto, Sandra González,Daniel Nagore, Laureano Simón, Felix Elortza approachesMaría González, Raquel Bartolomé, Jose María Sayagues, María González, Ana LauraMoro, Elena Andrada, Sahar Sibani, Josh LaBaer, Jacinto García, Alberto Orfao,Manuel FuentesMarina Rigau, Nuria Colome, Juan Morote, Mª Carme Mir, Carlos Ballesteros, MartaGarcia, Miguel Abal, Francesc Canals, Jaume Reventós, Andreas Dollsamples from osteoarthritis patientsPatricia Fernández-Puente, Jesús Mateos, Carolina Fernández-Costa, Cristina Ruiz-Romero, Francisco J. BlancoRaquel Bartolomé, María González-González, Jose M. Sayagües, Fridtjof Lund-Johansen, Alberto Orfao, Manuel FuentesAnticuerpos a la carta combinando expresión in vitro de proteínas, tecnología dedespliegue en fagos y arrays de anticuerposRodrigo Barderas, Ingrid Babel, Iván Cristobo, José Ignacio CasalSonia Blanco-Prieto, Nuria Sánchez-Otero, Ana M. Rodríguez-Piñeiro, M. IsabelBotana-Rial, Francisco J. Rodríguez-Berrocal, María Páez de la Cadena Sonia García-Rodriguez, María D. Pérez-Mezcua, Antonio Rosal-Vela, VictoriaLongobardo, Antonio Larios, Pilar Navarro, Raquel Largo, Gabriel Herrero-Beaumont,Jaime Sancho, Mercedes ZubiaurEstudio de la Estenosis Aórtica Valvular desde un punto de vista proteómicoTatiana Martin-Rojas, Felix Gil-Dones, Luis F. Lopez-Almodovar, Fernando de la Cuesta,Gloria Álvarez-Llamas, Fernando Vivanco, Luis R.. Radial, María G. BarderasValentina Calamia, Beatriz Rocha, Patricia Fernández, Jesús Mateos, Cristina Ruiz-Romero, Francisco J Blanco50535456585961636466

10 Virginia Sánchez-Quiles, Enrique Santamaría, Laura Sesma, Fernando J. Corrales Francesco Tortorella6870Keith Compson, James Langridge, Jeffery Brown, Steven Pringle, Iain Campuzano,Richard ChapmanMaría Ramírez-Boo, Feliciano Priego-Capote, Alexander Scherl y Jean-CharlesSanchezIsidro Masana. Reinout Raijmakers, Shabaz Mohammed, Albert Heck, Dayin LinNerea Osinalde, Miren Josu Omaetxebarria, Kerman Aloria, Ana M. Zubiaga, AsierFullaondo, Jesús M. Arizmendicuantitativa del fosfoproteomaDavid Ovelleiro, Montserrat Carrascal, Joaquin Abianproteínas en muestras vegetalesSira Echevarría-Zomeño, Per Hägglund, Birte Svensson, Ana M. Maldonado Alconada,Jesús V. Jorrín Novo Arabidopsis thaliana during the defenseresponseAna M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Christian Lindermayr, JörgDurner, Jesús V. Jorrín-Novo Esperanza Morato, Sira Echevarría Zomeño, Anabel MarinaLa inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducida experimentalmentereduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotiolesLaura M. López-Sánchez, Fernando J. Corrales, Montserrat Barcos, Isabel Espejo,Juan R. Muñoz-Castañeda, Antonio Rodríguez-Ariza717275777981838586

11 Daniel Tello, Rubén Fernández-Rodríguez, Antonio Martínez-Ruízin Schizosaccharomyces pombe by proteomic approachesSarela García-Santamarina, Susanna Boronat, Elena HidalgoLa lipoproteína lipasa de rata se nitra in vivo en respuesta a la administración delipopolisacáridoAlbert Casanovas, Montserrat Carrascal, Joaquín Abián, Miquel Llobera, M. DoloresLópez-TejerocysteinesBrian McDonagh, C. Alicia Padilla, J. Antonio Bárcena90919193 BiomarcadoresIsidro MasanaMaría luz Valero, Virginia Rejas, Manuel Mateo Sánchez del Pinodynamic rangeJuan Casado-Vela, María José Martínez-Esteso, Eva Rodríguez, Eva Borrás; FelixElortza, Roque Bru-Martínez E Kerman Aloria, Miren Josu Omaetxebarria, Mikel Azkargorta, Johannes P. C. Vissers,Asier Fullaondo, Jesús M. Arizmendi Marco Trevisan-Herraz, Pedro Navarro, Elena Bonzon-Kulichenko, Pablo Martínez-Acedo, Daniel Pérez-Hernández, Estefanía Núñez, María Luisa Hernáez, EnriqueCalvo, Montserrat Carrascal, Marina Gay, Inmaculada Jorge, Dolores Gutiérrez,Joaquín Abian, Concha Gil, Juan Miguel Redondo, Jesús VázquezAlex Campos, Jacques Borg, Claudio Diema, Marta Vilaseca, Eliandre Oliveira94969899101103A comparison of quantitative proteomics methodologies on a differential experimenton test samples

12 Joan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, Marta Monge, Francesc Canals Reiko Kiyonami, Alan Schoen, Amol Prakash, Huy Nguyen, Scott Peterman, VladZabrouskov, Andreas Huhmer, Sarah Robinson, Martin Hornshaw, MadalinaOppermann, Nathalie Selevsek, Bruno Domon1051075.1 Aspectos generalesProblemas en el análisis proteómico de muestras procedentes de organismos‘raros’María Luz Valero, Javier Ortiz, Esther Dionís, Laura Cantero, Manuel Mateo Sánchezdel Pino .5.2 Proteómica de MicroorganismosA) Proteómica de BacteriasPreparación de extractos proteicos bacterianos para el análisis de glicoproteínasAlfonso Olaya, Lidia Gómez-Gascón, Manuel J. Rodríguez-OrtegaMétodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posteriorLidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya y Manuel J. Rodríguez-OrtegaAnálisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus MALDI-TOFIsabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi MañesComparación de dos técnicas proteómicas aplicadas al análisis de las proteínas demembrana de Mycoplasma genitaliumNoemí Párraga-Niño, Núria Colomé, Francesc Canals, Jaume Piñol, Josep AntoniPérez Pons, Enrique Querol, Mario Ferrer-NavarroComparative proteomic analysis of collection and clinical-isolate strains ofStenotrophomonas maltophiliaMario Ferrer-Navarro, Elias Mongiardini, Gerard Torrent, Raquel Planell, AnaCalderón, Teresa Falgueras, Isidre Giber, Xavier DauraB) Proteómica de HongosAnálisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomycescerevisiae en dos condiciones de cultivoCarlos Luna, Teresa García-Martínez, Miguel Curto, Juan Carlos Mauricio108108110112115116118Estudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libres y

13Teresa García-Martínez, Juan Carlos Mauricio Saccharomyces cerevisiae en condiciones de ayuno en K +Miguel Curto, Clara Navarrete, Luis Valledor, María Luisa Hernández, José Ramos,Jesús Jorrín Saccharomyces cerevisiae potencialmente patógena aislada de suplementosdietéticosCarolina Hernández-Haro, Lucía Monteoliva, Gloria Molero, Concha Gil, MaríaMolinaAnálisis comparativo de diferentes aproximaciones para el estudio del proteomade Saccharomyces cerevisiaeDolores Gutiérrez, Mª Luisa Hernaéz, Montserrat Martínez-Gomariz, María Posada,Concha GilApplying proteomic technologies to dissect molecular aspect of phytopathogenicfungi, a Botrytis cinerea approachFrancisco Javier Fernández-Acero, Carlos Garrido, María Carbú, Victoria E. González-Rodríguez, Jesús Manuel Cantoral Botrytis cinerea. The differences in virulence-related protein abundance among strainsRaquel González-Fernández, Inmaculada Redondo, Jesús V. Jorrín-NovoProteomic approach to Botrytis cinerea survival structuresVictoria E. González-Rodríguez, Carlos Garrido, Maria Carbú, Jesús Manuel Cantoral,Francisco Javier Fernández-AceroCandida enel pronóstico de las candidiasis invasivasAida Pitarch, César Nombela, Concha Gil por mutantes del hongo Candida albicanscontienen el dominio CFEM rico en cisteína y genes implicados en glicosilaciónRosario Blanes, Ana M. Pérez, Amelia Murgui, Manuel Casanova, Ángel Domínguez,José P. MartínezExpresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras lainteracción con Candida albicansJose Antonio Reales-Calderón, Mª Luisa Hernáez, Mª Dolores Gutiérrez, Gloria Molero,Concha Gil1191211231241261281301311331355.3 Proteómica de Parásitos

14 Javier Sotillo, Ana Pérez García, María Trelis, Dolores Bernal, Carla Muñoz-Antolí,José Guillermo Esteban, Rafael Toledo, Antonio Marcilla Javier González-Miguel, Rodrigo Morchón-García, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas,Ricardo Pérez-Sánchez, Fernando SimónNeospora caninum implicadas en procesos de invasióny virulenciaVirginia Marugán-Hernández, Javier Regidor-Cerrillo, Gema Álvarez-García, FionaTomley, Adriana Aguado-Martínez, Mercedes Gómez-Bautista, Luís Miguel Ortega-Mora minoritarios de la saliva de Ornithodoros moubataRicardo Pérez-Sánchez, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Verónica Díaz-Martín, Eduardode la Torre Escudero, Ana Hernández-González, Raúl Manzano-Román Trypanosoma cruziMucinassociated Surface ProteinsLuis Miguel De Pablos ,Gloria González, Víctor Seco Hidalgo, Isabel María DíazLozano, Antonio OsunaLeishmania parasitesM. Auxiliadora Dea-Ayuela, Riccardo Concu, Lázaro G. Perez-Montoto, EugenioUriarte, Francisco Bolás-Fernández, Florencia Ubeira, Humberto González-Díaz136138140143145147plantasMarina Trigueros, Mónica Rojas-Triana, Maria Luisa Irigoyen, Javier Paz-Ares,Vicente RubioMedicago truncatula leaves in response to UromycesstriatusMª Ángeles Castillejo, Jesús V. Jorrín, Diego RubialesAnálisis proteómico del desarrollo sexual mediado por anteridiógeno en elBlechnum spicantVirginia Menéndez, Luis Valledor, Ángeles Revilla, Helena FernándezProteome regulation and epigenetic code during Pinus radiata needle maturationLuis Valledor, María Jesús Cañal, Christof Lenz, Roberto Rodríguez, Jesús Jorrín149150152153Quercus

15ilex subsp. ballota comparativa basada en electroforesis bidimensionalJosé Valero Galván, Rafael Mª Navarro Cerrillo, M a Cristina Romero Rodríguez, DavidAriza, Jesús Jorrín Novobidimensional en fruta de huesoEsther Giraldo Ramos, Amelia Díaz Méndez, Alfredo García SánchezComparative proteomic analysis of Arabidopsis wild-type and Fawrky1 transgenic Fragaria x ananassa regulators of resistanceAlba Ruíz-Ramos, Francisco Amil-Ruíz, Juan Muñoz-Blanco, José Luis Caballero, AnaM. Maldonado AlconadaArabidosis thaliana Marina Ribeiro-Pedro, Fátima Ezzahra Said, María Teresa Ruiz, José María Romero,Federico Valverdea free amino acid-based biostimulatorMaría JoséMartinez-Esteso, MayteVilella-Antón, Susana Sellés-Marchart, Anna Botta-Català, Rafael Piñol-Dastis , Roque Bru-Martinez tetraspanin associated proteins in T Limphocytes using second generationproteomics techniquesDaniel Pérez-Hernández, Elena Bonzón-Kulichenko, Pablo Martínez-Acedo, Pedro J.Navarro, Estefanía Núñez, Marco Trevisan-Herraz, María Yáñez-Mo, Mónica Sala-Valdés, Mª Ángeles Ursa, Francisco Sánchez-Madrid, JesúsVázquezAnna Marco, Gemma Rovira, Anna BassolsLa Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productoscárnicosMiguel Ángel Sentandreu, Paul D. Fraser, Enrique Sentandreu, Leticia Mora, Peter M.Bramleydigestión in vitro de la carne de cerdoElizabeth Escudero, Miguel Angel Sentandreu, Keizo Arihara, Fidel ToldráLeticia Mora, Miguel Angel Sentandreu, Fidel ToldráInstrucciones a los Autores156158160162164167168170172175177

17EDITORIALProteómica y las Jornadas caminan y deben caminar de la manoBienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica”. El proyecto, concebido por Jesús Vázquez,tuvo su bautizo en Barcelona, en febrero de hace dos años, y su organización corrió acargo de Montse Carrascal y Marina Gay (Proteómica 1, febrero 2008). La segunda ediciónse traslada a Córdoba, donde podremos recordar con nostalgia y cariño el periodo 2003-2005,el que transcurrió entre la primera reunión formal de proteómica en nuestro país (I Jornadassobre Proteómica UCO-2003) y el I Congreso de la recién creada SEProt. Como siempre,¡bienvenidos a esta vuestra casa!Este número aúna dos de los objetivos prioritarios de nuestra Junta directiva para elpróximo periodo, las Jornadas para Jóvenes Investigadores y la revista Proteómica, lo que,como co-editor responsable de la segunda, no deja de ser una enorme satisfacción. Estoyconvencido que el éxito de ambos proyectos, en especial de la revista, va a depender, en granmedida, de ese caminar juntos. Ya, desde esta editorial, quiero hacer una llamada al grupo deJóvenes Investigadores de la Sociedad para que os incorporéis al Comité Editorial.He sido un observador privilegiado, y actor pasivo, del devenir de las Jornadas, desdeque Jesús Vázquez promovió e impulsó la idea. El excelente trabajo realizado por Anita lo hepodido seguir día a día; a pesar de sus continuos desasosiegos, siempre tuve claro, tanto porel proyecto en sí como por su forma de ser y dedicación, que sería un éxito, tanto en el planoa nivel personal como en nombre de la Sociedad. Este agradecimiento y cariño ha de hacerseextensivo a Ángela Moreno, la persona que siempre está sin querer estar, y a Jesús Vázquez,el único senior al que dan cabida entre los jóvenes, posición que se ha ganado con creces. Losproyectos no son sólo de una, dos, o tres persona, sino de un buen equipo, y el de las Jornadasno es una excepción. Anita ha contado con la inestimable ayuda de Mª Carmen Molina Ruiz,Sira Echevarría Zomeño y Raquel González, y, ¡como no¡ de María Teresa Montero, al frente delos coordinadores de las diferentes sesiones, y de, lo último aquí, pero primero de las Jornadas,los investigadores que han presentado, como norma general, excelentes trabajos.A todos vosotros, muchísimas gracias!Jesús V. Jorrín Novo

18 Las II Jornadas de Jóvenes Investigadores en Proteómica, Córdoba 2010Jesús Vázquez, Ana M. Maldonado-Alconada, Sira Echevarría-Zomeño, Raquel GonzálezA raíz del éxito de las “I Jornadas Bienales deProteómica para Jóvenes Investigadores” (Sitges de este evento en los años alternos a los congresoscomo parte de las actividades de la Sociedad Españolade Proteómica. De hecho, las Jornadas respondena uno de los principales objetivos de la SEProt:de promover la comunicación entre los grupos queusamos la Proteómica. Como bien sabéis, la característicadiferencial de estas Jornadas respecto a loscongresos convencionales radica en el énfasis encontemplar aspectos prácticos y técnicos al mismolos socios “jóvenes” para organizar este evento. Es-y su apoyo constante.2009) presentamos con mucha ilusión la candidaturapara celebrar las “II Jornadas de Jóvenes Investigadoresen Proteómica” en la Universidad de Córdoba,un centro con una trayectoria conocida a nivelnacional e internacional por los esfuerzos realizadosen esta área y que ha jugado un papel fundamentalen el desarrollo de la Proteómica en España. Ademásde ser la sede de congresos y de cursos relacionadoscon la Proteómica, cabe recordar razonessentimentales e históricas que ligan Córdoba a laProteómica. Fue en Córdoba, en febrero de 2003,donde tuvo lugar el Congreso constituyente de laSociedad Española de Proteómica, y también fueCórdoba la que albergó en 2005 nuestro primer congreso,que coincidió con la creación de la EuropeanProteomics Association.En esta ocasión, una vez más, hemos contadocon el apoyo incondicional del Vicerrectorado deInvestigación de la Universidad de Córdoba. Queremosdar las gracias especialmente al Profesor D.Enrique Aguilar Benítez de Lugo, Vicerrector de-rectorado como sede de estas Jornadas. Sin duda,un aliciente más para participar en las “II JornadasBienales de Jóvenes Investigadores en Proteómica”que se celebrarán en Córdoba los días 11 y 12 defebrero de 2010.Tras la reunión de la JD en marzo del 2009, en laque se aprobó la candidatura de Córdoba, comenzóla información en relación a las mismas, que haido actualizando a medida que se concretaban loscontenidos de las sesiones, se puede encontrar enla dirección http://www.jjip.fundecor.es/, a la quese puede acceder también a través de la página webde la Sociedad. En línea con el espíritu de las mismasy sus objetivos, se hizo hincapié en el carácteracogida fue excelente y hemos recibido multitudde propuestas sobre posibles sesiones temáticas,formas de organizarlas y para participar como coordinadoresde las mismas.Una vez recogida la “lluvia de ideas” el Pro-temáticas que se detallan a continuación, cada unade ellas coordinadas por expertos en el área (entreparéntesis): Biomarcadores y Patologías Humanas(Ángel García de la Univ. de Santiago de Compostelay Cristina Ruíz del INIBIC, A Coruña); Bioinformática(Salvador Martínez de Bartolomé delCNB-CSIC y Pedro Navarro del CBMSO-CSIC);Proteómica Microbiana y de Parásitos (Aída Pitarchde la Univ. Complutense, Antonio Marcilla de laUniv. de Valencia, Ana Oleaga del CSIC, Salamancay Manuel Rodríguez de la UCO); Proteómica Vegetaly Animal (Luis Valledor de la Univ. de Oviedoy Federico Valverde del CSIC Sevilla); ProteómicaCuantitativa (Miren J. Omaetxebarría de la Univ.País Vasco y Eva Rodríguez-Suarez del CIC Biogu-Gay y Montse Carrascal del CSIC/UAB, AntonioMartínez-Ruiz del Hospital de La Princesa y PabloMartínez-Acedo del CBMSO-CSIC).En esta ocasión hay que destacar una novedadque los coordinadores han tenido total libertad paraorganizar sus sesiones de la forma que han consideradomás apropiada. Además de comunicacionesorales seleccionadas por los coordinadores, habrá

19paneles, mesas redondas con expertos en cada área,y debates y foros de discusión en los que se tratarántemas concretos sugeridos y votados previamentepor los socios. Cualquiera que sea el formato de lassesiones, se ha intentado dar libertad total a los coordinadoresy se ha considerado prioritario contemplarlínea con el espíritu del evento.Aunque en el momento de escribir esta reseñano estaba cerrado el plazo de inscripción, a día dehoy el número de participantes en estas Jornadassupera los 150. Hemos recibido 88 comunicaciones,distribuidas entre las diferentes sesiones temáticas,enviadas tanto por grupos con una trayectoria deinvestigación en proteómica, como por laboratoriosque comienzan a hacer sus primeras incursiones ende los resúmenes recibidos, podemos augurar eléxito de estas Jornadas. Que será el resultado delentusiasmo de los socios y del excelente trabajo quehan llevado a cabo los coordinadores de las sesionesque participen y envíen sus comunicaciones, y haciendouna investigación exhaustiva de cuales sonlas novedades, los retos y las limitaciones técnicasen sus áreas respectivas. Tenemos que mencionarque, dado el alto índice de participación, uno de losprincipales problemas a los que hemos tenido quehacer frente durante la organización ha sido “llegara un acuerdo” sobre la distribución del tiempo asignadoa cada sesión. En el momento de escribir esteresumen estamos todavía intentando resolver estaConvencidos de que el éxito de estas Jornadasdepende también de la difusión de sus contenidos,tal y como ocurrió en la anterior edición, éstos aparecenpublicados en forma de resúmenes extendidosen este número de Proteómica. De nuevo, ello hasido posible gracias a la labor de revisión y ediciónllevada a cabo por los coordinadores. Está previstoque una vez celebradas las Jornadas, los temas dediscusión y debate y las conclusiones obtenidas se-Como viene siendo habitual en los eventos organizadospor la Sociedad, las casas comercialeshan respondido con gran generosidad y entusiasmo.Su participación va mucho más lejos de la aportacióneconómica, pero este año queremos agradecerespecialmente la ayuda que nos han brindado enciera.Muchas gracias por su generosa participaciónApplied Biosystems, Bio-Rad, Isogen, Bruker,Beckman-Coulter-Izasa, Sigma y Nucliber. AppliedBiosystems patrocina el premio a la mejor comunicación(de entre todas la presentadas, tanto enformato póster como comunicación oral) y Thermola mejor sesión, ambos dotados de 300€. Queremosagradecer a todas las casas comerciales el apoyoinestimable que nos brindan.De nuevo queremos transmitir nuestro agradecimientoa la JD por su respaldo incondicional, conFernando Corrales a la cabeza, y a Ángela Morenocuya ayuda ha sido imprescindible. Muchas graciastambién a Mª Carmen Molina por su ayuda y suempeño en que todos se lleven un recuerdo imborrablede Córdoba. Esperamos que esta edicióntenga como mínimo el mismo éxito que la anterior.El buen hacer y el entusiasmo demostrado por todoslos participantes nos hace creer que así será. Es unplacer y un honor recibiros a todos en Córdoba losdías 11 y 12 de febrero.

20 1. BIOINFORMÁTICACoordinadores: Salvador Martínez-Bartolomé y Pedro NavarroMesa redonda sobre herramientas en bioinformáticaSalvador Martínez-Bartolomé 1 , Pedro Navarro 2 , Alex Campos 3 , Marco Trevisan-Herraz 2 , JuanAntonio Vizcaíno 4 , Alberto Medina 11ProteoRed – Laboratorio de proteómica del Centro Nacional de Biotecnología – CSIC, Madrid. 2 Laboratoriode química de proteínas del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa – CSIC, Madrid. 3 Plataforma de 4 Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK.El desarrollo y aparición de nuevas tecnologíasaplicadas a la proteómica han dado lugar a un crecimientoespectacular de datos experimentales. Lacaptura, el almacenamiento, el procesamiento y elanálisis de estos datos es, en numerosas ocasiones,un cuello de botella que debemos solucionar paraseguir avanzando en el campo.Pese a que, paralelamente, han aumentado losproyectos de desarrollo de herramientas y serviciosbioinformáticos aplicados a la proteómica, es muydifícil conocer todos los recursos disponibles. Muchosde estos proyectos son de software libre [http://www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/Software-List], y por tanto, disponibles de forma gratuita,la mayoría de las veces, a través de Internet. Laaparición de la proteómica de segunda generacióny los análisis a gran escala ha permitido los llamadosestudios de biología de sistemas, cuyos análisisserían imposibles de hacer sin herramientas bioinformáticasadecuadas. Por otro lado, es destacabletambién el avance en los últimos años de nuevastécnicas de marcaje isotópico y label-free que permitenrealizar estudios de proteómica cuantitativa.En dichos análisis, es necesario seguir metodologíasestadísticas rigurosas para minimizar la detección defalsos cambios de expresión. Numerosos grupos deinvestigación se resisten a utilizar herramientas nocomerciales, o desconocen la existencia de una alternativa.Otro problema existente relativo al manejo delos datos en proteómica es el intercambio de dichosdatos entre diferentes plataformas, laboratorios yherramientas. Es por ello por lo que el desarrollo deestándares se hace crucial, y es necesario conocer lasherramientas existentes que permiten la conversiónentre los formatos propietarios y los estándares.Todas estas cuestiones que surgen alrededor de laproteómica y la bioinformática nos han hecho pensarque un formato de mesa redonda podría ser ideal enunas jornadas que pretenden ser un espacio de intercambiode información entre los proteómicos y bioinformáticosespañoles. En dicha mesa redonda pretendemosplantear los problemas que más nos preocupana los proteómicos y que pueden ser resueltos, al menosen parte, por medio de recursos bioinformáticos. Porello, se realizó una encuesta, cuyos resultados se muestrana continuación (Figura 1), para elegir de entre unostemas propuestos, los que resultan más interesantespiladoslos prácticamente 200 votos que se recibieron,resultaron destacados tres temas principales: herramientasde biología de sistemas, estadística en proteómicacuantitativa y software libre en proteómica.Figura 1. Número de votaciones obtenidas en la encuestacon la que se sondearon los temas más interesantes parala comunidad proteómica española. Los temas propuestosfueron: “herramientas de biología de sistemas”, “análisisde resultados en proteómica cuantitativa”, “software libreen proteómica”, “combinación de motores de búsqueda”,“estándares en informes de experimentos en proteómica” y“estándares de formato de datos en proteómica”.

21Para la sesión hemos buscado personas con laser las personas de referencia en el debate sobredichos temas:Alberto Medina (CNB-CSIC), pionero de laproteómica computacional en España, con dilatadaexperiencia en temas relacionados con la biologíade sistemas como la búsqueda de anotaciones y losrepositorios de información biológica y proteómica,así como en temas relacionados con estándares.Alex Campos (PCB), experimentado usuario deherramientas de software libre aplicadas a la proteómica,así como de estándares y herramientas deconversión de formato de datos.Marco Trevisan (CBMSO-CSIC), uno de losuso gratuito para instituciones públicas y conocedorde los problemas a resolver con la estadística en laJuan Antonio Vizcaíno (EMBL-EBI) integrantedel proyecto PRIDE (database) [1], ha participado en estudios de mineríade datos de espectrometría de masas y es participanteen el desarrollo de estándares de la iniciativa deHUPO-PSI [2].Cada uno de ellos realizará una muy pequeñaintroducción de los temas propuestos, y seguidamentese aprovechará la mayor parte del tiempo dela sesión en el intercambio de información entre losasistentes y nuestros “expertos”.Creemos que entre los cuatro forman una mesamuy interesante y esperamos que podamos proporcionaruna sesión fructífera para todos.Referencias[1] Vizcaino JA, Cote R, Reisinger F, Foster JM,Mueller M, Rameseder J, et al. A guide to thedata repository. Proteomics 2009;9:4276-83.[2] Orchard S, Hermjakob H y Apweiler R. Theproteomics standards initiative. Proteomics2003;3:1374-6.J. Alberto Medina-Aunon 1,2 , Salvador Martínez-Bartolomé 1,2 , J. Pablo Albar 1,21Proteomics Facility, National Center for Biotechnology (CNB-CSIC), 2 Spanish Proteomics Institute(ProteoRed).Information derived by proteomics experimentssuch as sample preparation and separation, masssentedusing different and sometimes incompre-for daily life. To deal with this problem, severalinitiatives have been developed: HUPO-PSI MIAPEand XML-based formats [1], XML-based repository:PRIDE [2], etc... All of them are contributingeffectively within a Proteomics scope, but somelacks regarding the translation between some of theprevious schemas are still confusing.In order to contribute to this situation, we havedeveloped a new Sun Java application accessible onthe Internet (http://www.proteored.org/). This toolhas been designed using common graphics librariesand latest XML parsers offering a friendly and easyCurrently, the application is able to manage the-PE Gel, MS and MSI documents (MS Excel andXML format), GelML, and PRIDE.To illustrate this innovative work we realizedtwo tests, both of them based on the translationbetween GelML and MIAPE Gel schemas. InputExcel template and 2) ProteoRed MIAPE web site(www.proteored.org). Both schemas are perfectly

22 complementary: MIAPE Gel presents a lot of informationaccording to protocols, methods and imagesand GelML could exchange this information withother bioinformatics tools. In spite of the fact thatboth present a great combination, some problemsappeared during the transformation. For instance,peline-whereas GelML is a FUGE based one, dividingthe information along several linked sections.Furthermore, any assumption can be done about thecardinality of the relationships between both exam-The described work results a proper correspondencebetween both formats, allowing a complete translationbetween MIAPE Gel and GelML schemas.References[1] Martens L, Orchard S, Apweiler R and HermjakobH. Human proteome organization proteomicsstandards initiative: data standardization,a view on developments and policy. Mol CellProteomics 2007; 6: 1666-1667.[2] Jones P, Côté RG, Martens L, QuinnAF, TaylorCF, Derache H and ApweilerR. PRIDE: a public repository of protein andmunity;Nucl Acid Res. 2006; 34 (Databaseissue): D659-D663.Figure 1. Translation between proteomics standards willbe easier.Open-source Bioinformatics Solutions for the Analysis of Mass SpectrometrybasedProteomics Data: Pipelines and QuantitationAlexandre R. CamposProteomics Platform, Barcelona Science Park, Barcelona, SpainThe proteomics community has been generatingopenly available software framework for systematicproteomic data analyses and management. Processingand analysis of proteomics data involves a complex,peptide assignment to MSMS experimental spectra,some cases, MS-based quantitation. Here, I list anumber of freely available and open-source computationaltools for the analysis of proteomics data. Par-ticularly, I focus on available platforms and pipelines,and software for MS-based quantitation.1. Platforms and Pipelines for LC-MS andLC-MS/MS Data Analysistrometersarose the necessity of developing newbioinformatics solutions for mining large data sets.In the past years, we have witnessed a dynamic

23software development process that embraces variousfunctionalities of data analysis process suchas the preprocessing of MS data, evaluation andassignment of MS/MS spectra to peptide sequences,comparison and quantitation of multiple LC-MS experiments. The burgeoning of proteomicsdata has fostered the development of a number ofpublic domain proteomics pipelines that integratea number of open-source, cross-platform tools providinga pluggable development framework for thehttp://tools.proteomecenter.org/software.phpThe TPP is a collection of integrated tools forLC-MS/MS data analysis, developed at the SeattleProteome Center (SPC). The suite includes toolsfor conversion of instrument vendor’s raw data tomzXML or mzML formats; conversion of spectralsearch engine (Mascot, X!Tandem, Sequest, Phenyx,OMSSA) results to pepXML format; and statisticalvalidation of search engine results at the peptide- andprotein-level with PeptideProphet and ProteinProphet,respectively (and iProphet to combine multiplesearch results). TPP also supports quantitation analysisfor MS1 and MS2 labeling techniques.home/begin.viewThe Computational Proteomics Analysis System(CPAS) is implemented as a Tomcat web-basedapplication for mining LC-MS/MS proteomic experiments.CPAS is distributed with X!Tandem searchengine and the PeptideProphet and ProteinProphetvalidation tools; in addition, it can be also used withother search engines, including Mascot and Sequest.sort, customize, compare, and export experimentXPRESS quantitation analyses. In contrast to TPP,CPAS helps manage information about biologicalsamples and preparation protocols.4. TOPP - OpenMS Proteomics Pipelinehttp://open-ms.sourceforge.net/TOPP.phpTOPP is a customizable collection of severalsmall applications, based on OpenMS, an opensourceC++ library for LC-MS data management andanalysis. The individual applications of TOPP canbe grouped into several distinct packages: import/and analysis. Importing data into TOPP is handledwith the FileConverter, which converts several commonlyused MS formats into each other. Supportedformats are mzML, mzData, mzXML, among otherformats. TOPP shares most of the features providedby other pipelines; in addition, TOPP provides a setof computationaltools for signal preprocessing (e.g.,denoising, baseline correction, and smoothing), andprocessing (e.g., peak picking, deisotoping, centroiding,and feature extraction).http://www.proteios.org/ProSE was initially created as a repository forproteomics data, and just recently has been extendedto automate some data assembly and reporting.ProSE different from other platforms is the availabilityof a programming interface for method developersto write extensions and plug-ins. Extensionsand plug-ins make ProSE a highly customizable platform.One can for instance carry out batch searchesand then automatically upload the results to ProSE.In addition, data can be extracted into dedicated databasetables for further work with the results, suchsearch results.6. Software for Analysis of MS-based QuantitativeProteomics DataIn the past years, MS-based quantitation hasemerged as a promising core technology for pro-available MS platforms for quantitative proteomicsinto three categories: 1) identity-based methods thatrely on peptide analysis by data-dependent LC-MS/2) pattern-only methods that focus on production ofMS-derived protein patterns, and 3) hybrid identity/pattern-basedmethods use pattern recognitionalgorithms to ex post facto assign the identity ofLC-MS peaks against databases of peptide sequence,mass, and retention time built from multiple

24 Table 1. Summary of tools for MS-based quantitative proteomics data analysis.SoftwareInput spectraformatInput peptideformatType ofquantitationLanguageGraphical UserInterface?OperatingSystemCensusMS1/MS2 or mzXMLDTASelect orpepXMLMSQuant Instrument vendor raw e Mascot resultsMaxQuantXCalibur .raw e (highresolution)Mascot resultsa The acronym L.O.W. refers to Linux, OSX and WindowsMS1, MS2 andLabel-free (Id)MS1, MS2 andLabel-free (Id)SILAC and labelfree(Id)Java Yes a.NET Yes .NET Yes XPRESS mzXML pepXML MS1 C++ Yes b aASAPRatio mzXML pepXML MS1 C++ Yes b aMulti-Q mzXML pepXML MS2 .NET Yes iTracker .mgf or .dta none MS2 Perl No aQuant .mgf Mascot .dat MS2Matlab or.NETb Using TPP graphical user interfacec Using GenePattern graphical user interfaced e Label-free methods: SC (Spectral Counting); Id (Identity-based); HIP (hybrid identity/pattern-based); and AMT (accuratemass and time)MS1: methods based on precursor intensity or area (e.g., 15N, 18O, SILAC)MS2: methods based on reporter ions in MS/MS (e.g., iTRAQ, TMT)Yes a(Matlab)Libra mzXML pepXML MS2 C++ Yes b aAPEX none pepXML Label-free (SC) Java Yes aSuperHirn mzXML pepXML Label-free (HIP) C++ No aPEPPeRFeature list (e.g.,msInspect)PEPPeR .txt format Label-free (HIP) Perl Yes c amsInspect mzXML pepXMLLabel-free (Id, HIP,AMT)Java Yes aIDEAL-Q mzXML pepXML Label-free (HIP) .NET Yes msBID mzXML pepXML Label-free (Id) Java,Perl No aTOPP mzML TOPP adaptersPNNLpipeline d ormzXMLX!Tandem orSequestMS1, MS2 andLabel-free (Id)C++ Yes aLabel-free (AMT) .NET Yes aexperiments. As MS-based quantitation remains arimentalapproaches, a large number of open-source(or freely available (academic)) software has beencommunity (Table 1).Reference[1] Jaffe JD, Mani DR, Leptos KC, Church GM,Gillette MA y Carr SA. PEPPeR, a platform forexperimental proteomic pattern recognition. MolCell Proteomics 2006;5:1927-41.

25Java API for MIAPE GenerationEmilio Salazar Donate, Miguel Ángel López García, Salvador Martínez-Bartolomé, J. AlbertoMedina-Aunon, Juan Pablo AlbarProteoRed, Proteomics Facility, Centro Nacional de Biotecnología (CNB), Consejo Superior deThe HUPO- PSI (Human Proteome Organiza-necommunity standards for data representation inproteomics to facilitate data comparison, exchangeOne of these standards is the MIAPE-speci-About a Proteomics Experiment, contains the basicreporting guidelines for proteomics. Although,these guidelines are an invaluable support for experimentsdue to its acceptance by the proteomicsevery experiment requires a time consuming dutyfrom the user side.The Miape JAVA API (Application ProgrammingInterface) developed by the CNB-ProteoRedProteomics Bioinformatics Support group providesthe user with a powerful, platform-independentprogrammatic interface to store, retrieve and exportMIAPE documents in different formats. The librariesand the documentation are freely available atwww.proteored.org/miape-apiis via the abstract entity Miape, which includes theinformation available about the experiment, regardlessif it has been generate via XML, manually orit has been retrieved from the database.Moreover, the API allows the user to convertthe data from one module to another, favoring theexchange of information in very different formats.The modules are:Database Manager module: retrieves/storesdocuments from the ProteoRed Database,a relational database which has, so far, morethan 700 documents. However, this modulecan be easily extended to be used in otherDatabases (relational or not).XMLdifferent XML formats to generate the MIA-PE documents.Factory module creates a document manuallyby programmatically adding the informationto the document.The language of the API is Java, an object-orientedlanguage, massively used in professional andacademia environments due to its maintainability andThe aim of the API is to be integrated into thirdparty software to automatically generate a MIAPE,decreasing the amount of extra work which thisnormally involves. So far, the user must manuallysubmit this information independently, using thesemi-automatic MIAPE generator tool [3], whichallows the user to create a MIAPE, using templateswith some initial information.The API is divided in several independent modules,which can be extended for customization,(see Figure 1). The interaction between the modulesFigure 1. The different modules of the Miape JAVA API andtheir interactions.

26 References[1] Kaiser J. Proteomics. Public-private group mapsout initiatives. Science 2002;296:827. RK, Jr., Jones AR, et al. The minimum informationabout a proteomics experiment (MIAPE).Nat Biotechnol. 2007; 25:887-93.[3] Martínez-Bartolomé S, Medina-Aunon JA, JonesAR, Albar JP. “Semi-automatic tool to describe,store and compare proteomics experiments basedon MIAPE compliant reports”. Proteomics(in press) 2009.ProteomeXchange consortiumJuan Antonio Vizcaíno, Florian Reisinger, Richard Côté, Henning HermjakobAbstract-DE, http://www.ebi.ac.uk/pride) has become one ofthe main repositories of mass spectrometry derivedproteomics data. In this communication we willsummarize the main capabilities of the PRIDE system,including its associated tools. Finally, we willintroduce the ProteomeXchange consortium, as acollaborative approach to share proteomics data betweenthe most important proteomics repositories.(http://www.ebi.ac.uk/pride) at the European BioinformaticsInstitute (EBI) provides users with theability to explore and compare mass spectrometry(MS) based proteomics experiments that reveal detailsof the protein expression found in a broad rangeof taxonomic groups, tissues and disease states [1].PRIDE stores three different kinds of information:or MS/MS experiments, MS and MS/MS mass spectraas peak lists, and any and all associated metadata.PRIDE is now the recommended submission pointfor proteomics data for several journals such as NatureBiotechnology, Nature Methods, Molecular andCellular Proteomics, and Proteomics.ebi.ac.uk/olsferencingsystem [3] (PICR, http://www.ebi.ac.uk/Tools/picr). OLS provides convenient and powerfulaccess to a large number of biomedical ontologiesand controlled vocabularies (CVs). PRIDE takesadvantage of OLS to store, structure, and presentany and all metadata annotations on experiments,proteins, peptides and mass spectra.The PICR tool on the other hand, is built to overcomeone of the most recurrent problems in proteomics:the existence of heterogeneous and changingprotein in different databases. PICR is used to mapto all known accession numbers for those proteinsin the most important protein databases (includingUniProt, IPI, Ensembl and RefSeq, among others).originally derived from different databases, or fromdifferent time points of the same database, thus becomefully comparable. In addition to these two establishedtools, a new application called Database onDemand [4] (DoD, http://www.ebi.ac.uk/pride/dod)has recently been added to the PRIDE toolkit. Thistool allows custom sequence databases to be built inorder to optimize the results from search engines forgel-free proteomics experiments.1. PRIDE associated toolsPRIDE relies heavily on two additional tools:the Ontology Lookup Service [2] (OLS, http://www.2. ProteomeXchange ConsortiumOne of the reasons why proteomics data sharingis not a universal fact yet is the heterogeneity of the

27existing proteomics repositories, each repositoryhaving a major focus. This is why the ProteomeXchangeconsortium was founded [1]. The currentmembers and the way they interact are representedin Figure 1. Guidelines for ProteomeXchange sub-http://www.proteomexchange.org),and include three mandatory data typesthat will have to be included per submission: ins--A large scale ProteomeXchange pilot submissionhas already been performed containing data fromthe HUPO Plasma Proteome Project 2 (PPP 2) [5].Therefore, certain experiments in PRIDE (experimentaccession numbers 8172-8544, http://www.ebi.ac.uk/pride/ppp2_links.dostored in the Tranche repository in the “ExperimentView” page. For these experiments, it is thereforealready possible to get the original raw data orsuch in the PRIDE system.References[1] Vizcaíno JA, Côté R, Reisinger F, Foster J,Mueller M, Rameseder J, et al. A guide to thedata repository. Proteomics 2009;9:4276-83.[2] Côté RG, Jones P, Martens L, Apweiler R.and Hermjakob H. The Ontology LookupService: more data and better tools for controlledvocabulary queries. Nucleic Acids Res[3] Côté RG, Jones P, Martens L, Kerrien S, ReisingerF, Lin Q, et alCross-Referencing (PICR) service: reconcilingbases.BMC Bioinformatics 2007;8:401.[4] Reisinger F. and Martens L. Database on Demand– an online tool for the custom generationof FASTA formatted sequence databases. Proteomics2009;9:4421-4.[5] Omenn GS, Aebersold R. and Paik YK. 7(th) chingthe second phase of the HUPO PlasmaProteome Project (PPP-2) 16-20 August 2008,Amsterdam, The Netherlands. Proteomics2009;9:4-6.Figure 1. -via PRIDE or NCBI Peptidome. The ProteomeXchangepartners then ensure data are distributed internally, ultimatelygiving users the ability to access the data from anyparticipant database.

28 Proteopathogen, una base de datos de proteínas para el estudio de la interacciónCandida albicans – hospedadorVital Vialás 1 , Rubén Nogales-Cadenas 2 , César Nombela 1 , Alberto Pascual-Montano 2 , ConchaGil 1,31Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid. 2 Departamentode Arquitectura de Computadores y Automática, Facultad de Ciencias Físicas, UniversidadComplutense de Madrid. 3 Universidad Complutense de MadridExisten en la actualidad repositorios públicos enla web para el almacenamiento y gestión de datoshongos. Sin embargo, ninguno de ellos está enfoca-gospatógenos y su interacción con el hospedador ycontiene además datos experimentales proteómicos.En este contexto presentamos Proteopathogen, unabase de datos orientada a recopilar datos experimentalesproteómicos y a facilitar el almacenamiento yacceso a un amplio rango de información, abarcandocióndel experimento que lleva a la preparación dela muestra hasta los parámetros de espectrometríaciones.Proteopathogen está actualmente enfocadohacia Candida albicans y su interacción con macrófagos,sin embargo, datos experimentales relativosa otras especies de hongos patógenos y células demamíferos pueden ser adecuados para la inserciónen la base de datos. Proteopathogen es públicamenteaccesible en http://proteopathogen.dacya.ucm.es.Candida albicans es un hongo patógeno oportunistapresente habitualmente en las mucosas humanas.En individuos inmunocomprometidos puedeproliferar excesivamente y provocar candidiasis,una micosis muy extendida y en ocasiones fatal. Eneste sentido, abordar estudios proteómicos sobrela interacción de Candida con células del sistemainmune es clave para mejorar nuestra comprensióndel proceso de infección y puede suponer un pasoinicial en investigación básica para el futuro desarrollode métodos de diagnóstico, vacunas y fármacosantifúngicos.Respecto a la recopilación de información contenidaen Proteopathogen, se han incluido datos correspondientesa tres experimentos. Los dos prime-ros corresponden a trabajos de interacción Candida– macrófago [1,2] de los cuales el primero incluyeCandida y el segundo,38 proteínas de macrófago. El tercer estudio es unconjunto de experimentos destinados a la extracciónnascon anclaje GPI [3] de C. albicans.Además de la información experimental, y conel objetivo de proporcionar una visión más ampliade los datos, se recuperó información relevante debases de datos en la web. Se obtuvieron de CGD Saccharomycescerevisiae, anotaciones de Gene Ontologyy anotaciones para las proteínas de Candida,mientras que en el caso de proteínas de macrófagosmurinos, la información equivalente se obtuvo deUniProt [5] y de Mouse Genome Database [6]. Tambiénse recuperaron de KEGG [7], e información deestructuras de PDB [8]En cuanto a la arquitectura de la aplicación,la estructura básica consiste en una base de datosMySQL gestionada por la plataforma de desarrolloweb Ruby on Rails que permite crear las tablas yrelaciones entre los datos, manejar las consultas ymostrar las páginas.El contexto experimental es tratado en Proteopathogenjerárquicamente, mostrando una aproximacióngeneral del estudio, en donde se detallande PubMed, y dentro de esa descripción general,los experimentos concretos que dan lugar a lasLa información sobre una proteína particular semuestra dividida en secciones (Figura 1). En la seccióntitulada Protein Basic Information se muestranel número de acceso de Uniprot, descripción de la

29proteína, especie, evidencia de la existencia, nombreEn la sección Experiments se listan aquellos expe-particular. Además, y en los casos que las anotacionesestén disponibles, se muestran una o más de lassiguientes secciones: anotaciones de Gene Ontologycon las correspondientes referencias, rutas de KEGGy CGD, e información estructural de PDB.En todos los casos, las proteínas aparecen relacionadascon los experimentos a los que pertenecende forma que se puede enlazar con la informaciónden,por una parte parámetros comunes a todas lasyendola base de datos de la búsqueda, software devariables y máximo número permitido de cortes noefectuados. Por otra parte también están presentesse muestran la secuencia de los péptidos, su masaobservada y masa teórica y la puntuación.La interfaz pública de Proteopathogen ofrecemúltiples formas de consultar el contenido. Es posiblenavegar por la lista de experimentos y visualizarrápidamente la lista de proteínas pertenecientes acada uno de ellos, pero también se puede utilizar elformulario de búsqueda. Éste acepta varios tipos depor texto libre, recuperando una lista de proteínasque muestren coincidencias.Por último, y para mejorar la interactividad conel usuario, Proteopathogen incluye un formulariopara el envío de datos. Éstos serán revisados porincluidos en la base de datos.Referencias[1] Fernández-Arenas E, Cabezón V, Bermejo C,Arroyo J, Nombela C, Diez-Orejas R, et al.Integrated genomic and proteomic strategiesbring new insight into Candida albicans responseupon macrophage interaction. Mol CellProteomics 2007; 6: 460-478.[2] Martínez-Solano L, Nombela C, Molero G, GilC. Differential protein expression of murinemacrophages upon interaction with Candidaalbicans. Proteomics 2006; 6: 133-144.[3] Cabezón V, Llama-Palacios A, Nombela C, Monteoliva,L, Gil C. Analysis of Candida albicansplasma membrane proteome. Proteomics 2009;12, 9(20):4770-4786.[4] Arnaud MB, Costanzo MC, Skrzypek MS,Binkley G, Lane C, Miyasato SR, et al. TheCandida Genome Database (CGD), a communityresource for Candida albicans gene andprotein information. Nucleic Acids Res 2005;33:358-363.[5] UniProt Consortium. The Universal ProteinResource (UniProt). Nucleic Acid Res 2008;36: 190-195.[6] Bult C, Eppig JT, Kadin JA, Richardson JE,Blake JA The Mouse Genome Database (MGD):mouse biology and model systems. NucleicAcids Res 2008;36: 724-728.[7] Kanehisa M, Araki M, Goto S, Hattori M,Hirakawa M, Itoh M, et al. KEGG for linkinggenomes to life and the environment. NucleicAcids Res 2008; 36: 480-484. Bank. Nucleic Acids Res 2000; 28: 235-242.

30 Bioinformatics tools for inferring immune-related functions from proteomic dataGema Sanz, Ángeles Jiménez, Ángela Moreno, Juan José GarridoGenómica y Mejora Animal, Departamento de Genética, Universidad de Córdoba, Campus de Rabanales,14071 Córdoba, SpainThe development of functional genomics technologieshas lead to the generation of large amountsof data that needs to be structured for easier interpretationand full exploitation of the knowledgehidden in huge databases. This is only possiblediscover new techniques for data storage, querying,extracting and mining.In the present study, we use an experimental modelof response to infection, based in the exposure ofneutrophils to LPS from Salmonella typhimurium.Neutrophil activation by LPS involves the productionof reactive oxygen intermediates, release of lipidmediators and cytokines, adhesion, and phagocytosis.However, recent studies indicate that a robust transcriptionalresponse, mainly of cytokines, occurs inneutrophils after LPS stimulation, suggesting that thismediators and bactericidal agents [1, 2].The aim of this study was 2-fold. Firstly,it was intended to identify novel proteins involvedin the swine neutrophils response to LPS byusing a 2-dimensional gel electrophoresis (2-DE)approach. Despite of the rise of new technologiesin quantitative differential proteomics, 2-DE andmatrix-assisted laser-desorption ionization time ofstill the most widespread methods for proteomicsstudies [3]. The differences in protein expressionafter LPS treatment may lead to the elucidation processes, which could be involved in immune responseagainst bacterial pathogens. And secondly, itused bioinformatics tools such as Ingenuity PathwayAnalysis (IPA, www.ingenuity.com) and Cytoscape(www.cytoscape.org), to analyze how these alteredproteins interact in a cellular context to performcertain biological functions.Figure 1. . Differentially expressed proteins were subjectedto statistical analysis with a Student´s T-test and those categories with p < 0.05 were listed. The number of proteins ineach category is shown at the right side of the bars.

31Blood samples were collected at the slaughter-were isolated with Dextran sedimentation and centrifugationthrough Ficoll-Paque. For LPS stimulation,the neutrophils were incubated for 6, 9 and 18hours in presence or absence of 100 ng/ml LPS. Proteinswere solubilized and the extracts were pooledand six replicate 2-DE gels for condition (untreatedcells and treated with LPS) were analysed by 2-DE.The LPS-induced changes in proteins was subjectedto statistical analysis with a Student’s t test afterthose spots with p< 0.05 were analyzed by MALDITOF-TOF (MS/MS).The number of differentially expressed proteinsin neutrophils after LPS treatment varied through thetime-course. Up today, 44 and 31 proteins for 6 and 18IPA revealed that several immune response-relatedse,cellular movement and organization or cell deathwere altered during the time-course (Figure 1).Differentially expressed proteins in each timepointwere subjected to BiNGO plugin of Cytoscape[4] in order to elucidate the relationship amongthe altered GO functions through the time coursenerelated functions such as killing and apoptosisare conserved both at 6 and 18 hours. Similarly,cellular metabolism was also altered through thetime course.In conclusion, LPS stimulation alters the patternsof protein expression in neutrophils, and the presentbetter understanding a complex biological event suchas the swine innate immune response. Bioinformaticsprovides many tools for analyzing protein data setsby visually exploring biological networks, includingwell-known examples such as IPA and Cytoscape.Since these tools can integrate graph drawing, informationvisualization, network analysis and biology,we can use them to interpret our results from a proteomicapproach in an easy way.Figure 2. BiNGO analysis for 6 and 18 hours. Nodes represent biological functions categories and edges represent thefunction. Node weight indicates the number of interactions.References[1] Malcolm KC, Arndt PG, Manos EJ, Jones DA,lysaccharide-treatedhuman neutrophils. AmJ Physiol Lung Cell Mol Physiol 2003; 284:L663-L670. thenGS. Lipopolysaccharide Stimulation of theHuman Neutrophil: An Analysis of Changes inGene Transcription and Protein Expression byOligonucleotide Microarrays and Proteomics.CHEST 2002; 121: 75S-76S.[3] Monteoliva L y Albar JP. Differential proteomics:An overview of gel and non-gel based Proteomics 2004; 3: 220-239.[4] Maere S, Heymans K and Kuiper M. BiNGO:a Cytoscape plugin to assess overrepresentationof Gene Ontology categories in BiologicalNetworks. Bioinf Applic Note 2005; 16:3448-3449.

32 2. BIOMARCADORES Y PATOLOGÍAS HUMANASCoordinadores: Ángel García y Cristina RuizProtein targets of oxidative stress induced by Huntington disease in human brainEvaluation of an HD mice model: Tet/HD94M. Alba Sorolla 1 , Isidre Ferrer 2 , José Lucas 3 Joaquim Ros 1 , Elisa Cabiscol 11Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques, Universitat de Lleida, Spain. 2 Institut de Neuropatologia,Servei d’Anatomia Patològica, IDIBELL-Hospital de Bellvitge, Universitat de Barcelona, Spain. 3 Centro deBiología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), C/Nicolás Cabrera, 1 Campus Cantoblanco, UniversidadAutónoma de Madrid, Spain.Huntington disease (HD) is an inherited neurodegenerativedisorder characterized by degenerationof neurons affecting the striatum and the cortex. Thedisease involves expansion of CAG trinucleotiderepeats in the huntingtin gene codifying for glutaminesin the htt protein [1].doxal 5-phosphate kinase, potentially leading to areduction in PLP availability. PLP is a cofactor ofenzymes involved in neurotransmitter metabolism(GABA production).The main goal of this work is to study proteinoxidation in post-mortem tissue samples (striatum)from individuals affected of HD. Moreover,a conditional HD mouse model is used to evaluatewhether similar proteins are affected in thesemice (Tet/HD94) [2]. These mice express a polyQsequence of 94 glutamines under the control of adoxycycline-regulatable promoter and resemblesthe human phenotype.Protein oxidation by reactive oxygen speciescan generate carbonyl groups on the side-chain ofseveral amino acids and these groups can be derivatizedby 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) andgel electrophoresis analysis followed by anti-DNPin human brain post-mortem samples obtained fromstriatum of HD patients compared to samples ofage and sex-matched controls (Figure 1). A comparisonbetween 8 control-HD pairs was made andspots that showed a ratio of oxidation level HD/control > 1.5 (once normalized for protein amount)most interesting result was the oxidation of pyri-Figure 1. Oxyproteome analysis of human samples. Comparativeanalysis revealed several spots with increased oxida-listed in Table 1.The results from Tet/HD94 mice show that proteinoxidation is increased in HD94 expressing mice(gene on) in striatum, while no differences are observedin cortex and cerebellum (Fig 2). Also, there

33Table 1. SPOT PROTEIN GENEACCESSIONNUMBERMOLECULAR*OXIDATION1112,762 Transitional endoplasmic9,02VCP P55072 893223423,734 50,5057,386proteinHSC71 P11142 708981,647 2,53dehydrogenaseALDH7A1 P49419 553328Cytosol aminopeptidase LAP3 P28838 561313,40T-complex protein 1 subunit beta CCT2 P78371 5745295,4110 ENO1 P06733 471691,7911 4,8812 1,90DDHA1 O94460 3112213 dimethylaminohydrolase11,8214 PDXK O00764 35080 2,421547,0116M2PKM2 P14618 5793715,2617 4,8618 ATP synthase subunit alpha ATP5A1 P25705 59751 2,321920dehydrogenaseCytochrome b-c1 complex subunit2, mitochondrialGAPDH P04406 36053 2,28UQCRC2 P22695 48413 7,93Citrate synthase, mitochondrial CS O75390 51680mitochondrialCKMT1A P12532 4700721mitochondrialCKMT2 P17540 474747,51Fructose-biphosphate aldolase A ALDOA P04075 39395*The oxidation level is estimated as a ratio between HD and control oxidation signal, divided by the ratio of their proteinamount.

34 is an evident decrease in the pyridoxal 5-phosphatekinase levels in the HD94 expressing mice (geneon), that is recovered after 5 months of doxycyclinetreatment (gene off), reaching the levels of controlmice. Moreover, this protein seems to be more oxidizedin the “gene on” mice (Figure 3).As a conclusion, the human oxyproteome experimentsshow a clear energetic failure and PLPmetabolism disruption. Moreover, these evidencesare also observed in the mice model, leading to thehypothesis that possible interventions to increasePLP availability and energy production can betaken in account.ReferencesFigure 2. Protein oxidation in Tet/HD94 mice. All micewere 24 months old. C: control mice; HD: “gene on” mice;HD+doxy: “gene on” for 19 months + “gene off” for 5months (doxycycline treatment).[1] Huntington’s Disease Collaborative ResearchGroup. A novel gene containing a trinucleotiderepeat that is expanded and unstable onHuntington’s disease chromosomes. Cell 1993;72: 971-983.[2] Yamamoto Ai, Lucas JJ and Hen R. Reversalof Neuropathology and Motor Dysfunction in aConditional Model of Huntington disease. Cell2000; 101:57-66.Shacter, E. Carbonyl assays for determinationzymol.1994; 233: 346-357. Levels and oxidation of pyridoxal 5-phosphateanti-PDXK and anti-DNP from 2D gel separation of tissueextracts from striatum of Tet/HD94 mice.

35síndrome coronario agudoAndrés F. Parguiña 1 , Isaac Rosa 1 , Lilián Grigorian-Shamagián 2 , Elvis Teijeira-Fernández 2 , JanaAlonso 2 , Rosa Agra 2 , José Ramón González-Juanatey 2 , Ángel García 11Dpto de Farmacología; Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela. 2 ComplexoHospitalario Universitario de Santiago, Santiago de CompostelaIntroducciónLa activación plaquetaria y la formación deltrombo juegan un papel fundamental en el síndromecoronario agudo (SCA), principal causade muerte en Europa. El SCA es una enfermedadcrónica que se desarrolla durante la vida del individuoa causa de la lenta acumulación de placa deateroma en las arterias (aterosclerosis). La placade ateroma se va endureciendo poco a poco encerrandoen su interior un núcleo lipídico rodeadodebido a una serie de razones patológicas y llegar aromperse dando lugar a la formación de un coágulo.Si este coágulo llega a bloquear las arterias co-sangre al corazón (isquemia). Debido a esta faltade oxígeno en el corazón el paciente, dependiendode la gravedad, puede sufrir desde dolor al hacerejercicio (angina estable [AE]) hasta una situaciónaguda como una angina inestable (AI) o un infartode miocardio (IM). Las plaquetas juegan un papelfundamental en la patogénesis de la aterosclerosisy el SCA [1]. De hecho, la mayoría de las terapiasexistentes para tratar esta enfermedad interrumpenla activación plaquetaria. Dado que las plaquetascarecen de núcleo, la proteómica es una herramientafundamental para su estudio. Por todo ello, elestudio del proteoma plaquetario en el contexto delevento agudo podría ayudar a descubrir biomarcadoreso dianas terapéuticas que contribuyan a unmejor tratamiento/diagnóstico de la enfermedad.Ese ha sido el objetivo del presente trabajo.MétodosBasándonos en nuestra experiencia en proteómicade plaquetas [2-5], hemos utilizado la 2-DE paracomparar el proteoma de 18 pacientes con síndromecoronario agudo sin elevación del segmento ST enel electrocardiograma (SCASEST) frente al de ungrupo control constituido por 10 individuos concardiopatía isquémica crónica estable. La toma demuestra de los pacientes con SCASEST se hizo entres puntos: al ingreso (menos de 24 horas desde elinicio del evento agudo), a los 5 días y a los 6 meses.Los grupos se cotejaron de manera que no hubiesetos.Las plaquetas se procesaron en menos de doshoras tras la extracción sanguínea. Tras extraer lasproteínas, éstas se separaron mediante electroforesisbidimensional (2-DE). La primera dimensión fue entiras de gradiente inmovilizado de pH (4-7, 24 cm).Se escogió esa franja de pI porque análisis anterioresque hemos llevado a cabo han demostrado que lamayor parte de las proteínas plaquetarias detectablesmediante 2-DE se encuentran en dicha región delproteoma [2]. La segunda dimensión fue en geles del10% de poliacrilamida. Los geles fueron teñidos conSYPRO Ruby, y escaneados en un Typhoon 9410(GE Healthcare). Las imágenes fueron analizadasutilizando el software Ludesi REDFIN (Suecia).ResultadosEn cada gel se detectaron más de 2300 spots.Tras el análisis diferencial, se detectaron 55 spotscorrespondientes a proteínas que variaban entre losgrupos SCASEST y control (p

36 (2 spots diferentes). Algunas de las proteínas identi-responsables del proceso de activación plaquetaria.Es el caso de ILK, Src y talin. En la mayoría de lospost-traduccionales. También se detectó una menorpresencia de proteínas secretadas en pacientes SCA-SEST lo que podría deberse al proceso de secreciónque sufren las plaquetas tras activarse. Se observócomo la tendencia era que estas últimas proteínasestuviesen en mayor cantidad en el plasma pobre enplaquetas de los pacientes SCASEST.Figura 1. Imagen representativa del proteoma de plaquetasresaltando los 55 spots que varían entre pacientes SCASESTy controles crónicos.ConclusiónSe ha empleado satisfactoriamente la proteómicateínas–provenientes de 30 genes diferentes– que varíanentre pacientes SCASEST y controles crónicos.En próximos estudios investigaremos el papel de lasexploraremos su uso potencial como biomarcadorespara el tratamiento y/o prognosis de la enfermedad.AgradecimientosAG es investigador Ramón y Cajal del Dptode Farmacología de la Universidad de Santiago deCompostela; AFP es becario FPI del mismo depar-Ministerio de Ciencia e Innovación de España (ref.SAF2007-61773), la Consellería de Educación dela Xunta de Galicia y la Fundación de InvestigaciónMédica Mutua Madrileña.Bibliografía[1] Lindemann S, Krämer B, Seizer P y GawazJournal of thrombosis and haemostasis 2007;5Suppl 1:203-11.[2] García A, Prabhakar S, Brock CJ, et al. Extensiveanalysis of the human platelet proteome bytwo-dimensional gel electrophoresis and massspectrometry. Proteomics 2004;4:656-68.[3] García A, Prabhakar S, Hughan SC, et al.Differential proteome analysis of TRAPactivatedplatelets: involvement of DOK-2and phosphorylation of RGS proteins. Blood2004;103:2088-95.[4] García A, Senis YA, Antrobus R, et al. A globalproteomics approach identifies novel phosphorylatedsignaling proteins in GPVI-activatedplatelets: involvement of G6f, a novel plateletGrb2-binding membrane adapter. Proteomics2006;6:5332-43.[5] Senis YA, Antrobus R, Severin S, Parguiña AF, Proteomic analysis of integrin alphaIIbbeta3 outside-insignaling reveals Src-kinase-independentphosphorylation of Dok-1 and Dok-3 leading toSHIP-1 interactions. Journal of thrombosis andhaemostasis 2009;7:1718-26.

37Análisis de la expresión diferencial de proteínas en el suero de ratones C57BL/6-ProteoMinerAntonio Rosal, Sonia García-Rodríguez, Esther Zumaquero, Pilar Navarro, Mercedes Zubiaur,Jaime SanchoDepartamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”,CSIC, Armilla (Granada)IntroducciónLa tecnología asociada al ProteoMiner permitereducir el rango dinámico del proteoma sérico aumentandola concentración de las proteínas pocoabundantes y diminuyendo simultáneamente la concentraciónde las proteínas más abundantes, consiguiéndoseuna mayor diversidad de especies proteicas.Una desventaja es que en su formato tradicionalse necesita partir de una concentración de proteínasrelativamente grande, impidiendo su utilizacióncuando el material de partida es escaso. En esteestudio se ha utilizado esta técnica en combinacióncon la separación de proteínas por electroforesis ende masas, para el análisis de la expresión diferencialde proteínas en sueros de ratones B6 silvestres(CD38ko) a partir de volúmenes de sangre relativamentepequeños (100-200 µl).Material y métodosEl kit ProteoMiner de pequeña capacidad paraanálisis por geles 2-D (Bio-Rad) fue utilizadosiguiendo las instrucciones del fabricante. Lasproteínas eluidas de las columnas de hexapéptidosse separaron en geles 1-D (30 µg) o 2-D (50µg). Para la separación en geles 2-D se utilizóel sistema Protean IEF (Bio-Rad) en la primeradimensión y el sistema CRITERION (Bio-Rad)en la segunda (1). Para la primera dimensión secompararon dos soluciones diferentes: SoluciónI (7M Urea, 2 M Thiourea, 1% ASB-14, 40 mMTris, 2 mM TBP y 0.2% Anfolitos) o SoluciónII (8 M Urea, 2% CHAPS, 50 mM DTT, 2 mMTBP y 0.2% Anfolitos). Los geles se tiñeron conMS o MS/MS se realizó de forma idéntica a la denuestro trabajo previo [1]. El análisis diferencialse realizó utilizando el software PDQuest Advancedversión 8.0.1.ResultadosA partir de volúmenes relativamente de suerorelativamente pequeños (200 µl o 10 mg de proteínatotal) se obtenía un rendimiento de alrededor delsisposteriores por 2-D tradicional o 2-D DIGE (lapresencia de Urea y CHAPS en el buffer de eluidopermite la utilización de la técnica 2-D DIGE sipreviamente se ajusta el pH a 8.0-8.5 con 1 M Tris).spots en geles 2-D de los eluidos del ProteoMinereran claramente diferentes del de los sueros sin fraccionaro de las proteínas no unidas a las columnas,aunque proteínas mayoritarias como albúmina olas inmunoglobulinas eran todavía detectables. Lasolución II es superior a la solución I en cuantoal número, la resolución y la calidad de los spotsséricas que están en un rango de concentración queva desde µg/L hasta g/L, lo que demuestra que estatecnología permite detectar proteínas presentes enun amplio rango dinámico de concentración.ConclusionesLa utilización del ProteoMiner en combinacióncaciónde las proteínas por MS y posterior secuen--abundantes, pero reteniendo una representación detodas las proteínas de partida en sueros de ratón.

38 La utilización de volúmenes reducidos de suero oplasma (100-200 µl) no es un impedimento para unanálisis diferencial de expresión por técnicas 2-DDIGE, SELDI-TOF o LC-MS.Referencias[1] Pavon EJ, Munoz P, Lario A, Longobardo V,Carrascal M, Abián J, et al. Proteomic analysisof plasma from patients with systemic lupuserythematosus: increased presence of haptoglobinalpha2 polypeptide chains over the alpha1isoforms. Proteomics 2006; 6: 282-92.Developing MRM Assays for Peptide Quantitation: The MIDAS TM Qtrap TM technologyAntonio Serna SanzApplied Biosystemsmationneeded on biological samples of interestextends beyond just the identity of the protein.variety of MS and orthogonal experiments, a morein-depth study is necessary to characterize iso-even sites of cleavage after activation or secretion.Additionally, constructing methods to determinecomplex mixture is of greater importance as theRobust and sensitive techniques for this targeteddiscovery and characterization of peptides andproteins are necessary.The information known about the sample, suchas the protein sequence or a hypothesized post- questions to be addressed. Normal informationdependent acquisition techniques will not alwaysdetect the components of interest if they are of lowabundance, or are poorly amenable to MS analysis.A more hypothesis-driven acquisition approach isoften more effective such as the MIDAS TM wor-approach is explored here.Figure 1. Schematic of the Multiple Reaction Monitoring (MRM) scan for high selectivity and sensitivity. Q1 is set to transmitonly the parent m/z of the peptide , the collision energy is optimized to produce a diagnostic charged fragment of thispeptide in Q2, and Q3 is set to transmit this diagnostic fragment only. Because of the short dwell times required (10-50 ms)and the ability to change rapidly between MRM transitions, many components (transitions) in a mixture can be monitoredsimultaneously in a single LC/MS/MS run.

391. Key Features of the MIDAS TM Wor- TM and 5500 QTRAP TM Systemsdetecting peptides in complex mixtures.is detected by MRM, an Enhanced Resolution (ER)scan can be performed to obtain accurate charge andm/z information, and then MS/MS is performed. Inmany cases the detection of an MRM transition cancan provide additional validation of identity.provide quantitative information between samples.Figure 2: Creating a reliable MRM-based method for peptidequantitation is an iterative procedure that takes input fromvarious sources. Choosing which peptides, and then whichfragment ions, can be based on either 1 previously acquiredMS/MS data or from 2 non-MS based techniques and peptidefragmentation prediction. The next step is to 3 create anthis method to 4 acquire data. The selected MRM transitionsare then 5 evaluated for their suitability for quantitative measurements(i.e.signal/noise, intensity, etc.) and the MS/MS is eva-6 repeated until 7 a set of MRM transitions are generated thatreliably identify the peptides and can be used for quantitation.2. The MIDAS TM Typically in an information dependent acquisition(IDA), peaks are selected from full scan MSdata, and are then used for dependent MS/MS experiments.The MRM scan can also be used as sur-choice of precursor ion selection for MS/MS. Incombination with ab initio prediction of theoreti-driven IDA provides all of the advantages of MRMsensitivity, S/N gains, and high selectivity, with full tabasesearching. Figure 3 highlights the generalschema utilized in these experiments. Since eachMRM transition is rapid, many of these can be combinedin a single survey scan spanning hundreds of. MRM Initiated Detection and Sequencing usingthe MIDAS TM MRM scan can be used as a survey scan for Informationgicalsample. The MRM scan detects the peptide at highof peptide identity.3. Applications of the MIDAS TM -desfor that proteinmixtures-ConclusionsThe unique hybrid nature of the triple quadrupoleslinear ion traps 4000 Q TRAP® and 5500 QTRAP® systems allow for targeted powerful wor-Multiple Reaction Monitoring (MRM) with the highquality MS/MS allows for the targeted discovery ofMS/MS can be obtained on peptides at extremelylow amounts on column (1 amol), easily track.

40 Intelligent Use of Retention Time for Higher Order Multiple Reaction MonitoringMultiplexing – Scheduled MRM AlgorithmAntonio Serna SanzApplied BiosystemsThe utility of Multiple Reaction Monitoring(MRM) on triple quadrupole based MS systemsfor biomarker verification/validation studies iscurrently an active area of investigation, drivenby the well known sensitivity and selectivity attributesof this type of MS approach. As moreextensive protein panels need to be monitoredin a targeted way across multiple samples, higherMRM multiplexing is becoming essential forthroughput. The challenges of assay developmentand running these large scale studies arebecoming better understood, the need for rapidassay development, the need for higher multiplexingand the need for more robust assays aresome of the key challenges.In this work, the unique combination of triplequadrupole and ion trapping capabilities of the hybridtriple quadrupole - linear ion trap mass spectrometer(QTRAP® System) has been utilized to create 100speptides to many plasma proteins. Iterative analysisthoutrequiring synthetic peptides. Intelligent use ofretention time using new acquisition software enablesmany more MRM transitions to be included in asingle acquisition method, while maintaining goodpeak area reproducibility. The analytical reproducibilityof the MRM method developed was found tobe extremely high, even in plasma, with the majorityof peptides being measured with %CV

41este contexto es necesaria la búsqueda de nuevasseñales secretadas por este órgano para una mejorcomprensión de su funcionamiento [1].del secretoma de grasa visceral, 87 de subcutáneay 91 de gonadal.Hace tan solo unos pocos años que se empezó aaplicar las técnicas proteómicas al estudio del tejidotécnicas innatas a la naturaleza de este tejido, se haavanzado poco comparado con estudios similarespara otro tipo de tejidos. Los estudios sobre la secrecióndel tejido adiposo son recientes y escasos yhasta la fecha no se ha realizado un estudio comparativoentre los secretomas de los distintos tipos dedepósitos grasos [1].Objetivos1. Optimización y puesta a punto de las técnicasde proteómica para aplicar al estudio de tejidoadiposo procedente de distintos depósitos grasos;2. Realización de un mapa de referencia de la secreciónde tejido adiposo visceral, subcutáneo y-4. Estudio diferencial de los secretomas de los tresy nutricionales (ad libitum, ejercicio, anorexia yMétodosSe ha usado como modelo experimental ratasmacho Sprague Dawley en condiciones ad libitumpara la realización de los mapas de referencia. Losexplantes de tejido adiposo se incubaron in vitro ylos secretomas resultantes se concentraron y precipitaronpara ser sometidos a electroforesis bidimensionaly espectrometría de masas (MALDI-TOF/-el software del servidor SecretomeP 2.0 atendiendoa la presencia/ausencia de péptido señal (SignalP) osu adherencia a una ruta de secreción no clásica. Elestudio de expresión diferencial se está realizandocon el software Ludesi REDFIN 3, Sweden.ResultadosHemos completado los tres primeros objetivosFigura 1. Proteínas comunes secretadas por los tres depósitosgrasos. Localización en el secretoma de grasa visceralEl 58% de las proteínas de grasa visceral correspondierona proteínas secretadas, el 54% en subcutáneay el 45% en gonadal (Tabla 1 y 2). Se handetectado adipokinas clásicas como la adiponectinay el retinol-binding protein 4, así como proteínastodavía no asociadas a este tejido que están siendovalidadas.ConclusionesEl análisis de los secretomas de tejido adiposomuestra patrones de secreción diferente dependiendode la localización anatómica en condiciones adlibitum (Tabla 2). También se muestra la utilidad deya conocidas implicadas en diversos procesos metabólicos,así como de proteínas con funciones no tanconocidas en este tejido. El siguiente paso será hacerun estudio diferencial bajo diferentes condiciones

42 Tabla1. gonadal según los criterios: Proteínas totales, tipo de secreción y proteínas comunes entre los tres depósitos grasos.Visceral Subcutánea Gonadal 91Proteínas secretadas totales 109 47 49SignalP Ruta de secreción no clásica Proteínas comunes 27Proteínas secretadas comunes 15Tabla 2. MALDI-TOF/TOF sólo 15 son comunes a los tres tipos de depósitos grasos.Nº Spot Secretome P2.0 Nombre Proteína Nº Acceso1 SignalP 2 SignalP Serum albumin SignalP Calreticulin 4 Alpha-enolase 5 Gamma-enolase 6 SignalP Guanine deaminase 7 0.512 Actin, gamma-enteric smooth muscle SignalP Cathepsin D 9 SignalP 10 0.575 L-lactate dehydrogenase A chain 11 0.797 Fatty acid-binding protein, adipocyte 12 SignalP Transthyretin Thioredoxin 14 Ubiquitin 15 SignalP Serotransferrin AgradecimientosCIBERobn (ISCIII), FIS (ISCIII), Merk-Seronoy Fundación MM. A.R. está contratado por el programaLucas Labrada (Xunta de Galicia); L.M.S.y M.P. son investigadoras del SNS Miguel Servet(SERGAS/ISCIII).Referencias[1] Breitling R. Robust signaling networks of theadipose secretome. Trends in Endocrinol Metab2009; 20: 1-7.

43Top-Down proteomic analysis of CSF proteins from ALS patientsClaudio Diema 1 , Alex Campos 2 , Núria Omeñaca 1 , Eliandre de Oliveira 2 , Joan Guinovart 3 , JacquesBorg 4 , Marta Vilaseca 11Mass Spectrometry Core Facility, 3 Metabolic engineering and diabetes therapy, Institute for Research inBiomedicine, Barcelona, Spain. 2 Spain. 4 Medical Faculty Jacques Lisfranc, Jean Monnet University, Saint-Étienne, FranceAmyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a formof motor neuron disease. ALS is a progressive, fatal,neurodegenerative disease caused by the degenerationof motor neurons, the nerve cells in the central nervoussystem that control voluntary muscle movement.Diagnosis is achieved with clinical evaluation, as wellas electromyography and neuroimaging. However, adiagnosed after a long delay. Therefore, it is crucialreliable diagnosis. Using a Bottom-Up analysis anddifferentially expressed proteins (Borg et. al, submitted).In the present study we applied Top-Down pro-and various isoforms of targeted proteins from controland sporadic ALS (SALS) were characterized.ALS has largely unknown pathogenesis that typicallyresult in death within a few years from diagnosis[1]. There are currently no effective therapiesfor ALS. Clinical diagnosis usually takes severalmonths to complete and the long delay betweensymptom onset and diagnosis, limits the possibilitiesfor effective intervention and clinical trials [2]. Theestablishment of protein biomarkers for ALS mayaid an earlier diagnosis, facilitating the search foreffective therapeutic interventions and monitoringOur goal was to identify by Top-Down proteomicsPTMs and isoform variants of targeted CSF proteins inALS patients and controls, with the aim of using themfound differentially expressed in our previous studiesof CSF from ALS patients (Borg et. al, submitted).In order to achieve this goal, the following work-were precipitated with acetonitrile [3] and submit-ted to liquid chromatography- mass spectrometry(LC-MS) analysis. In detail, Top-Down analysis wasperformed by online LC-nanoESI-MS coupling on afraction collection using the Triversa Nanomate (Ad-10 µm RPC 2.0 x 75 mm column with a 5-80% ACNgradient over 60 min (100 µl/min) was used for intactprotein separations. A 1/250 part from the columneluent was injected directly to the mass spectrometerthrough the Triversa Nanomate using nanoESIchip technology (on line LC-nanoESI-MS, dynamicTop-Down) and the rest of the eluent was fractioncollected in a multi-well plate through the same Nanomate.According to data obtained by dynamicfractions containing ions of interest were infused intothe MS from the multi-well plate and analyzed bystatic Top-Down. Protein fragments were obtainedby applying CID or ECD and/or IRMPD on selectedintact proteins ions according to our interest of iden- From 500 to 1000 microscanaveraging was necessary to increase signal to noiseratio (S/N) and obtain informative fragment spectrafrom infused fractions. Obtained data was processedIn this work, we focused mainly in 4 proteins namedapolipoprotein A1, cystatin C, -microglobulinand -microglobulin short isoform.A truncated isoform of apolipoprotein A1 (ApoA1) was observed in both control and SALS samples.An isoform of -128 a.m.u of this truncatedApo A1 form was also detected in both samplesand fragment analysis was consistent with K-10deletion (natural variant; K missing in Marburg/Munster 2 isoform). Short and major isoforms of--

44 Figure 1. sition 22 (pyroglutamic acid formed from Gln), aglycosylation at Ser 4or Ser 2and a phosphorylationin the short isoform. Moreover, further analysis ofcystatin C protein showed a truncated isoform, anoxidation of the Met 14and a phosphorylation. Table1 summarized PTMs characterized by Top-Down.Protein samples collected in multi-well plate at retentiontimes of interest were pooled and digestedThe isoform variants and PTMs detected in thiswork, showed the potential of Top-Down applied invalidated in order to use them as a diagnosis tool forALS using and independent methodology.Acknowledgements: The authors would like toacknowledge Michaela Scigelova and Vlad Zabrous-thank Mark Baumert and Kees Vlak from AdvionBiosciences for technical support and advice.Table 1. Summary of the PTMs characterized by Top-Down methodology.Proteinret.timesIntact mass**Major isoform detectedcontrol ALSPTMsApo A131.2-31.730758.9328061.4727933.4328061.4028224.4428384.4827933.4328061.4028386.63t, -128.09, missing K 107or term Qtruncated Apo A1(t)t, +162.9, glycationß-microglobulin24.8-25.2 13705.9113871.8413928.8613752.8313871.8213928.84ß-microglobulin(short isoform)21.2-21.911741.0211721.7811801.7611883.8411721.7811801.76-17.02, pyro-Glu from Q-17, +79.96 phosphorylation-17, +162.05, Glc at S 2/4cystatin C23.5-24.515789.0813334.5613334.4813350.5613413.5113334.4813350.5613413.51truncated cystatin C (t)t, +15.99, M(O)t, +79.96, phosphorylation

45References[1] Rowland L.P., Shneider N.A. Amyotrophic lateralsclerosis. N. Engl. J. Med, 2001; 344:1688–1700.[2] Ryberg H and Bowser R. Protein biomarkers foramyotrophic lateral sclerosis. Expert Review ofProteomics, 2008: 5: 249-262.[3] Abdi F, Quinn JF, Jankovic J et al. Detection ofbiomarkers with a multiplex quantitative pro-with neurodegenerative disorders. J AlzheimersDis. 2006; 9:293-348.Optimum method designed for 2D-DIGE of arterial intima and media isolatedby laser microdissectionFernando de la Cuesta 1 , Gloria Álvarez-Llamas 1 , Irene Zubiri 1 , Aroa Sanz-Maroto 1 , Alicia Donado 2 ,Luis Rodríguez-Padial 4 , Ángel García-Pinto 2 , María González-Barderas *5 , Fernando Vivanco 1,61Department of Immunology. Fundación Jiménez Díaz, Madrid, Spain. 2 Cardiac Surgery Unit. HospitalGregorio Marañon, Madrid, Spain. 3 Department of Pathology. Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain.4Department of Cardiology. Hospital Virgen de la Salud, Toledo, Spain. 5 Department of Vascular Physiopathology.Hospital Nacional de Paraplejicos, SESCAM, Toledo, Spain. 6 Department of Biochemistry andMolecular Biology I, Universidad Complutense, Madrid, Spain.IntroductionTissue proteomic studies on atherosclerosishave traditionally focused on whole artery extractsfrom biopsy or necropsy origin. Arterial intima andmedia layers are both involved in atheroscleroticdevelopment. In the present work, we describe anoptimum method which employs the combinationof Laser Microdissection and Pressure Catapulting(LMPC) and 2D-DIGE saturation labellingto investigate the human intima and media subproteomesisolated from atherosclerotic (coronaryand aorta) or non-atherosclerotic (preatheroscleroticcoronary) arteries.MethodsCoronary biopsies from patients undergoingbypass surgery and coronary and aorta necropsieswere immediately washed in saline and freezed embeddedwith OCT. Intima and media were isolatedby LMPC with a Microbeam System (PALM Microlaser).Several methods for staining (hematoxilin,cresyl violet), protein extraction and DIGE labellingwere tested in order to achieve the better protocolfor 2-DE analysis of human arterial layers. First ofall, a spin column chromatographic step with ProteinDesalting Spin Columns (Pierce) was assayedin order to minimize negative effects from remainingstain. In addition, different lysis buffers wereproteome, which is problematic due to highly acidicResultsConcerning staining methods, both hematoxilinand cresyl violet were found to negatively affectprotein extraction and IEF. A chromatographic spincolumn step prior to saturation DIGE labelling improvedsubstantially 2-DE gels, permitting the useof both stains for human arterial layers proteomicanalysis. Ethanol solved cresyl violet minimizesproteases action and facilitates visualization of arterialtissue. For this reasons this stain was chosen forfurther analysis. Optimal DIGE labelling conditionswere set at 1nmol TCEP and 2nmol Dye, so that freedye deleterious effects were minimized. The additionof SDS, and in a higher extend DTT, on lysis

46 particularly on high molecular weight proteins asvisualized on 2-DE gels. Finally, LMPC methodwas checked by LC-MS/MS to assure correct layerssolution digested preatherosclerotic coronary intimaand media extracts, respectively. Although someproteins are common between layers, due to similarof contractile phenotype of VSMCs in the media andproliferative in the intima.librerías de fagos T7 impresas en microarraysIngrid Babel 1 , Rodrigo Barderas 1 , Victor Moreno 2 , Ivan Cristobo 1 , Gabriel Capellá 2 , Ignacio Casal 11Laboratorio de proteómica funcional. Centro de Investigaciones Biológicas (CIB) Madrid. 2 Instituto Catalánde Oncología (ICO) BarcelonaEl cáncer colorrectal (CCR) es el cáncer conmayor mortalidad en España por su tardía diagnosis.cioneshistopatológicas como pueden ser la invasiónde la capa muscular intestinal, los nódulos linfáticosadyacentes o la progresión metastática. Aunque sehan realizado diversos estudios genómicos usandomicroarrays de DNA no se ha conseguido obtenerproteínas que puedan revelar diferencias en los estadiosde diferenciación neoplásica sería muy importantepara el conocimiento de la enfermedad, unmejor diagnostico del CCR y para el descubrimientode nuevas dianas terapéuticas. Aunque se han iden-expresadas en CCR utilizando diferentes técnicasproteómicas [3] hasta ahora se han descrito muyLos autoanticuerpos presentes en el suero depacientes con cáncer son biomarcadores indicativosantes o durante la formación del tumor pueden induciruna respuesta inmune una vez liberadas [4-6].Así, la caracterización de la respuesta inmune enpacientes con cáncer constituye una nueva alterna--En este estudio, hemos usado una estrategia proteómicaalternativa a los microarrays de proteinasrecombinantes basada en el uso de microarrays de CCR. Se construyeron cuatro librerías de fagos quecontenían cDNA de tejido de pacientes con CCR,que fueron cribadas con sueros de pacientes con-total de 1536 fagos T7 en soportes de nitrocelulosay tras su cribado con 15 sueros normales y 15 tumo-diferenciaban entre pacientes con CCR e individuossanos. El punto de corte del False Discovery Ratese ajustó a 0.22. De los fagos que mostraron mayorreactividad en pacientes que en sueros control, únicamente55 fagos presentaron una secuencia única.-SA utilizando 5 fagos elegidos por su homologíacon una proteína conocida. Dichos 5 Fagos conteníansecuencias homólogas a MST1, SLC33A1,SREBF2, SULF1 y GTF2i. MST1 se describiócomo una proteína reactiva a autoanticuerpos depacientes con CCR en nuestro estudio previo realizadocon microarrays de proteínas humanas [7].Por otra parte, en un análisis de expresión diferencialde genes SULF1 se observó sobreexpresada enCCR [8]. Mediante ensayo de ELISA utilizando unacolección de 96 sueros, 50 de pacientes con cáncercolorrectal y 46 de individuos sanos, se obtuvieroncurvas de ROC (Receiver Operating Characteristic)con áreas debajo de la curva entre 0.57 y 0.63. Sinembargo, su poder discriminatorio aumentó hasta

47respectivamente, con un área debajo de la curvade 0.81 tras realizar diferentes combinaciones demarcadores. Además, el uso de la proteína completa(área debajo de la curva de 0.86). Un estudio decompetición entre MST1 y el fago correspondientepreincubando el suero con la proteína recombinanteredujo la unión de las IgG al fago MST1 hasta un40%, indicando que el péptido desplegado en la su-la proteína completa. Por otra parte, mediante westernblot se determinó que la presencia de autoanticuerposcorrelacionaba con una mayor expresión delas proteínas en líneas celulares de cáncer de colony de muestras tumorales.un panel de péptidos desplegados en fagos que respondena autoanticuerpos de pacientes con CCR yque poseen capacidad diagnóstica de la enfermedad.Finalmente, se han encontrado las mismas proteínasreactivas a autoanticuerpos en diversas estrategiasdespliegue de péptidos en Fagos T7 para la iden-diagnosis y tratamiento de cáncer colorrectal.AgradecimientosRodrigo Barderas, PhD, tiene un contrato postdoctoralde perfeccionamiento del FIS. Este trabajose ha realizado gracias al Programa de Biotecnologíadel Ministerio de Educación y CienciaBIO2006-07689.Referencias[1] Birkenkamp-Demtroder K, Christensen LL, OlesenSH, Frederiksen CM, Laiho P, Aaltonen LA,Laurberg S, Sørensen FB, Hagemann R, ØRntoftTF. Gene expression in colorectal cancer. CancerRes 2002; 62: 4352-63.[2] Zou TT, Selaru FM, Xu Y, Shustova V, Yin J,Deacu E, Liu TC, Abraham JM, Meltzer SJ.Application of cDNA microarrays to generate amolecular taxonomy capable of distinguishingbetween colon cancer and normal colon. Oncogene2002; 21: 4855-62.[3] Barderas R, Babel I and Casal J.I Colorectalcancer proteomics, molecular characterizationand biomarker discovery. Proteomics Clin. App2009; 4: 1-20.[4] Anderson KS, LaBaer J. The sentinel within:exploiting the immune system for cancer biomarkers.J Proteome Res 2005; 4: 1123-33.[5] Chapman C, Murray A, Chakrabarti J, ThorpeJ. Autoantibodies in breast cancer: their use asan aid to early diagnosis. Ann Oncol. 2007; 18:868-73.[6] Soussi T p53 Antibodies in the sera of patientswith various types of cancer: a review. CancerRes 2000; 60: 1777-88.[7] Babel I, Barderas R, Díaz-Uriarte R, Martínez-Torrecuadrada JL, Sánchez-Carbayo M, Casal JI.for the diagnosis of colorectal cancer in serumusing high density protein microarrays. Mol CellProteomics 2009; 8: 2382-95.[8] Madoz-Gúrpide J, López-Serra P, Martínez-Torrecuadrada JL, Sánchez L, Lombardía L,Casal JI Proteomics-based validation of genomicdata: applications in colorectal cancer diagnosis.Mol Cell Proteomics 2006; 5: 1471-83.

48 2D Blue native SDS-PAGE analysis of multiprotein complexes of humanerythrocyte membraneIrene Zubiri 1 , Gloria Álvarez-Llamas 1 , Fernando de la Cuesta 1 , María González-Barderas 2 ,Fernando Vivanco 1,31Department of Immunology, Fundación Jiménez Díaz,Madrid, Spain. 2 Department of VascularPathophysiology. Hospital Nacional de Paraplejicos, Toledo, Spain. 3 Department of Biochemistry andMolecular Biology, Universidad Complutense MadridIntroductionPatients with chronic kidney disease in haemodialysispresent low quality erythrocytes, showing cytes.Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis(BN-PAGE) is an electrophoretic techniquefor high resolution separation of membrane proteincomplexes in the mass range of 10KDa to 10MDa.Here we describe a methodology to perform BN-PAGE of erythrocyte membrane complexes followedby a second dimension of tricine-SDS pagefor isolating and identifying individual proteinsforming these complexes.MethodsErythrocytes were isolated from plasma aftermaturation, washed in 5mM Na 2HPO 4pH 8, 1mMEDTA and 0.9% NaCl and lysed in 5mM Na 2HPO 4pH 8, 1mM EDTA and 1mM PMSF. Membrane pelletswere frozen at -80º C in 50 mM imidazole / HCland 10% glycerol (pH 7) or immediately analyzed.For BN-PAGE, samples were centrifuged and pelletswere solubilized in 50 mM sodium chloride, 50mM imidazole, 2 mM 6- aminohexanoic acid, 1mMEDTA (pH 7) and the appropriate detergent. Aftercentrifugation, 5 µl of 5% glycerol and CoomassieG-250 in a detergent/dye ratio of 8:1 were added tothe supernatant. Membrane complexes were run in4-13% acrylamide gradient gels. The second dimensionwas run in 10% tricine-SDS/PAGE and a silvertricine gels [1, 2].ResultsMembrane proteins complexes solubilizationwas carried out by testing two different detergents(digitonin and Triton X-100) at various concentrations(0.1-10% and 0.5-2 %, respectively). Solubilizationwas always performed for 1 h. 4% Digitoninsionresolution, as it was the lowest detergent concentrationat which the highest number of distinctbands can be observed without disturbance from thedetergent in excess. Prior to the second dimension,protein complexes disruption into individual proteinswas optimized by treating the strips with SDS/- 12% SDS treatment for 1h prior to load the strip onthe second dimension provided a higher number ofprotein spots detected; however, further increaseof SDS amount negatively affected resolution. 1%membrane protein complexes isolated and analyzedby 2D-BN-PAGE is being carried out by massspectrometry.ReferencestivePAGE. Nature protocols 2006; 1:418–428.[2] Hermann Schägger. Tricine- SDS-PAGE. Natureprotocols 2006; 1:16-22.

49 Iván Cristobo 1 , María Jesús Larriba 2 , Vivian De los Ríos 3 , Ingrid Babel 1 , Rodrigo Barderas 1 , AlbertoMuñoz 2 , José Ignacio Casal 11Functional Proteomics Laboratory, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigacio- 2 Department of Cancer Biology, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto 3 Proteomicsand Genomics Facility, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de InvestigacionesEpithelial-mesenchymal transition (EMT) is atypical feature of cells undergoing proliferation andit is a fundamental process in the early stages of carcinomainvasion and metastasis [1-3]. It is a processcharacterized by loss of cell adhesion, repression ofE-cadherin expression, and increased cell mobility(Figure 1).cell types, inhibiting the proliferation and promotingthe differentiation to a normal adhesive epithelialphenotype of human colon cancer cells [6].In this study we have investigated the regula-of the direct regulation of a number of proteins byextracts of treated and non-treated cells were usedby triplicate for a proteomic analysis. Proteins werelabeled with CyDye Fluor for their subsequent separationby 2D-DIGE. Comparative analysis of proteinexpression patterns was performed with Progenesis-trometry(MS) MALDI-TOF/TOF and subsequentlyvalidated by western-blotting.Figure 1. Epithelial-mesenchymal transition. During EMTepithelial cells lose polarity and cell-cell contacts, becomemigratory, and divide at a faster rate. The cells can intravasateinto lymph or blood vessels, allowing their passivetransport to distant organs.There is an increasing interest in the active vi- An average of 1600 spots was detected on 2D-DIGE gels. A total of 31 and 19 spots were foundto be differentially expressed at 8 hours with Ludesiand Progenesis software (p 1.2), respectively; and a total of 84 and 71 spotsat 48 hours (p 1.3). A 36%of overlapping in spot detection was found betweenthe 2 software. By MS and MS/MS weretreatment at 8 and 48 hours, respectively. Theseproteins were mainly involved in DNA and RNAregulation, affecting cell morphology, cell assembly,cell organization as well as cellular repair. A

50 number of these proteins were further validated byIn summary, we have investigated the regulationcolon cancer cells. Through the use of proteomicstreatment, and some of them have been further validated.Our results show evidence of the direct rolethrough the transcriptional regulation of a number ofgenes mainly related to cell morphology, cell assembly,cell organization as well as cellular repair.References[1] Peinado H, Olmeda D, Cano A. Snail, Zeb andbHLH factors in tumour progression: an allianceagainst the epithelial phenotype? Nat Rev Cancer2007; 7: 415-428. toforiG. A causal role for E-cadherin in thetransition from adenoma to carcinoma. Nature1998; 392: 190-193. van Roy F. Genetic manipulation of E-cadherinexpression by epithelial tumor cells reveals an invasionsuppressor role. Cell 1991; 66: 107-119.[4] Deeb KK, Trump DL, Johnson CS. VitaminD signalling pathways in cancer: potential foranticancer therapeutics. Nat Rev Cancer 2007;7: 684-700.[5] Lappe JM, Travers-Gustafson D, Davies KM,Recker RR, Heaney RP. Vitamin D and calciumsupplementation reduces cancer risk: results ofa randomized trial. Am J Clin Nutr 2007; 85:1586-1591.[6] Palmer HG, Gonzalez-Sancho JM, Espada J,Berciano MT, Puig I, Baulida J, et al. VitaminD(3) promotes the differentiation of colon carcinomacells by the induction of E-cadherin andthe inhibition of beta-catenin signaling. J CellBiol 2001; 154: 369-387.Juan Casado-Vela 1† , Eva Rodriguez-Suarez 1† , Ibon Iloro 1† , Amagoia Ametzazurra 2 , Nere Alkorta 1 ,Juan Antonio García-Velasco 3 , Roberto Matorras 4,5 , Begoña Prieto 4,5 , Sandra González 5 , DanielNagore 2 , Laureano Simón 2 , Felix Elortza 1*1Proteomics Unit, CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed, Technology Park of Bizkaia, Derio, Spain, 2 ProteomikaS.L.; Technology Park of Bizkaia. Derio, Spain. 3 Instituto Valenciano de Infertilidad, Madrid, Spain.4Hospital de Cruces, Barakaldo, Spain. 5 Instituto Valenciano de Infertilidad, Bilbao, SpainAbstractwhich contains numerous secreted proteins repre- content of the EFA using proteomic techniques [1].To achieve this objective, three different but complementarystrategies were used. First, in solutiondigestion followed by reverse phase high-performanceliquid chromatography coupled to tandemmass spectrometry (HPLC-MS/MS); second, proteinseparation by denaturing one dimensional elec-trophoresis (SDS-PAGE) followed by HPLC-MS/MS analysis. Finally, two dimensional polyacrylamidegel electrophoresis (2D-PAGE) followed byMALDI-TOF/TOF analysis. The combination of theof 803 different proteins. An extensive descriptionthe basis for a better understanding of a number ofdiseases and processes, including endometriosis,believe that the thorough catalogue of proteins presentedhere can serve as a valuable reference for thestudy of embryo implantation and for future biomar-

51Figure 1. ker discovery involved in pathologic alterations ofendometrial function.Communicationtrialcavity and contains a multitude of proteins andproteolytic enzymes secreted from the endometrium.Currently the diagnosis of endometrial diseasessuch as endometriosis is achieved by invasivemethods that often include laparoscopic surgerycan be collected by aspiration in a painless mannerusing non-invasive methods. Interest in the proteincontent of endometrial secretions has gained muchmomentum in recent years and has been suggestedto play a key role in the embryo implantation process.Therefore, differential proteomics of the en-insight to understand the mechanisms involved inthe onset of endometrial pathologies and the processof embryo implantation [2].-tewe used three different methodological strategies(A, B and C) that combine chromatographic andgel separation methods, as depicted in Figure 1.The integrated proteomic approaches used here led,catalogue of proteins present in EFA.Figure 2. Venn diagram comparing the number of proteinswith the three different strategies (A, B and C).

52 Table 1. implantation.Protein descriptionEndometriosis / ectopic endometriumendometrial cancer /vulvar cancerembryo implantationreferencesMatrix metalloproteinase 9 X Kyama et al. Fertil. Steril. , 89, 301-310.Tissue inhibitor of matrix metalloproteinaseX Kyama et al. Fertil. Steril. , 89, 301-310.Annexin A1XChun-yan et al. Chin. Med. J. . 121, 927-931.Ametzazurra et al. Human Repr. 2009, 24, (4), 954-965Mucin 16 / CA125 X XLenhard et al. Clin. Chem. Lab. Med. 2009, 537-542.Mol et al. Fertil Steril. , 70, 101–1108Moore et al. Ultrasound Obstet Gynecol. 2002, 20, 630-634.Gupta et al. 2006, 13, 126-134.Cyclophilin A/ peptidyl-prolyl cistransisomerase AX Li et al. Mol. Cell. Proteomics. 7, 1810-1823. X X Luo et al. Reprod. Immunol. 2006, 72, 108-117.XDe Souza et al. Mol. Cell. Proteomics. 2007, 6, 1170-1182.De Souza et al. Proteomics. 2005, 5, 270-281.De Souza et al. J. Proteome Res. , 7, 3525-3534Alpha 1-antitrypsin/Alpha-1 protease inhibitor/Serpin 1XDeSouza et al. Mol. Cell. Proteomics. 2007, 6, 1170-1182.DeSouza et al. Proteomics. 2005, 5, 270-281.et al. Int. J. Cancer. 1999, 83, 167-170.Fatty acid-binding protein X Li et al. Int. J. Cancer. , 123, 2377-2383.VimentinX ten Have et al. Proteomics Clin. Appl.. 2007, 1, 1243-1251.Vitamin D binding protein X Ferrero et al. J. Soc. Gynecol. Investig. 2005. 12, 272-277Carbonic anhydrase 1 X Zhang et al. Fertil. Steril. 2006, 86, 274-282Annexin A2Peroxiredoxin 2Apolipoprotein A1X Fowler et al. Proteomics. 2006, 7, 130-142.Mucin 1 X Achache et al. Hum. Reprod. Update. 2006, 12, 731-746.Apolipoprotein A-1Alpha 1-antitrypsinX Ferrero et al. JPR. 2007, 6, 3402-3411

53MoesinBeta-actinTubulin beta chainF-actin capping protein subunitbetaWD repeat protein 1Rho GDP-dissociation inhibitor 1and 2GlycodelinBeta-2-glycoprotein 1Sialic acid synthaseAlcohol dehydrogenase [NADP+]Glutathione transferase omega-1naseIIFerritin heavy chainX Ametzazurra et al. Human Repr. 2009, 24, 4, 954-965The three different strategies followed for EFA391, 489 and 191 proteins, respectively (Figure 2).Combining the three strategies, we successfully-endometrial alterations or in embryo implantationaccording to the literature are shown in Table 1.References[1] Casado-Vela, J., Rodríguez-Suárez, E., Iloro, I.,Ametzazurra, A., Alkorta, N., Garcia-Velasco, J.A., Matorras, R., Prieto, B., Gonzalez, S., Nagore,D., Simon, L., and Elortza, F. Comprehensiveaspirate. J Proteome Res 2009; 8: 4622-32.[2] Boomsma, C. M., Kavelaars, A., Eijkemans, M.J., Amarouchi, K., Teklenburg, G., Gutknecht,D., Fauser, B. J., Heijnen, C. J., and Macklon, N.a non-invasive window on endometrial receptivity.Reprod.Biomed.Online. 2009; 18: 85-94.SNPs approachesMaría González 1 , Raquel Bartolomé 1 , Jose María Sayagues 1 , María González 1 , Ana Laura Moro 1 ,Elena Andrada 1 , Sahar Sibani 2 , Josh LaBaer 2 , Jacinto García 3 , Alberto Orfao 1 , Manuel Fuentes 1,21Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca-CSIC. Salamanca. Spain. 2 HarvardInstitute of Proteomics. Harvard Medical School. Boston. USA. 3 Departamento Cirugía. Hospital ClínicoUniversitario. Salamanca. SpainBiomarkers, particularly those with strong positiveand negative predictive value, have many potentialuses in the diagnosis and treatment of cancer,including monitoring treatment success, indicatingdisease progression and detecting early disease.markersis to exploit patients’ own immune systems,which produce humoral responses to cancerantigens released by their tumors due to alterationsin protein expression, mutation, degradation, or localization.Antibodies to tumor antigens have beendetected as early as several years before the clinical

54 these responses is high, typically only 5-20% of patientsdemonstrate a response to any given antigen,which has limited the usefulness of single antigenresponses as biomarkers. The recent developmentof protein microarrays may offer an ideal tool forscreening for immune response to tumor antigens.These arrays offer the advantage that hundreds tothousands of different proteins can be printed andscreened simultaneously and only require a fewmicroliters of serum per assay.Prof. LaBaer’s group (Harvard Institute of Proteomics)has developed a novel method for producingprotein microarrays called nucleic acid programmableprotein arrays (NAPPA) that avoids the needto express and purify the proteins by substituting theprinting of cDNAs on the arrays, which are thentranscribed and translated in situ as needed at thetime of the assay. NAPPA has been used successfullyto map the pairwise protein interactions of thehuman DNA replication complex. Here, we proposeadapting the NAPPA protein microarray technologyfrom cancer patients for antibodies to 1000 knownand potential tumor antigens in a multiplex formatin order to better characterize the immune responseto known tumor antigens, identify new informativetumor antigens and evaluate the value of using patternsof tumor antigen immune responses as biomarkersin Colorectal Cancer. For the validation of thepossible biomarkers found in 20 different patientsiFISH and SNPs approaches with the main goal tocorrelate genomics and functional proteomics.Detection of Prostate Cancer by Urine ProteomicsMarina Rigau 1 , Núria Colome 3 , Juan Morote 2 , Mª Carme Mir 2 , Carlos Ballesteros 2 , Marta Garcia 1 ,Miguel Abal 1 , Francesc Canals 3 , Jaume Reventós 1 , Andreas Doll 11Unitat de Recerca Biomèdica, Institut de Recerca. 2 Servei d’Urologia. 3 Laboratori de Proteòmica, Institutde Recerca. Hospital Vall d’Hebron, BarcelonaIntroductionmentin combination with a digital rectal examination(DRE) and transrectal ultrasound-guided biopsy(TURS) is currently the gold standard for prostatecancer (PCa) screening in Europe [1]. Nevertheless,lacks ideal sensitivity (12-30% false negatives) [2,3]. Therefore additional biomarkers are needed tosupplement or potentially replace the currently useddiagnostic techniques. As the secreted products fromboth, normal prostate epithelial cells as well as PCacells, can be detected in the urine of men, their use assince they could be the best compromise betweena minimal invasive technique accepted by a widerrange of the male population and the possibility toobtain enough cells for a correct diagnosis [4, 5].Objectiveurine able to distinguish between the presence andabsence of PCa.ogiesin aged matched post-Digital Rectal Exam(DRE) urine supernatants specimens to identify differentiallyexpressed proteins in patients with PCa.urine samples and 9 control samples (age-matchedpatients with the typical background of benign pros-mation)using ProteoMiner (BioRad), a novel depletiontechnique that reduces the level of the mostabundant species, while strongly concentrating themore dilute and rare ones. Then, Two-dimensional

55Figure 1. 2D-DIGE experiment design, comparison of 9 urine PCa samples against 9 urine control samples. (C) Example of arepresentive gel of the DIGE experiment. (D) Example of up-expressed spot in PCa samples. (E) IPA network interactionabundance using a labeled synthetic peptide as internal standard.gel-based proteomic approach (2D-DIGE) coupledwith matrix assisted laser desorption/ionization ti-and database mining experiment were performed toidentify novel biomarkers of PCa in urine. Finally,we validated the candiadate biomarkers using MultipleReaction Monitoring (MRM)-based assays, conductedby Liquid chromatography in conjunctionwith triple quadrupole mass spectrometry (LC-MS/MS) in a bigger cohort of urine samples.Resultstialbiomarkers (16 down and 10 up-expressed)for the detection of PCa in urine. Ingenuity pathwaysanalysis (IPA) showed that the majority ofthese proteins are secreted components of several-performed MRM-based assays for 15 candidatebiomarkers to quantify these in a sample set of 50urine supernatants (Figure 1).ConclusionsThese data demonstrate the ability of proteomicanalyses to reveal novel biomarkers for PCain urine, an important step forward in advancingaccurate diagnosis which is currently the bottleneckfor the ability to cure patients from PCa. MRM isemerging as a technology that ideally complementsthe discovery capabilities of shotgun strategies byanalytes of low abundance in complex mixtures,such urine samples[6]. These biomarkers could beused to develop a a simple diagnostic test (probablysimilar to the ELISA, either multiplex or strips,reactive to the 4-5 molecules most representative ofoutpatient routines.Referencesantigen in serum as a screening test for prostatecancer. N Engl J Med 1991; 324: 1156-1161.

56 [2] Cervera Deval, J., Morales Olaya, F. J., JornetFayos, J., Gonzalez Anon, M., [Diagnostic valueof the second prostate biopsies in males of risk.Esp 2004; 28: 666-671.[3] Raber, M., Scattoni, V., Salonia, A., Consonni,P., Rigatti, P., [Repeated ultrasound-guidedtransrectal prostate biopsy in patients withnegative histologic test]. Arch Ital Urol Androl2000; 72: 197-199.[4] Okamoto, A., Yamamoto, H., Imai, A., Hatakeyama,S., et al., Protein profiling ofpost-prostatic massage urine specimens bysurface-enhanced laser desorption/ionizationtebetween prostate cancer and benign lesions.Oncol Rep 2009; 21: 73-79.[5] M’Koma, A. E., Blum, D. L., Norris, J. L., Koyama,T., et al., Detection of pre-neoplastic andof urine. Biochem Biophys Res Commun 2007;353: 829-834.[6] Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold,R., Selected reaction monitoring for quantitativeproteomics: a tutorial. Mol Syst Biol2008; 4: 222.NanoLC/mass spectrometry-based proteomic analysis of serum and synovialPatricia Fernández-Puente, Jesús Mateos, Carolina Fernández-Costa, Cristina Ruiz-Romero,Francisco J BlancoOsteoarticular and Aging Research Lab, Nodo Asociado de Proteo-Red. INIBIC-Hospitalario UniversitarioA Coruña, Xubias 84, 15006 - A Coruña, SPAINIntroductionOsteoarthritis (OA) is the most common rheumaticpathology, characterized mainly by cartilagedegradation [1]. Despite its high prevalence, thediagnosis methods currently available are limitedand lacked of sensitivity. Therefore, there is a considerableinterest pointed in the characterization ofthis work we set up a nLC-MALDI-MS method forOA biomarker search in complex mixtures, with theaim of obtaining a standardized protocol for serumMethodsa) Sample preparation and immunodepletion:Serum and SF samples were obtained from OA patientsand control donors. Prior to protein depletion,SF was treated with hyaluronidase. The 20 most abun-dant proteins were removed from crude serum and SFusing the Immunodepletion column ProteoPrep® 20(Figure 1), according to manufacturer’s instructions(Sigma Aldrich). Depletion of abundant proteins waschecked by SDS-PAGE separation of the proteins and(ABI). For both serum and SF depleted samples, proteinconcentration was determined using a nanoDropb) Pre-fractioning of the samples: For serum samples,digestion of the depleted fractions was donewith trypsin, and the peptides obtained were fractionatedby strong cation exchange (SCX) liquidchromatography in a HP 1200 system (Agilent),using a PolySulfoethyl column (PolyLC). SF proteinswere separated by SDS-PAGE, using 10%acrylamide gels. The gel lanes were divided into 12sections, excised and proteins were in-gel digestedwith trypsin following standard procedures.

57depletion of the 20 most abundant proteins was ve-in the samples. Nevertheless, still a number of othertypically abundant serum proteins such as complementproteins and apolipoproteins were found.Figure 1. most abundant proteins from human plasma. Inset shows afraction (low abundant proteins); 2. Serum bound fraction(high-abundant proteins); 3. Untreated serum.c) NanoLC-MS/MS analysis: The serum andSF peptide fractions were desalted using PorosR2home-made columns (ABI). Each dried fractionwas re-dissolved and injected on a precolumn (Pep-Map100), and peptides were desalted and loaded toObjetive, USA) to perform the separation. Fractionswere collected from the NanoLC, mixed with matrixand spotted onto a MALDI plate using a MALDISpotter/Micro-Fraction Collector (SunChrom). MSspectra were acquired for each fraction in a 4800MALDI-TOF/TOF instrument (ABI).d) :-were reported. A Global False discovery Rate (FDR)of 1% was calculated independently with PSPEP sotware.SwissProt database was used to determine theResultscolsfor the proteomic analysis of human biological the other SDS-PAGE as pre-fractionation method.tify105 different proteins in human serum fromOA patients. These proteins are involved mainly inthe immune response (33%), proteolysis (22%) andFigure 2. (A) serum and (B) SF from OA patients.fferentproteins in SF samples from OA donors. Asexpected, many of these (76%) were also found inserum. Some of those had been previously suggestedas putative OA biomarkers, such as Gelsolin, Fibronectin,Clusterin or Serum Amyloid P protein. Ashappened with serum, the most abundant functionalthe immune response (Figure 2), but we also foundin this case many proteins related with metabolism,transport, cellular proliferation and signalling. Interestingly,we found in the group of 21 proteins that are directly involved in cartilage extracellularmatrix (ECM) synthesis, that are listed in Table 1.Conclusionsafter depletion of the 20 most abundant proteins ofplasma. These procedures have allowed us to des--data point out the usefulness of these approaches forOA biomarker discovery, although further studiesReferences[1] Blanco FJ. Catabolic events in osteoarthritic cartilage.Osteoarthritis and Cartilage 1999; 7:308-9.

58 Table 1. Acc. No.|Abbr. Name Cellular roleP01033|TIMP1 Metalloproteinase inhibitor 1 Prevents ECM degradationP16112|PGCA Aggrecan core protein ECM componentP49747|COMP Cartilage oligomeric matrix protein ECM componentQ15113|PCOC1 Procollagen C-endopeptidase enhancer 1 Collagen synthesisQ92954|PRG4 Proteoglycan-4 ECM componentQ9H9S5|FKRP Fukutin-related protein Glycoprotein synthesisQ9NQ79|CRAC1 Cartilage acidic protein 1 Cartilage componentRaquel Bartolomé 1 , María González-González 1 , Jose M. Sayagües 1 , Fridtjof Lund-Johansen 2 ,Alberto Orfao 1 , Manuel Fuentes 11Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca-CSIC. Spain. 2 Immunology Institute.University of Oslo. Norway.Despite the immense progress in Molecular Biologyand Genetics, only a small fraction of the proteomeis understood at biochemical level. Currently,a development of new methodological strategies inhigh-throughput format is needed for applications inProteomics, such as Biomarker and Drug Discoverystudies. These new methodologies must be able toanalyze simultaneously hundreds or thousands ofproteins in order to evaluate functionality, stability,interactions, relative abundance, post-transductionOur group has developed a microspheres array(Bead-based Array System, BBAS) that allow thesimultaneous analysis of numerous sera and intracellularproteins. The method consist of having differentpopulations of spheres, colored by surface- la-with different antibodies against target proteins. Awide range of available dyes could potentially beused to generate complex color codes that are analy-In the experimental process a lysate of B cellsis fractioned by size exclusion chromatography(FPLC) and incubated with a 1300 populationsarray. Each population has a code of dyes and isof these target proteins with phycoerythrin (PE)This methodology is capable of giving informationabout the amount of protein present in eachfraction, in addition to protein state (soluble, membraneprotein, monomeric vs multimeric, phosphorylated,coupled with other proteins in functionalcomplexes …).

59Anticuerpos a la carta combinando expresión in vitro de proteínas, tecnologíade despliegue en fagos y arrays de anticuerposRodrigo Barderas, Ingrid Babel, Iván Cristobo, José Ignacio CasalLaboratorio de Proteómica Funcional. Centro de Investigaciones Biológicas, c/ Ramiro de Maeztu, 9 28040MadridLos anticuerpos constituyen una importante herramientapara determinar la compartimentalizacióncelular y la función de sus proteínas diana y para elanálisis de interacciones proteína-proteína. Actualmente,los anticuerpos se utilizan para el diagnósticode enfermedades mediante inmunoensayos comoELISA, arrays de anticuerpos,… y, para el tratamientode enfermedades, como por ejemplo el anti-HER2(Herceptin) en cáncer de mama. De hecho, los anticuerposconstituyen aproximadamente el 50% de losmedicamentos aprobados por la FDA y la EMEA.El objetivo de este trabajo consistió en el desarrollode un nuevo método de obtención de anticuerposin vitro utilizando solo 5 µg de proteínamediante la combinación de diferentes técnicas pro-Figura 1. frente a PBS para su marcaje con AlexaFluor 647 o, se utilizaron para la selección de anticuerpos recombinantes usandolas librerías de scFvs humanas Mehta I y II.

60 vitro, selección utilizando Despliegue en Fagos y,nantesmediante el cribaje de array de anticuerposcon la proteína marcada con AlexaFluor 647.La aplicación de esta metodología nos ha permitidoobtener anticuerpos monoclonales humanosrecombinantes (scFvs) frente a cuatro proteínas-tiorredoxina, GFP, p53 y STK4- de diferente masamolecular (10-70 kDa), siendo p53 y STK4 proteínasdifíciles de expresar. El proceso de expresión,resumido en la Figura 1. El procedimiento completoincluye diferentes pasos. El primer paso consisteen la expresión de las proteínas in vitro utilizandode DNA y un sistema de expresión in vitro (Roche)que permite realizar la transcripción y la traducciónlas proteínas se realizó utilizando bolitas magnéticasTalon, mediante el Tag de Histidinas que incorporanlas proteínas en su extremo C-terminal. El segundopaso consistió en la selección de los anticuerpos monoclonalesrecombinantes, que se realiza en soluciónutilizando las proteínas unidas a las bolitas magnéticasy la librería de anticuerpos humanos Mehta I yII [1-3]. En total, se realizaron 4 rondas de seleccióny se picaron 200 colonias individuales procedentesde la 3ª y 4ª ronda de selección de anticuerpos frentea cada proteína. Así, se testaron 400 clones indivi-frente a cada proteína. Finalmente, el tercer paso -arrays de nitrocelulosa con los 1600 clones diferentesusando un robot de impresión Omnigrid. Laselección de los clones positivos se realizó cribandolos arrays de anticuerpos impresos en nitrocelulosacon las proteínas expresadas in vitro marcadas con-Creemos que esta nueva metodología para obteneranticuerpos monoclonales humanos recombinantespor combinación de la expresión in vitro deproteínas, el uso de librerías de anticuerpos humanosdesplegados en fagos y microarrays de anticuerposscFvs podría convertirse fácilmente en un sistemade alto rendimiento para obtener anticuerpos monoclonalesfrente a cualquier antígeno. El procesocompleto requiere solo 5µg de proteínas, solucionandoel cuello de botella habitual para la obtenciónde anticuerpos, dado que se necesitan grandes cantidadesde proteína para la inmunización de animalestodescrito nos permitió obtener anticuerpos frentea las cuatro proteínas utilizadas en el estudio STK4,p53, GFP y tiorredoxina que presentaban funcionalidadtras su impresión en arrays de nitrocelulosacenciae inmunodetección en membrana.En resumen, esta nueva aproximación podría serusada para la obtención de anticuerpos humanos desu funcionalidad en arrays de anticuerpos– e inclusociónde los anticuerpos fuese una diana terapéutica.AgradecimientosRodrigo Barderas, PhD, tiene un Contrato Postdoctoralde Perfeccionamiento del FIS. Este trabajose ha realizado gracias al Programa de Biotecnologíadel Ministerio de Educación y CienciaBIO2006-07689.Referencias Moore MJ, et al., Potent neutralization of severeacute respiratory syndrome (SARS) coronavirusby a human Mab to S1 protein that blocksreceptor association. Proc Natl Acad Sci USA.2004;101:2536-2541.[2] Barderas R, Desmet J, Timmerman P, Meloenassisted by in silico modeling. Proc Natl AcadSci U S A. 2008;105:9029-9034.[3] Barderas R, Shochat S, Timmerman P, HollestelleMJ, Martínez-Torrecuadrada JL, Höppenerof gastrin activity in tumoral cell lines. Int JCancer 2008;122:2351-2359.

61Sonia Blanco-Prieto 1 , Nuria Sánchez-Otero 1 , Ana M. Rodríguez-Piñeiro 1 , M. Isabel Botana-Rial 2 ,Francisco J. Rodríguez-Berrocal 1 , María Páez de la Cadena 1*1Dpto. Bioquímica, Universidad de Vigo, As Lagoas Marcosende s/n 36310 Vigo (Spain). 2 Servicio deNeumología, CHUVI, Vigo (Spain)non-small cell lung cancer (NSCLC) we combinedprefractionation techniques and protein separationby differential in-gel electrophoresis (2D-DIGE), to(serum and pleural effusion) from NSCLC subjectsand benign controls (pneumonia and tuberculosisindividuals, respectively).Pigment epithelium-derived factor (PEDF) wastiallyexpressed in NSCLC patients. PEDF is a 50kDa secreted glycoprotein that exhibits a dualitywith regards to apoptosis and survival [1]. PEDFhas been reported to be present in serum at a concentrationof 5 µg/mL [2], corroborating a relativesuccess in mining down the proteome. It couldbe concluded that although immnunodepletion ofand several relevant proteins were revealed, mostderateand highly abundant ones. Two argumentsthe dynamic range of plasma and plasma-derived linearity of DIGE in comparison with the reachedspots corresponded to the less intense. Our studyrevealed one PEDF spot altered in serum with anaverage fold increase of 1.4 in NSCLC samples,while in the case of pleural effusion there were twoaltered forms showing changes of 1.5 and 2 foldincrease in lung cancer patients.The next step after discovering a potential bio-on 2D gels; thus, immunodetection of PEDF wasteinwere resolved results were contradictory: in thecase of serum (Figure 1) the tendency was an elevatedexpression in NSCLC though levels were overlappedbetween cancer and benign control samples,whereas in pleural effusion (Figure 2) the patternwas opposed as the manifested by DIGE analysis.This discrepancy could be explained consideringthe superior sensitivity of antibody reactions and thegreat enrichment in PEDF levels achieved after pre-rencesfound by DIGE methodology. Another reasonmight be the existence of more PEDF isoforms notdistinguishable by 1D separation.Figure 1. 1D immunodetection of PEDF on serum depletedsamples.10 µg of protein (B) was not consistent between cancer andcontrol subjects, when dilution of the samples was perfor-NSCLC. Lanes 1, 3, 5, 7: NSCLC samples, lanes 2, 4 ,6, 8:pneumonia samples. LC: lung cancer; B: benign.These two hypothesis were tested. First, 1D-dingin serum the same pattern initially obtained in2D gels: a 1.5 fold increase in PEDF expression incancer patients (p = 0.043) (Figure 1). For pleuraleffusion (Figure 2), although a slight overall increasewas seen in NSCLC, the pattern was not repetitive.To assess if there were variations in other PEDFisoforms not visualized on DIGE gels the moleculefestedwith more than 12 spots detected (Figure 3),

62 which expanded about 1 pH unit. This variabilitytions.In serum all the isoforms observed displayeda higher intensity in NSCLC, while for pleural effusiona mixed pattern was generated with an average1.3 fold increase in NSCLC.Literature concerning PEDF expression on lungcancer is not conclusive, with a described reductionat the transcript level in lung tissues comparedto normal specimens [3]. However, when proteinadenocarcinoma type, the one we analised, with18/33 specimens overexpressing PEDF. The overallincrease showed by our work could be a responseof PEDF anti-angiogenic capability to counteractVEGF induced vasopermeability.markersis to corroborate this discrimination byfeasible and highly sensitive methods (commonlyELISAs) that could be implemented in the clinicalsetting. This requires that the differential expressionobserved in fractionated proteomes should hold aparallel comparison on crude samples, regardingdifferent histological types.Figure 2. 1D immunodetection of PEDF on depleted pleuraleffusions. Blotting of 10 µg of protein (B) displayed a tendencyto increased PEDF levels on benign samples, whilerepetition on diluted fractions partially reverse this pattern,although no statistically differences were achieved. Lanes1, 3, 5, 7: NSCLC samples, lanes 2, 4 ,6, 8: tuberculosissamples. MPE: malignant pleural effusion; BPE: benignpleural effusion.References[1] Fernandez-Garcia NI, Volpert OV, JimenezB. Pigment epithelium-derived factor as amultifunctional antitumor factor. J Mol Med2007;85:15-22.[2] Petersen SV, Valnickova Z, Enghild JJ. Pigmentepithelium-derivedfactor (PEDF) occurs at aphysiologically relevant concentration in human chemJ 2003;374:199-206.Expression of pigment epithelial derived factoris reduced in non-small cell lung cancer andis linked to clinical outcome. Int J Mol Med2006;17:937-44.2D immunodetection of PEDF. Both in depletedserum (left) and pleural effusion (right) several PEDF iso-rentvariations between benign- and malignant-origin samples,though most of the spots showed increased values in tumor-pleural effusion; BPE: benign pleural effusion; Normal Qty:normalized quantity (by total density in each blot).

63Utilización de ProteoMiner para el análisis proteómico de muestras de líquidoSonia García-Rodriguez 1 , María Dulce Pérez-Mezcua 1 , Antonio Rosal-Vela 1 , Victoria Longobardo 2 ,Antonio Larios 2 , Pilar Navarro 1 , Raquel Largo 3 , Gabriel Herrero-Beaumont 3 , Jaime Sancho 1 ,Mercedes Zubiaur 11Departamento de Biología Celular e Inmunología, Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra(IPBL-N), CSIC, Granada. 2 Servicio de Proteómica, IPBL-N, CSIC, Granada. 3 Servicio de Reumatología,Fundación Jiménez-Díaz, MadridIntroducciónProteoMiner o Combinatorial Peptide LigandLibraries (CPLL) [1] actualmente están compuestasde una gran variedad de hexapéptidos sintetizados,que actúan de ligandos para las proteínas de lasmuestras. Y están siendo actualizadas como herramientasde gran utilidad para el mapeo de proteomasde distintos organismos. Esta herramienta permiteel objetivo de reducir del rango dinámico de concentracionesen diversos tipos de muestras, comoplasma y suero, disminuyendo la concentración delas proteínas más abundantes y el enriquecimientoen proteínas menos abundantes, de cara a unaun posterior análisis proteómico [2]. Proteínas menosabundantes en las muestras biológicas son potecialmente de gran interés para el estudio de nuevobiomarcadores de enfermedad. El ProteoMiner quese ha utilizado en este trabajo es el distribuido porBioRad y se basa en una librería de hexapéptidos inmovilizadosen una matriz en forma de bolitas y envariedad de hexapéptidos sintetizados, que actúande ligandos para las proteínas de las muestras.Material y MétodosSe ha utilizado el ProteoMiner con el objetivocon Osteoartritis. Las muestras se trataron con hialuronidasa(10 U/ml LS, 1h, agitación, 500 rpm,37 ºC, en Thermomix-Eppendorf, centrifugación100g, 5 min., 4ºC) [3]. 10 mg de muestra se trataroncon ProteoMiner. La recuperación de proteínasobservadas fue inferior al 1/50 del material inicial.50 µg de muestra de LS tratado con hialuronidasay 50 µg muestra eluida tras el ProteoMiner se sepa-raron en un mismo gel 1-D, NOVEX (Invitrogen),4-12%, 10 pocillos, buffer MES. Los geles se tiñe-10% de metanol/7% de ácido acético, 60 min. TªAy se lavaron con agua bidestilada y se escanearonen un Typhoon.ResultadosEl análisis de imagen de los geles en el Typhoonindicó que a igual concentración de proteínas, lasmuestras eluidas después del ProteoMiner presentaronuna disminución de proteínas más abundantescómo albúmina e inmunoglobulinas y se observatambién una mejor distribución de proteínas, principalmentede masa molecular

64 kDa, siendo 3 de ellas fragmentos de proteínas másgrandes, posiblemente productos de degradación.ConclusionesEn este primer abordaje se ha demostrado queconseguir el enriquecimiento en proteínas menosabundantes en líquidos sinoviales de pacientes conlatentes o menos obvios que en otras patologíasarticulares como la artritis reumatoide.AgradecimientosMinisterio Sanidad y Consumo-ISCIII-FIS,Proyecto: FIS06/1502 (M.Z.). CSIC; Proyecto:PI-200820I216 (M.Z.). Junta de Andalucía (J.A.),Consejería Innovación Ciencia y Empresa y ConsejeríaEducación y Ciencia. Proyecto: PC08-CTS-04046 (J.S. y M.Z.). Ministerio Educación y Ciencia(MEC)-Ministerio Ciencia e Innovación (MICINN)Proyecto: SAF-2008-03685 (J.S. y M.Z.). CSIC-Beca JAE Intro a M.D.P.-M.Referencias[1] Righetti PG y Boschetti E. The ProteoMiner andthe FortyNiners: searching for gold nuggets inthe proteomic arena. Mass Spectrom Rev 2008;27: 596-608.[2] Boschetti E y Righetti P G. The ProteoMinerin the proteomic arena: a non-depleting tool fordiscovering low-abundance species. J Proteomics2008; 71: 255-264.[3] Herrero-Beaumont G, Guerrero R, Sanchez-Pernaute O, Acebes, C, et al. Cartilage and boneteoarthriticpatients after hyaluronan injections inthe knee. Clin Chim Acta 2001; 308: 107-115.Estudio de la Estenosis Aórtica Valvular desde un punto de vista proteómicoTatiana Martin-Rojas 1 , Félix Gil-Dones 1 , Luis F. López-Almodovar 2 , Fernando de la Cuesta 3 , GloriaÁlvarez-Llamas 3 , Fernando Vivanco 3 , Luis R. Padial 4 , María G. Barderas 1,51Laboratorio Fisiopatología Vascular, Hospital Nacional de Parapléjicos, SESCAM, Toledo, 2 Unidad de CirugíaCardiaca, Hospital Virgen de la Salud, SESCAM, Toledo, 3 Departamento de Inmunología, FundaciónJiménez Díaz, Madrid, , 4 Unidad de Cardiología, Hospital Virgen de la Salud, SESCAM, Toledo, 5 Unidad deProteómica, Hospital Nacional de Parapléjicos, SESCAM, ToledoEn la actualidad diversos autores han señaladoque la estenosis aórtica degenerativa comparte losmismos factores de riesgo que la enfermedad coronaria.Además, de compartir características histológicascon las placas ateroscleróticas, lo cual sugiere-sis.La existencia de datos discordantes con estateoría hace necesario el estudio de esta patologíamediante la aplicación de nuevas técnicas proteómicas(2D-DIGE, LC-MS/MS, etc), con el objetivode conseguir nuevos datos que puedan contribuir ala comprensión de los procesos implicados en estamarcadorespronóstico, diagnóstico y terapéuticos.La estenosis aórtica (EA) degenerativa es unaenfermedad de elevada prevalencia en los paísesdesarrollados y es la responsable del mayor númerode reemplazos valvulares aórticos. En la actualidad,diversos autores han señalado que comparte los mismosfactores de riesgo que la aterosclerosis 1 . Porello, parece esencial profundizar en el conocimientode la patogenia de la EA degenerativa como pasoprevio para establecer medidas de prevención dedicha enfermedad.

65En la actualidad, el estudio de proteínas individuales,aún siendo esencial, ha sido desplazadopor las estrategias proteómicas que permiten el análisisglobal de las proteínas de una muestra 2 . Lasnuevas tecnologías (MALDI-TOF/TOF, LC-MS,DIGE, MS-IMAGIN…) caracterizan miles de espe-muestra 3 . Debido a que las proteínas que componenlas válvulas aórticas son esenciales para el correctorizaciónmediante herramientas proteómicas es vitalaórtica y las posibles patologías de ésta.Tras la aprobación de la realización del estudiopor el Comité Ético del Hospital Virgen de la Salud(SESCAM, Toledo) y solicitar el correspondienteconsentimiento informado se incluyeron en el estudiopacientes (n=8) que fueron ingresados en laUnidad de Cirugía del mismo hospital y que fueronsometidos a cirugía de reemplazo valvular aórtico.Como controles se utilizaron válvulas aórtias sanas(n=8) procedentes de necropsias realizadas en elDepartamento de Anatomía Patológica del HospitalVirgen de la Salud (Toledo).Las válvulas fueron homogeniezadas en tampónde extracción 4 , centrifugadas y el sobrenadante obtenidocorrespondiente al extracto proteico se cuan- Lowry. Posteriormente se llevó a cabo el análisisproteómico mediante electroforesis bidimensionaldiferencial (2D-DIGE). Las proteínas fueron marcadassiguiendo las instrucciones de la casa comercial(GE.Healthcare). Se llevó a cabo la primerade los geles se capturaron mediante el escáner deanálisis de las imágenes se realizó con el programaDeCyder v6.5 (GE.Healthcare) que detectó 51 manchasproteicas diferencialmente expresadas con p

66 AgradecimientosBeca Esteve de la Sociedad Española de Cardiología.Instituto de Salud Carlos III (FIS PI070537),Fondo de Investigación Sanitaria de Castilla la Mancha(FISCAM, PI2008/08), Fondo de InvestigaciónSanitaria de Castilla la Mancha (FISCAM,PI2008/28), Redes Temáticas de Investigación Cooperativa(RD06/0014/1015).Referencias[1] Butany J, Collins MJ, Demellawy DE et al. Mor-excised native aortic valves. Can J Cardiol 2005;21:747-55.[2] Odile Carrette, Pierre R Burkhard, Jean-Charlesart two-dimensional gel electrophoresis: a keytool of proteomics research. Nature Protocols1, - 812 - 823 (2006).[3] F. Vivanco, L.R Padial, V. M. darde, F de laCuesta, G. Alvarez-Llamas, N. Diaz-Prieto, etal. Proteomic biomarkers of atherosclerosis.Biomarkers Insights 2008:3, 101-113.[4] Tatiana Martín-Rojas, Félix Gil Dones, LuisF. López-Almodovar, Rocío Juárez-Tosina,Fernando de la Cuesta, Gloria Álvarez-Llamas,Sergio Alonso-Orgaz, Fernando Vivanco, LuisRodríguez-Padial, y María G. Barderas. Obtenciónde un protocolo óptimo para el análisisproteómico de válvulas aórticas humanas sanasy estenóticas. Rev Esp Cardiol. 2010;63.Metabolic labelling of primary culture human cartilage cells to analyze the effectValentina Calamia, Beatriz Rocha, Patricia Fernández, Jesús Mateos, Cristina Ruiz-Romero,Francisco J. BlancoOsteoarticular and Aging Research Lab, Nodo Asociado de Proteo-Red. INIBIC-Hospitalario UniversitarioA Coruña, Xubias 84, 15006 - A Coruña, SPAINIntroduction cytokine that acts as an arthritic mediator withthe capacity to drive the key pathways typicallyassociated with osteoarthritis (OA) pathogenesis.This degenerative joint disease, characterized byarticular cartilage degradation, involve in its initialstages an increased cellular proliferation and synthesisof matrix proteins, proteinases, growth fac-by cartilage cells. Therefore, research has focusedon the chondrocyte (the unique cell type of cartilage)as the cellular mediator of OA pathogenesis.Chondrocytes of OA patients, as well as synovialthe biology of the chondrocytes towards articularcartilage degradation by increasing the expressionof matrix metalloproteinases while inhibiting theexpression of genes encoding essential componentsof the cartilage extra cellular matrix (ECM).cribethe intracellular proteome of normal and OAhuman chondrocytes [2-3]. In the present work,we have standardized the stable isotope labellingby amino acids in cell culture (SILAC) techniqueon primary culture human articular chondrocytes,studying the chondrocyte extracellular matrix metabolismin basal conditions and under the effect ofMethodsCartilage obtained from patients undergoing jointreplacement was provided by the Tissue Bank at

67CHU A Coruña. The study was approved by the localEthics Committee. Chondrocytes released fromcartilage by enzymatic digestion were recovered(Invitrogen) supplemented with antibiotics, glucoseand 10% FBS. In the case of light media, standardL-lysine (146 mg/L) and L-arginine (28 mg/L) wereused, while in the heavy media isotope-labelledL-lysine ( 13 C 6), and isotope-labelled L-arginine( 13 C 6, 15 N 4) were used. Titration assays were performedto minimize the problematic conversion ofheavy Arg to Pro in chondrocyte cell culture. Cellproliferation and cell viability was tested by cellcount and Trypan Blue dye exclusion. Real-timePCR analyses were carried out to verify the expressionof Collagen II, a typical marker of chondrocytecells, under the conditions of study.Chondrocytes were used at week 2-3 in primaryculture (P1), after making them quiescent by incubationin a medium containing 0% FBS for 24h.Cells were then washed thoroughly and incubatedin serum-free medium with 48 hours. Then, conditioned media were collected(Figure 1).ResultsChondrocytes are responsible of the synthesisof cartilage ECM components, but in primary cul-A method for obtaining a complete labelling of theproteins avoiding the cellular de-differentiation concentration in order to render it metabolicallyunfavourable as a precursor for Pro synthesis, andpromisecell proliferation, viability and expressionof chondrocyte markers such as Collagen II, whichis a proline-rich protein.Collection and proteomic analysis of the proteinssecreted by the chondrocytes allowed thepreviously related with OA pathogenesis, such asmatrix metalloproteinases and cathepsins. Interes-ECM components (27%) (Figure 2), clearly showingthe usefulness of secretome analysis for the study ofof growth factors, matrix remodelling proteins andcytokines (6 of them that are known to be involvedcytokine in cartilage cells.Figure 1. meanalysis of chondrocytes by SILAC and nanoLC-MS/MS.Heavy and light samples were mixed 1:1, and 4ced,alkylated and digested with trypsin. Peptidemicrocolumn, and column eluates were subjectedto nano-LC-MS analysis using a Tempo nanoLCequipped with a C18 column, and a 4800 MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Applied Biosystems).carried out with Protein Pilot software.Figure 2. in this work.Conclusionsthe proteomic analysis of human primary cartilagecells, and we have applied this technology for stu-chondrocyte secretome. The obtained informationwill increase knowledge about OA pathogenesis,and already points out a number of possible markersof the disease.

68 References Cytokine targeting in osteoarthritis. Curr DrugTargets. 2007;8(2):283-92.[2] Ruiz-Romero C, Lopez-Armada MJ, Blanco FJ.Proteomic characterization of human normalarticular chondrocytes: a novel tool for the studyof osteoarthritis and other rheumatic diseases.Proteomics. 2005;5(12):3048-59.[3] Ruiz-Romero C, Carreira V, Rego I, RemeseiroS, Lopez-Armada MJ, Blanco FJ. Proteomicanalysis of human osteoarthritic chondrocytesreveals protein changes in stress and glycolysis.Proteomics. 2008;8(3):495-507.Virginia Sánchez-Quiles, Enrique Santamaría, Laura Sesma, Fernando J. CorralesDivision of Hepatology and Gene Therapy, Proteomics Unit. Centre for Applied Medical Research (CIMA),University of Navarra. 31008, Pamplona, SpainIntroductionProhibitin (Phb) is a multifunctional proteinparticipating in a plethora of essential cellularfunctions, such as cell signalling, apoptosis, survivaland proliferation, playing a central role in the maintenanceof liver homeostasis through the regulationof central proteins involved in these processes bymeans of protein-protein interaction mechanisms.in the progression of non-alcoholic steatohepatitis(NASH) and obesity, according to mechanisms thatstill must be elucidated. Phb1 plays an essentialrole in hepatic functions such as inhibition of cellproliferation [1, 2] and response to anti-cancer [3] orcarcinogenic agents [4]. Down-regulation of Phb1is an early event in the development of NASH andhepatocellular carcinoma (HCC) in experimentalmouse models and humans [5]. All these data suggestthat Phb1 may play a prominent role in theprogression of HCC.Materials and MethodsPhb1 expression was silenced in the human(siGL, control cells; siPHB, treated cells). Phb1levels were analysed by immunodetection assay.tionKit (Roche). Cell proliferation was estimated bycell counting and with the Cell Proliferation Reagentmechanisms involved in the response of PLC cellsto impaired Phb1 activity we used a combination ofDIGE and mass spectrometry analyses. To increasesomalsubcellular fractions were isolated (QproteomeCell Compartment Kit, from Qiagen). Enrichedcytosolic and microsomal fractions from siGL andsiPHB cells were compared by DIGE analysis. Di-ResultsPhb1 levels were reduced by 80% upon siRNAwas 3-fold increased in siPHB cells indicating theIn addition, Phb silencing severely compromised thecapacity of PLC cells to proliferate in a semisolidsubstrate, an inherent property of transformed cellsthat is related with their metastatic capacity (Figure1C). Both cell counting and formazan productionrate of siPHB cells when compared with the controlsiGL cells (Figure 1A and B).DeCyder analysis of DIGE of cytosolic andmicrosomal fractions found 76 and 25 spots diffe-

69rentially represented (T test < 0.05) in siPHB withrespect to siGL cells. MS/MS analysis allowedthe cytosolic and microsomal fractions respectively(Table 1).gestER stress that, in turn, might participate in theapoptotic response of PLC cells to Phb1 silencing.In agreement to this hypothesis, we found increasedCHOP levels, PARP cleavage and activation ofcaspase 12 and downstream caspase 7 (Figure 2A).ER stress might result from proteasome malfunctionleading to the accumulation of miss-folded polypeptidechains in the cell. Phb1 silencing induced downregulationof proteasome activator complex subunit2B) suggesting impairment of proteasome activity.accumulation of ubiquitinated proteins upon Phbsilencing (Figure 2B).Figure 1. Cell growth and survival upon Phb1 silencing.ConclusionsPhb1 silencing in human hepatoma cell linePLC/PRF5 leads to an increase of apoptotic rate andan impaired cell proliferation. Down-regulation ofFigure 2. Molecular targets mediating the cellular responseTable 1analysis.

70 References[1] McClung JK, Danner DB, Stewart DA, SmithJR, Schneider EL, Lumpkin CK, et al. Isolationof a cDNA that hybrid selects antiproliferativemRNA from rat liver. Biochem Biophys ResCommun 1989; 164: 1316-1322. etal. Subproteomic analysis of the mitochondrialproteins in rats 24 h after partial hepatectomy.J Cell Biochem 2008; 105: 176-184.[3] Yoo DR, Jang YH, Jeon YK, Kim JY, Jeonet alanti-cancer proteins in luteolin-treated humanhepatoma Huh-7 cells. Cancer Lett 2009; 282:48-54.[4] Leonard JF, Courcol M, Mariet C, CharbonnierA, Boitier E, Duchesne M, et al. Proteomicprotein expression in rat liver. Proteomics 2006;6: 1915-1933.[5] Santamaria E, Avila MA, Latasa MU, RubioA, Martin-Duce A, Lu SC, et al. Functionalproteomics of nonalcoholic steatohepatitis:mitochondrial proteins as targets of S-adenosylmethionine.Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100: 3065-3070.Introduction to Lucid Proteomics System, a new solution for peptide and proteinTOF and TOF/TOF Mass SpectrometryFrancesco TortorellaLucid Sales Manager Europe, Bio-Rad LaboratoriesBio-Rad LaboratoriesThe Lucid Proteomics System provides a novelmeans for top-down proteomic analysis of complexbiological samples by combining the separationpower of SELDI ProteinChip arrays with high-resolutionMALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF massspectrometry.permits sample cleanup directly on the arrays, makingthe process compatible with crude biologicalsamples (such as neat urine) and harsh elution buffercomponents (salts, urea, etc.) that are not normallycompatible with MS analysis.

71Coordinadores: Marina Gay, Montserrat Carrascal, Antonio Martínez-Ruiz y Pablo Martínez-AcedoLiquid chromatography—electron transfer dissociation and ion mobility studieson a QTOF mass spectrometerKeith Compson,James Langridge, Jeffery Brown, Steven Pringle, Iain Campuzano, RichardChapmanETD (Electron Transfer Dissociation) is a MS/MS technique in which precursor cations are reactedwith radical reagent anions to induce fragmentation.Electron transfer from anion to cation, promotesfast and randomised dissociation comparedto collision induced dissociation (CID) and henceETD product ion spectra contain predominantly“c” and “z” type ions and post translational mo-sequence information.Here we show how ETD can be implementedSynapt) where a supply of reagent from a sealedampule is delivered to the intermediate pressure regionof the nano ESI source and a high voltage dischargepin was added to the ion source to generatethe reagent anions. Analyte cations were generatedusing the standard nanospray source via infusion ornanoACQUITY UPLC system. For ETD, the ionsource polarity and the quadrupole set mass weresequentially switched to deliver anions and cationswhere they reacted to form ETD product ions. Productions were optionally separated by ion mobility2nd generation collision induced dissociation (CID)ions prior to mass analysis in the TOF.Bovine serum albumin (BSA) tryptic peptides(250fm and 50fm) were separated by nanoAcquityUPLC and a selection of triply charged precursormasses were subsequently selected to generateLC-ETD spectra. Data were acquired at 1 spectra/second and the fragment ions were database searchedwith all spectra matching to BSA with highprobability. High quality data was observed at the50fm injection level, with ETD data acquired at 1spectra/second.Cleavage was observed at almost every amidebond in the peptide backbone, yielding easy-to-interpretsequence ladders of c and z-ions. This coupledwith the inherent mass measurement accuracy andresolution of the oa-TOF mass analyser makes thedata easily amenable to de novo sequencing. Thesignal intensity of the fragment ions seemed to diminishwith decreasing m/z, as previously reported.In addition to the ETD experiments the mass spectrometercan acquire alternate scans in CID, and assuch data will be compared and contrasted betweenETD and CID on a variety of peptides produced andseparated by nanoscale chromatography.

72 Strategies for proteomic analysis of blood glycated proteinsMaría Ramírez-Boo 1 , Feliciano Priego-Capote 2 , Alexander Scherl 1 , Jean-Charles Sanchez 11Biomedical Proteomics Research Group, Dpt. of Structural Biology and Bioinformatics, University MedicalCenter, Geneva, Switzerland. 2 Dpto. de Química Analítica, Universidad de Córdoba, Spain.of proteins, non-enzymatic glycation is one of theless frequently studied in proteomics. Glycated proteinsare formed by a non-enzymatic reaction betweenreducing carbohydrates (e.g., glucose, fructose,ribose or derivatives such as ascorbic acid) withamino groups located in N-terminal position or in lysineand arginine residues (Figure 1) [1]. Analyticalguidelines required to succeed in the characterizationof glycated proteins at qualitative levels have beenof glycated proteins as well as the elucidation of sugarattachment sites. Nevertheless, there is a demandfor quantitative proteomic strategies that could bepotentially applied for glycation assessment. One ofan energy source in humans, being the main circulatingsugar and, thus, the most relevant molecule interms of protein glycation. In fact, there are clinicalevidences relating glycation and pathological conditionsassociated to hyperglycaemia such as diabetesmellitus, renal failure or aging [5-7].A set of innovative approaches for analysis ofglycated proteins is here presented by application toblood samples [8]. Qualitative analysis was carriedout by tandem mass spectrometry (MS) after en-chromatography (BAC) for isolation of glycated peptides.For this purpose, two MS operational modeswere used: HCD-MS 2 and CID-MS 3 by neutral lossscan (monitoring two selective neutral losses typicaland 84.04 Da). Quantitative analysis was based on thelabelling of proteins with 13 C 6-glucose incubation inorder to evaluate the native glycated proteins labelledwith 12 C 6-glucose. As glycation is chemo-selective, itis exclusively occurring in potential targets for in vivopicLabelling (GIL), enabled to differentiate glycatedpeptides labelled with both isotopic forms resultingfrom enzymatic digestion by MS (6 Da mass shift perglycation site) as shown in Figure 2.been applied to human plasma and lysates fromFigure 1. Scheme of the glycation process (Maillard reaction).

73Figure 2. light and heavy glucose.

74 terizationof the native glycated proteome, incubatingthe clinical samples with 13 C 6-glucose prior toexposed above. Fifty glycated proteins with identi-tectedin the analysis of human plasma. Concerningtionof 54 glycation sites were detected without anyprotein pre-fractionation step. These proteins arerepresentative targets to compare between sampleswith different glycaemic states and monitor the glycaemiccontrol. The second task was focused on theassessment of glucose stimuli at different concentrations(0, 5, 10, 30 and 50 mM glucose) in humanindependently incubated with 0, 5, 10, 30 and 50mM12C 6-glucose for 24 h and, subsequently mixed witha plasma aliquot incubated with 30mM 13 C 6-glucosefor 24 h. Proteomic analysis of these pools has revealedadditional information about the biologicaleffect of different hyperglycemia conditions and thekinetic of glycation.References[1] Maillard, L. C. Action des acides amines sur lesucres: formation des mélanoidines per voie méthodique.C. R. Acad. Sci. 1912; 154, 66-68.[2] Zhang, Q., Tang, N., Schepmoes, A. A., Phillips,L. S., Smith, R. D., Metz, T. O. Proteomic pro-human plasma and erythrocyte membranes. J.Proteome Res. 2008; 7, 2025-2032.[3] Zhang, Q., Petyuk, V. A., Schepmoes, A. A.,Orton, D. J., Monroe, M. E., Feng, Y., Smith, R.D., Metz, T. O. Analysis of non-enzymaticallyglycated peptides: neutral-loss-triggered MS3versus multi-stage activation of tandem massspectrometry. Rap. Comm. Mass Spectrom.2008; 22, 3027-3034.[4] Zhang, Q., Ames, J. M., Smith, R. D., Baynes,reaction and the analysis of protein glycationby mass spectrometry: probing the pathogenesisof chronic disease. J. Proteome Res. 2009; 8,754-769. sationor correlation. Exp. Gerontol. 2001; 36,1527-1537.[6] Brownlee, M. Biochemistry and molecular cellbiology of diabetic complications. Nature 2001;14, 813-820.[7] Hipkiss, A. R. Accumulation of altered proteinsand ageing: causes and effects. Exper. Gerontol.2006; 41, 464-473.[8] Priego-Capote F., ScherlP., LisacekF., Jean-Charles SanchezJ-C. GlycationIsotopic Labelling (GIL) with 13 C-reducingSugars for Quantitative Analysis of Glycated Proteinsin Human Plasma MCP, 2009, in press.

75HPLC-FosfoChip una nueva tecnología para el análisis selectivo de fosfopéptidosmediante LC/MSIsidro Masana 1 . Reinout Raijmakers 2 , Shabaz Mohammed 2 , Albert Heck 2 , Dayin Lin 31Agilent Technologies–Barcelona. 2 Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Group, BijvoetCenter and Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences –Utrecht–Netherlands. 3 Agilent TechnologiesLa fosforilación de proteínas es uno de los máscional(PTM) para regular la función de las proteínasen las células. Miles de procesos biológicos, incluyendola proliferación, migración y apoptosis celular,implican pasos de fosforilación. Uno de los principalesy comprensión de los fosfoproteomas en las células.El enriquecimiento selectivo de péptidos yproteínas fosforiladas es necesario para conseguiruna mejor cobertura del fosfoproteoma. El enfoquebustezy reproducibilidad. La automatización de lasetapas de enriquecimiento y de separación analítica,son la mejor manera de conseguir una buena reproducibilidad,inyección a inyección y entre distintoschipes un HPLC-Chip reutilizable diseñado paraenriquecimiento y análisis fosfopeptídico [1-2] queFigura 1. Diseño del FosfoChip: (A). El FosfoChip incorpora una columna de enriquecimiento encapsulada con: RP-TiO2-RP.(B). Posición de carga para enriquecimiento de péptidos. (C). Etapa de separación de péptidos a través de columna analítica.basado en dióxido de titanio es un método particularmenterobusto y automatizable con una grantiplesmicro-válvulas, conexiones y micro-capilaresEl chip consiste en una multicapa de poliimidalaminada que contiene una zona de enriquecimientocon partículas de dióxido de titanio (TiO2),reversa C18 (ver Figura 1). La zona de enriquecimientoestá conectada a la columna de separación

76 de fase reversa que acaba en una punta integradade nanoelectrospray.A través del “Chip-cube” (la interfase al MSdel HPLC-Chip), una micro-válvula conecta direc-chip. Ello crea un sello de alta presión y cero volumenmuerto, y permite la automatización de lacarga de muestras, desalinización, elución desde laen la columna analítica mediante un gradiente de laconcentración de solvente orgánico del eluyente. ElFosfoChip se complementa con un kit de reactivospara el análisis de fosfopéptidos en cualquier sistemaHPLC-Chip/MS (Agilent QTOF/QqQ/TOF/Q).El kit incluye una mezcla acondicionadora y unestándar para saturar todos los potenciales puntosde adsorción de fosfopéptidos del HPLC.El conjunto de columna de enriquecimiento empaquetadacon RP1-TiO2-RP2, permite en un sóloexperimento la retención y análisis por separadode péptidos fosforilados y no fosforilados. El chippuede operar en dos modos diferentes, según intereseno no los péptidos no fosforilados. En el primermodo, cuando sólo interesan fosfopéptidos, la granmayoría de los péptidos se atraparán inicialmente enRP1. La elución posterior de péptidos con solventeorgánico los arrastrará hasta la fase TiO2, dondesólo se retendrán los fosfopéptidos, desechándoselos péptidos no fosforilados (no retenidos). En lasiguiente etapa, los fosfopéptidos se desorben delTiO2 con un tampón de elución básico, atrapándoseen RP2. Finalmente, se realiza un gradiente paraseparar los fosfopéptidos en la columna analítica.En el modo dual (fosforilados y no fosforilados),previamente a la separación de los fosfopéptidos, selleva a cabo un gradiente de elución de los péptidosretenidos en RP1 dirigiéndolos a la columnaanalítica para separar los péptidos no fosforilados(los fosforilados permanecen retenidos en el TiO2).Finalmente en un segundo gradiente se realiza la separaciónde los péptidos fosforilados (previa eluciónde estos de la columna de TiO2 a la RP2 como seindicaba en el párrafo anterior).Parte experimentalUn lisado de proteínas de células de osteosarcomaU2OS humano se redujo, alquiló y se digirió con tripsina.Los péptidos resultantes se fraccionaron por croma-contenía la mayoría de péptidos ionizados con 1 solacarga neta (conocida por contener la mayoría de fosfopéptidos),se analizó con un Agilent HPLC-Chip/MSconectado a un Q-TOF Agilent-6520 y se compararonlos resultados obtenidos mediante el FosfoChip y unHPLC-Chip standard mediante MS/MS automático.El 90% de la señal total se encontró en elFigura 2. Comparación análisis de fosfopéptidos fracción SCX de péptidos mono-cargados de osteosarcoma U2OS humano:(A) con HPLC-Chip estándar. (B) FosfoChip:fracción no retenida en TiO2 (C) FosfoChip: Fracción retenida en TiO2

77en TiO2. El análisis de la fracción retenida en TiO2,con el motor Spectrum Mill y la base de datos hu-fopéptidos.En contraste, sólo 11 fosfopéptidos se con el HPLC-Chip estándar. Como era de esperar,los componentes mayoritarios no fosforilados, en-en muestras en las que no se realizó el paso de enriquecimiento/separación en TiO2. Ello es debidoa la falta de tiempo para adquirir en un pico cro-minoritarios (como los fosforilados), cuando estoscoeluyen con diversos péptidos mayoritarios y setrabaja en Auto-MS/MS.Referencias[1] Mohammed S, et al. Chip-Based Enrichment andNanoLC/MS/MS Analysis of Phosphopeptides1565-71.[2] Raijmakers R, Mohammed S, J.R Heck A.Lin D., Masana I., HPLC-FosfoChip: análisisselectivo de Fosfopéptidos por LC/MS. Lifescienceslab2009; 5 :30-35.Nerea Osinalde 1 , Miren Josu Omaetxebarria 1 , Kerman Aloria 2 , Ana M. Zubiaga 3 , Asier Fullaondo 3 ,Jesus M. Arizmendi 11Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque Country, Leioa, Spain.2Proteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed), University of the Basque Country, Leioa, Spain.3Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the BasqueCountry, Leioa, Spain.The E2F transcription factor family (E2F1-8)is required for the regulation of a number of genesinvolved in several essential cellular processes.It is for that reason that the activity of E2Fs mustbe carefully controlled. Reversible phosphorylationis one of the main regulatory mechanismscontrolling the activity of proteins that has alsobeen described for E2Fs. Several phosphorylationevents have already been described for E2F1 butpletelyunderstand how this transcription factor isregulated. In order to identify new phosphorylationsites, E2F1 was immunoprecipitated and followingprotease mediated digestion was loaded onto TiO 2microcolumns. The enriched fractions were analyzedby LC-MS/MS. This methodology allowed thenot described to date.IntroductionE2Fs (E2F1-8) play a central role in cell cycleprogression, DNA damage repair, apoptosis, celldifferentiation and development. Each of this familymembers are known to regulate more than one cellularprocess depending on the stimuli they are subjectedto. For instance, E2F1-dependent transcription isessential for cell proliferation but depending on thecellular context can also trigger cell death. That iswhy E2F-dependent transcription needs to be tightlyregulated. Transcriptional activity of each E2F ismodulated at various levels. Not only protein-proteininteraction and subcellular localization but alsoand phosphorylation have been proven to regulatetance,it is known that the DNA binding capacity

78 of E2F1 is reduced when Ser375 is phosphorylated[1] while phosphorylation of Ser31 and Ser364 followingDNA damage has been reported to stabilizeE2F1 itself and also promote its apoptotic pathway[2]. However it cannot be ruled out the possibility toTo gain a better understanding of how E2F1is regulated, we looked for new phosphorylationevents it may suffer. Immunoprecipitation of E2F1followed by LC-MS/MS analysis of TiO 2enrichedof a novel phosphorylation site for E2F1.was loaded onto a Symmetry 300 C18 precolumn.The precolumn was connected to a BEH130 C18 co-http://www.matrixscience.comcation.Bioinformatics: Phosphorylation site- andmotif-prediction tools were used. Netphos 2.0 [4]and Phosida [5] were used for the prediction of putativephosphorylation sites in E2F1. Additionally,Phosida was used for kinase prediction of putativephosphorylation sites. http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/and http://www.phosida.com/Results and discussionE2F1. Manual validation of the spectra allowed theassignment of the phosphorylation to residue Ser307(Figure 2).Figure 1. Strategy for the analysis of phosphorylation inE2F1. E2F1 was immunoprecipitated, protease-digested andthe resulting peptides were enriched by TiO 2and analyzedby LC-MS/MS.Materials and methodsImmunoprecipitation of E2F1 transcriptionfactor: A cell extract from 293T cells overexpressingE2F1 was incubated with an antibody againstE2F1. After washing, proteins were eluted with0.1M glycine pH 2.5 at 25ºC O/N. Samples wereneutralized with 1.5M TrisHCl pH 8.8. In-solutiondigestion of the immnoprecipitated fractions: Proteineluates were reduced with dithiothreitol, alkylatedwith iodoacetamide and digested O/N at 25ºCwith GluC. Titanium Dioxide (TiO2) enrichmentof phosphorylated peptides: Preparation and use ofTiO 2microcolumns for phosphopeptide enrichmentwas performed essentially as previously describedby Larsen et al., 2005 [3]. LC-MS/MS: Titaniumenriched fractions were analyzed in a SYNAPTFigure 2. for E2F1 transcription factor. Among the four possible phosphorylableresidues for the phosphopeptide 301 ETVGGIS-PGKTPSQE 315 , it was possible to assign the phosphorylationsite to residue Ser307.Bioinformatic analysis was also performed topredict possible phosphorylation sites in E2F1. Accordingto NetPhos 2.0 predictor, the phosphoryla-is 0.997, which reinforces our result. Moreover,phosphorylation database Phosida predicted that thekinase involved in the phosphorylation of Ser307would be CDK2. It has already been described thatE2F1 can form a stable complex with cyclinA/CDK2and that CDK2 can phosphorylate E2F1 regulatingthis way its DNA-binding activity [1].N.O. is a recipient of University of the BasqueCountry fellowship for PhD studies. This work has

79been funded by Etortek and Saiotek grants from the IndustryDepartment of the Basque Government. ProteomicsCore Facility-SGIker is supported by UPV/EHU,MICINN, GV/EJ, ESF and ProteoRed agencies.[1] Peeper DS, Keblusek P, Helin K, Toebes M, Vander Eb AJ and Zantema A. Phosphorylation of aticmobility and promotes pRB-binding in vitro.Oncogene 1995;10:39–48. ductionof E2F1 in response to DNA damage,mediated by ATM-dependent phosphorylation.Genes Dev 2001;15:1833-44.[3] Larsen MR, Thingholm TE, Jensen ON, RoepstorffP and Jørgensen TJ. Highly selective enrichmentof phosphorylated peptides from peptidemixtures using titanium dioxide microcolumns.Mol Cell Proteomics 2005;4:873-86.[4] Blom N, Gammeltoft S and Brunak S. Sequenceand structure-based prediciton of eukaryoticprotein phosphorylation sites. J Mol Biol1999;294:1351-62.[5] Gnad F, Ren S, Cox J, Olsen JV, Macek B, OroshiM and Mann M. PHOSIDA (phosphorylationsite database): management, structural andevolutionary investigation, and prediction ofphosphosites Genome Biology 2007;8:R250.y cuantitativa del fosfoproteomaDavid Ovelleiro, Montserrat Carrascal, Joaquin AbianLa determinación de puntos de fosforilación enproteínas es una de las áreas de la proteómica conmayor interés en la actualidad. Los últimos avancesestán permitiendo la detección de formas fosforiladasde péptidos a muy bajas concentraciones y con granproteomahace posible la obtención de instantáneasdel estado de fosforilación de un determinado orga-obstante, debido a las utilización de métodos de en-en el análisis por espectrometría de masas, el análisisde los datos generados aumenta sensiblemente encomplejidad respecto a otros análisis proteómicosclásicos. Es por tanto necesario el establecimiento decon objeto de responder a las diversas necesidadesque las técnicas involucradas requieren.1. Peculiaridades de los datos obtenidos enEn el analisis de fosfopéptidos mediante técnicasde shotgun proteomics deben tenerse en cuentalas siguientes consideraciones:ciónde fosfoproteínas en base al número dedado que en las etapas de enriquecimiento granparte de los péptidos no fosforilados se eliminan.La información analítica reportada debepor tanto tener en cuenta todas las proteínas alas que apuntan estos péptidos únicos, tanto aefectos cualitativos como cuantitativos.-riablespara S/T/Y en MS 2 , y dos más para S/Ten MS 3 ) y las características espectrales de losfosfopéptidos (pérdida preponderante del grupofosfato) facilitan la aparición de falsos positivos.La utilización de bases de datos señuelo nos permiteobtener una estimación de la proporcion defalsos positivos en el conjunto de fosfopéptidosvalidados (FDR o False Discovery Rate) [4, 5].-de una alternativa posible. En estos casos, losbuscadores en base de datos como SEQUEST,

80 para distinguir entre las distintos posiciones defosforilación y pueden dar lugar a asignacionesincorrectas. Por este motivo son precisos análi-estas asignaciones o corregirlas. Entre los métodosdescritos para estos análisis [6,7], uno de losmás populares es la puntuación Ascore.2. Formatos para el almacenamiento deinformaciónFigura 1. contenida en el archivo de almacenamiento phosFile.El formato estándard más utilizado para almacenarla información analítica en proteómica es elXML. Uno de los estándares más recientes de archivoXML para el almacenamiento de datos analíticos esel mzIdentML [8]. Sin embargo, la complejidad ydiversidad de la información recopilada en un experimentoproteómico hacen que estos estándares seanevaluar otras alternativas de almacenamiento. Porotra parte, es también importante establecer un procedimientopara la incorporación de la informaciónexperimental utilizando diferentes MIAPE asociadasal experimento, teniendo especial importancia aquíel modelo MIASPPE [9] (“Minimum InformationAbout Sample Preparation for a PhosphoproteomicsExperiment”). En la Figura 1 se presenta el esquema-almacenamiento de la información obtenida en cadapaso en un único formato de almacenamiento llamado. Dicho formato de almacenamientopermite una fácil conversión a formatos usables porel investigador (ie. Excel) o la exportación de la informacióna una base de datos como Lymphos [10].Referencias[1] Nesvizhskii A. I. and Aebersold, R.. Interpretationof Shotgun Proteomic Data. The ProteinInference Problem. Mol. Cell Proteomics 2005;4:1419-1440. al., Guidelines for the next 10 years of proteomics.Proteomics 2006; 6: 1, 4-8.[3] Reiter L, Claassen M, Schrimpf , S.P., et al. Pro-large proteomics datasets generated by tandemmass spectrometry. Mol. Cell Proteomics 2009.[4] Elias, J.E. and Gygi, S.P. Target-decoy search Nat. Methods 2007; 4: 207-214.[5] Xiuxia Du.et al. Linear Discriminant Analysis-Based Estimation of the False Discovery RateRes. 2008 ; 7 : 2195-2203.[6] Beausoleil, S. A., Villen, J., Gerber, S. A., et al. Aprobability-based approach for high-throughputprotein phosphorylation analysis and site localization.Nat. Biotechnol. 2006; 24: 1285-1292.[7] Ruttenberg, B.E., Pisitkun, T., Knepper, M.A.and Hoffert, J.D. PhosphoScore: An Open-Source Phosphorylation Site Assignment Toolfor MS n Data. J. Proteome Res. 2008; 7: 3054-3059.[8] Orchard S, Jones P, Taylor C, et al. Proteomicdata exchange and storage: the need for commonstandards and public repositories. Methods MolBiol. 2007; 367: 261-70.[9] Carrascal, M., Ovelleiro, D., Casas, V. et al.Phosphorylation Analysis of Primary HumanT Lymphocytes Using Sequential IMAC andTitanium Oxide Enrichment. J. Proteome Res.2008; 7: 5167–5176.[10] Ovelleiro D, Carrascal M, Casas V and Abian J. Lym-PHOS: design of a phosphosite database of primaryhuman T cells. Proteomics 2009; 9: 3741-51.

81de proteínas en muestras vegetalesSira Echevarría-Zomeño 1 , Per Hägglund 2 P, Birte Svensson 2 , Ana María Maldonado Alconada 1 ,Jesús V. Jorrín Novo 11Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Grupo de Bioquímica y Proteómica Vegetal y Agrícola,Universidad de Córdoba, España. 2 Department of Systems Biology, Technical University of Denmark,Lyngby, DenmarkResumenPara el estudio del estado redox (tiol-disulfuro)de las proteínas, se utilizan técnicas de bioquímicaclásica y de proteómica, incluidas aquellas de segundageneración (DIGE, ICAT), basadas en el marcajeproteómica se han empezado a usar en el estudio delos mecanismos que median procesos de desarrollo yrespuesta a estreses en humanos, mamíferos, organismosmodelo tales como Escherichia coli, y en menormedida en plantas. Sin embargo, su potencial distamucho de ser totalmente explotado. El objetivo deeste trabajo es el de optimizar el uso de las técnicasDIGE e ICAT para el estudio del proteoma redox, utilizandoArabidopsis thaliana como sistema modelo.La aplicación de estas técnicas ha puesto de mani-redox de las proteínas, pero también a demostrado laimportancia de incluir en los experimentos controlesadecuados para cada paso del protocolo.Se conoce como proteoma redox al conjunto deproteínas susceptibles de cambiar su estado de oxidorreducciónen respuesta a algún estímulo. Estas modi-de cisteína, pueden ser irreversibles (como la oxidacióna ácido cisteico), lo que conlleva la pérdida deactividad biológica, o reversibles, en los que el grupotiol se puede oxidar a puente disulfuro (cisteína-cis-mecanismos de regulación de la actividad, vida mediay patrón de interacción de la proteína [1-4].En un experimento típico dirigido a la caracterizacióndel proteoma redox, se utilizan técnicas basadastracciónproteica, ii) marcaje de tioles libres medianteagentes tiol-reactivos (iodoacetamida, maleimida,glutatión) unidos a algún tipo de elemento marcador,---análisis de imagen y espectrometría de masas.Las técnicas de proteómica cuantitativa de segun-restos de cisteína, tales como DIGE o ICAT, se hanempezado a utilizar en estudios del estado redox deproteínas en diversos sistemas como mamíferos [5],bacterias [6] y en menor medida, en plantas [7]. Paracaracterizar el estado redox de las proteínas en Arabidopsisthaliana, en nuestro grupo se están optimizandolas técnicas redox-DIGE y oxICAT. Estas técnicasse basan en el marcaje diferencial de los residuos oxidadosy los reducidos. En nuestro caso, este marcajese llevó a cabo en la misma muestra, en lugar de endetalla en la Figura 1. La preparación de la muestrase llevó a cabo a pH ácido, lo que evita intercambiostiol-disulfuro y oxidaciones espontáneas, que se dana pHs 7-9 [8]. Para poder utilizar los dos agentesen el mismo tubo de ensayo, fue necesario eliminarel exceso de reactivo en cada paso del proceso. Enel experimento, se incluyeron controles en los quelas muestras se redujeron completamente desde elprincipio, de manera que sólo uno de los reactivosmarcadores debería detectarse en los resultados.La aplicación de ambas técnica puso de ma-entre residuos oxidados y reducidos. Sin embargo,a la vista de los resultados de los controles condel proceso de marcaje es menor de la esperada,demostrando que la inclusión de este tipo de controleses de gran importancia para evaluar la validezdel experimento y corregir el error generado por elmarcaje residual.

82 Figura 1. Esquema de las técnicas redox-ICAT (A) y redox-DIGE (B). Tras la extracción proteica, los marcajes se realizaroncon ambos agentes en el mismo tubo de ensayo.Referencias[1] Forman HJ y Torres M. Redox signaling inmacrophages. Mol Aspects Med 2001;22:189-216.[2] Klatt P y Lamas S. Regulation of proteinfunction by S-glutathiolation in response tooxidative and nitrosative stress. Eur J Biochem2000;267:4928-44.[3] Bonetto V y Ghezzi P, tionof protein cysteines: old methods revisited forproteomics en Redox Proteomics: from protein(editores: Dalle-Donne Isabella, Scaloni AndreaLTD.(2ª), Hoboken, New Jersey 2006, p. 976.[4] Bardwell JC. Building bridges: disulphidebond formation in the cell. Mol Microbiol1994;14:199-205.[5] Hurd TR, Prime TA, Harbour ME, Lilley KSy Murphy MP. Detection of reactive oxygenspecies-sensitive thiol proteins by redox differencegel electrophoresis: implications formitochondrial redox signaling. J Biol Chem2007;282:22040-51.[6] Leichert LI, Gehrke F, Gudiseva HV, Blackwellchanges in the thiol redox proteome upon oxidativestress in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A2008;105:8197-202.[7] Hagglund P, Bunkenborg J, Maeda K y Svenssonusing a quantitative proteomics approach based2008;7:5270-6. teins.Methods Enzymol 1984;107:305-29.

83Deciphering the S-Nitrosylome of Arabidopsis thaliana during the defenseresponseAna M. Maldonado-Alconada 1 , Sira Echevarría-Zomeño 1 , Christian Lindermayr 2 , Jörg Durner 2 ,Jesús V. Jorrín-Novo 11Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and MolecularBiology, University of Cordoba, Spain. 2 Institute of Biochemical Plant Pathology, Helmholtz ZentrumMünchen - German Research Center for Environmental Health, D-85764 Neuherberg, GermanyThe biological effects of nitric oxide (NO) aremainly mediated through S-nitrosylation of cysteinebinedwith mass spectrometry analysis to identifytargets of S-nitrosylation in Arabidopsis thalianacell suspension cultures and leaves challenged withthe pathogenic bacteria Pseudomonas syringae pv.tomato. The NO targets belong to different functionalcategories, and include proteins previouslytargets. Our data support the idea that NO orchestratesthe whole plant physiology through covalentOne of the earliest events occurring in plantsfollowing pathogen infection is a strong oxidativeburst and increases in the NO level being the correctintracellular balance between these moleculescrucial for the establishment of resistance [1, 2].The reversible covalent binding of NO to a speci-mechanism by which NO exerts its function and[3, 4]. In order to uncover the role of this type ofactive defense in plants) and R-mediated resistanceto identify S-nitrosylated proteins in Arabidopsisplants and cell extracts challenged with virulent Pstand avirulent Pst avrRpt2.Protein extracts were subjected to the biotinswitch method converting S-nitrosylated Cys tobiotinylated Cys [3]. Extracts (10 mg for proteinµg for detection of biotinylatedmethanethionsulfonate (MMTS) and 2.5% SDS forblocking free cys residues. Treatment with GSNO(500 µM) was used to generate S-nitrosothiols invitro and the treatment with the reducing agent DTT(20mM) was performed as a control that the labellingobserved corresponds to originally S-nitrosylatedproteins. Biotinylated proteins were visualizedby immunoblotting using anti-biotin antibody andtravidinmatrix, and bound proteins were eluatedwith 100 mM β-mercaptoethanol. For protein iden-and subjected to LC/MS/MS analysis using a Surveyor/MicroASHPLC system in tandem with anUSA). The MS/MS spectra obtained were analysedusing the Bioworks 3.2 software (ThermoFisher(Thermo, MA), against a non-redundant NCBI andMSDB databases and their reverse, allowing for va-β-mercaptoethanoland organism restriction to Arabidopsis. The FDRvalue was adjusted to 1% taking as a reference theXcorr values obtained from the search using thereverse database (DCn >0.1).The results obtained indicate more intense labelingfollowing P. syringae infection, especially thosefrom PstavrRpt2- treated samples. In addition moreor cells challenged with P.syringae compared tocontrol and non-treated samples. This indicates thatleaves and cells undergoing a defense reaction containhigher levels of S-nitrosothiols, which is consistentwith the increased NO production during theincompatible interaction [2].sicallyany process of cellular physiology and includecytoskeleton proteins (11%), enzymes involved

84 in carbon and nitrogen mobilization (41%), pathogen-and stress-related proteins (10%), enzymes ofthe antioxidant defense system (6%) and signalingand regulating proteins (14%). The majority of theNO targets were not exclusive to a given treatment,which is in agreement with the dynamic nature ofS-nitrosylation, and suggests that the right balancebetween both redox states are needed for the correctfunction of the protein.Comparison of S-nitrosylation targets in animalwork and in previous studies in plants [4] revealscommon targets between animals and plants. Aboutpotential targets for S-nitrosylation, while othersand plant systems.These results provide clues on the possible NOtargets during basal and R-mediated resistance, andzymesallows the coordinated modulation of redoxsignalling and orchestrates the outcome of compa-planning to identify the cys residues involved andand transgenic of selected candidates, we haveconducted infection experiments with Arabidopsisloss-of-function insertion mutants for redox- anddefense-related genes. The differential behaviourof these mutants from wild-type control plants inboth, compatible and incompatible interactions, andthe monitoring of the progress of disease symptomsprovide evidence that these mutants are compromisedin the activation of basal and R-mediateddefense responses.pportfrom the Spanish “Ministerio de EducaciónmaculadaRedondo for her technical assistance.TheMS analysis was conducted at the Proteomics Unit(SCAI) at Cordoba University. SEZ is supported bya by a grant from the the Spanish “Ministerio deEducación y Ciencia”.References[1] Durner J and Klessig DF. Nitric oxide as a signalin plants. Curr Opin Plant Biol. 1999; 2: 369-74.[2] Delledonne M, Zeier J, Marocco A and LambC. Signal interactions between nitric oxide andreactive oxygen intermediates in the plant hypersensitivedisease resistance response. ProcNatl Acad Sci U S A. 2001; 98: 13454-9.[3] Lindermayr C, Saalbach G and Durner J. Pro-in Arabidopsis. Plant Physiol 2005; 137: 921-930.[4] Lindermayr C and Durner J. S-Nitrosylation inplants: pattern and function. J Proteomics. 2009;73:1-9.[5] Hao G, Derakhshan B, Shi L, Campagne F andGross SS. SNOSID, a proteomic method forcomplex protein mixtures. ProcNatl Acad Sci US A. 2006; 103: 1012-1017.[6] Martínez-Ruiz A and Lamas S. Detection andproteomic identification of S-nitrosylatedproteins in endothelial cells. Arch. Biochem.Biophys. 2004; 423: 192–199.

85Caracterización de S-glutationilación de proteínas a nivel de proteoma.Esperanza Morato López 1 , Sira Echevarría Zomeño 2 , Anabel Marina Ramírez 11Servicio de Proteómica. C.B.M. “Severo Ochoa”. CSIC-UAM2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de CórdobaLa S-glutationilación no solo es una respuestacelular al estrés oxidativo, también es un mecanismopara la regulación postraduccional dinámica deproteínas reguladoras, estructurales y metabólicas.Estudios recientes han demostrado su implicaciónen la regulación de la señalización y rutas metabólicasde sistemas celulares [1, 2]. Por todo ello seestán desarrollando métodos analíticos y proteómicosque permitan la caracterización de estas modi-espectrometría de masas que hemos encontrado ennuestro laboratorio es la “calidad” de los espectrosde fragmentación MS/MS.Recibimos en nuestro laboratorio unas muestraspara la caracterización de glutationilaciones.de glutationilación de proteínas en el proteoma deArabidopsis thaliana tras la infección con la cepano virulenta de Pseudomonas syringae. Disponíamosdel proteoma no infectado (NI), del proteomaincubado 4 h con un placebo (MgCl) y del proteomainfectado 4 h con la cepa de P. syringae. Decada proteoma disponíamos de tres condiciones: sinagente reductor, tratada con glutatión (GSH) y tratadacon glutatión disulfuro (GSSH). Comenzamosel trabajo con las tres condiciones de la muestra NI,para lo cual confeccionamos tres geles SDS-PAGE,en gel concentrador y, de esta manera, limpiar elproteoma [3] (el tampón de muestra no conteníabeta-mercaptoetanol ni DTT). Los péptidos obtenidostras las digestiones se analizaron medianteLC-MS empleando un espectrómetro de masas LTQpéptidos se empleó el software SEQUEST (ThermoAl analizar los resultados observamos un altola muestra NI como en la NI+GSH. El número de similar (aproximadamente 200), así como fueronsimilares los valores de este parámetro entre lospéptidos de ambas muestras. Analizamos de modomanual los espectros MS/MS con mejores puntua-muestra NI, pero demostrando S-glutationilaciónpara la muestra NI+GSH. Las conclusiones preliminaresde estos resultados son que este abordaje noglutationilaciones en proteomas ya que no es posibleestablecer un punto de corte, puesto que espectroscon el mismo valor de Xcorr pueden ser asignadosestudio en profundidad de los espectros MS/MS dauna explicación a este hecho y es la “idiosincrasia”gran mayoría son especies M+3H + , probablementedebido a que en el glutatión el enlace entre el aspárticoy la cisteína es tal que queda expuesto unnuevo extremo -NH 2susceptible de protonación.Esto acompleja el patrón de fragmentación a la parque, en péptidos grandes, se pierde la zona alta delespectro (m/z > 2000). Son espectros con un altonivel de “background” cuando los valores de Xcorrno son > 4, y se asemejan mucho a espectros de“contaminantes”. Este hecho hace que un espectrocon mal aspecto que no se corresponda con elpéptido candidato tenga la misma puntuación, enocasiones, que el que si se corresponde. Dentro del“background” podemos encontrar fragmentos procedentesdel glutatión [4] como pérdida del glutámico,de todo el glutatión o de parte del mismo, pero notodos los fragmentos del espectro se pueden asignara este patrón extra de fragmentación.En consecuencia, las puntuaciones obtenidasempleando SEQUEST son, mayoritariamente, bajos,aún en las asignaciones correctas, lo que hacemuy difícil establecer un criterio de calidad que es

86 a gran escala. El examen manual de los espectrossería impensable, solo factible cuando estudiamosQuizás, un mayor conocimiento del mecanismode fragmentación de estos péptidos pueda dar lugarmismos y, de esta forma, hacer posible el estudio deReferencias[1] Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, ColomboR, Milzani A. “S-glutathionylation in protein Medicine 2007; 43:883-898.[2] Dalle-Donne I, Rossi R, Colombo G, GiustariniD, Milzani A. “Protein S-glutathionylation: aregulatory device from bacteria to humans”.Trends in Biochemical Sciences 2008; 34,2:85-96.[3] Bonzon-Kulichenko E, Pérez-Hernández D,Núñez E, Martínez-Acedo P, Navarro P, Trevisan-HerrazM, Ramos MC, Sierra S, Martínez-Martínez S, Ruiz-Meana M, Miró-Casas E,García-Dorado D, Redondo JM, Burgos JS,Vázquez J. “A robust method for quantitativehigh-throughput analysis of proteomes by 18Olabeling”. Mol Cell Proteomics, 2009 (enrevisión). D.M. “Dopamine biosynthesis is regulated byS-glutathionylation. Potential mechanism oftyrosine hydroxylase inhibition under oxidativestress”. J Biol Chem 2002; 277:48295-48302.La inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducidaexperimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasisde nitrosotiolesLaura M. López-Sánchez 1 , Fernando J. Corrales 2 , Montserrat Barcos 3 , Isabel Espejo 3 , Juan R.Muñoz-Castañeda 1 , Antonio Rodríguez-Ariza 11Hospital Universitario Reina Sofía. Unidad de Investigación, IMIBIC, Córdoba, 2 Universidad de Navarra,Hepatology and Gene Therapy Unit, Pamplona, 3 Hospital Universitario Reina Sofía. Servicio de AnálisisClínicos, CórdobaIntroducciónLas intervenciones que faciliten el metabolismodel óxido nítrico (NO) en etapas colestásicas tempranaspueden ayudar a mantener el estado redox de lasproteínas hepáticas. Además, escasos estudios hanexplorado la participación de la S-nitrosilación deproteínas y el metabolismo de nitrosotioles (SNO)en la lesión hepatocelular por colestasis.Metodología4 grupos (n=10): operación simulada (OS), ligaduradel conducto biliar (BDL), y ratas BDL tratadascon el inhibidor de síntesis de NO S-metilisotiourea(SMT, 25 mg/Kg) o con ácido tauroursodeoxicólico(TUDCA, 50 mg/Kg). La función hepática y NOplasmático se analizaron mediante ensayos bioquímicos.La proliferación ductular se determinó encortes teñidos con hematoxilina-eosina y se con-se determinó mediante tinción con tricrómico deMasson. Se analizó la expresión de la bomba exportadorade productos conjugados (Mrp2), afectadaen diversos modelos experimentales de colestasis,mediante western blot, y la de iNOS y la enzi-por el gen ADH5 en humanos) por RT-PCR. Lascon el método “biotin-switch”, una aproximación

87metodológica que permite el marcado selectivo delas nitrosoproteínas con biotina, en el que los tioleslibres se bloquean con metil metanotiosulfonato, acontinuación los SNO son reducidos selectivamenteformados reaccionan con HPDP-biotina. Las proteínasbiotiniladas se detectaron mediante un anti--con HPLC acoplado a ESI-MS/MS.ResultadosFigura 1. Marcadores séricos de función hepática en ratasBDL.Después de 7 días, el inhibidor de iNOS fuemucho mas efectivo que TUDCA en reducir la lesiónhepatocelular, con una disminución de enzimashepáticas y de bilirrubina circulantes (Figura 1) ytosrecuperaron los niveles basales del transportadorcanalicular Mrp2 cuya expresión se inhibe durantela colestasis (Figura 2), pero sólo el tratamientoniveles plasmáticos de NO y de proteínas hepáticasS-nitrosiladas en las ratas BDL (Figuras 3 y 4). Laexpresión de GSNOR hepática, que regula la homeostasisde SNO y los niveles de proteínas S-nitrosiladas,mostró un acusado descenso en ratas BDL,que se recuperó tras el tratamiento con SMT, pero nonashepáticas que se encontraban S-nitrosiladas enratas BDL (Tabla 1), incluyendo enzimas mitocondrialesque participan en la síntesis de ATP y el metabolismode ácidos grasos, dos procesos que se venalterados en colestasis. Además, dos de las proteínassa(también llamada metionina adenosiltransferasa,MAT), y la betaína-homocisteina S-metiltransferasa(BHMT), dos importantes enzimas implicadas en elciclo de la metionina cuya alteración es frecuentementeobservada en procesos colestásicos.Producción de NO y expresión del gen Nos2 enratas BDL.Figura 2. Expresión de la proteína Mrp2 en ratas BDL.Figura 4. Detección de proteínas S-nitrosiladas en ratasBDL. *Lisado hepático incubado in vitro con GSNO.

88 Tabla 1. Nombre de la proteínaNúmero deacceso NCBINúmerode péptidosCobertura deLocalizaciónProteínas del citoesqueleto P62738 1 10 Cit P04691 1 4 CitEnzimas metabólicasS-adenosil metionina sintetasa tipo 1 P13444 1 6 CitAldehido deshidrogenasa, microsomal P30839 2 5 RE P15999 1 2 MitBetaina-homocisteina S-metil-transferasa 2 Q68FT5 1 4 CitCarbamoil-fosfato sintasa 1 P07756 13 20 MitCarboxilesterasa 3 precursor P16303 3 7 REDihidroxiacetona quinasa Q4KLZ6 2 6 RE10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa P28037 2 3 CitFructosa-bifosfato aldolasa B P00884 3 11 CitGlutamato deshidrogenasa 1 P10860 1 5 MitHidroximetilglutaril-CoA sintasa P22791 3 17 Mit3-cetoacil-CoA tiolasa P13437 1 8 MitL-lactato deshidrogenasa, cadena A P04642 1 6 CitAcido graso CoA ligasa, cadena larga 1 P18163 2 9 MitMalato deshidrogenasa P04636 1 21 MitPiruvato carboxilasa mitocondrial precursor P52873 2 6 MitChaperonas moleculares P34058 1 6 CitPDI P04785 2 9 RERiboforina 1 P07153 2 7 REGlutatión S-transferasa Mu 1 P04905 2 28 CitGlutatión S-transferasa Mu 2 P08010 3 22 CitProteínas de señalización P62632 1 4 CitOtrasAlbúmina de suero, precursor P02770 3 12 Sec

89Figura 5. Actividad GSNOR hepática y expresión del gen Adh5 en ratas BDL.Conclusionespéuticode inhibir la síntesis de NO, en un contextocolestásico, al facilitar la homeostasis de nitrosotioles.y proporcionan dianas de S-nitrosilación queposibilitarán el desarrollo de nuevas terapias en dolenciascolestásicas.AgradecimientosReferencias[1] López-Sánchez LM, Corrales FJ, Barcos M, EspejoI, Muñoz-Castañeda JR, Rodríguez-ArizaA. Inhibition of nitric oxide synthesis duringinduced cholestasis ameliorates hepatocellularinjury by facilitating S-nitrosothiol homeostasis.Lab Invest. 2009 Oct 5. DOI: 10.1038/labinvest.2009.104.Financiado por FIS PI 07/0159

90 Daniel Tello, Rubén Fernández-Rodríguez, Antonio Martínez-RuízHospital Universitario de La Princesa, Madrid, EspañaLas especies reactivas de oxígeno (ROS) y nitrógeno(RNS) pueden jugar un papel fundamentalen mecanismos de señalización celular en diversosmoleculares por los que actúan, van cobrando im-en cisteínas entre ellas la nitrosilación, tiolación yformación de ácido sulfénico, además de la forma-en los últimos años se ha puesto gran interés en laaplicación de diferentes métodos proteómicos parapostraduccionales “nitroxidativas”.El método de “biotin switch” abrió paso a la-cisteína oxidada) por biotina, previa reducción es-nitrosotioles y DTT en el caso de cisteínas oxidadas).Una evolución del clásico “biotin switch” es elpara reaccionar con tioles libres.dor,y empleando electroforesis bidimensionales,a nitrosocisteína (CysSNO) en células endotelialesy denotar la importancia de la ruta de la tiorredoxinareductasa en la eliminación de nitrosotioles en ma-se ha conseguido correlacionando el aumento en latrónde proteína total marcada con un reactivo quedetecta proteína total en solución neutra (Lucy-565),de forma que pudiéramos obtener ambos patronesEste tipo de metodología proteómica la estamos-a hipoxia en diversos sistemas celulares. Se ha sus-ceínapor Bodipy-FL, el cual presenta carga netaneutra, con lo que se elimina el desplazamiento en lamigración de las proteínas en el isoelectroenfoque.Para observar diferencias pequeñas entre diferentescondiciones estamos aplicado una metodología ba-Bodipy-FL o Bodipy-TMR y se cargan en el mismogel bidimensional. Sin embargo, el análisis detalladode los resultados en ambos esquemas, para relacionarloscon el patrón de proteína total, requiere de uncambio en los protocolos de análisis respecto a lospaquetes de software preparados para los esquemashabitualmente utilizados.Referencias[1] Tello D, Tarín C, Ahicart P, Bretón-Romero R, switch” technique increases the sensitivity S-nitrosylated proteins. Proteomics 2009; inpress. Published online with DOI 10.1002/pmic.200900070.

91in Schizosaccharomyces pombe by proteomic approachesSarela García-Santamarina, Susanna Boronat, Elena HidalgoDepartament de Ciències Experimentals i de la Salut. Universitat Pompeu FabraReactive oxygen species (ROS) (H 2O 2, OH·, O 2-.)generated as a consequence of the oxygen metabolismin aerobic organisms, have important roles in cell signalling.However, if they reach concentrations beyondhomeostatic levels they generate a situation of oxidativestress where damages to cellular components areproduced. In the case of H 2O 2, even physiological levelsmay produce a chronic low level of stress, whichprogressively drives the cell into the aging process.In order to understand the consequences of anoxidative stress situation in the cell, it is importantto unravel which are the primarily biological targetsof ROS and which are the consequences of suchreactivity. Here we report the study of different ty-Schizzosacharomyces pombe, under exogenous oxidativestress, by adding H 2O 2to the culture media,and also under endogenous oxidative stress, usingmutant strains defective for ROS scavengers.By 1D electrophoresis, we observe that rever-both stresses, and in the case of H 2O 2treatment,the kinetics correlates with oxidative activation ofthe S. pombe H 2O 2shifting the growth of the mutant strains from ananaerobic condition to an aerobic one results indifferential irreversible carbonylation of proteins. -cysteines. In addition, we have established a 2Delectrophoresis approach to identify targets of car-This would allow us to study the consequences oftheir biological relevance after situations of intrinsicand extrinsic oxidative stresses.La lipoproteína lipasa de rata se nitra in vivo en respuesta a la administraciónde lipopolisacáridoAlbert Casanovas 1 , Montserrat Carrascal 2 , Joaquín Abián 2 , Miquel Llobera 1 , M. Dolores López-Tejero 11Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona, Barcelona,España. 2 CSIC/UAB Proteomics Laboratory, IIBB-CSIC-IDIBAPS, Universitat Autònoma de Barcelona,Bellaterra, España.La lipoproteína lipasa (LPL) juega un papelcentral en el metabolismo lipídico hidrolizando lostriacilgliceroles (TAG) plasmáticos. Una de las respuestasmetabólicas características a la infección esla hipertrigliceridemia, que es consecuencia, al menosen parte, de la disminución de la actividad LPLde los tejidos. La administración de lipopolisacárido(LPS) provoca una inhibición de la actividad LPLtisular a nivel postranscripcional [1,2] y un aumentode la producción de óxido nítrico (NO). Estudiosanteriores han propuesto una relación causa/efectoentre el aumento de la síntesis de NO y la disminuciónde actividad LPL tisular [2] aunque no seha determinado si esta interacción es directa o está

92 mediada por otros factores. En este trabajo hemosestudiado la potencial nitración in vivo de la LPL enrespuesta a la administración de LPS en rata.La administración de LPS produce un aumentode los TAG circulantes, de la expresión de la óxidonítrico sintasa inducible, de la producción de NO yuna disminución generalizada de la actividad LPL entejidos. De manera preliminar evaluamos la sensibilidadde la LPL a la nitración, tratando in vitro LPLbovina con peroxinitrito, una especie reactiva delnidocomo un marcador de la interacción de proteínascon RNS. Así, la nitración de la LPL bovina tratadacon peroxinitrito se determinó mediante Western blotespectrometría de masas en tándem (MS/MS) desinasnitradas. Para la localización de nitrotirosinasmediante espectrometría de masas se compararontres estrategias distintas de fragmentación MS/MS:(1) MS/MS dependiente de datos de los péptidosmás abundantes, (2) MS/MS dependiente de datos dey (3) MS/MS secuencial siguiendo una lista de ionesalta para este modo de barrido. Este análisis permitiódetectar 8 residuos nitrados in vitro en la LPL bovina(Figura 1). El alto grado de homología entre la LPLbovina y la de rata permitieron el uso de los espectrosMS/MS de péptidos nitrados de la LPL bovina comoespectros de referencia para el análisis de una potencialnitración in vivo de la LPL de rata en respuesta ala administración de LPS. Para el estudio de la LPLmosparcialmente la enzima a partir de homogenadoparina-Sepharosey resolvimos isoformas de pI de laLPL mediante electroforesis en 2 dimensiones, comodescribimos en trabajos anteriores [3]. Las isoformasde pI de la LPL se recortaron del gel, se digirieroncon tripsina y los péptidos obtenidos se analizaronmediante MS/MS secuencial siguiendo una lista deinvivo (en las posiciones 94, 164 y 316) en la LPL decorazón de rata tratada con LPS (Figura 1).nitrados en la LPL, tanto in vivo como in vitro, ydemuestra que la LPL es una diana de las RNS en elcontexto de la endotoxemia [4]. Así, estos resultadossugieren que la nitración puede constituir un mecanismonuevo de regulación de la actividad LPL tisulary abren las puertas a futuros estudios dirigidosen las que se ha propuesto que la LPL puede estarregulada por NO.ReferenciasFigura 1. Alineación de las secuencias de la LPL bovina yde rata y localización de las tirosinas nitradas detectadas.En la secuencia se indican las tirosinas nitradas detectadasfragmentación MS/MS secuencial sobre un listado de ionesblecon el listado de iones barridos, mientras que la coberturadetectada experimentalmente se muestra en negrita. Elpéptido señal se indica en cursiva. Los aminoácidos estánnumerados empezando por el extremo N-terminal de la proteínamadura. LPLb, LPL bovina; LPLr, LPL de rata.La primera estrategia de fragmentación ofreció lamáxima cobertura de secuencia, mientras que el tercermétodo permitió detectar un mayor número detirosinas nitradas, mostrando una sensibilidad más[1] Gouni I, Oka K, Etienne J y Chan L. Endotoxininducedhypertriglyceridemia is mediated bysuppression of lipoprotein lipase at a post-transcriptionallevel. J Lipid Res 1993;34:139-46.[2] Picard F, Kapur S, Perreault M, Marette A yDeshaies Y. Nitric oxide mediates endotoxininducedhypertriglyceridemia through its actionon skeletal muscle lipoprotein lipase. FASEB J2001;15:1828-30.[3] Casanovas A, Carrascal M, Abián J, López-TejeroMD y Llobera M. Discovery of lipoproteinlipase pI isoforms and contributions to their characterization.J Proteomics 2009;72:1031-9.[4] Casanovas A, Carrascal M, Abián J, López-Tejero MD y Llobera M. Lipoprotein lipase isnitrated in vivo after lipopolysaccharide challenge.Free Radic Biol Med 2009;47:1553-60.

93Application of iTRAQ reagents to relatively quantify the reversible redox stateof cysteinesBrian McDonagh, C. Alicia Padilla, J. Antonio BárcenaDepartment of Biochemistry and Molecular Biology, University of Córdoba, Instituto Maimónides deInvestigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), SpainThe dynamic nature of the proteome ensures thatthe cell is able to respond to environmental, genetic,biochemical and pathological perturbations. Howthe proteome responds to these stimuli is of considerableinterest as it can relate to the cells stressresponse and can take the form of post-translationalsubsequent effects on translation and transcription.Improvements in mass spectrometry has lead to thedevelopment of a number of techniques to quantifythe abundance of proteins within any given sample,stable isotope labelling of amino acids in cell culture(SILAC) isobaric tags for relative and absoluterelative quantity of a protein between two samplesdoes not tell us anything about the functional stateof the protein itself, this is especially important inreference to redox proteins that contain thiol switchesand are susceptible to activation or inactiva-alcohol dehydrogenase, which has a decrease in thenumber of free thiols and loss of activity in responseto oxidative stress. This protein contains two cysteinecontaining tryptic peptides that are amenable toto these peptides to relatively quantify the reversibleredox state of cysteine peptides both in a control andtest state, in a single analysis.

94 4. PROTEÓMICA CUANTITATIVACoordinadores: Miren J. Omaetxebarría y Eva Rodríguez-SuárezSoluciones a Retos Analíticos en Proteómica Cuantitativa y Validación deBiomarcadoresIsidro MasanaAgilent Technologies – Barcelonaquiriendocada vez una mayor importancia en proteómica.A medida que se van descubriendo potencialesción-cada vez más- requiere herramientas analíticasconcretos, en un gran número de muestras con muyelevada sensibilidad y reducido tiempo de análisis.La nano-cromatografía líquida acoplada a espectrometríade masas con la tecnología de triple cuadrupolo(nano-LC/MS-QQQ) en su modalidad de MRM(“Multiple Reaction Monitoring”) proporciona hoyen día la mayor sensibilidad, robutez y selectividadcompounds”) en muestras complejas. La modalidadMRM también ofrece una alta precisión y un tiempopocos miles de péptidos en un solo análisis. Todo ellola convierte en la tecnología ideal para aplicacionescuantitativas y especialmente para la validación demarcadores biológicos con alto rendimiento.Retos analíticos: elevada sensibilidadComparando equipos de igual gama, los QqQ enMRM son capaces de proporcionar sensibilidades delorden de 20 veces mejores que otros sistemas de MS/MS que siempre proporcionan el espectro completo.muy bajos de atomoles con buena repetibilidad (Figura1). Su mayor sensibilidad se debe a:1º La total focalización de la detección por MRMen sólo los iones precursores y producto de interés(estos se irán programando en el tiempo).2º Al efectuar MS/MS en el espacio, la sensibilidaddel proceso de detección en un QqQ no seve reducida por la coelución con otros péptidosmayoritarios. Con respecto a sistemas basadosatrapado temporal de los iones en un espacio),los QqQ proporcionan una mayor y más robustasensibilidad - menos “entorno dependiente”-pues ésta sólo se ve afectada por cambios en larespuesta debida a interacciones en el proceso deionización de péptidos coeluyentes. En sistemases habitual perder sensibilidad en la detecciónde péptidos minoritarios cuando éstos coeluyencon otros de mayoritarios o contaminantes delsistema; éstos generan una saturación de cargasen el espacio de atrapado de los iones que reducela sensibilidad (por reducción en el tiempo deacumulación o cambio en la m/z medida).temasbasados en nano-cromatografía (como p.e. elsistema HPLC-Chip/MS) [1] serán los que mayorsensibilidad proporcionen. Una buena cromatografíaserá también importante para minimizar las posiblessupresiones en la ionización, y reducir así efectosadversos de la matriz de la muestra o coelucionescon péptidos mayoritarios. Otra posibilidad es la deutilizar sistemas de preconcentración selectiva deltipo de péptidos de interés; destaca el nuevo HPLC/Fosfo-Chip [2-3] que incluye una precolumna deóxido de titanio y permite automatizar la preconcentraciónselectiva de los péptidos fosforilados ysu análisis por separado del resto de péptidos nofosforilados (que suelen estar presentes a concentracionesmucho más elevadas).

95Figura 1. MRM péptidoALELFR2+ (480.3 630.4).Desde el punto de vista de preparación de mues-considerablemente la sensibilidad. Eliminar proteínasmayoritarias [4], fraccionar las proteínas o péptidospor pI (Offgel Electroforesis) [5], por cromatografía(mRP-C18, SCX,..) o con los tradicionales geles sonherramientas todas ellas muy útiles. Eliminar las 14proteínas mayoritarias~94% proteína total (Hu-14Column) y luego fraccionar la fracción de proteínasminoritarias por pI con un sistema de Offgel Electroforesis,que permite recoger directamente la muestraen solución líquida (compatible con LC/MS) conelevada resolución (hasta 0,1 unidades pI), es muyútil para separar isoformas y facilitar el estudio deRetos Analíticos: RapidezLa elevada variabilidad de los sistemas biológicosconlleva tener que evaluar un elevado nº deindividuos de cada una de las poblaciones sujetas aestudio, que exigirá el uso de métodos optimizadossibilidadde los péptidos de interés. Para ello convienedisponer de sistemas de nano-cromatografía rápidos;capaces de proporcionar un mínimo volumende retardo del gradiente, para evitar que el cambiode composición del eluyente tarde mucho tiempo(5-10min) en llegar a columna y retrase todo elcromatograma (primeros péptidos eluyendo al cabode 10-15min). De los diversos tipos de sistemas delos que proporcionan volúmenes de retardo del gradientemás pequeños (en algunos sólo unos pocoscentenares de nL) y permiten análisis más rápidos.Otro punto a considerar es la rapidez del detec-10-15 puntos de medida a lo largo del pico (mínimo-de cada transición. Los QqQ más rápidos permitenmedir hasta +200 transiciones MRM distintas porsegundo, unas 20 veces más rápido que el resto desistemas MS/MS que, a lo sumo, suelen llegar a10 MS/MS por segundo y limitan el nº de péptidosReferencias[1] Fortier M, Bonneil E, Goodley P, Thibault P.trometry-BasedProteomics and Its Applicationto Biomarker Discovery Programs. Anal. Chem.2005; 77: 1631-1640. S, Benschop JJ, Heck AJ. Chip-Based Enrichmentand NanoLC-MS/MS Analysis of Phos-Res. 2008; 7(4): 1565-71.[3] Raijmakers R, Mohammed S, J.R Heck A.

96 Lin D., Masana I., HPLC-FosfoChip: análisisselectivo de Fosfopéptidos por LC/MS. Lifescienceslab2009; 5 :30-35.[4] Björhall K, Miliotis T, Davidsson P. Comparisonof different depletion strategies for improved resolutionin proteomic analysis of human serum.Proteomics 2005; 5: 307–317.[5] Hubner N.C., Ren S., Mann M. Peptide separationwith immobilized pI strips is an attractive alternativeto in-gel protein digestion for proteomeanalysis. Proteomics 2008; 8(23-24):4862-72.[6] Kandasamy K, Pandey A, Molina H. Evaluationof Several MS/MS Search Algorithms forETD Experiments. Anal. Chem. 2009: 81 (17):7170–7180.María Luz Valero, Virginia Rejas, Manuel Mateo Sánchez del PinoLaboratorio de Proteómica. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Avda. Autopista del Saler 16. 46012Valenciaes una de las tareas más importantes y difíciles enproteómica. En los últimos años se están desa-espectrometría de masas como complemento a lastécnicas más clásicas basadas en 2D PAGE. Losmétodos más populares utilizan marcajes isotópicosdiferenciales siendo uno de los más utilizados elsistema iTRAQ (Applied Biosystems).Para obtener la máxima información de un experimentoiTRAQ es fundamental un adecuado diseño delmismo. Según el problema biológico que queramosabordar será necesario utilizar un número de replicastrínsecasa la muestra [1; 2] de las debidas al problemabiológico en estudio. En el caso de experimentos complejoscon elevado número de réplicas que impliquenvarios experimentos iTRAQ será necesario introduciren todos los experimentos un estándar interno quepermita posteriormente un análisis global de todas lasmuestras presentes en el estudio.Preparación de la muestraUna vez se dispone de un diseño experimentalclaro el primer paso es la preparación de las muestras.En nuestra experiencia es mejor partir de lamayor cantidad de proteína recomendada para evitarproblemas debidos al exceso de reactivos, como laformación de precipitados y la obturación de losUna vez elegidas y disponibles las muestras aanalizar hemos de ponerlas en un medio adecuadopara el análisis. En general, la precipitación es elmétodo más usado en este paso. Para la elección delmedio para redisolver las proteínas hay que tener encuenta que sea compatible con los tratamientos dereducción, alquilación y digestión. Además, parael marcaje posterior ha de evitarse la presencia deaminos reactivos en el medio y de otros posiblesocasiones es difícil disolver la muestra, siendo necesariauna puesta a punto para cada tipo de extractoproteico. Tras disolver la muestra es necesario reali-proteína presente en cada muestra.Marcaje y separación de los péptidosLas muestras marcadas diferencialmente secombinan y se elimina el exceso de reactivos y compuestosque podrían potencialmente interferir con lacromatografía líquida o el análisis de MSMS de lospéptidos. En la mayoría de aplicaciones es necesarioprefraccionar la mezcla de péptidos ya que lasmuestras suelen ser demasiado complejas para unúnico análisis LCMSMS.

97Hay diferentes métodos de separación de péptidosque pueden aplicarse en este punto. La elecciónde uno u otro dependerá del tipo de péptidos quequeramos separar y de la disponibilidad de equipos.En el laboratorio habitualmente realizamos cromatografíaC18RP a pH básico [3; 4], cromatografíaSCX y, más recientemente, también mediante IEF[5] en gradientes de pH inmovilizados (3-10NL,7 cm, GE). En todos los casos se prefraccionan de200 a 400 µg de péptidos y suele ser necesario unatratamiento posterior de limpieza y/o concentraciónantes del análisis por LCMSMS.Fragmentación de los péptidosPara el análisis por MSMS de los péptidos marcadoses necesario ajustar los parámetros respectoa los que utilizaríamos para los péptidos no marcados.En el caso de los espectrómetros de masasQTOF de ABI (QStar) este ajuste es muy sencillo, yconsiste en incrementar los valores de intercept dela ecuación |CE|0=(slope)*(m/z)+(intercept) usadapara calcular la energía de colisión para cada ión. Elincremento es mayor para los péptidos derivatizadoscon iTRAQ 4 plex que con iTRAQ 8plex. Con otrotipo de espectrómetros de masas su puesta a puntoes más compleja [6].Análisis de resultadosCon los péptidos analizados se ha de procederpresentes en las muestras. El hecho de que ambasdeterminaciones se realicen simultáneamente suponeuna gran ventaja respecto a los sistemas de-de manera convencional indicando simplemente la nivel de MSMS hace que las relaciones S/N seanmejores. En este punto cabe destacar que según elinstrumento utilizado en el análisis el rango linealpara la determinación de estas áreas será diferente.y en los que haya sido posible medir las áreas de losiones reporteros con bajo error.tenerse en cuenta que se ha podido introducir unerror experimental diferente en la manipulación decada muestra, así como la pureza de los distintosreactivos usados. Ha de comprobarse también quepertenezcan a varias proteínas (isoformas) o cuyaasignación sea dudosa.Si todo esto se realiza adecuadamente la técnicanos permitirá disponer de un elevado número derazonable.Referencias plasma proteome: history, character, and diagnosticprospects. Mol Cell Proteomics 2002;1: 845-67.[2] Molloy MP, Brzezinski EE, Hang J, McDowellvariation and biological variation in quantitativeproteomics. Proteomics 2003; 3: 1912-9. tidomicsby LC-MS/MS and MALDI-FTMS:Enhanced dissection and extraction techniquescoupled with 2D RP-RP HPLC. Journal of proteomeresearch 2006; 5: 3368-75.[4] Tenorio-Laranga J, Valero ML, Mannisto PT,Combination of snap freezing, differential pHtwo-dimensional reverse-phase high-performanceliquid chromatography, and iTRAQ technologyfor the peptidomic analysis of the effectof prolyl oligopeptidase inhibition in the ratbrain. Analytical biochemistry 2009; 393: 80-7[5] Cargile BJ, Sevinsky JR, Essader AS, Ste-separation in shotgun proteomics. J Biomol Tech2005; 16: 181-9.[6] Bantscheff M, Boesche M, Eberhard D, Matthie--mass spectrometer. Mol Cell Proteomics 2008;7: 1702-13.

98 iTRAQ-based quantitative analysis of protein mixtures with large fold changeand dynamic rangeJuan Casado-Vela 1 , María José Martínez-Esteso 2 , Eva Rodriguez 1 , Eva Borrás 3 , Felix Elortza 1 ,Roque Bru-Martínez 21Proteomics Platform. CIC bioGUNE, CIBERehd, ProteoRed. Technology Park of Bizkaia, Building 800.Derio, Spain. 2 Grupo de Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Departamento de Agroquímicay Bioquímica. Facultad de Ciencias. Universidad de Alicante. Spain. 3 Servicio Proteómica. UniversidadPompeu Fabra. Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. Dr Aiguader 88. 08003 Barcelona, SpainQuantitation of changes in protein abundanceis key to discovering novel biomarkers. Currently,reverse phase liquid chromatography coupled totandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) canbe used to quantify changes in protein expressionlevels. Nevertheless, quantitative analysis of proteinmixtures by HPLC-MS/MS is still hampered by thewide range of protein expression levels, the high dynamicrange of protein concentrations and the lackof reliable quantitation algorithms. In this context,we describe two different samples (4-protmix and8-protmix) suitable for relative protein quantitationusing isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation(iTRAQ). Using the 4-protmix, relative proteinchanges of up to 24-fold were measured. The8-protmix allowed the quantitation of the relativeprotein changes in a mixture of proteins within therange of two orders of magnitude in concentrationand 10-fold differences in relative abundance.Figure 1. Schematic view of the preparation of the4-protmix.The two reference samples proposed here (4-protmixand 8-protmix) cover a wide range of proteinfold changes and protein concentrations, respectively,which can be used to optimize the settings usedduring acquisition with different mass spectrometersand to test the performance of different quantitationalgorithms used for iTRAQ experiments.Three technical replicates corresponding to 800fmol of 4-protmix and 8-protmix were analyzed byHPLC-MS/MS using two platforms, a ChipLC coupledto a 6530 Q-ToF (Agilent Technologies) and a1200 nano-HPLC (Agilent Technologies) coupled tosult,the analysis of the 4-protmix and the 8-protmixall proteins in the samples (Tables 1 and 2).Figure 2. Schematic view of the preparation of the8-protmix.As shown here, we were able to detect up to24-fold changes in protein ratios. The standard de-spondedto the highest protein fold change in oursamples (24-fold).

99Table 1. 4-protmix iTRAQ protein relative quantitation. A: ChipLC coupled to a 6530 Q-ToF and analysed using MASCOT.B: 1200 nanoHPLC coupled to LTQ Orbitrap and analysed using Proteome Discover.Table 2. 8-protmix iTRAQ protein relative quantitation measured with LTQ Orbitrap and analysed using ProteomeDiscover.In conclusion, we described two different samplessuitable for iTRAQ analysis that can be used toassess the performance of different mass spectrometersand quantitation algorithms. A considerable partof the proteome of a typical biological sample fallswithin the fold change and dynamic range windowsof these two samples.Evaluation of MS E Kerman Aloria 1 , Miren Josu Omaetxebarria 2 , Mikel Azkargorta 2* , Johannes P. C. Vissers 4 , AsierFullaondo 5 , Jesus M. Arizmendi 1,21Proteomics Core Facility-SGIker (ProteoRed). University of the Basque Country. Leioa, Spain. 2 Departmentof Biochemistry and Molecular Biology. University of the Basque Country. Leioa, Spain. 3 Proteomics CoreFacility. CIC bioGUNE. Derio, Spain. 4 5 Department ofGenetics, Physical Anthropology and Animal Physiology. University of the Basque Country. Leioa, Spain* Current address: Proteomics Core Facility. CIC bioGUNE. Derio, Spainhave recently gained popularity as powerful technologiescapable of addressing protein expressionanalysis in complex samples. As an alternative toisotope labeling methodologies, which are samplenumberand sample-type dependant and requirespecial labeling chemistries, label-free approachesafford greater experimental design and less sample

100 manipulation. A relatively new label-free approachbased on MS E or data independent acquisition modewas applied in this study [1, 2]. Unlike the traditionalLC-MS/MS strategy, no precursor ion selectionand fragmentation is applied and the acquisitionmethod is based on alternating the collision energyof sequential scans applied to the gas cell betweenlow and elevated states (Figure 1). MS E based acquisitioncollects information on all the isotopes of allcharge-states of the eluting peptide precursor acrossthe chromatographic peak width. MS E provides accuratemass data for precursor and product ions precursor ion intensity measurement for relativeteinamount can be estimated by comparing the topthree ionising peptides of each protein with a knownamount of an internal standard [3]. In this study weevaluated the utility of estimated absolute quanti-data acquired using the data independent acquisitionmethod. Our results indicate that MS E based label-plexsamples.Two mixtures (ECOLI_1 and ECOLI_2) of digestedADH1_YEAST, PGYM_RABIT, ENO1_poration)were prepared at a relative molar ratio foreach protein of 1:1, 1:0.5, 1:2 and 1:8 respectivelyand spiked into a digested E. coli cytosolic proteinacquisition analyses were performed with a nanoAcquityUPLC system interfaced to a SYNAPTand samples were run in quintuplicate. Data wereand relative, with a beta release of ProteinLynx GlobalSERVERv2.4 software. Absolute protein quan-added to the sample (ADH_YEAST) and its amountprotein values were used to express relative quanti--between different samples based on deconvolutedpeptide intensities and probabilistic relative proteinIn this analysis a total of 525 different proteinsand 428 in ECOLI_2 samples. 257 proteins inin both samples (Figure 2. A, B) and therefore, re-comparative analysis of estimated absolute amountand ion current (probability) based, accurately determinedthe relative protein ratio of the eukaryoticproteins spiked into an E. coli protein matrix (ta-E2F2 -/- T lymphocytes. 736 proteins were iden-purposes. Obtained results indicate that both quan-pressiontrends although numerical ratios can varydue to differential handling of protein isoforms anddifferences in statistical analyses (data not shown).Overall we can conclude that label-free LC-MS Etype of analysis has proven to be a robust and repro-in complex samples. Furthermore, relative quanti-and on ion current comparison consistently measuredprotein expression ratios.Table 1. Expected and experimental ratios obtained forALBU_BOVIN, ENO1_YEAST and PGYM_RABIT proteins.Proteinalbu_bovineno1_yeastpgym_rabitExpectedratioRatio basedon absoluteRatiobased oncomparativeion current8.0 6.95 7.612.0 1.91 2.040.5 0.54 0.55Figure 1. Schematic of MS E mode of analysis Waters Corporation).

101This work was supported by grants from theBasque Government Department of Industry (Etortekand Saiotek to J.M.A.). Proteomics Core Facility-SGIkeris supported by UPV/EHU, MICINN,GV/EJ, ESF and ProteoRed agencies.Figure 2. . A.number of replicates. B. Venn diagram of overlapping proteins[1] Silva JC, Denny R, Dorschel CA, GorensteinMV, Kass IJ, Li GZ, et al. Quantitative proteomicanalysis by accurate mass retention time pairs.Anal Chem 2005;77:2187-200.[2] Li GZ, Vissers JP, Silva JC, Golick D, GorensteinMV and Geromanos SJ. Database searching andaccounting of multiplexed precursor and production spectra from the data independent analysisof simple and complex peptide mixtures. Proteomics2009;9:1696-719.[3] Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP andteinsby LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.Mol Cell Proteomics 2006;5: 144-56.Desarrollo de un Modelo Estadístico Universal para Proteómica CuantitativaMediante Marcaje Isotópico EstableMarco Trevisan-Herraz 1 , Pedro Navarro 1 , Elena Bonzon-Kulichenko 1 , Pablo Martínez-Acedo 1 ,Daniel Pérez-Hernández 1 , Estefanía Núñez 1 , María Luisa Hernáez 2 , Enrique Calvo 4 , MontserratCarrascal 3 , Marina Gay 3 , Inmaculada Jorge 1 , Dolores Gutiérrez 2 , Joaquín Abian 3 , Concha Gil 2 ,Juan Miguel Redondo 4 , Jesús Vázquez 11Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa” (CSIC-UAM), Madrid (CBMSO). 2 Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutensede Madrid (UCM). 3 Laboratorio de Proteómica, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Barcelona (IIBB-CSIC) (IDIBAPS). 4 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, Madrid (CNIC)Aunque en la actualidad existen diferentes métodosde marcaje isotópico para la realización deestudios de proteómica cuantitativa, los modelos estadísticospara el tratamiento de los datos obtenidosestán todavía muy poco desarrollados. La mayoríade los modelos asumen distribuciones normales delos datos y la existencia de varianzas homogéneas,que no se han demostrado en la práctica. En el laboratoriode J. Vázquez hemos desarrollado recientementeun nuevo modelo estadístico jerárquico deefectos aleatorios para el análisis de los datos deexpresión diferencial obtenidos por marcaje con18O/ 16 O y espectrometría de masas de trampa iónicalineal [1]. La validez de este modelo, que considerapor separado las fuentes de error debidas a lamanipulación de la muestra, la preparación de losmasas, ha sido demostrada en experimentos masivosde hipótesis nula [1] y ha sido validada en variosmodelos biológicos de diferente naturaleza [2]. Enel presente trabajo hemos abordado un proyectocooperativo a gran escala entre varios grupos de investigacióncon el objetivo de extrapolar dicho modeloestadístico, de forma general, a los métodos demarcaje isotópico más comunes (SILAC y iTRAQ),y a otros espectrómetros de masas.

102 Figura 1. Descripción del software que conforma la plataforma QuiXoT.Como modelo biológico se ha empleado unúnico cultivo celular de Saccharomyces cerevisiae,control (muestra A), marcado con aminoácidos SI-LAC (A * ) o tratado con H 2O 2(B) (UCM), y se hanrealizado experimentos comparativos a gran escalaA vs B y A vs A mediante 18 O/ 16 O y iTRAQ, y A *vs B y A * vs A mediante SILAC. Las muestras sedigirieron en el CBM utilizando un nuevo métodode gel concentrante [2] y los péptidos resultantesse marcaron y separaron en 24 fracciones mediantela técnica Off-gel [2]. Las fracciones fueron analizadasusando un LTQ (CBM, IDIBAPS) en modoconvencional o PQD, un LTQ-Orbitrap (CNIC) yun MALDI-TOF-TOF (UCM). Cada uno de los por 18 O se determinó usando el método cinético[3]. Los resultados de los experimentos de hipótesisnula se utilizaron para el modelado de los pesosestadísticos y para el análisis de normalidad de laspoblaciones a los diferentes niveles, según describimospreviamente [1].Nuestros resultados demuestran que el modeloestadístico jerárquico es válido, de forma universal,para todos los tipos de marcaje y todos losespectrómetros de masas utilizados, obteniéndosedistribuciones que superan los test de normalidada nivel de medida, a nivel de péptido y a nivel deproteína. El modelo global ha sido implementadoen la plataforma informática QuiXoT, en la que sehan desarrollado interfaces para la entrada de datosobtenidos por los diferentes motores de búsqueda,equipos y métodos de marcaje (Figura 1).El análisis de los datos arroja unas varianzasa nivel de péptido que son consistentemente semejantespara todos los métodos de marcaje posdigestión,mientras que en el caso de SILAC lavarianza es prácticamente nula. Por otra parte, lavarianza a nivel de medida en modo MS (SILAC,18O) es algo menor en el Orbitrap en relación con elLTQ, aumentando considerablemente en el modoPQD-MS/MS (iTRAQ) en el LTQ. Finalmente lavarianza a nivel de proteína es muy baja y similaren todos los casos. Estos resultados demuestran lacoherencia del modelo y establecen por primeravez un marco de referencia estadístico común paracomparar las prestaciones relativas de los diferentesequipos y métodos de marcaje. Este modelo, porde los cambios de expresión obtenidos y ofrece un

103estricto control sobre las posibles fuentes de errordel experimento.El desarrollo de un modelo estadístico de validezuniversal y de una plataforma informática comúnpermite por primera vez el análisis sistemático y lade forma semiautomática en cualquier experimentode expresión diferencial a escala masiva mediantetécnicas de marcaje isotópico estable.References[1] Jorge I, Navarro P, Martinez-Acedo P, Nunez E,Serrano H, Alfranca A, et al. Statistical modelto analyze quantitative proteomics data obtainedby 18O/16O labeling and linear ion trap massspectrometry: application to the study of vascularendothelial growth factor-induced angiogenesisin endothelial cells Mol Cell Proteomics2009;8:1130-49.[2] Bonzón-Kulichenko E, Pérez-HernándezD, Martínez-Acedo P, Núñez E, Navarro P,Trevisan-Herraz M, et al. A robust method forquantitative high-throughput analysis of proteomesby 18O labeling Mol Cell Proteomics2009;En revisión.[3] Ramos-Fernández A, López-Ferrer D y VázquezJ. Improved method for differential expressionproteomics using trypsin-catalyzed 18O labelingProteomics 2007;6:1274-86.Alex Campos 1 , Jacques Borg 2 , Claudio Diema 3 , Marta Vilaseca 3 , Eliande Oliveira 11Proteomics Platform, Barcelona Science Park, Barcelona, Spain. 2 Neurochemistry Lab, Faculty of Medicine, SaintEtienne, France. 3 Mass Spectrometry Core Facility, Institute for Research in Biomedicine, Barcelona, SpainMass Spectrometry (MS) has emerged as one ofthe most promising core technologies for discoveryof diagnostic, prognostic and therapeutic proteinbiomarkers. Despite its rapid technological developments,MS-based assays have also raised majorconcerns regarding its reproducibility, sensibilityand throughput, and hence its potential applicationin the clinical and regulatory settings. To addressthese concerns, we explore relevant quality assurancebenchmarks for MS-based quantitative CSF-lopmenttechnology entails the understanding of thelimits of each process, including sample handling,instrument setup, and bioinformatics tools.Despite the increasing clinical interest in bio--proteomics technologies. The immense dynamicrange of human plasma proteins, which spans 10 to12 orders of magnitude, poses a major limiting fac-this problem, enrichment techniques and orthogonalfractionation strategies are routinely applied in proteomicsstudies prior to MS analysis. Biomarkersof “interest” could be enriched with the selection ofa biological material that is in close proximity withthe disease source. In this regard, the cerebrospinalveryin neurological diseases. Because of its directcontact with the brain’s extracellular space, CSF isa valuable reporter of processes that occur in thecentral nervous system. Although CSF shares someproduced brain’s proteins are found in higher concentrationin the CSF compared to blood [1].Platforms combining removal of high abundanceproteins using multi-component immunodepletionsystems (IDS) followed by multidimensionalprotein/peptide fractionation are currentlythe mainstay of unbiased proteomic biomarker discovery.At the present, a number of commercialIDS are available for highly selective removal ofmost abundant human plasma proteins. To the best

104 Figure 1. Distribution of the APEX values (left side) for the CSF proteome following depletion with IgY-HSA or IgY-14, andno depletion (y-axis on log scale). Pie charts (right side) depict the CSF protein content in context of their abundance. (HSA,Figure 2. AMT quality control metrics. (A) 2D display of the CSF AMT database. (B) 3D perspective plot of the peptidematches between IgY14-depleted sample and the AMT database (axis: mass and retention time error). (C) Heatmap of similarityscore between LC-MS features of IgY14-depleted sample and AMT database. Best alignment is found using a dynamicprogramming algorithm that determines the transformation function with maximum likelihood.of our knowledge, all commercial IDS have beendevised to deplete plasma (or serum) samples andluatedyet. To address this problem, we carried outCSF depletion (in triplicate) using either Sigma’sSeppro systems designed to immunodeplete HSA(IgY-HSA) or the 14 most abundant proteins (IgY- counting method for Absolute Protein EXpression(APEX) measurements was used to assess the depletedand undepleted samples in the context of proteincontent stoichiometry and achieved dynamic range(Figure 1). Our results show that IDS originally devisedto deplete blood’s most abundant proteins areabundant) to be depleted in CSF for downstreamThe advent of a new generation of robust MSinstruments with very high resolution and mass ac-

105curacy has inspired the development of new quantitativeapproaches [2]. In particular, label free hybrididentity/pattern-based approaches have gainedSuch approaches use pattern recognition algorithmsto ex post facto assign the identity of LC-MS peaksagainst databases of peptide sequence, mass, andretention time built from multiple experiments. Herewe employ the accurate mass and time (AMT) strategyto identify and quantify peptides/proteins fromunfractionated CSF samples using msInspect pla--pect)data analysis. A peptide accurate mass and LCelution time AMT database was initially generatedusing MS/MS following extensive multidimensionalLC separations to provide the basis for subsequenttains>2,000 entries from a total number of ~7,500-clusion,hybrid identity/pattern-based approachesare amenable for high throughput quantitative proteomeanalyses in biomarker discovery pipelines.References[1] Zougman, A et al. Integrated Analysis of theCerebrospinal Fluid Peptidome and Proteome.J Proteome Res 2007; 7: 386-399.[2] Mueller, LK et al. An Assessment of SoftwareSolutions for the Analysis of Mass SpectrometryBased Quantitative Proteomics Data. J ProteomeRes 2008; 7: 51-61.[3] Jaffe, J et al. PEPPeR, a Platform for ExperimentalProteomic Pattern Recognition. Mol CellProteomics 2006; 5:1927-1941.[4] May, D et al. A Platform for Accurate Mass andTime Analyses of Mass Spectrometry Data. JProteome Res 2007; 6: 2685-2694.A comparison of quantitative proteomics methodologies on a differentialexperiment on test samplesJoan Josep Bech-Serra, Núria Colomé, Marta Monge, Francesc CanalsLaboratori de Proteòmica, Programa de Recerca en Oncologia Mèdica. Institut de Recerca. Hospital Valld’Hebron, Barcelonaof technologies aimed to the analysis of large numberof proteins, representing ideally the entire proteome,in the same experiment. In its early stages , massspectrometry-based proteomics was successfullyused to the qualitative characterization of complexmixtures of proteins, leaving the quantitative aspectsin a secondary role, essentially because of the lackof suitable technologies for quantitative analysis ofsuch complex mixtures. However, in the last years,a wide number of strategies have been developedto obtain reliable quantitative data. Those strategiesinclude both 2D-gel based and non-based methodo-enabling the simultaneous separation of differentsamples in the same 2D-gel, which allows to over-come reproducibility problems inherent to the 2Dprocedure and internal standardization of spot volumemeasurements, providing a robust quantitativecomparison technique. Alternatively, a number ofgel-free quantitative techniques can be used. Someof them are based on non-isobaric isotope labeling,such as ICAT, ICPL or SILAC labeling methodologies,the quantitative data being obtained fromthe from the MS data, by integrating extracted ionchromatograms of the heavy-light peptide pair masses.A second group which includes iTRAQ or TMTreagents is based on isobaric labeling that introducedifferent reporter fragments in the derivatized peptides.Quantitative data is in this case obtained atthe MS-MS level, from the relative intensities ofthe reporter fragment ions. Finally, a third groupof label-free methods uses different approaches forquantitative comparison of LC-MS data.

106 In order to evaluate and compare the performanceof different quantitative proteomics methods,we have prepared a set of two test samples to becompared quantitatively. The samples consist on amatrix of cytoplasmatic E. Coli proteins, of mediumcomplexity (around 100 proteins), to which fourstandard mammalian proteins have been spiked indifferent amounts, ranging from the fmol to thepmol level per microgram of total protein.. The ratiosof the spiked proteins between the two sampleshave been chosen to range form 1.5:1 to 5:1.These samples have been analyzed by differentmethodologies (Figure 1):- 2D-DIGE, using four technical replicas of eachsample on a 4 2D-gel experiment.- Labeling with ICPL reagents at the proteinlevel, followed by tryptic digestion and analysisby LC-MS. This is the standard procedure for thismethodology, but has the drawback that only lysinethe reagent can be used for quantitation. This resultsquantitative information.- Labeling with ICPL at peptide level. In orderto overcome this problem, we have explored analternative procedure introducing the ICPL labelingstep after tryptic digestion of the protein mixtures.This should result in a more comprehensive quantitativeinformation, since all tryptic peptides willbe derivatized at the N-terminus. The weakness ofthis strategy is that digestion of the two sampleshas to be run independently, which can introducetechnical bias. To minimize the problem of a possibleimbalance, both labeling schemes are run inparallel on sample aliquots. This way the balancecorrection derived from the protein level labelingexperiment can be used to normalize the data fromthe second experiment.ICPL labeled samples have been analyzed infour independent LC-MS runs in order to assessreproducibility.- iTRAQ Labeling. The samples have beenanalyzed using an 8-plex iTRAQ reagent, using fourdifferent reporter masses for each of the samples,and analyzed by LC-MALDI.- Label-free quantitation. Four LC-MS runs of atryptic digest of each sample have used to quantitativelycompare the two samples using Progenesis LC-MS software for alignment and statistical analysisof the LC-MS maps.The results of all the quantitative proteomicsmethods used have been evaluated in terms of accuracyand reproducibility, and their performance androbustness is discussed.Figure 1.

107Triple Quadrupole Mass Spectromery-Based Peptide Assays Using IntelligentReiko Kiyonami 1 , Alan Schoen 1 , Amol Prakash 1 , Huy Nguyen 1 , Scott Peterman 1 , Vlad Zabrouskov 1 ,Andreas Huhmer 1 , Sarah Robinson 1 , Martin Hornshaw 1 , Madalina Oppermann 1 , Nathalie Selevsek2 , Bruno Domon 21 2 ETH Zurich, SwitzerlandIntroductionThe commonly used SRM technique providessensitive and precise quantitative results by monitoringone or several primary SRM transitions pertargeted compound. Recently this technique wasquantify multiple compounds in one HPLC/MS runby monitoring eight or more SRM transitions percompound. The bottleneck of this approach is thatonly a limited number of compounds can be targetedin one run because of the time required to monitoreach transition. The newly developed instrumentsubset of SRM transitions to simultaneously quan-mation,thereby allowing the analysis of up to 1000compounds in a single LC-MS run.ExperimentalA triple quadrupole mass spectrometer equippedwith a nanoLC pump and a nanospray source wasused. The intelligent SRM method utilizes SRM-sition,which monitors several primary transitionsfor each compound. The second is a data dependentSRM acquisition, which monitors both those primaryand additional secondary transitions and istriggered only when the intensities of all primaryintensity threshold. For large scale screening experiments,the dynamic exclusion was used to triggersecondary acquisition only once for each peak for-Results and discussionThe technique was applied to quantify preci-biological samples, including yeast cell lysates,and pesticides in orange oil. By monitoring multipletransitions, it is possible to use very low intensitythresholds to accurately trigger the datadependent SRM scan. The trigger is the leadingedge of the LC peak and relatively independent ofthe LC peak intensity. Using known LC peak widths,the strongest intensity point to obtain the datadependant scan is easily anticipated. Instead of afull product ion scan, high quality SRM spectramonitor eight or more transitions at that point. Theresulting eight spectra are assembled into a pseudofull scan MS/MS spectra that can be used for con-them to reference spectra stored in a library. Usinga constant cycle time allows enough points acrossthe peaks from the primary SRM scans for precisetidesin the low attomol range.

108 5. PROTEÓMICA MICROBIANA Y DE PARÁSITOSCoordinadores: Aída Pitarch, Antonio Marcilla, Ana Oleaga y Manuel Rodríguez5.1 Aspectos generalesProblemas en el análisis proteómico de muestras procedentes de organismos ‘raros’María Luz Valero 1 , Javier Ortiz 2 , Esther Dionís 1 , Laura Cantero 1 , Manuel Mateo Sánchez del Pino 11Laboratorio de Proteómica. Centro de Investigación Príncipe Felipe. Avda. Autopista del Saler 16. 46012Valencia. 2 SCSIE. Universitat de Valenciateínasse basan generalmente en la comparación dela información de MS (o MS/MS) obtenida con lainformación de secuencias de proteínas que existeen diferentes bases de datos.Aunque algunas bases de datos incluyen un elevadonúmero de proteínas, como por ejemplo NCBIcon aproximadamente 8500000 secuencias, no todoslos organismos están representados por igual. Así,en NCBI existen 508911 proteínas humanas y elnúmero decae drásticamente hasta 110313 para rata,un organismo ampliamente utilizado en experimentación.Y el número es mucho menor para otrosorganismos de alto interés como parásitos (54542entradas para Trematoda), vegetales (13955 paraCitrus) o especies marinas de alto interés económico(2353 entradas para Clavicipitaceae).En muchos casos es necesario recurrir a la secuenciaciónde novo que requiere de espectros deMS/MS de gran calidad y es costosa en cantidad demuestra y tiempo de análisis, por lo que su aplicabilidades limitada.Aún así existen algunas estrategias que pueden aplicarseen el caso de disponer sólo de información de MSy MS/MS parcial. En algunos casos pueden utilizarseherramientas químicas para la mejora de los espectrosde MS/MS. Mientras que en otros las herramientas sonbioinformáticas, y nos permitirán obtener más informaciónde las diferentes bases de datos existentes.5.2 Proteómica de MicroorganismosA) Proteómica de BacteriasPreparación de extractos proteicos bacterianos para el análisis de glicoproteínasAlfonso Olaya, Lidia Gómez-Gascón, Manuel J. Rodríguez-OrtegaDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria, Universidad de CórdobaResumenLas glicoproteínas bacterianas, por sus funcionesy localización, son potenciales dianas para vacunas.Sin embargo, su estudio mediante electroforesismediante la química de la hidrazida y del ácidoaminofenilborónico o bien mediante reconocimien-

109como la presencia de ADN o azúcares libres en lamuestra respectivamente. Para intentar solventarlasnos centramos en la optimización del proceso deobtención de extractos proteicos totales, tanto encuanto a calidad como a rapidez.La glicosilación bacteriana es un proceso recientementedescrito y del cual todavía existen muchasincógnitas. Todas las glicoproteínas procarióticasdescritas, en función de su localización, pueden cla-glicoproteínas secretadas y exoenzimas, y celulares(cuya localización en la célula no está muy clara y secree que, más bien, son contaminaciones citoplasmáticas)[1]. Esto, junto con sus funciones [1], que po-proceso de infección, convierte a las estas moléculasen potenciales dianas para vacunas, nuestro principalobjetivo para estirpes del género Streptococcus.Dos de las aproximaciones que se están llevandoa cabo son la electroforesis bidimensional (2-DE)en geles de poliacrilamida y las cromatografías dehacia las glicoproteínas que exhiben las lectinas [2].Los principales problemas que nos encontramosen la 2-DE tienen que ver con el enfoque de las proteínasdebido a la presencia de ADN, que provocadesenfoque horizontal y vertical de las proteínas,y la propia naturaleza altamente hidrofóbica de lasglicoproteínas asociadas a membranas. En cuantoa las cromatografías nos encontramos con el problemapor contaminación con azúcares libres quela hidrazida y el ácido aminofenilborónico. En basea estos problemas hemos de conseguir una prepara-de obtención de proteínas, pureza, medio en las quese encuentren éstas y rapidez.Para optimizar el método de extracción de proteínastotales hemos probado una serie de protocolos,con variaciones desde sus fuentes originalespara adaptarlos a nuestros organismos. Tras cultivarlas bacterias se resuspenden en distintos tamponespara romper por ultrasonidos (10 ciclos de 20 segundos)tras tratamiento con mutanolisina (150 U/ml, a 37ºC, O/N) debido al grosor de la pared celularde los estreptococos. La presencia de ADN en lasmuestras se comprueba mediante electroforesis engel de agarosa al 1% y espectrofotometría, y la deazúcares libres mediante la reacción de Fehling y elmétodo de la antrona.1) Rotura en presencia de tampón de rehidrataciónde 2-DE (Urea 7M, Tiourea 2M, Tritón X-100de rotura y rendimiento de obtención de proteínases grande. Sin embargo, al no poder descartarsela fracción en la que se ha incubado conmutanolisina (y que contiene proteínas de unióna pared, liberadas por la acción de la enzima),el tampón se diluye. Otros inconvenientes sonque las proteínas resuspendidas en este tampónno pueden ser tratadas enzimáticamente en solucióny permanecen los azúcares y el ADN.Para eliminar los contaminantes anteriores debecambiarse de tampón mediante, por ejemplo,precipitación de proteínas, con la consecuentees imposible al formarse cristales de urea en lamembrana, que la obstruyen y da lugar a unagran pérdida de proteínas.2) Rotura en tampón Tris 50 mM pH 8 tras trata-y obtención de proteínas es menor. Sin embargopresenta una serie de ventajas con respectoal anterior tampón, como que las muestras seobtienen en un tampón más apto para las cro-tocoloen concreto, también para la 2-DE. 2A)Precipitación con Tricloroacético [3]. Da lugara un rendimiento en la recuperación de proteínatotal bajo. 2B) Rotura a pH 10 e incubacióncon Benzonasa [3] a pH 8, 500 U/ml a 37ºC,1,5 h. Se elimina el ADN por completo pero nofácilmente. 2C) Incubación con espermina [4]5 mM tras subir el pH de la muestra a 10 antesde la rotura y añadir 20 mM de EDTA. En estascondiciones la ratio proteína recuperada/ADNen las muestras es muy bueno. Sin embargo, altratarse de una molécula cargada, la 2-DE se vecomprometida y, aunque el efecto que tendríasobre los distintos análisis glicoproteicos no seha ensayado aún, este hecho obliga a cambiarción.2D) Incubación con DNAasa I (4 µg/ml)y RNAasa (4 µg/ml) [5] a 37ºC, 1,5 h. Con estasconcentraciones se sigue observando restosde ADN, siendo además necesario un paso de-

110 nas con Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico(25:24:1 v/v/v) [3]. La cantidad de proteínasrecuperadas es baja.rotura es buena, sin embargo, la cantidad de proteínasrecuperadas tras seguir el protocolo es baja.Para aumentar la resolución y el enfoque delas proteínas en 2-DE se están ensayando, en losextractos totales potencialmente más idóneos paranuestro estudio, el detergente ASB-14, el DeStreaky el método de cargado de las tiras de IPG mediante“cup loading”.AgradecimientosSAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Innovación,Gobierno de España.Referencias[1] Raj K. Upreti Manoj K., y V. Shankar. Bacterialglycoproteins: Functions, biosíntesis and applications.Proteomics 2003; 3: 363-379.[2] Balanova L., Hernychova L., Bilkova Z. Bioanalyticaltools for the discovery of eukaryoticglycoproteins applied to the análisis of bacterialglycoproteins. Expert Rev. Proteomics 2009;6(1), 75-85. cientremoval of DNA from proteomic samplesprior to two-dimensional map análisis. Journalof Chromatography A, 1216 2009; 3606-3612. tionof DNA by Spermine during the ChemicalExtraction of Insoluble Cytoplasmic Protein.Biotechnol. Prog. 2001; 17: 1107-1113. Shah H. Comparison of extraction proceduresfor proteome analysis of Streptococcus pneumoniaeand a basic reference map. Proteomics2006; 6: 3306–3317.Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterioranálisis y caracterización mediante espectrometría de masasLidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya, Manuel J. Rodríguez-OrtegaDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria. Universidad de CórdobaResumennespostraduccionales de proteínas es la glicosilación.Se estima que más del 50% de las proteínas conocidas,así como el 80% de las proteínas de membrana,están glicosiladas. En contra de lo que se creía, se hademostrado que los procariotas también poseen glicoproteínas.Las glicoproteínas bacterianas parecenEste hecho sugiere por tanto que están implicadasen la interacción de la bacteria con el hospedador ypor tanto puede existir una relación directa con la capacidadpatógena del microorganismo. El objeto deeste estudio consiste en desarrollar una metodología,bacterias del género Streptococcus.En contra de lo que estaba establecido hastahace unos años, recientemente se ha demostrado quelos procariotas producen glicoproteínas [1]. Estas organismo,lo que sugiere que están implicadas enla interacción con el hospedador y por tanto, con lacapacidad patógena del microorganismo. Hay dos tiposde glicosilación en procariotas: N-glicosilación,en la cual los glicanos están unidos a un residuo deasparagina, y O-glicosilación, en la cual está unido aun residuo de serina, treonina o tirosina [1,2].

111Para el enriquecimiento de glicoproteínas, losmétodos que hemos utilizado se basan en croma- química de la hidrazida y del ácido aminofenilborónico[1,3].camentea motivos oligosacarídicos, reconociendocada una a un subgrupo de especies de glicanos.Para asegurar el reconocimiento del mayor númerode glicoproteínas, se está poniendo a puntouna batería de lectinas: Canavalia ensiformis lectin(ConA), que reconoce principalmente residuosdeUlex europaeus lectin Triticumvulgaris lectin grupos N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico; Arachishypogaea lectingalNAc; y Bandeiraea simplivifolia lectin (BC-1)Los extractos proteicos se separaron medianteelectroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, y pos-lulosa,las cuales se bloquearon con gelatina al 3%, sehibridaron con cada una de las cinco lectinas, se incubaroncon estreptavidina-HRP y se revelaron mediantequimioluminiscencia. [1,2,4]. Resultados preliminareshan indicado hasta ahora que tanto la ConA como laAH son las lectinas que reconocen un mayor númerode glicoproteínas ya que revelan un mayor número debandas a partir de extractos totales (Figura 1).El segundo método de enriquecimiento está basadoen la química de la hidrazida [6], mediante lacual dicho grupo funcional reacciona con los gruposcis-diol de los residuos de azúcares, previamenteoxidados a aldehídos, para formar un enlace hidrazona.Para ello se está poniendo a punto una cromatografíacon una resina de hidrazida (Bio-Rad). Enprimer lugar las muestras se oxidan con peryodatosódico, y después la muestra se hace pasar por laresina para permitir la formación de los enlaceshidrazona. El resto de proteínas no glicosiladas seeliminan mediante lavados. Posteriormente las glicoproteínasse digieren con tripsina y se recogenmediante lavados los péptidos generados, que correspondena las proteínas glicosiladas, quedandolos glicopéptidos unidos a la resina. Los N-glicopéptidospueden recuperarse de la resina digiriendo conla glicosilasa PNGasa F, ya que esta enzima cortael sitio de unión del glicano a la asparagina. Paracon dimetilamina al 26%, que convierte las serinas ytreoninas glicosiladas en alanina y ácido 2-aminobutíricorespectivamente [1-2-3,6]. Tras hacer pasar latripsina por la resina para digerir las proteínas retenidasy analizar los péptidos mediante nano-LC/MS/en principio no esperadas.Figura 2. Gel teñido con Coomassie de proteínas obtenidasde Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a dere-Figura 1. Blotting con lectinas de extractos totales de Streptococcuspneumoniae. Calles de izquierda a derecha: ConA,A.H., WGA, UEA-I, BC-I.El tercer método consistió en la cromatografíanilborónico,que forma enlaces covalentes con losgrupos cis-diol de residuos de glucosa, manosa ygalactosa en condiciones de alcalinidad, dando lugara diésteres, siendo estos enlaces reversibles encondiciones ácidas. Se usó como tampón de unióna la resina taurina 50 mM /NaOH, pH 8.7 + 20 mMMgCl 2,y de elución igual al anterior pero con 50mM Tris/HCl, pH 7.5 [1, 2, 5]. El eluido se separómediante electroforesis en gel de poliacrilamidaal 12% (Figura 2), y las bandas se analizaron porteínascitoplasmáticas. Además, el eluido se digirió

112 en solución con tripsina y se analizó mediante ESI-MS/MS, dando también como resultado principalmenteproteínas citoplasmáticas.AgradecimientosSAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Innovación,Gobierno de España.Referencia[1] Balonova L., et al. Bioanalytical tools for thediscovery of eukaryotic glycoproteins appliedto the analysis of bacterial glycoproteins. ExpertRev. Proteomics 2009; 6 (1): 75-85.[2] Capote F.P. y Sanchez J.C.. Strategies for proteomicamalysis of non-enzymatically glycated pro-mas.20187.[3] Greis K. et al. Selective Detection and Site-by B-Elimination and Tandem ElectrosprayMass Spectrometry. Analytical Biochemistry1996; 234: 38-49. coded tagging and mass spectometry to identifyN-linked glycoproteins. Nature biotechnology2003; v.21, n.6. chromatography.1.Simultaneous glycoproteinbinding with selective or combined elution. AnalBioanal Chem. 2007; 389: 2097-2102.of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry,stable isotope labeling and mass spectomrtry.Nature biotechnology. 2003; v. 21, n. 6.Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus en leche por ionizaciónmediante desorción por láser asistida por matriz, acoplada a espectrometría deIsabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi MañesDepartamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y MedicinaLegal. Facultad de Farmacia. Universitat de ValènciaResumenLas bacterias del género Staphylococcus son microorganismosde amplia distribución, causantesde numerosas intoxicaciones alimentarias debido,en gran medida, a su capacidad de producir enterotoxinas.La enterotoxina del serotipo A es la que conmás frecuencia aparece en los brotes de intoxicaciónalimentaria. En el presente trabajo se desarrollauna técnica de análisis de muestras de leche porMALDI-TOF para la detección de la enterotoxinatajassobre las técnicas actualmente utilizadas suobtenidos mostraron la efectividad de la extracciónutilizada demostrando la utilidad del método deanálisis utilizado.Staphylococcus aureus es una bacteria patógena,de amplia distribución en la naturaleza, asociada ainfecciones generalizadas y brotes alimentarios [1].de una familia de proteínas no glicosiladas de bajopeso molecular (M r22-31.000) conocidas como enterotoxinasEstas enterotoxinasson causa de intoxicaciones alimentarias por laingesta de productos contaminados, principalmentede origen cárnico y lácteo [2-3] destacándose la enterotoxinaA [4], que es la que con mayor frecuenciase asocia a brotes de intoxicación alimentaria y quees extremadamente potente.

113El presente trabajo pretende detectar la presenciade enterotoxina A en muestras de leche utilizando unmétodo de extracción rápido y sencillo y detecciónpor MALDI TOF.cara dos niveles diferentes 1 ml de leche procedentede supermercados locales. La extracción de la enterotoxinase llevó a cabo por precipitación de lascaseínas de la leche con diclorometano (DCM)/H 2O5% ácido acético y centrifugación (6000 rpm). Lasproteínas contenidas en el sobrenadante se separaronpor electroforesis 1D-SDS-PAGE en gel de poliacrilamidaal 10% y se tiñeron con azul de Coomassie.Las zonas del gel que contenían la enterotoxina (25-30KD) se cortaron y fueron sometidas a digestiónpeptídicos correspondientes a la enterotoxina A.La digestión en gel se realizó siguiendo unaadaptación de protocolos estandarizados [5] conronlas muestras en MTP AnchorChip (BrukerDaltonics),mediante la técnica de doble gota seca (depósitode matriz y evaporación de la misma; depósitode la muestra y evaporación de la misma), utilizandomatriz, preparado a saturación en una mezcla de(TA 0’1%) y diluido 1:2 en TA 0’1%. Las muestras(0’5 µL) fueron analizadas en un Espectrómetro de realizó utilizando el motor de búsqueda MASCOT(Matrixscience, UK).Figura 1. Imagen del aislamiento de la enterotoxina A delas proteínas del suero de la leche en gel de poliacrilamidateñido con azul de Comassie.tracciónjunto con la separación por electroforesisen gel para aislar la enterotoxina de la matriz láctea.Los resultados obtenidos tras la digestión trípticaTabla 1. cusaureus.Rango depéptidos[M + H] + calculada[M + H] + observadaSecuencia de péptidos16-27 1229.65 1230.67 SELQGTALGNLK28-35 1119.51 1120.55 QIYYYNEK42-55 1741.87 1742.92 ESHDQFLQHTILFK56-74 2305.02 2306.10 104-118 1650.71 1651.76 TACMYGGVTLHDNNR124-134 1281.73 1282.75 125-134 1153.64 1154.69 135-144 1127.61 1128.65 QNTVPLETVK148-160 1512.81 1513.84 KNVTVQELDLQAR149-160 1384.72 1385.75 NVTVQELDLQAR167-178 1433.64 1434.66 YNLYNSDVFDGK218-233 1912.88 1913.94 TINSENMHIDIYLYTS

114 de las bandas del gel y el análisis de los péptidospor MALDI-TOF aparecen en la Figura 2, dondese muestran los fragmentos de enterotoxina A procedentesde la leche junto con el espectro obtenidodel patrón. En la muestra de leche sólo aparecen 8enterotoxina A (Tabla1). Con el método propuesto precisa de su presencia en muestras de leche.Figura 2. Espectros de masas MALDI-TOF de las digestionescon tripsina. (A) Espectro correspondiente a patrón deenterotoxina A aislada de la muestra de leche.AgradecimientosLos autores agradecen a la Conselleria de Sanitatel soporte de esta investigación. GeneralitatValenciana (072/2009).Referencias[1] Pesavento, G., Ducci, B., Comodo, N., Nostro,Staphylococcusaureus isolated from raw meat: a researchfor methicillin resistant Staphylococcus aureus(MRSA). Food Control .2007; 18: 196-200. C., Tsen, H. PCR detection of Staphylococcalenterotoxins (SEs) N, O, P, Q, R, U, and surveyof SE types in Staphylococcus aureus isolatesfrom food-poisoning cases in Taiwan. Int. J.Food Microbiol. 2008; 121: 66-73.[3] Ikeda, T., Tamate, N., Yamaguchi, K., MakinS. Mass Outbreak of Food Poisoning DiseaseCaused by Small Amounts of StaphylococcalEnterotoxins A and H. Appl. Environ. Microbiol.,2005; 71:2793-2795. of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev.2000; 13: 16-34.and Matthias Mann Mass, Spectrometric Sequencingof Proteins from Silver-Stained PolyacrylamideGels, Anal. Chem. 1996; 68: 850-858.

115Comparación de dos técnicas proteómicas aplicadas al análisis de las proteínasde membrana de Mycoplasma genitaliumNoemí Párraga-Niño 1 , Núria Colomé 2 , Francesc Canals 2 , Jaume Piñol 1 , Josep Antoni Pérez Pons 1 ,Enrique Querol 1 , Mario Ferrer-Navarro 31Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad Autónoma deBarcelona (IBB-UAB). 2 Instituto de Investigación del Hospital Universitario Vall d’Hebrón. 3 Laboratoriode Biología Computacional y Proteómica, Instituto de Biotecnología y Biomedicina, Universidad Autónomade Barcelona (IBB-UAB)Los micoplasmas representan uno de los sistemasbiológicos más simples descritos hasta el momentoy son un buen ejemplo de célula mínimaautoreplicativa. Este género se caracteriza por la ausenciade pared celular y por presentar un genoma dereducido tamaño. Las infecciones causadas por Micoplasmassuelen estar asociadas al sistema urogenitaly al tracto respiratorio, provocando en muchoscasos infecciones crónicas. Mycoplasma genitalium,el microorganismo de estudio en este trabajo, infectael sistema urogenital humano provocando cervicitisen mujeres y uretritis en hombres. Es sabido que enmuchos microorganismos patógenos la patogenicidadreside en proteínas expuestas en la membrana.de Mycoplasma genitalium mediante 2DE. Uno delos principales problemas de la electroforesis bidimensionales la baja representación de proteínas dede membrana de M. genitalium se han aplicado dosmetodologías proteómicas diferentes con su posteriorcomparación. Las metodologías utilizadas en esteestudio han sido el fraccionamiento de las proteínashidrofóbicas en Tritón X-114 y posterior 2DE, y elmembrana con biotina, su captura con estreptavidinaLC-MS/MS. La aplicación de estas técnicas ha per-este microorganismo sino también comparar ambosmétodos para poder discutir las ventajas e inconvenientesde cada uno de ellos.

116 Comparative proteomic analysis of collection and clinical-isolate strains ofStenotrophomonas maltophiliaMario Ferrer-Navarro 1 , Elias Mongiardini 1 , Gerard Torrent 1 , Raquel Planell 1 , Ana Calderón 3 ,Teresa Falgueras, 3 Isidre Gibert, 1 Xavier Daura 1,21Institut de Biotecnologia i de Biomedicina (IBB), Universitat Autònoma de Barcelona (UAB), E-08193Cerdanyola del Vallès (Barcelona). 2 Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), E-08010Barcelona. 3 Hospital Municipal de Badalona, Badalona Serveis Assistencials, E-08911 Badalona (Barcelona)Stenotrophomonas maltophilia is a Gram-negativepathogen with emerging nosocomial incidence[1]. It has been associated with several clinical syndromes,primarily in relation to the opportunistic infectionof immunocompromised patients. Althoughnot an inherently virulent pathogen, its ability tocolonise respiratory-tract epithelial cells and medical-devicesurfaces makes it a ready coloniser ofhospital settings.Antibiotic treatment of S. maltophilia is greatlyhampered by extensive drug resistance [2]. Besides protection in front of the immune system, antibioticsand disinfectants [3].The genomes of two different strains have beenrecently sequenced and compared [4] but no expression-patternstudies have been performed yet. In thiscommunication, we present a comparative proteomeanalysis of four strains with different infective capacities,ATCC 13637 and the new clinical isolatesM30, UV74 and E77.Bacterial strains and growthThree new S. maltophilia strains were isolated.M30 from a patient with decubitus ulcer. E77 fromsputum and UV74 from patient with a vascular ulcer.ATCC 13637 and clinical isolated S. maltophiliastrains were cultured in LB media to reachexponential growth. Total protein extract: 20ml ofculture were washed with PBS and resuspended inlysis solution (8M urea, 2M thiourea, 2.5% CHAPS,2% ASB-14, 40mM Tris-HCL pH 8.8, 0.5% IPG).Then, samples were disrupted by sonication andcentrifuged. DIGE labeling: Samples were labeledas follows: Clinical strains with Cy3 (green), ATCC13637 strain with Cy5 (red) and the internal standardwith Cy2 (Blue). 50 µg of each sample weremixed and the resulting 150 µg were loaded ontothe IPG strips. 2-D Gel Electrophoresis: The IPGstrips were 24cm long and the pH range was from 3to 10 lineal and 4 to 7. The sample was loaded withthe cup-loading system. The second dimension wasperformed in 12.5% polyacrylamide gels. Gels wereperformed in triplicate for statistical analysis. Imageanalysis: Images were acquired immediately usinga Typhoon scanner (GE Healthcare) and the imageanalysis was carried out with Samespots software(Nonlinear dynamics). In-Gel Tryptic Digestion:After image analysis silver staining of the gels wasperformed. The selected spots were excised fromthe acrylamide gel, and immediately destained anddigested. MALDI-MS Analysis:-PMF analysis, the MASCOT search engine (MatrixScience) was used with the following parameters:one missed cleavage permission, 50 ppm measure-masses. In the searches, methionine oxidation andcystein carbamidomethylation were taken into ac-ConclusionsA differential expression analysis of the proteomesof newly isolated clinical strains of S. maltophiliaand the laboratory strain ATCC 13637 hasbeen performed (Figure 1). Eye-inspection of the gelimages readily suggests the existence of substantialdifferences between the two proteomes under the ex-tiallyexpressed proteins in these strains shall provide

117the basis for the interpretation of their phenotypicdifferences at a biomolecular level, with a specialfocus on infection and resistance mechanisms.protein synthesis (Spot nº 3, 4, 5, 13 and 17) and inamino acid metabolism (spot nº 12, 15 and 20).AntiPathoGN is supported by funding under theSeventh Research Framework Programme of theEuropean Union (ref. HEALTH-F3-2009-223101).The Authors thank Francesc Canals, from Unitat deProteòmica of Hospital Vall d’Hebron for his valuableadvice on image adquisition.ReferencesFigure 1. DIGE of the M30 and the ATCC 13637 S. maltophiliastrainsOn average, around 1500 spot features weredetected on each analytical gel. Statistical analysisof gels allowed the detection of about 300 spots withexpressed proteins. Interestingly, some of these proteins(Spot nº 9, 16 and 21) are involved in the fattyacid metabolism. Moreover, a protein involved inthe poliketide sugar unit biosynthesis has also beenproteins in the some of the clinical strains suggestsa different membrane lipopolysaccharide composi-formation and pathogenesis. A number of proteasesare upregulated in the clinical strains (Spot nº 2, 14,22 and 23) that could also be potentially relevant to Stenotrophomonas maltophilia: an emergingopportunist human pathogen. The Lancet InfectiousDiseases 2009; 9:312.[2] Nicodemo, A. C., and J. I. Paez.. Antimicrobialtherapy for Stenotrophomonas maltophilia infections.Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007;26:229-37.[3] Doroti de, O.-G., D. A. Monique, R. Mónica, C.G. S. A. Ana, A. Norma, B. M. Marina, and A.G. Jorge. Fimbriae and adherence of Stenotrophomonasmaltophilia to epithelial cells and toabiotic surfaces. Cellular Microbiology 2003;5:625-636.[4] Rocco, F., E. De Gregorio, B. Colonna, and P.P. Di Nocera. Stenotrophomonas maltophiliagenomes: A start-up comparison. InternationalJournal of Medical Microbiology In Press, CorrectedProof.

118 B) Proteómica de HongosAnálisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomycescerevisiae en dos condiciones de cultivoCarlos Luna 1 , Teresa García-Martínez 1 , Miguel Curto 2 , Juan Carlos Mauricio 11Departamento de Microbiología. 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad deLa levadura Saccharomyces cerevisiae es uno delos organismos modelo utilizados en Biología Molecular,y además es un organismo que tiene un granvalor comercial. La mayoría de los estudios sobreproteómica de levadura se ha realizado sobre cepasde laboratorio, y existen pocos datos sobre levadurasde interés industrial. Saccharomyces cerevisiae esun microorganismo anaerobio facultativo. Duranteel proceso de fermentación, la levadura se adaptavadapresión osmótica, agotamiento de la fuente decarbono como la glucosa y la aparición de etanol,que le es tóxico. Durante la fermentación alcohólica,implicadas en las rutas de las pentosas fosfato, glicolisis,gluconeogénesis, biosíntesis del glicerol ytambién proteínas de choque térmico. El objetivo dede una levadura industrial en dos medios de cultivo:medio fermentativo con glucosa y medio oxidativocon glicerol y etanol.La levadura Saccharomyces cerevisiae G1, aisladade un vino de la D.O Montilla-Moriles, crecióen dos condiciones: en un medio fermentativo, mediocompleto YPD compuesto por 17% de glucosa,1% de extracto de levadura, 2% peptona bacteriológica;y en un medio oxidativo formado por 0.67% deYNB, ácido glutámico 10mM, 1% de glicerol y 15%de etanol. Finalizado el experimento, las células delevadura se recogieron por centrifugación a 3.000x g a 4º C durante 10 minutos. Posteriormente, serealizó una lisis física con bolas de vidrio y una lisisquímica con 20 ml totales de tampón de extraccióncompuesto por tampón Tris 100 mM, a pH 8,0,PMSF 1mM, EDTA1 mM, DTT2 mM, y un cóctelde inhibidores de proteasas (Roche). El extractode proteínas se precipitó con TCA-Acetona-DTT0.07% durante 24 horas a -20ºC. Se resuspendió entampón de solubilización (Urea 8M, 2% CHAPSdeterminó mediante el método Bradford [2]. IEF-2D: Se utilizaron tiras con gradientes de pH inmovilizados(IPG) de 17 cm, de gradiente no lineal3-10, (Bio-Rad). Se rehidrataron pasivamente durante2 horas con 500 µg de proteína en 300 µL detampón de solubilización (Urea 8M; 2% CHAPS;0,5% tampón IPG 5-8, 3-10, 30 mM DTT, y azulde bromofenol 0.01%) [3]. Las tiras se cargaronen IEF CELL (Bio-Rad) para ser enfocadas por sugeles de poliacrilamida al 13% fueron sometidosa electroforesis en PROTEAN II CELL. Los gelesfueron teñidos con azul de coomassie G-250 durante24 h por el método descrito por Mathesius y colaboradores[4]. Las imágenes fueron adquiridas conun densitómetro GS-800 calibrado y se analizaroncon el software PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad). Se calcularonlos puntos isoelétricos según la distribuciónde las tiras, y los pesos moleculares según el patrónmarcadores correspondientes. Ciertos spots obtenidostanto en fermentación como en medio oxidativoestán secuenciados mediante MALDI-TOF/TOF enel Centro de Genómica y Proteómica - Unidad deProteómica - Facultad de Farmacia. Universidaddrid(UCM-PCM).Hemos obtenidos 477±20 spots en geles de fermentación.En el caso geles de medio oxidativo sesentestanto en los geles correspondientes al mediode fermentación como en los geles pertenecientes almedio oxidativo, éstos son los spots comunes.Se ha observado que la expresión de los spots engeles de medio oxidativo está mucho menos acen-

119tuada que en los geles de fermentación, así comoque el número total de spots expresados es menorque en el caso de fermentación.Se ha comprobado que las proteínas en ambosgeles bidimensionales pertenecen fundamentalmentea la glicolisis, gluconeogénesis y biosíntesis deglicerol. Por otro lado, se han encontrado proteínasexpresadas en medio oxidativo que no están presentesen medio de fermentación. Estas proteínasse relacionan con el estrés oxidativo y actualmenteestán siendo estudiadas. La mayoría de las proteí-de SwissProt de Saccharomyces cerevisiae (www.expasy.ch/sprot).Agradecimientosde Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA2008-00056-C02-02 y FEDER.Referencias[1] Cheng JS, Qiao B, Yuan YJ. Comparativeproteome analysis of robust Saccharomycescerevisiae insights into industrial continuous andbatch fermentation. Appl Microbiol Biotechnol2008; 81:327-338.[2] Bradford MM. A rapid and sensitive methodfor the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dyebinding. Anal Biochem 1976;72:248-254.[3] Kolkman A, Slijper M, J.R. Heck A. Developmentand application of proteomics technologiesin Saccharomyces cerevisiae. Trends in Biotechnol2005; 23:12. JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishmentof a root proteoma reference map for the modellegume Medigaco trunculata using the expressedsequence tag database for peptide massEstudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libresy bioinmovilizadasTeresa García-Martínez, Juan Carlos MauricioTradicionalmente, la levadura Saccharomyces cerevisiaese ha usado en alimentación, principalmentepor su producción de etanol en bebidas alcohólicasdurante miles de años. La avanzada biotecnología delas células inmovilizadas en procesos fermentativosde interés aporta una serie de ventajas técnicas yeconómicas frente a los sistemas convencionales decélulas libres [1]. Nuestro grupo de investigación hapuesto a punto un sistema de bioinmovilización queconsiste en una co-inmovilización espontánea de unPenicillium chrysogenum H3) yuna levadura (Saccharomyces cerevisiae G1), en ausenciade compuestos químicos de unión y de sopor-condiciones adecuadas para favorecer una simbiosis[2]. Al inmovilizado creado, que son esferas huecasde ambos microorganismos, lo hemos denominado“biocápsulas de levadura”, y éstas pueden ser aplicadasa diversos procesos fermentativos. El objetivode este trabajo ha sido realizar un estudio proteómicocomparativo entre las células de levadura en formalibre y en forma bioinmovilizada en el medio de formaciónde las biocápsulas de levadura.Los microorganismos usados en este estudio hansido una cepa de Saccharomyces cerevisiae var. capensisG1, aislada de un vino bajo crianza biológicade la D.O. Montilla-Moriles y un hongo, Penicilliumchrysogenum H3, aislado del ambiente. El mediode cultivo y las condiciones en las que se produjo labioinmovilización fueron: medio YNB que contieneácido glucónico como fuente de carbono, amoniocomo fuente de nitrógeno y tamponado a pH 7. Dosmatraces Erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de mediode formación de biocápsulas se inocularon con4 x 10 6 células de G1/mL y un asa de siembra delhongo H3. Se incubaron a 28ºC en un agitador orbitala 200 rpm durante 7 días, formándose durante este

120 tiempo las biocápsulas de levadura. Para el estudio delas células de levadura libres se procedió de la mismacélulas de levadura inmovilizadas se extrajeron delinmovilizado por rotura mecánica y agitación vigorosaen una solución de NaCl 100 mM, posteriormentelas células de levadura se separaron de las hifasMillipore de 180 µm y después por otro de 30µm).Ambos tipos de células de levadura se recogieron porcentrifugación a 3000 x g a 4º C durante 10 minutos.La lisis celular tanto de las células de levadura librescomo las procedentes del inmovilizado se realizóen un Vórtex- Genie2 con DTT, bolas de vidrio, ylos tampones 1 y 2 necesarios para la extracción delas proteínas. Tampón 1: SDS (5%); TRIS-HCl (0.5M); pH 7.5 y tampón 2: Thiourea (2 M); urea (7 M);CHAPS (4 %); DTT (1%); Pharmalite 3-10 (2 %) [3].La precipitación de proteínas se hizo con Tricloroacético(TCA) al 10% diluido en acetona fría. La concentraciónde proteínas de los extractos celulares sedeterminó mediante el método descrito por Bradford[4]. Se realizó una electroforesis bidimensional: parala primera dimensión se utilizaron tiras IPG de 17cm, con gradiente de pH no lineal +N3-10 (Bio-Rad)fueron rehidratadas con 150 µg de proteína en 300 µLde tampón de solubilización. El isoelectroenfoque sellevó a cabo en un PROTEAN IEF CELL (Bio-Rad)a una corriente constante de 50 µA per tira hasta 40000 Vh. Para la segunda dimensión (SDS-PAGE), lasproteínas se separaron en geles al 13% de poliacrilamidaen un PROTEAN II CELL. Los geles corrierona una corriente constante a 60 mA per gel. Los gelespreparativos fueron teñidos con CBB G-250 [5]se realizó en la Unidad de Proteómica, de la UCO,miembro de ProteoRed, usando MALDI-TOF paraTrembl del Proteoma de Levaduras de S.cerevisiae,(www.expasy.ch/sprot). Los geles se analizaron medianteel programa PD-Quest 8.0.1 (Bio-Rad).Después de 7 días, la levadura libre en el mediode formación de biocápsulas solamente se dividió unavez (una generación), lo que era de esperar puesto queeste medio no es fermentativo para la levadura. Sinembargo, la levadura inmovilizada creció algo más,El número de spots encontrados en los geles delas células libres de levadura fue aproximadamentedel doble de los observados en los geles de las célulasde levadura inmovilizadas. Esta gran disminuciónen el nivel de proteínas de las células inmovilizadaspuede ser debido a que la levadura reduzca su sín-en forma de simbiosis. La totalidad de las proteínasSwissProt de Saccharomyces cerevisiae y en amboscasos abundan las proteínas de la glicolisis. En célulasbioinmovilizadas, se observa una disminución deproteínas básicas de bajo peso molecular. En la actualidad,se está continuando con el análisis de proteínasde estos geles en estas dos condiciones ensayadas.En conclusión, el análisis proteómico de ambosgeles bidimensionales muestra una disminución importantedel número de spots en las células de leva-mayor disminución corresponde a proteínas básicasde bajo peso molecular.Agradecimientosde Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA2008-00056-C02-02 y FEDER.Referencias[1] Kourkoutas Y, Bekatorou A, Banat IM, MarchantR, Koutinas AA. Immobilization technologiesand support materials suitable in alcohol beveragesproduction: a review. Food Microbiol2004;21:377-397.[2] Peinado RA, Moreno JJ, Villalba JM, González-ReyesJA, Ortega JM, Mauricio JC. Yeastbiocapsules: A new immobilization methodand their applications. Enz Microb Technol2006;40:79-84.[3] Khoudoli GA, Porter IM, Blow JJ, Swedlow, R.Optimisation of the two-dimensional gel electrophoresisprotocol using the Taguchi approach.Proteome Sci 2004;2:6.[4] Bradford MM. A rapid and sensitive methodfor the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dyebinding. Anal Biochem 1976;72:248-254.JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishmentof a root proteoma reference map for the modellegume Medigaco trunculata using the expressedsequence tag database for peptide mass

121 Saccharomyces cerevisiae en condiciones de ayuno en K +Miguel Curto 1 , Clara Navarrete 2 , Luis Valledor 3 , María Luisa Hernández 4 , José Ramos 2 , JesúsJorrín 11Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, 14071 Córdoba, España.2Departamento de Microbiología, Universidad de Córdoba, Córdoba, España. 3 Departamento de Biología de 4 Departamento Madrid (UCM-PCM). Madrid, España.ResumenSe ha llevado a cabo el estudio comparativo delproteoma de las cepas silvestre (BY4741) y mutante(trk1,2) de Saccharomyces cerevisiae en condicioneslimitantes de K + , utilizando electroforesis bidimensionalacoplada a MS. En respuesta al ayuno enK + se observó un marcado descenso del contenidoen proteínas en extractos celulares y del número despots en geles bidimensionales, tanto en la variedadsilvestre como la mutante. Los spots que presentarondiferencias cualitativas o cuantitativas, estadística-espectrometría de masas (MALDI-TOF-TOF). Tras(UniProtKB-SwissProt; limitada a la taxonomía deSaccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast)) las proteínasse agruparon de acuerdo a su función. El ayunoen potasio causó una disminución en enzimas delmetabolismo energético y del metabolismo de aminoácidos,así como a proteínas de respuesta a estrés.Este trabajo forma parte del proyecto TRANS-LUCENT (http://www.translucent-network.org/),cuyo objetivo es analizar los mecanismos implicadosen la homeostasis catiónica [1] usandocomo sistema modelo S. cerevisiae. Mediante unaaproximación de proteómica de expresión diferencialbasada en electroforesis bidimensional, se haproteínas como resultado de la doble mutación enK + (TRK1 y TRK2) [1], y en condiciones de ayunoen K + . En un trabajo preliminar, el proteoma de lasdos cepas (silvestre y doble mutante) se comparó enlas fases exponencial y estacionaria de la curva decrecimiento, con concentraciones óptimas (50 mMClK) de K + en el medio [2]. Se realizaron extraccionesde proteínas [3] y geles bidimensionales (IEF enel rango de pH 5-8; SDS-PAGE 12 %; tinción contrk1,2 a 0 (control),30, 60, 180 y 300 tras la eliminación del K + . Se detectoun descenso progresivo con el tiempo de ayunotanto en el contenido en proteínas del extracto comoen el número de spots resueltos, siendo este efectomás acusado en la cepa mutante que en la silvestre(Figura 1). Se picaron los spots que mostraron diferenciascualitativas o cuantitativas, estadísticamentetríptica, analizándose los péptidos resultantes porMS (MALDI-TOF-TOF). Tras la búsqueda en basesde datos (UniProtKB-SwissProt; limitada a la taxonomíade Saccharomyces cerevisiae (Baker’s yeast))171 proteínas, que se agruparon según su función(Figura 2). El ayuno en potasio causó una disminuciónen enzimas del metabolismo energético y delmetabolismo de aminoácidos, así como a proteínasdas,las relacionadas con el estrés y/o reacciones dedefensa, metabolismo de nucleótidos y transcripción,fueron las que presentaron mayores cambios entrecepas, siendo más abundantes en la cepa silvestre.AgradecimientosAgradecemos el trabajo desarrollado, por la Dra.Hanna Sychrova (Departamento del transporte dePraga), con las cepas de S. cerevisiae usadas en estetrabajo. Así como al proyecto “Gene interactionnetworks and models of cation homeostasis in Saccharomycescerevisiae –TRANSLUCENT” por

122 ReferenciasFigura 1. A. Contenido en proteínas en extractos de la cepasilvestre y doble mutante a distintos tiempos tras la eliminaciónde K+ del medio. B. Número de spots resueltos endichos extractos, en el rango de pH 5-8 y Mr 6-95 KDa.[1] Rodríguez-Navarro A y Ramos J. Dual systemfor potassium transport in Saccharomyces cerevisiae.Journal of bacteriology, 1984; 159:940-45.[2] Curto M, Ramos J, Gutierrez L, Gil C, Jorrin J,Proteome analysis of Saccharomyces cerevisiaewild and potassium transport-affected mutantstrains. Joint congreess of the spanish societyand the latin american human proteome organization.2009 ; Pamplona.[3] Damerval C, De Vienne D, Zivy M, ThiellementH. Technical improvements in two-dimensionalelectrophoresis increase the level of geneticvariation detected in wheat-seedling proteins.Electrophoresis, 1986; 7: 52–54. JJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment ofa root proteome reference map for the model legumeMedicago truncatula using the expressedprinting.Proteomics 2001; 1: 1424–40.[5] Perkins DN, Pappin DJC, Creasy DM, CottrellJS. Probability-based protein identificationby searching sequence databases using massspectrometry data. Electrophoresis, 1999; 20:3551-67.Figura 2. Agrupación funcional de las proteínas afectadaspor el ayuno en potasio. A. Cepa silvestre; B. Doble mutante.Datos expresados en porcentaje.

123Análisis mediante 2D-DIGE de la interacción con sangre de una cepa de Saccharomycescerevisiae potencialmente patógena aislada de suplementos dietéticosCarolina Hernández-Haro, Lucía Monteoliva, Gloria Molero, Concha Gil, María MolinaDepartamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia (UCM). Plaza Ramón y Cajal s/n, Madrid, Spain.La levadura Saccharomyces cerevisiae es conocidapor su papel en la elaboración de pan y debebidas alcohólicas tales como el vino, la cervezao la sidra. Además, esta levadura es también consumidaen forma de suplementos dietéticos y deprobióticos lo que implica el consumo de las célulashospedador derivados de este consumo son conocidos;sin embargo, no se han estudiado los posiblesefectos indeseables, sin duda debido a que S. cerevisiaese ha considerado siempre un microorganismoseguro para uso alimentario. En los últimos años,la bibliografía clínica muestra que la incidencia deinfecciones causadas por S. cerevisiae ha aumenta-primidos[1], por lo que actualmente S. cerevisiaese incluye en el grupo de “patógenos oportunistasemergentes” [2-3]. Para estudiar la posible relaciónentre la ingesta de células vivas de S. cerevisiae,a través del consumo de suplementos dietéticos yprobióticos, y las infecciones en humanos, se probóla virulencia de diferentes cepas en modelo murinode infección sistémica observándose un 50% demuerte de ratones con una de las cepas, por lo que seplanteó el análisis de los posibles rasgos de virulenciaasociados a estos S. cerevisiae patógenos [4]. Elteínaspotencialmente implicadas en la virulencia,para lo cual se ha realizado un estudio comparativode la expresión diferencial mediante el sistema 2D-DIGE de proteínas de extractos citoplasmáticos deuna cepa procedente de dichos suplementos dietéticoscaracterizada como virulenta y una cepa delaboratorio avirulenta. Las muestras se obtuvierontras la interacción de las células de levadura consangre humana a distintos tiempos (0, 1.5 y 3 horas)a 37ºC y en condiciones semiaeróbicas. Se utilizó lasangre humana debido a que la diseminación de lalevadura en el torrente sanguíneo constituye una etapaesencial para el desarrollo de infección sistémica.Los extractos de proteína de tres réplicas biológicasestándar interno con Cy2 y se separaron en 9 gelescon el módulo BVA (Biological Variation Analysis)del software DeCyder. Se realizaron comparacionesentre cepas y entre tiempos de interacción con sangremediante análisis 2-ANOVA detectándose: 43manchas proteicas de expresión diferencial al compararlos distintos tiempos (2-ANOVA-condición25, 391 manchas proteicas al comparar las 2 cepas(2-ANOVA-condición cepa < = 0.05) de las cualescomparar las distintas cepas en los distintos tiempos(2-ANOVA-interacción < = 0.05) de las cuales secuentranproteínas metabólicas, chaperonas y ATPsintasas. Además, podemos destacar que entre lasbiénse encuentran proteínas de la sangre. Esto podríaser debido a una fuerte unión de estas proteínasel resto de las proteínas de expresión diferencial.Carolina Hernández Haro es becaria FPI delAGL2006-12710-C02-02/ALI de la DGICYT delMEC. Proyecto coordinado con el grupo de investigaciónde las Dras. Amparo Querol y Mª TeresaFernández-Espinar del IATA (Valencia).Referencias[1] Enache-Angoulvant A y Hennequin C. InvasiveSaccharomyces infection: a comprehensivereview. Clin Infect Dis 2005;41:1559-68.[2] Murphy A y Kavanagh K. Emergence of Saccharomycescerevisiae as a human pathogen,Implications for biotechnology. Enz MicrobialTechnol 1999;25:551-7.[3] Muñoz P, Bouza E, Cuenca-Estrella M, Eiros J M,Pérez M J, Sánchez-Somolinos M et al. Saccharomycescerevisiae fungemia: an emerging infectious

124 disease. Clin Infect Dis 2005;40:1625-34.[4] De Llanos R, Querol A, Permán J, GobernadoM y Fernández-Espinar M T. Food and probioticstrains from Saccharomyces cerevisiae speciesas a possible origin of systemic infection. Int JFood Microbiol 2006;110:286-90.Análisis comparativo de diferentes aproximaciones para el estudio del proteomade Saccharomyces cerevisiaeDolores Gutiérrez 1 , Mª Luisa Hernaéz 1 , Montserrat Martínez-Gomariz 1 , María Posada 1 , Concha Gil 212Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de MadridEn los últimos años el gran desarrollo de losespectrómetros de masas y las técnicas de fraccionamientode péptidos y proteínas ha permitido elestudio de muestras complejas de proteínas. A pesarde ello aún estamos lejos de conseguir el análisiscompleto de proteomas o subproteomas.Saccharomyces cerevisiae es un organismo modelodesde el inicio en proteómica, para estimar lacapacidad real de una tecnología dada en el estudioprofundo de un proteoma. Además, cuando estalevadura esta creciendo en fase logarítmica hay evidenciasde que más de 4500 proteínas son expresadasen un amplio rango dinámico, desde 100 copiaspor célula para aquellas proteínas menos abundanteshasta millones de copias por célula para las proteínasmás abundantes. En la actualidad, se ha cubiertomás del 50% de su proteoma, aplicando diferentescombinaciones de fraccionamiento y diferentesequipamientos de espectrometría de masas [1]La electroforesis bidimensional en geles depoliacrilamida (2D-PAGE) ha demostrado ampliamentesu utilidad en la capacidad de separación deproteínas aportando gran información acerca delcontenido proteico celular [2]. Sin embargo, presentaalgunas desventajas importantes, como lalimitada cantidad de muestra que se puede cargaren el gel, y la inadecuada resolución de proteínashidrofóbicas o de elevado peso molecular. Alter-separación de péptidos y proteínas permiten reducirla complejidad de la muestra y aumentar el númeroLa técnica de separación mediante isoelectroenfoqueen solución resuelve proteínas o péptidos enfunción de su punto isoeléctrico (pI). Las fraccionesresultantes están en solución lo que permite acoplarlasa un segundo paso de fraccionamiento comocromatografía líquida y su posterior análisis porespectrometría de masas en tandem (MS/MS). Estametodología parece altamente efectiva y reproduci-de proteínas por marcaje con iTRAQ [3].En este trabajo hemos diseñado cuatro aproximacionesproteómicas diferentes en los que secombinan diversas técnicas de fraccionamiento yanálisis por espectrometría de masas para compararla capacidad de las distintas estrategias para la caracterizacióndel proteoma de esta levadura (Figura1). Los experimentos se detallan a caontinuación:Experimento 1: Proteínas intactas son separadasmediante isoelectroenfoque, utilizando tiras de 12cm con un rango de PH de 3-10 con una resoluciónde 0.6, seguido de digestión tríptica de cada fraccióny nano-RP-HPLC acoplada on-line a ESI-MS/MS(LTQ) y off-line a MALDI-MS/MS (4800 MALDI-ciónde proteínas. Experimento 2: Digestión trípticadel extracto proteico seguido de separación de lospéptidos según pI mediante Off-Gel usando las mismastiras que para la separación de proteínas. Las diferentesfracciones se separaron mediante RP-HPLCacoplado a MS/MS de la misma manera que en elexperimento 1. Experimento 3: Digestión de proteínasseguida de cromatografía bidimensional off-line(SCX y nano-RP-HPLC) acopladas a espectrometría

125Figura 1. Esquema de trabajo de los cuatro experimentosde masas en tandem en la misma forma que los experimentosanteriores. Experimento 4: Separaciónde proteínas mediante SDS-PAGE. Se corta el gel en12 bandas, cada una de éstas se digiere por separadoy los péptidos extraídos se analizan mediante nano-RP-HPLC y espectrometría de masas en tandemcomo se ha detallado anteriormente.efecto de las cuatro estrategias en relación a la S. cerevisiae yanalizar la capacidad de las distintas técnicas defraccionamiento para detectar proteínas de bajaabundancia. Este estudio nos facilitará informaciónpara decidir cuál es la aproximación de elección,con la tecnología que disponemos, para el análisisde mezclas complejas.AgradecimientosEl análisis proteómico se ha realizado en la Unidadde Proteómica de la UCM-PCM, miembro deProteored.Referencias[1] de Godoy LM, Olsen JV, de Souza GA, Li G,Mortensen P y Mann M. Status of completeproteome analysis by mass spectrometry: SILAClabeled yeast as a model system. Genome Biol2006;7:R50.[2] Perrot M, Moes S, Massoni A, Jenoe P yBoucherie H. Yeast proteome map (last update).Proteomics 2009;9:4669-73.[3] Chenau J, Michelland S, Sidibe J y Seve M.Peptides OFFGEL electrophoresis: a suitablepre-analytical step for complex eukaryotic samplesfractionation compatible with quantitativeiTRAQ labeling. Proteome Sci 2008;6:9.

126 Applying proteomic technologies to dissect molecular aspect of phytopathogenicfungi, a Botrytis cinerea approachFrancisco Javier Fernández-Acero, Carlos Garrido, María Carbú, Victoria E. González-Rodríguez,Jesús Manuel CantoralLaboratory of Microbiology, Marine and Environmental Sciences Faculty, University of Cádiz, Pol. Río SanPedro s/n, Puerto Real, 11510, Cádiz, SpainAbstractTwo dimensional gel electrophoresis (2-DE)plus mass spectrometry (MS) have been widely usedto study the proteome of a good number of tissues,plants, animals or microorganisms. However, fewof them have been carried out to study the proteomeof phytopathogenic fungi. These organisms are responsibleof several plant diseases in different cropsaround the world, causing very important economiclosses to the farmers. There are several reasons toexplain the lack of proteomic studies describing fungalplant pathogen proteomes. The main aim of thiswork is to tackle the strategies to overcome thesetionprotocols, or using microbiology techniques todecrease the analytical variability.Main textFungal plant pathogens are one of the main responsibleof farmer losses. By way of example, theannual consumption of fungicides against phytopathogenicfungus Botrytis cinerea (Botrycides) movesabout 10% of global fungicide market, which wouldmean 540 million per year [1]. Moreover, the lossesincrease with the value of agricultural losses, quan-The losses caused by B. cinerea in French vineyardsare between 15% and 40% per year, depending onweather conditions. In Holland, B. cinerea producesin the strawberry crops. Annual average expenditureon fungicides against Botrytis, is around 3 millionEuros in tomato crops, 2 million in strawberry and3 million in grapewine crops (BASF, personal communication).The genus Botrytis is an ascomycetesof pathogenic species capable of infecting a varietyof crops. Some species are able to infect a singlecrop, such as B. tulipae, B. squamosa or B. fabae,pathogen to tulips, bean and onions respectively.However, B. cinerea is able to attack more than 200species, including tomatoes, strawberries and grapes,three of the most important crops in Andalusia.to attack fruit (grapes, strawberries, tomatoes, etc.),seeds. Moreover, it is also capable to attack manydifferent plants (grapevine, tomato, Arabidopsis,roses, etc.), in different organs of the same plant(fruits, leaves, petals and other structures of thesame plant). Furthermore, the disease may appeardirectly “in planta” or during storage and distributionof fruits. These data show the relevance of thispathogen that is being currently considered as a modelorganism in all those experimental approaches tothe study of plant-pathogen interaction.The fact that there are only few reports on theproteome of phytopathogenic fungi is mainly duegalprotein extracts or the lack of available fungalprotein databases [2]. An effective protein extractionis a key step for obtaining a good resolutionavoiding streaking in the 2-DE gels. It will allowus to remove contaminants (i. e. nucleid acid, salts,lipids, pigments) which may disturb the proteinsfocusing. However, it is especially relevant when to its richness in cell wall polysaccharides, and themechanical resistance of the fungal cell wall. Thisproblem has been overcome by using phenol basedprotocol [3]. On the other hand, the amount ofgenomic resources is increasing continuously, and(Broad Institute, MIT, Harvard). This information isbe overcame, there are still some points that become

127proteome. In spite of other aspects, we are especia-levels of variability founded in these studies, and (ii)Calculations of analytical and biological variabilityare directed to quantify the variations associatedwith the 2-DE experiments and differences in thelevel of protein expression between independent replicates[4]. The averages of analytical and biologi-[5]. Only those changes consistently present in allthe extract replicates, whose quantitative differencesare higher than the corresponding biological andanalytical variance, should be considered [2]. Inspite of the levels obtained in fungal approaches aresimilar to the obtained variability in plant or micro-isolates in attempt to decrease these levels, but theresults obtained in a proteomic approach use to beprotein is also discussed for its biological relevance,or used “in further studies”. This information is veryimportant and interesting, but if we apply our ownand particular “optics”, we assume the risk of informationlosses in other parallel biological process. Asan interesting tool is the website PANTHER (ProteinANalysis THrough Evolutionary Relationships;dingto (i) its biological process or (ii) its molecularfunction, based on Gene Ontology. This informationextract directly from a protein list. In this sense, analgorithm to elucidate the drug target-likeness of aprotein has been published [7]. This work could improvethe development of new therapeutic targets tomoment is not feasible to develop similar approachto analyse new candidates for fungicide design (personalcommunication).References[1] UIPP, Union des Industries de la Proteccion desPlantes, Boulogne 2002.[2] Fernández-Acero FJ, Carbú M, Garrido C, VallejoI and Cantoral JM. Proteomic Advancesin Phytopathogenic Fungi. Curr Proteomics2007;4:79-88.[3] Fernández-Acero FJ, Colby T, Harzen A, CantoralJM and Schmidt J. Proteomic analysisof the phytopathogenic fungus Botrytis cinereaduring cellulose degradation. Proteomics2009;9:2892-902.[4] Fernández-Acero FJ, Carbú M, Garrido C,Collado IG, et al. Screening Study of PotentialLead Compounds for Natural Product-basedFungicides Against Phytophthora Species. J.Phytopathol 2006;154:616-21.[5] Jorge I, Navarro RM, Lenz C, Ariza D, et al.The Holm Oak leaf proteome: Analytical andbiological variability in the protein expressiontandem mass spectrometry de novo sequencingand sequence similarity searching. Proteomics2005;5:222–34.[6] Fernández-Acero FJ, Jorge I., Calvo E, VallejoI, et al. Proteomic analysis of phytopathogenicfungus Botrytis cinerea as a potential tool foridentifying pathogenicity factors, therapeutictargets and for basic research. Arch of Microbiol2007;187:207–15.Learning the drug target-likeness of a protein.Proteomics, 2007;7:4255-63.

128 Gel-based proteomic analysis of Botrytis cinerea. The simplest 1-DE revealsdifferences in virulence-related protein abundance among strainsRaquel González-Fernández, Inmaculada Redondo, Jesús V. Jorrín-NovoAgricultural and Plant Biochemistry and Proteomics Research Group, Dept. of Biochemistry and MolecularBiology, University of Córdoba, SpainBotrytis cinereafungus, which infects more than 200 plant species [1],There are a number of isolates of B. cinerea that differfew years, B. cinerea has been adopted as an importantmodel system in molecular phytopathology fungistudies [1]. In the post-genomics era, Proteomics hasbecame in a powerful tool which can contribute to understandbiology, infection strategies, and lyfe cycleof this fungus, to identify virulence factors, and, onthe bases of them, to develop crop protection strategies.Up to date only a few proteomics studies havebeen published on this organism [3-7]. In this work,we present a preliminary gel-based proteomic analysisof mycelium extracts from six different strains of B.cinereaMALDI-TOF/TOF. This work is part of an Europeanresearch project (BOTBANK EUI2008-03686)within Plant-KBBE, intended at develop a collectionof mutants of B. cinerea and validate the creation ofthis library with the characterization of the mutantlines whose infectious cycle is affected.B. cinerea strains used were B05.10 (from Prof.Dr. Paul Tudzynski lab, Münster, Germany), CECT2100, 2850, 2996 and 20518 (from Spanish Type CultureCollection) and BOLC (provided by Dr. AngelVillegas from IAS, Córdoba, Spain, and isolated fromlentil infected plants). Three independent (biological)medium (2% w/v sucrose, 0.3% w/v NaNO 3, 0.1% w/vK 2HPO 4, 0.05% w/v KCl, 0.05% w/v MgSO 4·7H 2O,pH 5.0) were inoculated with mycelium taken fromsolid cultures grown on cellophane membrane withpotato dextrose agar. The cultures were grown for 6days at 21ºC with agitation (120 rpm) in darkness. precipitation method used was TCA/acetone-phenol/methanol for recalcitrant tissues described in [8]. Fifteenµg of protein were subjected to SDS-PAGE [9],using the Criterion System (Bio-Rad) with precast CriterionStain Free Gels, Tris-HCl, 4-20% linear gradient(Bio-Rad). The protein band pattern was analyzedusing the Image Lab software (Bio-Rad). The bandswere cutted out and digested with trypsin. The MS oftryptic peptides was analyzed in a 4800 ProteomicsFigure 1. SDS-PAGE of mycelium protein extracts of six different strains of B. cinerea.

129Analyzer MALDI–TOF/TOF mass spectrometer (AppliedBiosystems). The 3 most abundant peptide ionswere subjected to MS/MS analysis. A PMF searchand a combined search (+MS/MS) were performed innrNCBI database of proteins using MASCOT.eliumextract from the six strains studied (B05.10,2100, 2850, 2996, 20518 and BOLC). There wereysis(Figure 1). Some of them have been reportedto be involved in pathogenicity in B. cinerea or inother phytopathogenic fungi, such as malate dehydrogenase[5], woronin body major protein [10],peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (PPI) [11] andPIC5 protein [12], or implicated in fungal growthand differentiation, such as nucleoside diphosphatekinase [13]. The abundance of these proteins wasdifferent among isolated (Figure 1).i) analysis of spores and culture media in wild-typestrains; ii) analysis of mutants, obtained by Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation(ATMT) and affected in infectious cycle; and iii)use of 2-DE, and LC-based proteomic approaches.This work was supported by the Spanish “Ministeriode Ciencia e Innovación” (BOTBANKProyect: EUI2008-03686), the “Junta de Andalucía”and the “Universidad de Córdoba” (AGR 164).Thanks to Consuelo Gómez from SCAI (Córdoba,References N. Botrytis: biology, pathology and control.Springer, 2004.[2] Choquer M, Fournier E, Kunz C, Levis C,Pradier J.M, Simon A y Viaud M. Botrytiscinerea virulence factors: new insights into anecrotrophic and polyphageous pathogen. FEMSMicrobiology Letters 2007;277:1-10.[3] Fernandez-Acero FJ, Colby T, Harzen A, CantoralJM y Schmidt J. Proteomic analysis of the phytopathogenicfungus Botrytis cinerea during cellulosedegradation. Proteomics 2009;9:2892-902.[4] Fernandez-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, VallejoI, Carbu M, Camafeita E, Garrido C, Lopez JA,Jorrin J y Cantoral JM. Proteomic analysis ofphytopathogenic fungus Botrytis cinerea as apotential tool for identifying pathogenicity factors,therapeutic targets and for basic research.Arch Microbiol 2007;187:207-15.[5] Fernandez-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo I,Carbu M, Camafeita E, Lopez JA, Cantoral JM yJorrin J. Two-dimensional electrophoresis protein Botrytiscinerea. Proteomics 2006;6S1:S88-96.[6] Shah P, Atwood JA, Orlando R, El Mubarek H,Podila GK y Davis MR. Comparative proteomicanalysis of Botrytis cinerea secretome. J ProteomeRes 2009;8:1123-30.[7] Shah P, Gutierrez-Sanchez G, Orlando R y BergmannC. A proteomic study of pectin-degradingenzymes secreted by Botrytis cinerea grown inliquid culture. Proteomics 2009;9:3126-35. versaland rapid protocol for protein extractionfrom recalcitrant plant tissues for proteomicanalysis. Electrophoresis 2006;27:2782-6.[9] Laemmli UK. Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophageT4. Nature 1970;227:680-5.[10] Soundararajan S, Jedd G, Li X, Ramos-Pamplonain Magnaporthe griseapathogenesis and for survival during nitrogenstarvation stress. Plant Cell 2004;16:1564-74.[11] Viaud M, Brunet-Simon A, Brygoo Y, PradierJM y Levis C. Cyclophilin A and calcineurinfunctions investigated by gene inactivation, cyclosporinA inhibition and cDNA arrays approachesin the phytopathogenic fungus Botrytiscinerea. Mol Microbiol 2003;50:1451-65.[12] Gioti A, Simon A, Le Pecheur P, Giraud C,Pradier JM, Viaud M y Levis C. Expression Botrytis cinereathree patterns of up-regulation in planta and anFKBP12 protein affecting pathogenicity. J MolBiol 2006;358:372-86.[13] Lin X, Momany C y Momany M. SwoHp, a nucleosidediphosphate kinase, is essential in Aspergillusnidulans. Eukaryot Cell 2003;2:1169-77.

130 Proteomic approach to Botrytis cinerea survival structuresVictoria E. González-Rodríguez, Carlos Garrido, Maria Carbú, Jesús Manuel Cantoral, FranciscoJavier Fernández-AceroLaboratory of Microbiology, Marine and Environmental Sciences Faculty, University of Cádiz, Pol. Río SanPedro s/n, Puerto Real, 11510, Cádiz, SpainAbstractThe ascomycete Botrytis cinerea is a phytopathogenicfungus infecting a high number of crops, causing(Spain). In the last few years, B. cinerea has beenadopted as an important model system in molecularphytopathology. Several approaches have been appliedto this fungus to unravel its mechanisms of infection.These studies have revealed the complexity and widevariety of infection strategies used by B. cinerea. Thisstudy presents an initial approach to characterize theproteins content of two principal structures of resistance:conidia and sclerotia, which constitutes the princi-the majority of the spots were found from 5 to 8 ofpI values, presenting a Mr from 14 to 105 kDa. Aftersclerotia. Both, conidia and sclerotia, were homogenizedby using FastPrep Instrument (Q-BIOgene,Valencia, USA), 12 cycles of 30 second and 6.0 ofspeed. Protein extraction was developed followingFernandez-Acero et al [2]. Protein concentrationwas determined by using the RC-DC Protein Assay(Bio-Rad). 2-DE was developed following Fernandez-Aceroet al [2] using Immobilized pH gradient(IPG) strips (Bio-Rad, 7 cm,) 3-10 or 5-8 linear pHgradient (Figure 1).Main textBotrytis cinerea Pers. Fr. is a phytopathogenicsubstantial number of crops. In the last years, manyresearch advances regarding the infection processdeveloped by this pathogen have been made. Lately,berof proteins from B. cinerea [1-3]. However, aspecial interest is focused in those proteins involvedin the initial steps of plant infection process due tothese proteins are excellent candidates for fungicidedesign or targets to design diagnosis techniques.Conidial suspensions (1 x 10 8 cond/mL) wereobtained from 15 days B. cinerea 2100 (Spanishtype culture collection) malt agar plates followingCarbu et al [4]. Sclerotia were obtained from B.cinerea strain 992.1-89 (University of Cádiz culturecollection) maintained during 30 days in maltagar, at 22ºC to obtain a stock of well maturatedFigure 1. dia(left) and sclerotium (right), showing the protein separa-Obtained proteins from ungerminated conidialsuspension showed that most of the stained spotswere allocated between pI 5 and 8. The distributionof the spots attending to its molecular weight (Mr)was found from 14.7 to 105.7 kDa. Those spotspresented in all the three replicates were used tocalculate the analytical variability of the experiment.One hundred and eight spots were used obtaining% CV average of 42.05 %, which is similar to ourprevious experiments. Two dimensional gels fromSclerotia present more diverse content. In spite thatboth structures show similar pI distribution, themolecular weight was between 3.1 to 158.8 kDa,showing a wider distribution. The obtained % CV

131result was 44.61% by using 205 protein spots. ThisB. cinereaconidial germination, representing its initial step.Moreover, our initial results with sclerotia seem tocoincide with the previous studies with Sclerotiniasclerotiorum [5] presenting a mayor protein with 34-36 kDa and 3 isoforms with a pI of 6.2, 6 and 5.8.Our gels show 6 isoforms with a Mr about 41 kDa,and a pI of 5.23, 5.51, 5.65, 5.81, 5.94 and 6.19 asa mayor component. In spite of the observed differencesand waiting the results from MALDI TOF/TOF, we assume that our protein is the same, a Ssp1protein involved in sclerotia development.References[1] Fernández-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, Vallejo I,et al. Two-dimensional electrophoresis proteinBotrytiscinerea. Proteomics 2006;6:S88-96.[2] Fernández-Acero FJ, Colby T, Harzen A, CantoralJM, Schmidt J. Proteomic analysis of the phytopathogenicfungus Botrytis cinerea during cellulosedegradation. Proteomics 2009;9:2892-902.[3] Fernández-Acero FJ, Jorge I, Calvo E, VallejoI, et al. Proteomic analysis of phytopathogenicfungus Botrytis cinerea as a potential tool foridentifying pathogenicity factors, therapeutictargets and for basic research. Arch Microbiol2007;187:207–15.[4] Carbú M, Fernández-Acero FJ, Garrido C, RebordinosL, et al. Estudio de la competitividad deBotrytis cinerea en viñedos del marco vitivinñicolade Jerez. Tecnología del Vino 2004;34-8.[5] Russo GM, Van Etten JL. Synthesis and loca- sclerotia of Sclerotinia sclerotiorum. J Bacteriol1985;163:696-703.Candidaen el pronóstico de las candidiasis invasivasAida Pitarch, César Nombela, Concha GilDepartamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de MadridLas candidiasis invasivas son infecciones denotable morbilidad y mortalidad, en pacientes severamenteinmunocomprometidos y enfermos críticos[1]. El hallazgo de nuevos biomarcadores depronóstico para estas infecciones oportunistas puedesuponer un nuevo camino para tomar decisionesterapéuticas más precisas e individualizadas quepodrían a su vez mejorar la evolución clínica de estospacientes. Para esta búsqueda, pueden ser útilestécnicas globales de alto rendimiento tales como lainmunoproteómica clásica o el análisis del proteomaserológico (SERPA) [2]. Diferentes estrategiasSERPA (basadas en electroforesis bidimensionalseguida de “western-blotting” y espectrometría demasas) han permitido el descubrimiento de variosbiomarcadores clínicos y dianas terapéuticas paraestas micosis oportunistas [2-5].todode pronóstico para las candidiasis invasivas,se combinó la tecnología SERPA con análisis bioinformáticospara examinar, en un estadio precoz deanticuerpos frente al inmunoma de Candida en 45pacientes con candidiasis invasivas que tuvieron undesenlace fatal o favorable.Análisis de conglomerados jerárquicos bidimensionalesy del componente principal de los patronesde reactividad de anticuerpos séricos frente a 31proteínas inmunogénicas de Candida separaron conprecisión pacientes con estas micosis oportunistasen dos grupos con pronósticos diferentes (aquellosque sobrevivieron de los que fallecieron duranteel proceso infeccioso). Estos subgrupos fueron in-

132 y clínicas de la población de estudio. Análisis supervisadoscon validaciones cruzadas permitieronmejor combinación para predecir el pronóstico deen otro grupo de pacientes con estas micosis oportunistas.Este panel permitió determinar, en un estadioprecoz de infección, el riesgo de un pronóstico fatalen pacientes con estas infecciones invasivas, asílosde regresión logística indicaron que este panelproporcionaba un poder discriminatorio adicionalsobre factores de pronóstico conocidos para estasinfecciones invasivas.puede predecir el pronóstico en pacientes con candidiasisinvasivas mediante la evaluación de un númerorelativamente pequeño de biomarcadores. Simulticéntricos, éstos serán de enorme utilidad paradividualizadas.AgradecimientosLos autores expresan su más sincero agradeci-Dohme (MSD) en Genómica y Proteómica, a la RedEspañola para la Investigación en EnfermedadesInfecciosas (REIPI) del Ministerio de Salud y Consumoe Instituto de Salud Carlos III – FEDER (proyectoRD06/0008/1027), a la Comunidad de Madrid(proyecto S-SAL-0246/2006 DEREMICROBIA-NA-CM), y a la Comisión Interministerial de Cienciay Tecnología (proyecto BIO-2009-07654) por lasReferencias[1] Pfaller MA y Diekema DJ. Epidemiology ofinvasive candidiasis: a persistent public healthproblem. Clin Microbiol Rev 2007;20:133-63.[2] Pitarch A, Nombela C y Gil C, The Candidaimmunome as a mine for clinical biomarkerdevelopment for invasive candidiasis: Frombiomarker discovery to assay validation en PathogenicFungi: Insights in Molecular Biology(editores: San-Blas G. y Calderone R.A.), Cais-103-42.[3] Pitarch A, Jiménez A, Nombela C y Gil C. Serologicalproteome analysis to identify systemiccandidiasis patients in the intensive care unit:Analytical, diagnostic and prognostic validationof anti-Candida enolase antibodies on quantitativeclinical platforms. Proteomics Clin Appl2008;2:596-618.[4] Pitarch A, Jiménez A, Nombela C y Gil C. Decodingserological response to Candida cell wallimmunome into novel diagnostic, prognostic,and therapeutic candidates for systemic candidiasisby proteomic and bioinformatic analyses.Mol Cell Proteomics 2006;5:79-96.[5] Pitarch A, Abian J, Carrascal M, Sánchez M,cationof novel Candida albicans antigens fordiagnosis of systemic candidiasis in patientswith underlying hematological malignancies.Proteomics 2004;4:3084-106.

133mutantes del hongo Candida albicanstienenel dominio CFEM rico en cisteína y genes implicados en glicosilaciónRosario Blanes 1 , Ana M. Pérez 1 , Amelia Murgui 2 , Manuel Casanova 1 , Ángel Domínguez 3 , José P.Martínez 11Departamento de Microbiología y Ecologia, 2 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultadde Farmacia, Universitat de València/Estudi General (UVEG), Valencia, e 3 Instituto de Microbiología Bioquímica,Universidad de Salamanca, Salamanca (España)IntroducciónCandida albicans es un hongo patógeno oportunistacapaz de producir graves infecciones sistémicasen indivíduos inmunocomprometidos. Entre losC. albicanssu potencial patogénico, la capacidad de formarbiopelículas parece jugar un papel esencial. Lasbiopelículas son comunidades celulares altamenteorganizadas con una compleja estructura tridimensional,adheridas a un sustrato sólido (biológico ono biológico), en la que las células se encuentranembebidas en una matriz exocelular (ME) formadapor polisacáridos, proteínas y otros componentesminoritarios. La ME juega un papel crítico en elmantenimiento de la integridad estructural de lasbiopelículas y en la protección de las células frente afactores externos adversos como el sistema inmunitarioy/o el tratamiento con antimicrobianos [1]. Porlo tanto, un mejor conocimiento a nivel moleculary funcional de los constituyentes mayoritarios de laME podría ser esencial en el desarrollo de nuevasestrategias para el diagnóstico, prevención y controlde las candidiasis [2].La formación de biopelículas es un proceso biológicomuy complejo durante el cual las célulasfúngicas deben establecer múltiples interaccionescon el entorno ambiental. En este contexto, se hadescrito la presencia en C. albicans de una familiade proteínas que contienen un dominio formadopor 8 cisteínas, denominado CFEM (common inseveral fungal extracellular membrane proteins), yen transducción de señales, y como moléculas deadhesión en las interacciones huésped-parásito [3].Nuestro grupo dispone de una colección de cepasproteínas de la familia CFEM, en concreto los genesPGA10 (también designado como RBT51 y HPB1) yWAP1, que forman biopelículas muy frágiles y conpoca capacidad de adherencia al sustrato (Figura1) frente a lo observado en la cepa parental CAI4-URA3 (Fig. 1) [4]. Por otro lado, dado que los resultadosdescritos en la bibliografía [5] indican queel componente mayoritario presente en la ME de lasbiopelículas formadas por C. albicans son carbohidratos,también se consideró interesante determinarla capacidad de formar biopelículas de mutantes detose estudiaron mutantes para los genes MNN9 yALG5, que al igual que en el caso anterior formaronbiopelículas muy frágiles y con poca capacidad deadherencia al sustrato (Figura 1).Figura 1. Aspecto macroscópico de las biopelículas formadaspor las diferentes cepas de C. albicans analizadas.Material y métodosBiopelículas de 48 h formadas por las cepas deC. albicans analizadas fueron tratadas con etanol al60% durante 60 min. Los extractos etanólicos resul-valorándose su concentración proteica mediante elmétodo de Bradford [6]. Seguidamente se determinóel patrón polipeptídico asociado a cada extractomediante electroforesis bidimensional en geles de

134 poliacrilamida del 12% (en la segunda dimensión).análisis proteómico por espectrometría de masas(MALDI/MALDI-TOF).ReferenciasFigura 2. Análisis mediante electroforesis bidimensionalen geles de poliacrilamida de los extractos obtenidos portratamiento con etanol al 60% de las biopelículas formadaspor las diferentes cepas de C. albicans estudiadas y que semuestran en la Fig. 1.Resultados y ConclusionesEl análisis comparativo de los diferentes extrac- diferencias cualitativas y cuantitativas en los respec-peciesque se expresan diferencial y/o mayoritariamenteen la ME de la cepa parental (CAI4-URA3) ode las cepas mutantes para los genes PGA10, WAP1,MNN9 y ALG5. La identidad de estos polipéptidosestá siendo investigada en estos momentos mediante[1] Branda SS, Vik S, Friedman L y Kolter R. Bio- 2005;13:20-6.[2] Thomas DP, Viudes A, Monteagudo C, LazzellAL, Saville SP, López-Ribot JL. A proteomic-Candidaalbicans protein components present in a subunitvaccine that protects against disseminated candidiasis.Proteomics 2006;6:6033-41.[3] Kulkarni RD, Kelkar HS, Dean RA. An eightcysteine-containingCFEM domain unique toa group of fungal membrane proteins. TrendsBiochem Sci 2003;28:118-21.[4] Pérez A, Pedrós B, Murgui A, Casanova M,by Candida albicans mutants for genes codingfungal proteins exhibiting the eight-cysteinecontainingCFEM domain. FEMS Yeast Res2006;6:1074-84.[5] Baillie GS y Douglas LJ. Matrix polymers ofCandida-Chemother 2000;46:397-403.[6] Bradford, M.M. A rapid and sensitive methodfor the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein-dyebinding. Anal Biochem 1976;72:248-54.

135Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras lainteracción con Candida albicans: Problemas en la normalización de lasmuestrasJose Antonio Reales-Calderón 1 , Mª Luisa Hernaez 2 , Mª Dolores Gutiérrez 2 , Gloria Molero 1 ,Concha Gil 1,21Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. 2 UnidadAbstractEl estudio del citoesqueleto de macrófagos murinosen la interacción con Candida albicans resultade gran interés por los importantes cambios que ocurrenen una célula fagocítica tras entrar en contactocon un “cuerpo extraño”. La fagocitosis conllevaalteraciones en el citoesqueleto de actina, tubulinay miosina y de las proteínas que se asocian a ellas previos basados en la obtención de subproteomasde macrófagos utilizando una extracción secuencialy analizados mediante 2D-DIGE, nos ha permitidoobservar un gran número de proteínas en la fracciónenriquecida en citoesqueleto que aumentan suexpresión tras interaccionar con C. albicans. Sinteínashemos puesto a punto un método más especí- de proteínas de citoesqueleto.Utilizando esta estrategia nos hemos encontrado conque se produce un aumento considerable en la cantidadde proteína tras la interacción en comparaciónmuestras a analizar.Resultados PreviosEstudios previos de nuestro laboratorio de lasproteínas presentes en diferentes subproteomas obtenidospor extracción secuencial con el kit ProteoExtract®Subcellular Proteome Extraction Kitde Calbiochem y analizadas por DIGE, mostraronmuchas proteínas con expresión diferencial en lafracción enriquecida en citoesqueleto. Sin embar-encontrarse en muy baja concentración (Reales-Calderón J. A.; Martínez-Solano L.; Molero G.;Gil C.; resultados no publicados). Se analizó estafracción por cromatografía líquida, aumentando elen la muestra extraída con el kit había muy pocasproteínas propias de citoesqueleto.Obtención de las muestras de citoesqueletoUtilizando protocolos de extracción más espe-chométodo se basa en la utilización independiente dedos tampones con diferente concentración de sales:un tampón con alto contenido en sales (High-salt),mentosintermedios de citoesqueleto; y otro de bajocontenido en sales (Low-salt), con el que se extraenactinas y proteínas asociadas al citoesqueleto.El análisis preliminar de las muestras por cro-mientomuy importante en proteínas de citoesqueletocon respecto a la fracción extraída con el kit.Extracción de las muestras de iTRAQSe realizó la extracción de proteínas de citoesqueletocon estos dos tampones, partiendo de unnúmero constante de macrófagos, y realizamos 3aumento considerable (150%) de la cantidad de proteínade citoesqueleto en las muestras extraídas conel tampón High-salt procedentes de macrófagos quehabían interaccionado con C. albicans con respectoa los macrófagos control. Dichas diferencias en lacantidad de proteína no se producían en las muestrasextraídas con el tampón Low-salt, como se puedeobservar en la Figura 1.

136 Vamos a comenzar el análisis de las muestrasextraídas con el tampón Low-salt, el cual no planteaproblemas de concentración y después se procederáal análisis de las muestras extraídas con el tampónHigh-salt, donde hay un aumento del 150% de lasproteínas tras la interacción con la levadura.Figura 1. Geles monodimensionales teñidos con CoomasieColoidal de muestras enriquecidas en proteínas de citoesqueleto.Izquierda: Tampón High-salt; Derecha: TampónLow-Salt. Cnt: Macrófagos control; Int: Macrófagos trasla interacción con C. albicans.Para realizar el iTRAQ habría que igualar laconcentración de las muestras antes de marcar. Silo hiciéramos con las muestras extraídas con el tampónHigh Salt, estararíamos aumentando las concentracionesde las proteínas de la muestra de losmacrófagos control, alterando los resultados de lapresióndiferencial tan importante, hemos decididoigualar en el número de células de partida en todosantes de marcar con iTRAQ.AgradecimientosLos autores expresan su agradecimiento a laComisión Internacional de Ciencia y Tecnología cierasrecibidas.Referencias[1] Funchal C, de Almeida LM, Oliveira Loureiro S,Vivian L, de Lima Pelaez P, Dall Bello PessuttoF, et al. In vitro phosphorylation of cytoskeletalproteins from cerebral cortex of rats. Brain research2003;11:111-8.Javier Sotillo 1 , Ana Pérez García 1 , María Trelis 1 , Dolores Bernal 2 , Carla Muñoz-Antolí 1 , JoséGuillermo Esteban 1 , Rafael Toledo 1 , Antonio Marcilla 11Departamento de Biología Celular y Parasitología, Facultat de Farmàcia, Universitat de València.2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de ValènciaEl principal problema al que se enfrentan losinvestigadores que trabajan en proteómica parasitariaes la falta de genomas completos de los parásitosestudiados. Tan solo se encuentran disponibleslos de Schistosoma mansoni y Schistosoma japonicum,[1,2], además de numerosas entradas deDNA depositadas en bases de datos. El hecho de queexistan tantas entradas de Schistosoma en bases dede numerosas proteínas de otros trematodos comolos echinostomátidos [3]. Sin embargo, no siemprepueden usarse bases de datos de otros parásitos paraproteínas. Ha de tratarse de proteínas conservadasque mantengan una cierta homología entre diferentesgéneros de parásitos. Además, en el caso deSchistosomade sus transcriptomas no tienen función conocida oEn el caso de Echinostoma, no sólo no se tieneel transcriptoma entero, sino que existen muy pocas

137ESTs. Tan solo existe una biblioteca de ESTs disponiblepara Echinostoma parensei. Además, estabiblioteca puede considerarse muy pobre con 358secuencias depositadas si la comparamos con otrostrematodos como Fasciola hepatica o Schistosomahaematobium (con más de 15000 ESTs cada uno).E. caproni,sólo un pequeño porcentaje de las moléculas anali-Otra de las limitaciones con la que se encuentranlos investigadores que trabajan en proteómicaUna de las posibles soluciones que pueden ayu-cuerposheterólogos en diferentes técnicas como lade western-blot. Gracias a la mayor sensibilidad deesta técnica respecto de las tinciones de geles, seminimiza la limitación por falta de material en lase pueda usar con proteínas altamente conservadasy pueda ser una técnica muy cara en algunos casos(si se emplean diferentes anticuerpos comerciales),nostomátidoscomo la enolasa, la GST, la GAPDH,la aldolasa o la Hsp-70 [3,6].Sin embargo, sigue siendo de vital importanciael dedicar tiempo y esfuerzo en la secuenciaciónde nuevas EST o de genomas completos de pará-y que puedan ser de utilidad en la investigacióncon otros parásitos del mismo orden. Además de lasecuenciación genómica, también las herramientasbioinformáticas podrían contribuir al progreso enproteómica parasitaria.Figura 1. . Debido a la poca informaciónparasitaria es la escasez de material parasitario.Los estudios de proteínas se encuentran limitadospor la sensibilidad de la espectometría de masas, y,en última instancia, dependen en gran medida de lacantidad y calidad de material disponible. Debidoa la costosa obtención de materiales procedentesproteínas parasitarias. Para la mayoría de parásitos(incluido Echinostoma) es muy difícil su cultivo invitro, y se depende únicamente de su obtención ala mayoría tienen ciclos complejos donde intervienenvarios hospedadores intermediarios, ademáspueden disponer del ciclo completo en su laboratorio,habiéndose de conformar con las muestrasque les llegan de otros laboratorios, hospitales opacientes aislados.AgradecimientosyectoCGL-2005-0231/BOS del Ministerio deEducación y Ciencia (España) y FEDER (EU),los proyectos GV07/006, GVPRE/2008/049 yPROMETEO/2009/081 de la Conselleria d’Educacióde la Generalitat Valenciana. Este trabajo ha sidollevado a cabo mientras el primer autor (J.S.) erade Educación y Ciencia (Spain) y el segundo autorde las becas BC06-284 y BC08-098 de la Universitatde València.Referencias[1] Berriman M, Haas BJ, LoVerde PT, sonRA, Dillon GP et al. The genome of theblood fluke Schistosoma mansoni. Nature2009;460:352-8.[2] Schistosoma japonicum Genome Sequencingand Functional Analysis Consortium, ZhouY, Zheng H, Liu F, , , Gang L,Ren S. The Schistosoma japonicum genome revealsfeatures of host-parasite interplay. Nature2009;460:345-51.[3] Sotillo J, Valero L, Sánchez del Pino MM,Fried B, Esteban JG, Marcilla A, Toledo R.Echi-

138 nostoma caproni (Trematoda) recognized byMouse immunoglobulins M, A and G using animmunoproteomic approach. Parasite Immunol2008;30:271-79.[4] Verjovski-Almeida S, DeMarco R, Martins EAL,Guimaraes PEM, Ojopi EPB et al. Transcriptomeanalysis of the acoelomate human parasite Schistosomamansoni. Nat Genet 2003;35:148-57. Berriman M, Ivens A. “Oming” in on schistosomes:prospects and limitations for postgenomics.Trends Parasitol 2003;23:14-20.[6] Bernal D, Carpena I, Espert A, De la Rubia JE,of proteins in excretory/secretory extracts ofEchinostoma friedi (Trematoda) from chronic andacute infections. Proteomics 2006;9:2835-43.Las técnicas de proteómica aplicadas al estudio de las relaciones parásito/Javier González-Miguel 1 , Rodrigo Morchón-García 1 , Ana Oleaga 2 , Mar Siles-Lucas 2 , RicardoPérez-Sánchez 2 , Fernando Simón 11Laboratorio de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad de Salamanca. 2 Laboratorio deParasitología, IRNA Salamanca (CSIC)ResumenEn el presente trabajo se emplean técnicas deelectroforesis 2D, western blot y espectrometría demasas para analizar la existencia de una base molecularen las relaciones que establececon sus diferentes hospedadores. Se han iden-parasitarias que parecen jugar un papel fundamentalen dichas relaciones, en cada hospedador. es el agente causante de la rrollodel parásito, como las implicaciones clínicas,son diferentes en cada uno de sus 3 hospedadores.En el perro los vermes adultos de D. immitispueden vivir durante más de 7 años produciendoun desarrollo crónico. En el gato los adultos vivensolamente 2 años y las infecciones son siempreprevisibley habitualmente agudo. En el hombre,D. immitis no alcanza el estado adulto. En algunasocasiones, vermes preadultos se alojan en una ramade la arteria pulmonar, donde embolizan y causan unnódulo pulmonar benigno que puede confundirsecon cáncer en radiología. La comprensión de lasprecisa de datos sobre las moléculas del parásito yel papel que desempeñan, tanto en el estímulo delos mecanismos patológicos e inmunes, como delos mecanismos de supervivencia. Las técnicas deproteómica son una herramienta muy útil para iden-En el presente trabajo, el proteoma de D. immitisy los inmunomas obtenidos en cada hospedador,se relacionan los datos biológicos y clínicos de laenfermedad en cada uno de ellos.Se utilizó un extracto antigénico soluble de vermesadultos de D. immitis (DiSB). El proteomade D. immitis fue obtenido mediante electroforesis2D del extracto DiSB. Las proteínas se tiñeron connitrocelulosa para la realización del western blot 2D,en las que se incubaron con pools de sueros de losdiferentes hospedadores infectados y de controlessanos. Los spots que contenían proteínas inmunógenas,se escindieron manualmente de los geles 2Dy fueron enviadas al Servicio de Proteómica delespectrometría de masas [1].

139Tras la electroforesis 2D, el extracto DiSB resolviómás de 400 spots, la mayor parte con pIs entre5 y 8, y con un amplio intervalo de PMs (10-170kDa). Los western blot 2D revelaron, en los casos deanálisis con sueros de perros, gatos y humanos conspots de D.immitisdosy se correspondieron con 19, 32 y 23 proteínas,respectivamente. A continuación, se determinó la funciónmolecular y el proceso biológico en el que estánde datos Gen Ontology y Swiss-Prot/UniProt.La mayor parte de las proteínas inmunógenas(Figura 1), que son fundamentales en las relacioneschoque térmico (Hsps), enzimas del metabolismoenergético y enzimas redox. Como se observa en latabla 1, dentro de las Hsps y las enzimas redox, losgatos reconocen más proteínas que los humanos, yestos últimos a su vez, más que el hospedador canino.Por otra parte, desde el punto de vista del metabolismoenergético, la ruta glicolítica del parásito esampliamente inhibida por los tres hospedadores, noobstante, D. immitis es un fermentador homolácticoy la principal enzima de la glicolisis anaerobia, lalactato deshidrogenasa, es tan solo bloqueada porgatos y humanos.Figura 1. Procesos biológicos en los que están implicadaslas proteínas inmunógenas del extracto DiSB reconocidaspor perros, gatos y humanos. Datos expresados como porcentajedel total de proteínas reconocidas por cada hospedador.Los grupos funcionales discutidos en el presentetrabajo se hallan recuadrados.Estos resultados sugieren que las diferenciasbiológicas y clínicas existentes entre los diferentesTabla 1. Proteínas inmunógenas del extracto DiSB reconocidas por perros, gatos y humanos en los grupos funcionales deproteínas de choque térmico, enzimas del metabolismo energético y enzimas redox.Función Proteína Perros Gatos HumanosProteínas dechoque térmicoEnzimas delmetabolismo energéticoEnzimas redoxHsp 70 X X XsHsp X XProteína OV25-1 X XsHsp p27XEnolasa X X XFructosa-bisfosfato aldolasa X X XGAPDH X X XTriosa-fosfato isomerasa X X XFosfoglicerato mutasa X X XFosfoglicerato quinasa X XGlucosa-fosfato isomerasa X XLactato deshidrogenasa X XFumarasa X XAldo/queto oxidorreductasa X X XTiorredoxina peroxidasaXPrecursor de Glutatión peroxidasaXGlutatión transferasaXHipotética oxidorreductasa FAD dep. X XPrecursor de transglutaminasa X XDisulfuro isomerasaX

140 hospedadores de D. immitis tienen una base molecular.El acortamiento del ciclo vital de los vermesde D. immitis en el gato y el humano, con respectoa lo que ocurre en el perro, podría relacionarse conuna mayor capacidad para bloquear con anticuerpos,algunas proteínas fundamentales implicadas en losmecanismos de generación de energía y de evasiónde la respuesta inmune por parte del parásito.Referencias[1] Oleaga A, Pérez-Sánchez R, Pagés E, Marcos-reactiveproteins from the dog heartworm (Diro-sera from dogs with patent or occult infections.Mol Biochem Parasitol 2009;166:134-141.Neospora caninum implicadas en procesos deinvasión y virulenciaVirginia Marugán-Hernández 1 , Javier Regidor-Cerrillo 1 , Gema Álvarez-García 1 , Fiona Tomley 2 ,Adriana Aguado-Martínez 1 , Mercedes Gómez-Bautista 1 , Luís Miguel Ortega-Mora 11SALUVET. Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense deMadrid. 2 Division of Microbiology. Institute for Animal Health. Reino UnidoLa neosporosis bovina es una de las principalescausas de fallo reproductivo en el ganado bovino anivel mundial [1]. Neospora caninum, agente etiológicode esta enfermedad, es un protozoo intracelularobligado perteneciente al phylum Apicomplexa y re-Toxoplasma gondii.entre aislados de N. caninum desde el punto de vistagenético [2] y fenotípico (patogenicidad in vivo,tasas de crecimiento e invasión in vitro) (Regidor-Cerrillo y col., manuscrito enviado).Por otra parte, en la invasión de la célula hospedadoraestán implicadas tres tipos de organelassecretoras, micronemas, roptrias y gránulos densos.En concreto, las roptrias han sido descritas comofactores de virulencia en T. gondii [3]. Se ha iden-T. gondii mientras que en N. caninum únicamenteNcROP2 ha sido caracterizada [4].Por todo ello, el objetivo del presente estudio fuepresiónproteica entre distintos aislados de N. caninumpara dilucidar los mecanismos implicados en lavirulencia del parásito. Por otro lado, se procedió a lalacionadascon los procesos de invasión y virulencia.Los extractos proteicos empleados fueron obtenidosa partir de taquizoítos -fase de replicaciónrápida- mantenidos en cultivos celulares de célulascolumnas desaladoras PD-10.OBJETIVO 1: La técnica DIGE fue empleadaen el estudio comparativo de expresión proteicadiferencial de aislados que presentaron diferenciasde patogenicidad: dos aislados virulentos (Nc-Livy Nc-Spain7) y uno naturalmente atenuado (Nc-Spain1H). Se realizaron seis réplicas de geles y quefueron analizadas con el software DeCyder v6.0.Las manchas proteicas con una abundancia relativamayor o menor que 1,3 con una p < 0,05 (t de Student)fueron consideradas diferencialmente expresadas.Algunas de estas manchas fueron escindidas delgel para su posterior análisis por MALDI-TOF.nasde roptrias se obtuvieron fracciones enriquecidasen organelas secretoras a partir de los taquizoítos deNc-Liv mediante fraccionamiento subcelular. Sobrelas fracciones enriquecidas en roptrias se llevó a cabode peso molecular de 37 a 250 kDa, mediante nanocromatografíalíquida acoplada a espectrometría demasas en trampa iónica LQT linear.

141En ambos estudios proteómicos se empleó elalgoritmo MASCOT frente a las bases de datos delNCBI nr y ToxoDB v5.1 para llevar a cabo las iden-Resultados y conclusionesOBJETIVO 1: Un total de 124 manchas proteicasmostraron una expresión diferencial. Nueveal comparar Nc-Liv y Nc-Spain1H, 50 al hacerlocon Nc-Liv y Nc-Spain 7 y 65 entre Nc-Spain7 yNc-Spain1H. A partir de ellas se consiguió la iden-teínasque se detallan en la Tabla 1. Entre ellas, seobservaron variaciones en algunas isoformas de lasproteínas actina y miosina dependientes del aislado,implicadas ambas en la motilidad del parásitoTabla 1. Proteínas de roptrias de N. caninum.y en la invasión. Además, se observó una mayorabundancia de la proteína de membrana NcPDI, yde aquellas de organelas como NcMIC1, NcROP8y NcNTPasa en aquellos aislados más virulentos,todas ellas relacionadas con los mecanismos de invasióny proliferación.OBJETIVO 2: A partir de las fracciones subcelularesenriquecidas en roptrias se obtuvo un amplionuevas proteínas, denominadas “ROP”, presentaronhomólogos en T. gondii, si bien no siempre estabansituadas en el mismo locus. Por otra parte, la apariciónde una serie de kinasas y fosfatasas indicala existencia de posibles factores de virulencia, y existencia de la “unión móvil” durante el procesode invasión, tal como ocurre en T. gondii.ProteínapI/MrTeóricoIdentidadNºpéptidosSecuenciaNTPase 5,56/69,6 34 21 NCLIV 145870aspartyl-tRNA synthetase 5,95/62,8 48 13 NCLIV 082700AbundanciaNcSp7>NcSp1H*NcSp7>NcSp1HFunciónSíntesis deproteínasmicroneme-associatedprotein (NcMIC1)4,79/50,1 46 18 gi 17226315NcSp7>NcSp1HInvasiónelongation factor 2 5,93/94 38 29 NCLIV 081030NcSp7>NcSp1HSíntesis deproteínasglucose-6-phosphatedehydrogenase8,59/112,6 21 17 NCLIV 010690NcSp7>NcSp1HMetabolismoROP8 6,29/43,2 66 23 NCLIV 000700myosin light chain 4,55/24,9 46 18 NCLIV 000030NcSp7>NcSp1HNcSp7NcSp1HPlegamiento deproteínasactin 5,05/42,6 72 24 NCLIV 020800NcSp7

142 proteínas potencialmente implicadas en procesos deinvasión y virulencia. Estas proteínas podrían cons-tituir un nuevo arsenal de dianas terapéuticas e inmu-N. caninum.Tabla 2. Proteína de N. caninumHomólogo en T. gondiiMismolocusIdentidadsurface protein rhoptry rhoptry 1 SI 65.9 28 38ROP8 ROP8 NO 348 43 64rhoptry antigen rhoptry protein 5 SI 213 53 67surface protein rhoptry rhoptry protein 5 SI 282 51 63rhoptry antigen rhoptry 1 NO 70.5 29 38Rhoptry neck protein 4 rhoptry neck protein 4 SI 902 65 78conserved hypothetical proteinrhoptry neck protein 2 SI 2209 72 81hypothetical protein rhoptry neck protein 3 SI 3262 78 88hypothetical protein rhoptry neck protein 8 SI 4298 82 91hypothetical protein protein kinase SI 758 80 89acid phosphatase acid phosphatase SI 741 88 92mitogen-activated proteinkinase-relatedSubtilisin-like serine proteasesubtilase family serine protease,serine/threonine proteinphosphatase,Protein kinase domain proteinsubtilisin-like proteinTgSUB1NO 99 27 46SI 373 62 73subtilisin SI 1123 57 67serine/threonine proteinphosphataseSI 2265 69 82Subtilisin-like serine proteasesubtilisin-like serine protease SI 1193 100 100AgradecimientosAgradecemos a Rick Oakes y Vanesa Navarrosu excelente apoyo técnico. El trabajo proteómicoha sido realizado por el Servicio de ProteómicaUCM-PCM, miembro de la red ProteoRed. VMHAGL 2007-60132/GAN.Referencias[1] Dubey, J. P., Schares, G., Ortega-Mora, L. M.,Epidemiology and control of neosporosis andNeospora caninum. Clin. Microbiol. Rev. 2007;20: 323-367.[2] Regidor-Cerrillo, J., Pedraza-Diaz, S., Gomez-Bautista, M., Ortega-Mora, L. M., Multilocusmicrosatellite analysis reveals extensive geneticdiversity in Neospora caninum. J. Parasitol.2006; 92:517-524.[3] Saeij, J. P., Boyle, J. P., Coller, S., Taylor, S. etal., Polymorphic secreted kinases are key virulencefactors in toxoplasmosis. Science 2006;314:1780-1783.[4] Debache, K., Guionaud, C., Alaeddine, F., Mevissen,M., Hemphill, A., Vaccination of micewith recombinant NcROP2 antigen reducesmortality and cerebral infection in mice infectedwith Neospora caninum tachyzoites. Int. J.Parasitol. 2008; 38: 1455-1463.

143 minoritarios de la saliva de Ornithodoros moubataRicardo Pérez-Sánchez, Ana Oleaga, Mar Siles-Lucas, Verónica Díaz-Martín, Eduardo de la TorreEscudero, Ana Hernández-González, Raúl Manzano-RománLaboratorio de Parasitología Animal. IRNASA. CSIC. SalamancaResumenEl extracto salival (SGE) de la garrapata Ornithodorosmoubata contiene una proteína antigénica(Om44) de interés para el desarrollo de una vacunaanti-O. moubata. Om44 es minoritaria en el SGE,tamientodel SGE con un ecualizador de proteinaspermite concentrar a Om44 hasta niveles perfectamentedetectables en geles 2D teñidos con plata errespondiente,aunque para ello haya que recurrir ala secuenciación de novo por estar O. moubata muypoco secuenciada.Ornithodoros moubataafricano que se refugia en el interior de las madriguerasde los animales salvajes, de las pocilgasdomésticas e incluso de las viviendas humanas.vestigación de vacunas antigarrapata como métodoalternativo de control.En trabajos anteriores nuestro equipo inició eldesarrollo de una vacuna anti-O. moubata inmunizandocerdos con un extracto proteico de glándulassalivales (SGE) de este argásido. El SGE indujo unarespuesta inmunitaria capaz de reducir hasta en un70% las tasas de alimentación y reproducción del argásido.El antígeno inductor de esta respuesta es unaproteína de 44 kDa (Om44) que se une a la moléculaP-selectina del hospedador, lo que previsiblementebloquea las respuestas hemostáticas mediadas porla P-selectina y permite a la garrapata completar laingesta de sangre [1].Consecuentemente, nuestro siguiente objetivo para su clonación y obtención en forma recombi-Figura 1. SGE sin ecualizar separado en geles 2D (12% acrilamida, pH 3-10) teñidos con plata (A) y Sypro rubi (B). Westernblot con suero de cerdo vacunado con SGE (C).Sus principales hospedadores son los facoceros, loscerdos y las personas, a los que puede transmitirgraves enfermedades como la Peste porcina africanay la Fiebre recurrente humana. La eliminaciónde esta garrapata del medio sinantrópico puedefacilitar el control de las citadas enfermedades.Los inconvenientes del uso de acaricidas en lalucha contra las garrapatas han favorecido la in-estrategia proteómica clásica: separación del SGEen geles 2D, localización del spot correspondientea Om44 y análisis del mismo por espectrometríade masas. Esta estrategia se enfrentó con dos problemas.El primero es que Om44 es minoritaria enel SGE y, aunque su spot sí se detecta en westernblot 2D usando sueros de cerdos vacunados, no es

144 visible en geles 2D teñidos con plata o con SyproRubi (Figura 1). Para solucionar este problema, elSGE se trató con un equalizador de proteínas [2]utilizando el kit ProteoMiner Protein Enrichment(Bio-Rad). El SGE ecualizado se resolvió en geles2D y se analizó en western blot 2D, lo que permitiólocalizar y cortar el spot correspondiente a la Om44(44 kDa, pI 6,8), claramente visible ahora en geles2D teñidos con plata (Figura 2).Solucionado el primer problema, el segundo alque nos enfrentamos fue que O. moubata está aunmuy poco secuenciado, como ocurre en general conpor comparación de huellas peptídicas y espectrosde fragmentación, obligándonos a recurrir a la secuenciaciónde novo de péptidos trípsicos de Om44.El inconveniente de la secuenciación de novo es quees caro y sus resultados no siempre garantizan lapeptídicas de novo pueden utilizarse como base parael diseño de oligonucleótidos con los cuales abordarOm44 sin conocer a priori la identidad de la proteína.Los resultados de la secuenciación de novode los péptidos procedentes del spot de la Om44proteínas, lo cual plantea un nuevo problema: ¿cuálde ellas es la proteína Om44?. Teniendo en cuentaparámetros proteómicos, como el score, pI y pesomolecular, y biológicos, como su localización citoplasmática,pensamos que enolasa o actina puedenquizá sean contaminaciones, aunque no podemosdescartar que algunas de ellas tengan un homólogoen O. moubata con un peso molecular y pI compatiblescon los del spot analizado.Figura 2. SGE equalizado separado en geles 2D (12%acrilamida, pH 5-8) teñidos con plata (A). Western blot consuero de cerdo vacunado con SGE (B).Tabla 1. Numerode accesoProteínaPéptidoScoreP06733 Enolasa. Homo sapiens239VVIGMDVAASEFFR 252 175,5Actina. Ornithodoros moubatapI / MWteóricos6.73 /4702420AGFAGDDAPR 2921794,6 5.29 /LCYVALDFEQE-41793MATAASSSSLEK 239FunciónGlucólisis,FibrinolisisEstructuralP257051condrialprecursor. H. sapiens520EIVTNFLAGFEA 531 80,89.16 /59750Síntesis de ATPP09867Heterogeneous nuclear ribonucleoproteinA1. Bos taurus56GFGFVTYATVEEVDAAMNAR 75 55,19.27 /34196Procesamiento ytransporte de RNAB7Q349P15252Elongation factor-1. Ixodesscapularis1Elongation factorHevea brasiliensis111NMITGTSQADCAVLIVAAGT-GEFEAGISK 129 52,643SGPLQPGVDIIEGPVK 58 50,4P81605 1Dermcidin. Homo sapiens43ENAGEDPGLAR 53 50,2P0ACT01HTH-type transcriptional regulatoracrR. Escherichia coli162RAAIIMR 168 42,8P402271Chaperone containingT-complex protein 1 subunit z.Homo sapiens433AQLGVQAFADALLIIPK 449 42,09.13 /507535.04 /147216.09 /112835.66 /247666.24 /58024Biosíntesis de proteínasAlérgenoAntimicrobiano.Regulación de latrancripciónChaperonaPlegamiento deproteínasP24789Vimentin-1/2Xenopus laevis99AEMIELNDR 107 40,95.16 /52844Estructural.Filamentos citoesqueletoQ98QV21Translation initiation factorIF-3. Mycoplasma pulmonis141ELGIDTLNR 149 40,39.65 /23283Biosíntesis de proteínas1Posibles contaminantes

145AgradecimientosLeón (CSI07A08).Referencias[1] García-Varas S, Manzano-Román R, Fernádez-Soto F, Encinas-Grandes A, Oleaga A y Pérez- of a P-selectin binding molecule from thesalivary glands of Ornithodoros moubata thatinduces protective anti-tick immune responsesin pigs. Int J Parasitol 2009, doi:10.1016/j.ijpara.2009.08.011[2] Righetti PG, Bochetti E, Lomas L y Citterio A.Protein Equalizer Technology: The quest for a democraticproteome. Proteomics 2006;6:3980-92[3] Francischetti IMB, Sá-Nunes A, Mans BJ, Santos,IM y Ribeiro JMC. The role of saliva in tickfeeding. Front Biosci 2009;14:2051-88[4] Oleaga A, Escudero-Población A, Camafeita Ey Pérez-Sánchez R. A proteomic approach toargasid ticks Ornithodoros moubata and Ornithodoroserraticus. Insect Biochem Mol Biol2007;37:1149-59.el protozoo parásito Trypanosoma cruziMucinassociated Surface ProteinsLuis Miguel De Pablos ,Gloria González, Víctor Seco Hidalgo, Isabel María Díaz Lozano,Antonio OsunaInstituto Biotecnología. Universidad de Granada. Grupo de Parasitología Bioquímica y MolecularResumenEl agente causal de la tripanosomiasis o enfermedadde Chagas es el protozoo parásito Trypanosomacruzi. Dicho parásito es un organismo intracelularobligado que utiliza una enorme cantidad detipos celulares para multiplicarse. Durante el procesode entrada e invasión celular, T. cruzi secreta unaserie de proteínas encargadas del reconocimientode la célula hospedadora y la posterior entrada delprotozoo en ella.de dos proteínas pertenecientes a la familia MASP(Mucin Associated Surface Protein) secretadas tras doshoras de interacción célula-parásito. Las secuencias deestas proteínas poseen las características básicas de lafamilia MASP con dos regiones hidrofóbicas en losextremos N- y C- terminal y una región central en elcual existen sitios para la N-glicosilación. Tras mapearepítopos de tipo MHC-I en las secuencias encontramosvarias regiones en las proteínas que podrían compor-tarse potencialmente como posibles lugares que estimularanla generación de una respuesta inmune celularfrente a T. cruzi. Como conclusión, consideramos quecialesantígenos inmunógenos y posibles herramientasdiagnósticas para evaluar una respuesta humoral frentea éstas durante el transcurso de la enfermedad.Trypanosoma cruziperteneciente al Orden Kinetoplástida y agente etiológicode la tripanosomiasis americana o enfermedadde Chagas, estimándose en unos 16-18 milloneslas personas infectadas principalmente en Centro ySudamérica [1, 2]. La familia MASP (Mucin AssociatedSurface Protein) descrita por primera vez trasel desarrollo y posterior publicación de los datos delgenoma de T. cruzi, constituye una extensa familiagénica que representa el 6% del genoma del parásitoaproximadamente [3]. Las MASPs, pueden mos-las de las mucinas, describiéndose como proteínasN-glicosiladas [4]. Las aproximaciones proteómi-

146 cas realizadas, muestran como la expresión de lasMASPs es pequeña en comparación con el númerode genes encontrados. Si bien no se conocen losmecanismos que han permitido la expansión de lafamilia de las MASPs en T. cruzi, la presión inmunepudiera constituir la fuerza inductora que haprovocado la amplia presencia de genes masp en elgenoma del trypanosomatidos.Se estudió el medio de interacción célula-parásito,incubándose durante dos horas la fase trypomastigotametacíclica de T. cruzi con células Verocionarondiferentes bandas en geles de SDS-PAGEmediante espectrometría de masas (MALDI-TOFy MALDI-TOF-TOF) y análisis mediante trampaiónica de los péptidos fragmentados.los motores de búsqueda Mascot y proteome discover,estas se analizaron en busca de motivos estructuralesmediante el paquete de software bioinformáticode ExPASy (http://www.expasy.ch/tools/).Además se realizó un mapeo de epítopos para éstas,utilizando los programas BIMAS y SYFPEITHI. nuevas proteínas pertenecientes a la familia MASPde T. cruzi. Estas proteínas poseen pesos molecularesde 52 kDa y 5 kDa, siendo secretadas durante elproceso de invasión celular por parte del parásito.Tras la búsqueda de motivos estructurales encontramosque existían dos regiones N- y C- terminal altamentehidrofóbicas, un lugar para N-Glicosilacióny en el caso de la proteína de 52 kDa un lugar deunión a ATP/GTP (P-loop).Estas proteínas poseen potenciales epítopos declase MHC-I principalmente en los extremos delas secuencias coincidiendo con las regiones máshidrofóbicas de éstas. Los epítopos se sitúan en lasposiciones conservadas para esta familia, generándoseun panel de péptidos potencialmente positivospara ser expuestos por moléculas MHC-I.La obtención en el medio de interacción célulaparásitode dos miembros pertenecientes a la familiaMASP indica que proteínas pertenecientes a esta familiason capaces de secretarse y de poseer una posibleimplicación en la entrada del parásito en la célulahospedadora. Además los epítopo encontrados demuestracomo estas secuencias están potencialmenteimplicadas en la generación de una respuesta inmunecelular frente al parásito. Por tanto, la familia MASPserá en un futuro objeto de nuestros estudios tantocomo posible diana terapéutica como herramientasdiagnósticas debido a su clara exposición al sistemainmunitario durante una infección por T. cruzi.Referencias disease 2002; 905: 1-109.[2] Tarleton RL, Reithinger R, Urbina JA, KitronU. y Gürtler RE. The Challenges of ChagasDisease-Grim Outlook or Glimmer of Hope?PloS Med 2007; 4: 1852-1857.[3] El-Sayed NM, Myler PJ, Bartholomeu DC,Nilsson D, Aggarwal G, Tran AN, Ghedin E E,nomesequence of Trypanosoma cruzi, etiologicagent of Chagas disease. Science 2005; 309:409–415.[4] Bartholomeu, DC, Cerqueira GC, Lea AA, daRo-SMR y El-Sayed NM. Genomic organizationsurface protein (masp) family of the humanpathogen Trypanosoma cruzi. Nucleic AcidsRes 2009; 1–11.

147Leishmania parasitesM. Auxiliadora Dea-Ayuela 1 , Riccardo Concu 2 , Lazaro G. Perez-Montoto 3 , Eugenio Uriarte 3 ,Francisco Bolás-Fernández 4 , Florencia Ubeira 2 , Humberto González-Díaz 21Faculty of Experimental and Health Sciences, Department of Chemistry, Biochemistry and MolecularBiology, Cardenal Herrera University, 46113, Moncada, Valencia, Spain. 2 Faculty of Pharmacy, Departmentof Microbiology and Parasitology, 3 Faculty of Pharmacy, Department of Organic Chemistry Universityof Santiago de Compostela, 15782 Santiago de Compostela, Spain. 4 Faculty of Pharmacy, Department ofParasitology, Complutense University, 28040, Madrid, SpainAbstractThe number of protein and peptide structuresparasites, their hosts, and other organisms, releasedto Protein Data Bank (PDB) and Gen Bank withoutfunctional annotation has increased. UsingProteomics tools such as MASCOT, we can performfunction annotation of these proteins if we haveMass Spectra (MS) outcomes and there are in databasesknown template proteins with known functionand high similarity scores if not these methods maynot succeed. Consequently, there is a high demandfor Quantitative Structure-Activity Relationships(QSAR) equations to predict these functions fromand validated a new 3D-QSAR equation based on aby their possible mechanism of action according[1] using aLeishmaniamethodology proposed here is essentially new, andenables prediction of all EC classes with a singleequation without the need for an equation for eachclass or nonlinear models with multiple outputs. Inaddition, the model may be used to predict whetherone peptide presents a positive or negative contributionof the activity of the same EC class.Materials and methodsStationary promastigotes proteins of the Leishmaniainfantum strain LEM75 were analyzed bytwo-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis(2D-PAGE) employing an immobilized linear pH4-7 gradient for isoelectric focusing. Proteins werevisualized by silver stain and spots of interest wereexcised from preparative 2D gels, and then analyzedby MALDI-TOF and/or MALDI-TOF/TOF massspectrometry. [2]In order to predict protein function we usedvalues were used as inputs to construct the QSARmodel. The average general potentials depend on theabsolute probabilities pk(j) and the total potentialwith which the amino acid j-th interact with the restof amino acids. All calculations were carried outwith our in-house software MARCH-INSIDE [3].ResultsThe model predicts EC for 106 out of 151(70.2%) oxidoreductases, 178/178 (100%) transferases,223/223 (100%) hydrolases, 64/85 (75.3%) lyases,74/74 (100%) isomerases and 100/100 (100%)ligases, as well as 745/811 (91.9%) non-enzymes.tideMass Fingerprints (PMFs) of new protein sequencesof parasites proteins when traditional alignmentsearch procedures fail. First, we obtained the2D-Electrophoresis (2DE) localization of the spotfor a new protein from Leishmania infantumalso give MALDI TOF MS characterization andresults of MS MASCOT search and detected that alltemplates with possible enzyme or any other actionhave low similarity score and/or unknown function.Then, we decided to carry out prediction with ourenzyme action of 29 peptides found in the PMF ofthe new query protein. As the QSAR bases on 3Dinformation, we had to predict previously possible3D structures of these peptides using Molecular Dynamic(MD) methods. Some of the more interestingpeptides were predicted with positive contribution

148 ConclusionThis combined strategy may be used to identifyand predict peptides of proteins from parasite and/or their hosts when classic proteomics tools fails;which may be of interest in drug or vaccine develo-References[1] C.o.B. Nomenclature, Enzyme Nomenclature.[2] Dea-Ayuela MA, Rama-Iñiguez S, Bolás-FernándezF. Proteomic analysis of antigens fromLeishmania infantum promastigotes. Proteomics2006;6:4187-94.[3] González-Díaz H, González-Díaz Y, Santana L,Ubeira FM, Uriarte E. Proteomics, networks andconnectivity indices. Proteomics 2008;8:750-78.

1496. PROTEÓMICA VEGETAL Y ANIMALCoordinadores: Luis Valledor y Federico ValverdeUbiquitinación de proteínas nucleares en la señalización del ayuno de fosfatoen plantasMarina Trigueros, Mónica Rojas-Triana, Maria Luisa Irigoyen, Javier Paz-Ares, Vicente RubioDepartamento de Genética Molecular de Plantas. Centro Nacional de Biotecnología-CSIC. Campus de laUAM. Cantoblanco. Madridpostraduccional implicado en prácticamente todoslos aspectos de la biología celular de los eucariotas[1]. La ubiquitinación, mediada por enzimas E3una señal de marcaje de proteínas para su posteriordegradación vía el proteosoma. Sin embargo,la Ub también está implicada en la regulación dela función de proteínas a través de cambios en sucapacidad para interaccionar con otras proteínas osustratos, control de su localización subcelular o decionespostraduccionales [1].En plantas, la Ub está asociada a diversos procesosde señalización y respuesta a estrés, incluyendoel ayuno de fosfato [2]. Este último es un nutrienteesencial para el desarrollo de cualquier organismo.La implicación de la Ub en el control de la homeostasisde Pi se basa en parte en la caracterizacióndel gen PHO2 de Arabidopsis. Este gen controla ladistribución de Pi entre la raíz y la parte aérea de laplanta [3]. La proteína PHO2 es similar a enzimascon actividad E2/E3 Ub ligasa, aunque su funciónbioquímica y sus posibles proteínas diana se desco-5 E3 Ub ligasas nucleares cuya expresión dependedel aporte de Pi al medio y que afectan a la expresiónde genes de respuesta al ayuno de Pi. Estosresultados sugieren que la señalización del ayuno dePi en plantas implica el control de la acumulaciónde proteínas reguladoras mediado por la ruta de ubiquitinacióny degradación por el proteosoma (UPS).papel regulador de la ruta UPS en la regulación dela respuesta a dicho estrés; una dirigida, analizandoel efecto que tiene la sobreexpresión de las 5bajo distintos aportes de Pi. La otra, mas genérica, acumulación dependa de la concentración de Pi enel medio y de la presencia/ausencia de inhibidoresdel proteosoma. Durante el desarrollo de este congresose mostrarán nuestros avances más recientessiguiendo ambas aproximaciones.Referencias[1] Ulrich H. Mutual interactions between theSUMO and ubiquitin systems: a plea of nocontest. Trends Cell Biol. 2005;15: 525-532.[2] Downes B. And Vierstra R.D. Post-translationalregulation in plants employing a diverse set ofpolypeptide tags. Biochem. Soc. Trans. 2005;33:393-399.PHO2, MicroRNA399, and PHR1 Define aPhosphate-Signaling Pathway in Plants. PlantPhysiol. 2006;141: 988-999.

150 Proteome profile analysis of Medicago truncatula leaves in response toUromyces striatusMª Ángeles Castillejo 1 , Jesús V. Jorrín 2 , Diego Rubiales 11Departamento de Agronomía y Mejora, IAS (CSIC), Córdoba.2Departamento de Bioquímica y BiologíaMolecular, ETSIAM, Universidad de CórdobaSummaryThe two-dimensional electrophoresis (2-DE)notypesdisplaying different phenotypes in responseto rust (Uromyces striatus) inoculation has been studied.Quantitative as well as qualitative differenceswere observed between non-inoculated and inoculatedplants. Differential spots were analyzed byMALDI-TOF/TOF mass spectrometry and a total ofnalcategory of metabolism with a high proportionbeing photosynthetic and stress-related proteins.IntroductionAlfalfa rust (U. striatus) is an important diseaseof worldwide distribution, being particularly damagingin alfalfa (Medicago sativa) grown for seedM. truncatula as amore tractable biological system to study the proteomicresponse to rust. Genotypes were selectedbased on its differential responses to U. striatus infection[1, 2]: A17, susceptible; Grc.098 showing posthaustorialresistance; F11.008 and Paraggio showingpre-haustorial resistance. Leaf proteins from non-inoculatedand rust inoculated M. truncatula plants wereextracted and resolved by 2-DE, and the differentialspots were analyzed by mass spectrometry.MethodologyM. truncatula seedlings were inoculated whenthe third trifoliate leaf was completely expanded.Leaves were collected 48 hours post inoculation(hpi) for microscopic observations [1]. For proteomicsanalyses, inoculated and non-inoculated plantswere sampled 24 and 48 hpi. Proteins from leaftissue were TCA/acetone extracted [3] and resolvedby 2-DE. Gels were silver and SyproRuby stainedand the images were analysed with the PD-Questsoftware (BioRad). Those spots that showed statis-were considered for further analysis. Differentialspots were excised from gels and digested with tripsin.Peptide fragments from digested proteins werethen subjected to mass spectrometry. A PMF (pepti-non-redundant MSDB database using the MAS-COTsearch engine.Results and DiscussionDifferences in rust responses among genotypeswere evident 48 hpi (table 1). Of the appressoriasuccessfully formed on a stoma, less were able topenetrate the stoma and form a substomatal vesicle(SV) on F11.008 and Paraggio than on the other genotypes.Differences were also found in the rate ofin F11.008 and Paraggio genotypes. However unitsassociated with host cell necrosis was markedlyhigher in Grc.098. Of a total of 37 differential spotan increase of stress-related proteins in pre-hausto-longingto other functional categories (glycine-richRNA binding protein and malate dehydrogenase)which have been involved in transcriptional regulationby different effectors related to plant defenseproteins was different in relation to susceptibility/resistance of the genotypes studied at early stage ofthe infection and the clear increase of stress-relatedproteins only in the genotypes with pre-haustorialresistance makes us suspect that these proteins maybe involved in the stop of parasite development beforeforming haustoria.

151Table 2. aMolecularfunctionMetabolismNucleic acidbinding/TranscriptionDefense andstress-relatedMedicago truncatula genotypesAI ParaggioRuBisCO smallRuBisCO largeFerredoxin-NADPGlycine-rich RNARuBisCO smallRuBisCO activaseElongation factorTu, chloroplastRuBisCO small subunit (4)Glycine-rich RNA bindingAscorbate peroxidase Glutathione peroxidise[new]aintensity of protein.The authors thanks to European Union GrainLegumes Integrated Project, Spanish projectAGL2008-01239/AGR and Andalusian project P07-ReferencesFigure 1. 2DE image gel of M. truncatula leaves proteome.dase),EF-Tu (elongation factor Tu), FR (ferredoxin-NADPreductase), GP (glutathione peroxidise), GRP (glycine-richRNA binding protein), GST (glutathione transferase), MA(malate dehydrogenase), RUB (RubisCo), RUBa (RubisCoactivasa).Table 1. Microscopical analysis of the early development ofU. striatus on M. truncatula xGenotypesAppr.penetratedforming SV(%)Number ofhaustoria/colonyColonieswhit necrosisA17 75.0 a 1.8 a 0 bGrc.098 76.1 a 1.5 a 51 aF11.008 42.3 b 1.0 b 0 bParaggio 31.8 b 0.03 c 0 bxValues with letters in common in each column are not sig-[1] Rubiales D and Moral A. Mechanisms of resistanceagainst alfalfa rust (Uromyces striatus) inMedicago truncatula. Eur J Plant Pathol 2004;110:239-243.[2] Kemen E, Hahn M, Mendgen K and Struck C.Different resistance mechanisms of Medicagotruncatula ecotypes against the rust fungusUromyces striatus. Phytopathology 2005;95:153-157.[3] Damerval C, de Vienne D, Zivy M and ThiellementH. Technical improvements in twodimensionalelectrophoresis increase the levelof genetic variation detected in wheat-seedlingproteins. Electrophoresis 1986;7:52-54.[4] Maurino VG, Saigo M, Andreo CS and DrincovichMF. Non-photosynthetic ‘malic enzyme’from maize: a constituvely expressed enzymethat responds to plant defence inducers. PlantMol Biol 2001; 45:409–420.[5] Amey RC, Schleicher T, Slinn J, Lewis M, MacdonaldH, et al. Proteomic analysis of a compatibleinteraction between Pisum sativum (pea)and the downy mildew pathogen Peronosporaviciae. Eur J Plant Pathol 2008; 122:41-55.

152 Análisis proteómico del desarrollo sexual mediado por anteridiógeno en elBlechnum spicantVirginia Menéndez, Luis Valledor, Angeles Revilla, Helena FernándezArea de Fisiología Vegetal, Departamento B.O.S. Facultad de Biología. Universidad de OviedoLos helechos actuales son un legado genéticode gran valor. Se trata de plantas vasculares con unaorganización primitiva cuyo ciclo vital consta deuna fase gametofítica (haploide) y otra esporofítica(diploide), que se hallan separadas en el espacio y enfológicamentemuy sencilla y también muy vulnerablea factores ambientales. La reproducción sexualen este conjunto de especies implica la formación deórganos sexuales femeninos (arquegonios) y masculinos(anteridios) en distintas secuencias cronológicas.Una de estas secuencias implica la formacióninicial de órganos femeninos seguida de la formaciónde los órganos masculinos que es controladapor la presencia de un sistema anteridiógeno. Estesistema inductor se ha relacionado tradicionalmentecon las giberelinas [1], aunque en Blechnum spicantaún no se conoce su naturaleza química exacta [2-4].mafrodita(Ceratopteris) o femenino (Blechnum), yéste, una vez alcanzada la madurez, producirá y secretaráactivamente anteridiógeno que actuará sobrela masculinidad. Este mecanismo está destinado aevitar la autofecundación.una única capa de células y no presenta interaccionescon el tejido esporofítico, se presenta como un sistemaexperimental ideal para profundizar en el estudiode procesos del desarrollo sexual en plantas.En este trabajo, se han empleado por primeravez técnicas proteómicas para estudiar la expresióndesarrollado en presencia y en ausencia de sustanciascon acción anteridiógena.ducción de masculinidad. A este medio se añadieronde cultivo de 20 dias, se caracterizaron (estado dedesarrollo, órganos sexuales) y se compararon conde cultivo sin anteridiógeno (Control).En primer lugar se extrajeron anteridiógenos dede Yamauchi [5], y posteriormente se añadieron amedio de cultivo MS para generar un sistema de in-trógenolíquido (50 mg de peso seco por muestra) yseguida de precipitación en acetato de amonio enmetanol descrito por Carpentier [6]. La concentraciónde proteínas se midió por medio de Bradfordy las muestras se almacenaron a -80ºC hasta quese realizó el isoelectroenfoque. Para ello se utilizaron10 tiras de 24 cm con un rango de pH 3-10no lineal, que fueron rehidratadas todas a la vez deforma pasiva con 550 µg de proteína en 450 µL detampón de solubilización. El isoelectroenfoque serealizó siguiendo las recomendaciones del fabricante(GE Healthcare). Una vez terminado el enfoquelas tiras fueron equilibradas posteriormente almacenadasa -80ºC.La segunda dimensión SDS-PAGE se llevó acabo en geles de poliacrilamida al 13%. Posteriormentese tiñeron con azul de Coomassie coloidalG-250 durante 20 horas (3 veces) siguiendo el protocolode Mathesius et al. [7]. Las imágenes de losgeles se adquirieron con un densitómetro y se analizaroncon software PDQuest 8 (Biorad). Tras unarevisión manual, se contabilizaron 581 spots bien resueltos.Solo se consideraron spots que aparecieranen al menos 3 de los 5 geles. Se asignaron valoresperdidos empleando el algoritmo KNN aplicado deforma secuencial (R environment). Posteriormentese normalizó la intensidad de los spots y, para reducirla dependencia de la media y la varianza, serealizó una transformación logarítmica. Tras aplicarcomo diferencialmente expresados.

153Se aplicó un análisis de componendes principalesa todos los spots, permitiendo el PC2 la separación delas muestras en dos grupos. Teniendo en cuenta losanálisis uni y multivariables se seleccionaron para sup-valor más bajo en el caso de la prueba T, y aquelloslos componentes principales 1-3.mitiódescribir por primera vez en helechos lasrutas metabolicas cuya expresión varía en relacióncon el desarrollo sexual dependiente de la accióndel anteridiógeno.Referencias[1] Yamane H. Fern antheridiogens. Int Rev Cytol1998; 184:1-32.[2] Fernández H, Bertrand AM, Sierra MI, Sánchez-Tamés R. An apolar GA-like compound responsiblefor antheridiogen in Blechnum spicant.Plant Growth Regul 1999; 28:143-4.[3] Menéndez V, Revilla MA, Fernández H. Growthand gender in the gametophyte of Blechnumspicant L. Plant Cell Tiss Org 2006; 86:47-53.[4] Menéndez V, Revilla MA, Bernard P, GotorV, and Fernández H (2006) Gibberellins andantheridiogen on sex in Blechnum spicant L.Plant Cell Rep 25:1104-1110.[5] Yamauchi T, Oyama N, Yamane H, MurofushiN, Schraudolf H, Pour M, Furber M, ManderLygodiumcircinatum and Lygodium flexuosum. PlantPhysiol 1996; 111:741-5.Swennen R and Panis B. Preparation of proteinextracts from recalcitrant plant tissues: An evaluationof different methods for two-dimensionalgel electrophoresis analysis. Proteomics 2005;5:2497-507.manJJ, et al. Establishment of root proteomereference map for the model legume Medicagotrunculata using the expressed sequence tag data-2001; 1:1424-40.Proteome regulation and epigenetic code during Pinus radiata needlematurationLuis Valledor 1 , Maria Jesus Cañal 1 , Christof Lenz 3 , Roberto Rodríguez 1 , Jesús Jorrín 31Plant Physiology. I.U.B.A. University of Oviedo.C/ Cat. Rodrigo Uria s/n, E-33071 Oviedo, Spain. 2 AppliedBiosystems Deutschland, Frankfurter Strasse 129-B, Darmstadt, Germany. 3 Biochemistry and MolecularBiology. University of Córdoba. Campus de Rabanales. E-14071 Córdoba, SpainNeedle differentiation is a very complex processwhich leads to the formation of a mature photosyntheticorgan. This fact implies important changes inprotein accumulation and gene expression whichmust be regulated, amongst others, by epigenetic 3m ,Histone H3K9 3m and acetylated Histone H4) presentin immature (1 month old) and mature (12 monthold) Pinus radiata needles (Figure 1a), determiningthe differential expression levels of histone epigeneticmarks, being the levels of acetylated Histone H4and Histone H3K4 3m , associated to gene expression,higher in immature needles whereas the HistoneH3K9 3m was only found in mature needles (Figure1c). This could be explained by the fact that chromatinneeds to be altered and restructured during thedifferentiation to regulate gene expression [1].To determinate which genes and proteinsshowed as differential during needle development

154 Figure 1. a) Mature (top) and immature (bottom) needle fascicles. b) Immunodetection of 5-mdC. In 3D view the intensity 3m and H3K9 3m on protein extracts from immature (I) and mature (M) scions. Theleft lane corresponds to Coomassie stained MW standards.we have also characterized and compared proteomeand transcriptome of immature and mature needles.Immature needles are characterized by a low tissuedifferentiation and high morphogenetic capabilitywhereas mature needles are a specialized photosyntheticorgan, which do not show morphogeneticpreviously described protocol [2], showed variationsin the relative abundance of 280 spots from a totalof 856 that were studied whereas transcriptomicanalyses (substractive library building and determinationof differential expression by macroarrayand real time PCR) resulted in the description of176 differentially expressed genes in immature andmature needles. The joint analysis of proteomic andtranscriptomic data that was performed provideda broad overview of differentially expressed genesand proteins associated with needle maturation.Some spots and genes related to photosynthesis andoxidative phosphorylation were overexpressed inmature needles. On the other hand immature needleswere characterized by the overexpression of biosynthesis-,cell division- and differentiation-relatedproteins [3]. A joint data analysis of proteomic andtranscriptomic results provided a broader view overdifferentially expressed pathways associated withneedle maturation. Energy metabolism pathways,with photosynthetic and oxidative phosphorylationrelated proteins and genes, were overexpressed inmature needles. Amino acid metabolism, transcriptionand translation pathways were overexpressed inimmature needles. Interestingly, stress related proteinsand defense mechanisms were characteristicof immature tissues, a fact that may be linked to thetrees’ need to defend the needles in young stages orthe higher growth rate and morphogenetic competenceexhibited by this tissue [3].From these functional groups we have selectedRBCA), regulationof gene expression (MSI1, CSDP2), leafelongation (CYP78A7) and stress (SHM4) to further-detected by Chromatin Immunoprecipitation, furthermoreCYP78A7 and CSDP2 showed a sequenceDNA methylation patterns related to tissue differentiationwere found for CSDP2epigenetic mechanisms in conifers.

155Figure 2. Master gel combining spots of B1 and B12 protein extracts (a). Three sections of the 2-DE gels showing two representativeB1 and B12 gels (b). Red and green arrows up and down accumulated spots, respectively, while black arrows pointspots only detected in one kind of protein extract.CSDP2 showed a differential methylation pattern of cytosines. The callus tissue, without any methylated cytosines,showed the highest expression level of this gene and the higher proportion of AcH4 and H3K4 3m (all epigenetic marks associatedwith gene expression). One of these marks, H3K4 3m , was lost in mature needles, the tissue which showed the lowest expressionlevel. (Valledor et al., in preparation)References[1] Valledor L, Meijon M, Hasbún R, Cañal MJ,Rodriguez R. Variations in DNA methylation,acetylated histone H4, and methylated histoneH3 during Pinus radiata needle maturation inrelation to the loss of in vitro organogenic capability.J Plant Physiol 2009; available on line(DOI 10.1016/j.jplph.2009.09.018).[2] Valledor L, Castillejo MA, Lenz C, RodríguezR, Cañal MJ, Jorrin J. The 2-DE proteome ofPinus radiata needle tissue: analytical, biologicalRes 2008; 7: 2616-31.[3] Valledor L, Jorrín JV, Rodríguez JL, Lenz C,Rodriguez R, Cañal MJ. Combined Proteomictiallyexpressed pathways associated to Pinusradiata needle maturation. Mol Cell Proteomics,under review.

156 Quercusilex subsp. ballota comparativa basada en electroforesis bidimensionalJosé Valero Galván 1 , Rafael Mª Navarro Cerrillo 2 , M a Cristina Romero Rodríguez 1 , David Ariza 2 ,Jesús Jorrín Novo 11Grupo de Bioquímica, Proteómica Vegetal y Agrícola. Departamento de Bioquímica y BiologíaMolecular. Córdoba, España. 2 Departamento de Ingeniería Forestal. ETSIAM, Universidad de Córdoba.Córdoba, EspañaResumenLa encina (Quercus ilex subsp. ballota) es unade las especies forestales más importantes del BosqueMediterráneo, siendo ampliamente utilizada enprogramas de conservación forestal, reforestacióny otras practicas silvícolas. El éxito de dichas prácticasdepende, en gran medida, de la supervivenciade las plántulas, siendo el estrés por sequía la principalcausa de mortalidad tras el transplante. Espor ello que la selección de “individuos plus” contolerancia a estrés hídrico es de gran importancia.Los mecanismos de respuesta a estrés en encinay su variabilidad poblacional han sido muy pocoestudiados. En el presente trabajo se ha evaluado,mediante una aproximación de proteómica comparativabasada en geles bidimensionales, la respuestadiferencial de dos poblaciones de encina a la sequía.Aunque dicha aproximación revela diferencias en laintensidad de manchas entre tratamientos, no lo haceentre poblaciones, sin que, por otro lado, hayamospodido asociar las diferencias observadas al caráctermás o menos tolerante de la población utilizada.Ello puede ser debido a la intensidad y duración dellimitaciones de la técnica.Nuestro grupo de investigación esta trabajandoen un proyecto de investigación (Variabilidad, catalogación,respuesta a estreses y propagación clonalde encina (Q. ilex), DECOVA, AGL2009-12243-C02-02), dirigido, entre otros objetivos, a estudiar larespuesta de la encina a estrés producido por sequíautilizando una aproximación multidisciplinar, proteómicaincluida [1, 2]. La proteómica en especiessistema experimental (variabilidad genética alta,ciclo de vida largo, ausencia de entradas en basesde datos de DNA genómico, ESTs o proteínas). No-Figura 1. A) Imagen de hojas y raíz de plantas de las dos poblaciones utilizadas a los 28 días del tratamiento de sequía. SSA(población almeriense), GSE (población sevillana). B) Gel 2-DE representativo de extractos de hoja de encina. La imagencorresponde a una muestra de la población SSA a los 28 días del tratamiento de sequía. En la tabla se indican las proteínas

157tancia económica y medioambiental de la especie,componente principal de la “dehesa” y el BosqueMediterráneo. Mediante una aproximación de proteómicade expresión diferencial basada en electroforesisbidimensional se han analizados cambios[Almería (SSA) y Sevilla (GSE)] [3] sometidas aPreviamente se caracterizó la respuesta de las dospoblaciones mediante parámetros de crecimiento,potencial hídrico, humedad relativa en raíz y hojas,A tenor de los resultados obtenidos se concluyó quela población SSA fue más tolerante, mientras que lapoblación GSE fue la más susceptible (Figura 1A).Las proteínas de hoja (300 mg) de plantas de unaño de crecimiento (control, plantas regadas cadatres días; tratamiento de sequía, plantas no regadasa los 28 días) fueron extraídas usando el protocolode precipitación TCA-FENOL [4]. Las condicionesde electroforesis, tinción, análisis de los geles y es-como lo indica Maldonado et al. [4].Después de la tinción de los geles y análisis delas imágenes se detectaron alrededor de 350-370manchas. Tras el análisis estadístico se concluyoque existían 40 manchas diferenciales entre tratamientosy tan solo 4 entre poblaciones (muestrascontrol). Dado el carácter de especie huérfana de en-del 50 % de las manchas diferenciales. En general,se observó como consecuencia del tratamiento desequía un descenso en la intensidad de manchascorrespondientes a proteínas fotosintéticas, fosfoglicerato-quinasa(glicólisis), peroxiredoxinas (estrésoxidativo) y una glucanasa (proteína de defensafrente a patógenos) (Figura 1B). Por el contrario seobservó un aumento de intensidad de la glutaminasintetasa y la s-adenosil-metionina sintetasa. No setivasentre las dos poblaciones analizadas, tanto encontroles como en tratamiento de sequía.Estos resultados son similares a los obtenidos enplántulas de encina sometidas a diferentes nivelesde estés hídrico [1, 2] y a otras especies forestalescomo el caso del genero Populus [5], sin que hasta lafecha, y en especies forestales, se haya concluido deforma contundente la base molecular de la respuestaa estrés, y si las consecuencias del estrés.Referencias[1] Jorge I, Navarro-Cerrillo RM, Lenz C, Ariza D,Jorrín J, Variation in the holm oak leaf proteomeat different plant developmental stages, betweenprovenances and in response to drought stress.Proteomics, 2006; 6: S207–14.[2] Echevarría-Zomeño S, Ariza D, Jorge I, LenzcC, Campo A, Jorrín J, Navarro-Cerrillo, RM.Quercus ilexleaves in response to drought tress and in responseto drought stress and recovery. J. PlantPhysiol.2009; 166:233–245.[3] Valero GJ, Navarro-Cerrillo RM, Gómez CA,Ariza D, Jorrín J. Population variability andmother tree selection in holm oak (Quercusilex L. subsp. ballota [Desf.] Samp.) based onacorn morphometry and analysis by near in-(Submited).[4] Maldonado AM, Echevarria-Zomeno S, Jean-Baptiste S, Hernandez M, Jorrin-Novo JV.Evaluation of three different protocols of proteinextraction for Arabidopsis thaliana leafproteome analysis by two-dimensional electrophoresis.J. Proteomics, 2008; 71:461–72.[5] Bonhomme L, Monclus R, Vincent D, Carpin S,Claverol S, Lomenech MA, Labas V, Plomion C,Brignolas F, Morabito D. Genetic variation anddrought response in two Populus euramericanagenotypes through 2-DE proteomic analysisplants. Phytochemistry, 2009; 70: 988–1002.

158 Desarrollo y optimización del proceso de extracción de proteínas y electroforesisbidimensional en fruta de huesoEsther Giraldo Ramos 1 , Amelia Díaz Méndez 1 , Alfredo Garcia Sánchez 21Departamento de Vegetales II. Instituto Tecnológico Agroalimentario (INTAEX) 2 Centro de Investigación“Finca La Orden-Valdesequera”La fruta de hueso es muy inestable y se deterioramuy rápido a temperatura ambiente. El almacenamientoa bajas temperaturas para prolongar su vidapuede afectar negativamente a la calidad de la fruta,nocidoscomo daños por frió (DF) [1]. La incidenciade estos daños es mayor en unas variedades queen otras [2], por lo tanto su severidad parece tenerun componente genético [3]. Conocer los procesosmoleculares puede permitir diseñar procedimientospara inducir resistencia o disminuir la sensibilidad alDF. El estudio de la proteomica comparativa es cadavez más atractivo en la biología de plantas dadalas amplias bases de datos de secuencia genómicasy EST que proporcionan grandes oportunidadesmensional(2D) constituye actualmente el métodopermite separar cientos, incluso miles de proteínasen un solo experimento. En este trabajo se presentala optimización de la extracción y separación deproteínas mediante geles bidimensionales a partirdel problemático tejido de la fruta. Las proteínasfueron extraídas de la pulpa del melocotón y la nectarinamediante un método ya descrito [4] con lige-de pulpa de melocotón o nectarina, pulverizados enmortero con nitrógeno liquido, resuspendidos en 10ml de tampón de extracción (100 mM TRIS pH 8.8,5 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 Mm PMSF y 30% desacarosa), más fenol saturado en TRIS (pH 8.8) enproporción 1:1 (v/v), mezclamos vigorosamente y sedejó reposar las muestras durante 10 minutos a 4ºCantes de centrifugar (10.000g; 15 minutos; 4ºC), serecuperó la fase fenólica se añadió 1:5 (v/v) volúmenesde Acetato Amónico 100 mM en metanol yse dejó a -20ºC toda la noche. También se probó eneste paso el empleo de ácido tricloroacético (ATC)en lugar de Acetato Amónico, sin embargo los resultadosfueron decepcionantes. Tras la precipitación,las muestras fueron centrifugadas (10.000g; 15minutos; 4ºC), y el precipitado lavado 2 veces conacetona fría, y se dejó secar al aire para eliminar losrestos de acetona. Finalmente el precipitado de proteínasse resuspendió en tampón de rehidratación (7M Urea, 2 M thiurea, 4% CHAPS, 2% Pharmalyte,40 mM DTT). Debido a la baja calidad de los geles,causados por la presencia de sales y contaminantesno proteínicos, se decidió el empleo del PlusOne2-D Clean-Up kit. El precipitado limpio fue disueltoen tampón (7M Urea, 4% (p/v) CHAPS, 1% (v/v)tampón de inmobilización gradiente de pH 3-11(GE Healthcare), 0,037 DTT y 0,002% (p/v) azulde bromofenol, conteniendo una tableta de MiniProtease Inhibitor Cocktail (Roche) por cada 10 mlde tampón). La concentración de proteínas extraídasfue determinado utilizando el PlusOne Quant Kit(GE Healthcare). En el Isoelectroenfoque, se utilizarón150 mg de proteínas/ geles teñidos con platay 300 mg/ geles teñidos con azul de Coomassie parala rehidratación pasiva de tiras de isoelectroenfoque(IEF) de 13 cm con pH 3-11 “no lineal” (al menos12 horas). Tras la rehidratación se procedió al IEF a100, 200, 500 y 1000 V durante 1 hora cada uno, unpaso de gradiente hasta 8000 V durante 2:30 horasy 8000 V durante 1 hora en un Ettan IPGphor Manifold(GE Healthcare) a 20ºC y con una corrientemáxima de 50 uA/gel. A continuación las tiras fueronincubadas 30 minutos en Tampón de equilibrado(0,075 M Tris, 6 M urea, 29.3% (v/v) glicerol, 2%(p/v) SDS y 0,002% (p/v) azul de bromofenol), losprimeros 15 minutos con 0,065 M DTT y la segundaincubación con iodoacetamida (0,135 M). La electroforesisSDS PAGE se realizó en geles (20x20 cm)de poliacrilamida 12,5% (p/v) utilizando tamponesLos geles fueron teñidos mediante las tinciones deplata, (silver-stain GE Healthcare) y azul Coomassie(GE Healthcare). Los geles obtenidos fueronescáneados y calibrados con el software labscan6 (GH Healthcare) (Figuras 1 y 2). La mayoría delos protocolos de extracción incluyen un paso de

159precipitación con ATC para incrementar la concentraciónde proteínas y ayudar a la eliminación decontaminantes [6], sin embargo en ciertas ocasiones,como es nuestro caso, provoca una co-extracción decontaminantes, este es el principal problema de lostejidos de fruta carnoso, que presentan un alto niveltanto de polisacaridos de pared celular como de pectinas[7]. Una alternativa ya descrita [8] y adoptadapor nuestro grupo en el protocolo de extracción fuesolubilizar las proteínas con fenol y precipitar conacetato amónico. En este caso se consiguió una altacalidad y cantidad de extracción de proteínas libresde contaminantes. Ya que el fenol ofrece una mayorestabilidad proteica al minimizar la proteolisis durantela extracción [9]. Por otro lado el melocotón yla nectarina presentaron un comportamiento similaren la extracción de proteínas. La electroforesis 2Des actualmente el método de elección para los estu-se trata de una técnica muy resolutiva empleadafrecuentemente en los análisis proteómicos, que permitela generación de datos fácilmente evaluables,así como su comparación cuantitativa [10].Bibliografía[1] Lill RE, O´Donoghue EM y King GA. Postharvestphysiology of peach and nectarines.Horticultural Reviews 1989;11:413-452.[2] Lurie S y Crisosto CH. Chilling injury inpeach and nectarine. Postharvest Biol. Technol.2005;37:195-208.[3] Ogundiwin EA, Peace CP y Gradziel TM. Moleculargenetic dissection of chilling injury in peachfruit. Acta Horticulturae 2007;738:633-638.[4] Renaut J, Lutts S, Hoffmann L, et al. Responsesof poplar to chilling temperatures: Proteomic andphysiological aspects. Plant Biol. 2004;6:81-90.[5] Laemmli UK. Cleavage Of Structural ProteinsDuring Assembly Of Head Of Bacteriophage-T4. Nature 1970;227:680.[6] Santoni V, Bellini C y Caboche M. Use Of2-Dimensional Protein-Pattern Analysis For TheCharacterization Of Arabidopsis-Thaliana Mutants.Planta 1994;192:557-566. [7] SaravananRS y Rose JKC. A critical evaluation of sampleextraction techniques for enhanced proteomicanalysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics2004;4:2522-2532. Plant Membrane-Proteins For Analysis By Two-Dimensional Gel-Electrophoresis. Plant Physiol.1986;81:802-806.[9] Schuster AM y Davies E. Ribonucleic-Acid AndProtein-Metabolism In Pea Epicotyls .1. TheAging Process. Plant Physiol. 1983;73:809-816.[10] Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresisin proteomics: Old, old fashioned, but it still climbsup the mountains. Proteomics 2002;2:3-10.Figura 1. Gel teñido con CoomassieFigura 2. Gel teñido con Plata

160 Comparative proteomic analysis of Arabidopsis wild-type, mutants, and FaWRKY1Fragariax ananassapositive regulators of resistanceAlba Ruíz-Ramos 1 , Francisco Amil-Ruíz 1 , Juan Muñoz-Blanco 1,3 , José Luis Caballero 1,3 , Ana M.Maldonado Alconada 21Plant Biotechnology Research Group and 2 Agricultural and Plant Biochemistry and Proteomics ResearchGroup, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, University of Cordoba , , and 3 Andalusian Institute ofBiotechnology, Spain-enhanced resistance to pathogen infection, andused a proteomic approach to identify differentiallyaccumulated proteins when compared to thewrky75 parentalthe signaling networks in which these two factorsmight be involved.Plant resistance involves the reprogramming ofhost cells which relies on major changes in genechanismsthat translate recognition of pathogens intoappropriate transcriptional outputs resulting in resistanceis a valuable tool in directing programs aimedat generating resistant varieties [1]. Nevertheless, relevantcrops of agronomical interest usually containThis is the case of the interaction between strawberry(Fragaria x ananassa), an important agronomicalfruit crop, and Colletotrichum acutatum, a pathogenwhich infection causes severe yield losses.In a previous work we used the molecular resourcesof the model plant Arabidopsis for studyingthis plant-pathogen interaction, and characterize FaWRKY1siologyand orchestrate the defense transcriptomeagainst a range of biotic and abiotic stresses [3].In strawberry, Fa WRKY1 gene is modulated du-ring fruit ripening and strongly up-regulated followingColletotrichum infection, and treatmentswith defense-related hormones. -plants) and R-mediated resistance (a strong form ofwrky75T-DNA insertion mutants were more susceptibleto virulent and avirulent isolates of the pathogenicbacteria Pseudomonas syringae, while overexpressionof Fa WRKY1 in At wrky75 mutant and wildtypereverts the enhanced susceptible phenotypeof the mutant, and even increases resistance. Theresistance phenotype of these transgenic plants wasuncoupled to the expression of the tipical PATHO-GENESIS RELATED (PR) signalling pathway associatedwith resistance, suggesting differences inthe way of action between both factors in order toactivate the defense response.In order to investigate the mode of action oftargets of these factors we are using a differentialexpression proteomics strategy, consisting in 2- DEcombined with MS [4].Here we present the proteomic analysis carriedArabidopsis plants overexpressing Fa WRKY1 andwrky75 parentallines to identify proteome alterations due tothe expression of this strawberry gene under normalphysiological conditions. This constitutes a previousand neccesary step for further comparisonsof these lines, that exhibit enhanced resistance and

161susceptibility, in response to pathogen infection orhormone treatment.-FAWRKY1 overexpressinglines and their controls (mutant and wildtype plants) will give us some clues on the signallingnetworks in which these two factors might beinvolved, in addition to defense-related signaling.This work was supported by grants PROFIT010000-2001-100, 2002-81, 2003-32 and 2004-2from MCYT, Proyecto de Excelencia P07-AGR-02482 and grants to Grupo CVI278 from Junta deAndalucía, Spain. Alba Ruíz-Ramos y FranciscoAmil-Ruíz thank the Junta de Andalucía, Spain fortheir predoctoral grants.References[1] Jones JDG and Dangl JL. The plant immunesystem. Nature 2006; 444: 323–329.[2] Encinas-Villarejo S, Maldonado AM, Amil-Ruiz F, Berta De Los Santos F, Romero F,Pliego-Alfaro F, et al. Evidence for a positiveregulatory role of strawberry (Fragaria xananassa2009; 60: 3043-65.transcription factors in defence signaling.Current Opinion in Plant Biology 2007;10:366-371.[4] Jorrín J, Maldonado AM and Castillejo MA.Plant proteome analysis: a 2006 update. Proteomics2007; 7: 2947–2962.

162 El estudio comparativo, proteómico y transcriptómico, de la respuesta a azúcares enArabidosis thaliana Marina Ribeiro-Pedro, Fatima Ezzahra Said, María Teresa Ruiz, José María Romero, FedericoValverdeInstituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis. CSIC-Universidad de Sevilla. Av. Américo Vespucio, 49.41092 Sevilla, SpainEl desarrollo vegetal está bajo el control decomplejos programas genéticos que permiten generarmúltiples respuestas a cambios ambientales. Latranscriptómica y la proteómica han surgido comopotentes herramientas para profundizar en el conocimientode los mecanismos regulatorios que loscontrolan. En particular, la proteómica vegetal, esun campo de investigación emergente ya que, al determinadas condiciones, proporciona informaciónfuncional sobre los mecanismos moleculares básicos.En nuestro laboratorio estudiamos los cambiosque ocurren en el proteoma nuclear de A. thaliana encadosvarias proteínas posiblemente implicadas enesta señalización incluidos factores de transcripción,como FRIGIDA, y otras proteínas señalizadoras.Las complejas interacciones moleculares quesubyacen los procesos de desarrollo vegetal puedenabordarse en la actualidad mediante un conjuntolas moléculas biológicamente más relevantes [1].Entre ellas, la transcriptómica permite el análisisglobal de la expresión del genoma en determinadas-involucradas [1, 2]. Dado que, por una parte, son lasproteínas los componentes directos de las cascadasde señalización y rutas bioquímicas, y que no existecorrespondencia directa entre gen-proteína, la proteómicavegetal emerge como la mejor herramientasistemas vegetales.Las plantas son organismos sésiles y responden -estamos interesados en estudiar los cambios a nivelmolecular que ocurren en el núcleo de A. thalianaen respuesta al suministro de azúcares. La funciónreguladora y moduladora de los azúcares es conocidadesde hace tiempo. Sin embargo, se sabepoco sobre su mecanismo molecular, es decir, quéfactores de transcripción y proteínas reguladorasintervienen en esta respuesta. Para responder a estaincógnita hemos diseñado y optimizado un protoco-proteínas implicadas en la respuesta a azúcares. Másrecientemente, y con objeto de profundizar en elconocimiento de dicho mecanismo, hemos iniciadoun acercamiento transcriptómico mediante la utilizaciónde microarrays y estudios más detalladosmenteimplicadas en la regulación por azúcares. Dela comparación de ambas aproximaciones podremossacar datos que ayuden a comprender la respuesta aazúcares.Proteómica. núcleos de A. thaliana var. Col-0 cultivadas en medioMS (control) y medio MS suplementado con 3%(p/v) de sacarosa, extrayendo las proteínas nuclearescon sulfato de amónio/deoxicolato en condicionesnativas. Luego se eliminan los contaminantes porenriquecen las muestras en potenciales factores deen una matriz de heparín-sulfato. En condicionesdesnaturalizantes se extraen las proteínas con fenoly luego se precipitan con una mezcla de acetato de proteicas se sometieron a una electroforesis bidimensional:isoelectroenfoque en stripIPG y separación en SDS-PAGE en geles CriterionXT Bis-Tris (Bio-Rad). Los geles fueron teñidoscon SYPRO Ruby, nitrato de plata o Coomassiecoloidal. Las proteínas de interés fueron analizadasmediante espectrometría de masas MALDI-TOF e

163análisis de Western blot se utilizaron anticuerpos es-control de casas comerciales.Transcriptómica. de expresión en presencia de azúcares se extrajoRNA total de plántulas de A.thaliana var. Col-0 cultivadasen medio MS o MS con sacarosa mediante“RNeasy” (Qiagen). Se hibridaron 3 muestras biológicasde cada condición experimental en “Gene-Chips” de Affymetrix (Unidad de Genómica, CNB)y los datos se analizaron mediante LiMMA con elsoftware FIESTA (http://bioinfogp.cnb.csic.es). Losresultados fueron posteriormente analizados conlos programas disponibles en red en el “Bio-arrayResource” (http://bar.utoronto.ca). En función delos resultados obtenidos se procedió al análisis, medianteQPCR, de los genes de interés.Figura 1. Comparación funcional, entre transcriptómica y proteómica,de la respuesta a sacarosa. de los genes cuya expresión se altera (represión FDR

164 Figura 2. Estudio de los niveles de expresión de FRIGIDAy detección de la proteína en plántulas de A. thaliana, enrespuesta a sacarosa. A) Análisis, por QPCR, de los nivelesde transcripto de FRIGIDA en plántulas (Wt col y Sf2col) crecidas en medio MS y medio MS suplementado con3% de sacarosa. B) Análisis, mediante Western blot, de lapresencia de FRIGIDA en extractos nucleares y citosólicosde plántulas Wt col y Sf2 col crecidas en las mismascondiciones de ensayo. Cabe mencionar que FRIGIDA sedetecta exclusivamente en las fracciones nucleares (bandade 57 Kda aprox.) y que en presencia de sacarosa pareceaumentar su producción. La banda de 20 Kda correspondea la Histona H3, utilizada como control de la integridad ypureza de las fracciones.representado corresponde a proteínas implicadasen mecanismos de señalización y regulación de laexpresión génica, como es el caso de FRIGIDA cuyaexpresión parece aumentar en presencia de sacarosa.Una situación similar puede comprobarse a nivelen el caso particular de FRIGIDA, no parece existiruna relación directa entre gen-proteína ya que, enpresencia de sacarosa, una mayor producción decorrespondiente transcrito (Figura 2a). Mediante eluso combinado de estas herramientas (Proteómicay Transcriptómica) hemos mostrado que podemosaumentar la comprensión de los mecanismos biológicos,ya que permite la integración y la intersecciónde la información transcripcional, traduccional ypost-traduccional.Referencias[1] Hochholdinger F, Sauer M, Dembinsky D, HoeckerN, Muthreich N, Saleem M, Liu Y.Proteomicdissection of plant development. Proteomics2006; 6:4076-4083.[2] Chen S y Harmon AC. Advances in plant proteomics.Proteomics 2006; 6:5504-5516.[3] Casal, JJ. Fankhauser C, Coupland G, BlázquezMA. Signalling for developmental plasticity.Trends in Plant Science 2004; 9 (6):309-314.foliar, a free amino acid-based biostimulatorMaría José Martinez-Esteso 1 , Mayte Vilella-Antón 1 , Susana Sellés-Marchart 2 , Anna Botta-Català 3 ,Rafael Piñol-Dastis 3 , Roque Bru-Martinez 11Grupo de Proteómica y Genómica Funcional de Plantas. Dpto. Agroquímica y Bioquímica, IMEM RamonMargalef, Universidad de Alicante; 2 Unidad de Genómica y Proteómica, SSTTI, Universidad de Alicante;3Departamento I+D Fisiología Vegetal, BIOIBERICA, S.A.AbstractIn this work, we have undertaken a proteomicapproach using DIGE in order to explore molecularmechanisms potentially involved in the biostimulatingeffect of Terra-Sorb® foliar on wheat applied attedsuggest an improvement of wheat productivity by acombination of an enhanced CO 2protein synthesis and a decrease of oxidative stress.

165Table 1. and TREATED samples.Protein InformationNorm. Vol.Ref.SpotProtein Description Accession No. CONTROL Terra-Sorb73 EF-Tu Chl-1 translational elongation factor Tu 125540125 1 1,41210 EF-Tu Chl-2 translational elongation factor Tu 125540125 1 1,37114 EF-Tu Chl-3 translational elongation factor Tu 125540125 1 1,30118 RUBISCO LBP-B-1122 RUBISCO LBP-B-230 RUBISCO LBP-B-38 RUBISCO LBP-A-112 RUBISCO LBP-A-211 RUBISCO LBP-A-3RuBisCO large subunit-binding proteinsubunit beta, chloroplastRuBisCO large subunit-binding proteinsubunit beta, chloroplastRuBisCO large subunit-binding proteinsubunit beta, chloroplastRuBisCO large subunit-binding protein subunitalpha, chloroplast precursorRuBisCO large subunit-binding protein subunitalpha, chloroplast precursorRuBisCO large subunit-binding protein subunitalpha, chloroplast precursor2493650 1 1,2562493650 1 1,2312493650 1 1,176134102 1 1,4134102 1 1,328134102 1 1,28456 RUBISCO-L(fragmento?)-1RuBisCO large subunit. Ribulose bisphosphatecarboxylase large chain, N-terminal domain.548677 1 1,82562 RUBISCO-L(fragmento?)-2RuBisCO large subunit. Ribulose bisphosphatecarboxylase large chain, N-terminal domain.548677 1 1,6115 RUBISCO A-1 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,439 RUBISCO A-2 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,41389 RUBISCO A-3 RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,274170RUBISCO A-A(Precursor?)RuBisCO activase A chloroplast precursor 12643756 1 1,18440 PRK-1 Phosphoribulokinase, chloroplast precursor 125580 1 1,08746 PRK-2 Phosphoribulokinase, chloroplast precursor 125580 1 1,03771 HSP90 Heat schock protein 90kDa 556673 1 1,4733 EF-G Chl36 EF-G ChlElongation factor G, chloroplast precursor(EF-G)Elongation factor G, chloroplast precursor(EF-G)125549171 1 1,113125549171 1 1,10832 PGM phosphoglycerate mutase 32400802 1 -1,26434 GA3PDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 15222111 1 -1,2729 ATP-CF1-A ATP synthase CF1 alpha subunit 14017569 1 -1,27322 pEF-G Chlputative Elongation factor G, chloroplastprecursor (EF-G). Fragmento?125549171 1 -1,289131 Cu/Zn SOD Cu/Zn superoxide dismutase 1568639 1 -1,3413 Cu/Zn SOD Cu/Zn superoxide dismutase 1568639 1 -1,476

166 CommunicationProteomics has been shown as successful approachto analyze the response of plants to externalin order to study the effects of Terra-Sorb ® foliarductfrom enzymatic hydrolysis with a high ratio offree-to-total amino acids, was applied two and threedays following foliar by spraying treatment. Flagleaf samples were taken from independent control(C) and treated plots (T).A quantitative DIGE approach was used to comparethe proteomes of T vs C plants in four biologicalreplicates. After SameSpots v3.0 gel analysis, 37 deregulatedspots were selected out of 918 detected, withan ANOVA p

167High-throughput biological and functional analisys of interactions among tetraspaninassociated proteins in T Limphocytes using second generation proteomicstechniquesDaniel Pérez-Hernández 1&2 , Elena Bonzón-Kulichenko 1 , Pablo Martínez-Acedo 1 , Pedro J. Navarro 1 ,Estefanía Núñez 1 , Marco Trevisan-Herraz 1 , María Yáñez-Mo 2 , Mónica Sala-Valdés 2 , Mª ÁngelesUrsa 2 , Francisco Sánchez-Madrid 2 , JesúsVázquez 11Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, CBMSO. 2 Hospital Universitario La Princesa y CentroNacional de Investigaciones Cardiovasculares CNICThe tetraspanin superfamily of transmembraneproteins is clustered in compact structural groupsforming specialized membrane microdomains (TetraspaninEnriched Microdomains, TEM or TERM).Through heterolog and homolog interactions, tetraspaninsregulate signalling processes mediated bycellular adhesion molecules, growth factor receptorsand costimulatory proteins. The presence in TERMsof Major Histocompatibility Complex (MHC) I andII molecules also suggest that tetraspanins partici-pate in antigen presentation. Furthermore, they participateas viral correceptors in certain situations andare involved viral growth in infected cells [1].In spite of the growing interest for these proteins,the cytosolic interactions by which tetraspanins areinvolved in various receptor activation pathways, theircytoskeleton anchorage and in general the proteinligands that interact with these proteins are poorlyknown. In this work we have made a systematic analy-Figure 1. Systems Biology analysis of the proteins that interact with the peptide baits belonging to CD81, ICAM-1 and EWI-2.Proteins with the same molecular or biological function are clustered. The same colour belongs to the same bait or the samecombination of the three peptide baits. Links between proteins are previously validated by IPA.

168 sis of interacting partners of different proteins that arepresented in TERMs [2]. This was accomplished by“pull-down” techniques and high-throughput proteintrometry.For this end, synthetic biotinylated peptidesspanning the C-terminal cytoplasmic end of these proteinswere incubated with extracts from lymphoblastcell models, and then captured using Streptavidin-sepharosemicrobeads. Proteins interacting with the peptidebaits were subjected to digestion and the resultingpeptides systematically analyzed by HPLC-linear iontrap MS/MS mass spectrometry. Proteins from moresoftware developed by our group with an error rate ofin all the partners in the same pull down experi-sideringthe reproducibility in all the experiments.tiallyclustered revealing strong relationships amonggroups of peptide baits.The validated proteins have been analyzed usingSystem Biology tools (Ingenuity Pathways Analysisor IPA) (Figure 1). Interacting proteins from differentbaits were found to share biological functionality,and the groups of interactions showed a strongfunctional and biological relationship among them.This information suggests that proteins which linkthe citosolic domains of tetraspanins form a coherentnetwork of interactions with their functionalrole between T lymphocytes and vascular endotheliumin the processes of diapedesis.References[1] Hemler ME. Tetraspanin functions and associatedmicrodomains. Nat Rev Mol Cell Biol.2005;6:801-11.[2] Barreiro O, Yáñez-Mó M, Sala-Valdés M, Sánchez-MadridF. Endothelial tetraspanin microdo-extravasation. Blood. 2005; 105:2852-61.[3] Martínez de Bartolomé S., Navarro P., Martín-Maroto F., Vazquez J., López-Ferrer D., Ramos-Fernández A.,et al. Properties of Average ScoreDistributions of SEQUEST The Probability2008; 7:1135-1145.[4] Navarro P, Vázquez J. -cationusing decoy databases. J Proteome Res.2009;8:1792-6.Use of ProteoMiner in Veterinary ResearchAnna Marco, Gemma Rovira, Anna BassolsDepartament de Bioquímica i Biologia Molecular. Facultat de Veterinària. Universitat Autònoma de Barcelona.08193 Cerdanyola del VallèsOne of the main applications of serum proteo-animal disease or animal production. However, potentialobstacles to these studies are the poor perfor-on human antigens when using animal samples. Inand reproducibility of the ProteoMiner® beads withbovine and porcine serum samples.tiallythe most valuable biological sample, becauseit contains thousands of different proteins and peptidesand it is the most easily accessible, noninvasive,and widely collected sample [1]. Unfortunately, itscontent is dominated by a handful of high-abundantproteins, with their estimated concentration exceedingthe low-abundant proteins highly by 10 ordersof magnitude [2]. This large dynamic range exceeds

169the analytical capabilities of traditional proteomicmethods, making the detection of lower abundanceserum proteins extremely challenging. In particular,most potential biomarkers are among those lowabundanceproteins, secreted into the bloodstreamby tissues or cells because of the disease process.To detect these low-abundance proteins usingcurrently available technologies, it is advisable totegieshave been developed for the removal of albuminand other high-abundance proteins; howeveranimal proteins [3]. Recently, a new method forcapturing low-abundance proteins has been commerciallyavailable, which is known under the tradename of ProteoMiner® and it is based on the useof a combinatorial peptide binding library, whichproteome [4].Proteomics constitutes an interesting approachto veterinary medicine and animal production. Inthis sense, porcine and bovine livestock are themost interesting species due to their economicalinterest. Surprisingly, there are very few applicationsof serum proteomics to veterinary science.The ProteoMiner technology, since it is not basedon an immunological approach, should be speciesindependent, and thus of potential application tosamples of veterinary interest.The objective of the present work was to analyzesystem with bovine and porcine serum samples.Blood was collected from the coccygeal vein inHolstein cows and from the cava vein in Duroc xwith no added chemicals. Serum samples were treatedwith the ProteoMiner beads (Bio-Rad, Hercules,CA, USA); a relationship 1:10 (mg protein:µl resin)was used to optimize the yield of the procedure. Firstdimension was performed on pH 3-10, 24 cm ImmobilineDryStrips (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)under reducing and denaturing conditions. Then,strips were reduced and alkilated with equilibrationbuffer (50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30% (v/v)glycerol, 2% (w/v) SDS and bromophenol blue) and1% (w/v) DTT or 2.5% (w/v) IAA, respectively. Thesecond dimension was performed with home-made12% polyacrylamide gels. Protein staining was performedwith silver, following the Berkelman andStendstedt protocol [5]. Gels were scanned with theImage Scanner III (GE Healthcare).After treatment with the ProteoMiner system, asubstantial enrichment of the low-abundance proteinswas achieved and new spots were detected,whereas albumin and the light and heavy chains ofimmunoglobulins were less represented (Figure 1).all kind of proteins and thus they intend to captureand amplify the low-abundance proteome.Figure 1. Two-dimensional electrophoresis of bovine andporcine serum after treatment with the ProteoMiner beads:a) control, non-depleted serum; b) bound fraction (“enriched”serum).Reproducibility is necessary for accurate downstreamanalysis. To assess this characteristic in thetesfrom cow and pig were prepared from aliquotsof the same sample and run on a one dimensionallane. Gels were stained with silver and scannedas described above. Densitometry was performedin Figure 2, the ProteoMiner system presents goodreproducibility.Figure 2. Reproducibility analysis of the enriched lowabundanceproteome achieved with the ProteoMiner beadson bovine and porcine samples. Densitometry of the boundfraction (“enriched” serum) obtained from one-dimensionalSDS-PAGE gels is shown.These results clearly demonstrate that the ProteoMinersystem is useful for bovine and porcine

170 to remove high abundance proteins, like others usedtreatment will decrease the amount of these highabundanceproteins. This kind of strategies shouldwiden the number of applications in serum animalproteomics.This work was funded by grant AGL2006-02364/GAN from the Spanish “Ministerio de Edu-by the FEDER program from the European Union.calassistance.References[1] Adkins JN, Varnum SM, Auberry KJ, Moore RJ,Angell NH, Smith RD et al. Toward a humanblood serum proteome: analysis by multidimensionalseparation coupled with mass spectrometry.Mol. Cell. Proteomics 2002; 1, 947-955.[2] Anderson NL and Anderson NG. The humanplasma proteome: history, character, and diagnosticprospects. Mol. Cell. Proteomics 2002;1, 845-867.[3] Echan LA, Tang HY, Ali-Khan N, Lee K andcapacities of human serum and plasma. Proteomics2005; 5, 3292-3303.[4] Boschetti E and Righetti PG. The ProteoMinerin the proteomic arena: A non-depleting tool fordiscovering low-abundance species. J. Proteomics2008; 71, 255-264.[5] Berkelman T and Stenstedt T. 2-D Electrophoresis.Principles and methods. AmershamBiosciences, Uppsala, Sweden. 1998.La Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productoscárnicosMiguel Ángel Sentandreu 1 , Paul D. Fraser 2 , Enrique Sentandreu 1 , Leticia Mora 1 , Peter M.Bramley 21Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia.España. 2 Center for Systems and Synthetic Biology, School of Biological Sciences, Royal Holloway,ResumenEn el presente trabajo se describe el desarrollode un método para detectar la presencia de carnede pollo en mezclas de carne haciendo uso de latecnología proteómica. Es un método simple yrobusto que incluye una etapa de extracción deproteínas musculares, enriquecimiento de la proteínadiana mediante isoelectroenfoque, digestióncon tripsina de la misma y análisis de un péptidodianteLC-ESI-MS/MS. Esta metodología ha permitidodetectar la presencia de un 0,5 % de carnede pollo contaminando carne de cerdo. Ademásde su sencillez, el método presenta la ventaja depoder aplicarse indistintamente al análisis de carnefresca y cocinada, representando una alternativainteresante a los métodos que se están empleandoactualmente para el control del origen animal delos productos cárnicos.Texto principalLos principales casos de adulteración en productoscárnicos se relacionan con la sustitución de carnede elevada calidad por carne de un menor coste conadicional. Para poder controlar el fraude que suponeesta forma de proceder es necesario disponer demétodos de análisis robustos, sensibles y precisos.De entre las tecnologías más empleadas hasta elmomento para este propósito hay que destacar losinmunoensayos y los análisis de ADN. A pesar del

171gran avance que ha supuesto la introducción y eldesarrollo de estas técnicas, existen importanteslimitaciones cuando éstas se aplican al análisis deproductos cárnicos procesados ya que las agresivascondiciones empleadas durante el procesado de lamientode las proteínas diana o del ADN [1]. Losrecientes avances en las técnicas de espectrometríade masas aplicadas al campo de la proteómicaconstituyen una alternativa interesante a través de lade cada especie animal. En el presente trabajo se hala especie aviar para poder detectar esta carne encualquier tipo de mezcla de carne tanto fresca comococinada. Para ello, un gramo de distintas mezclasde carne de pollo se homogeneizaron con 10 mL detampón Tris, pH 8,0, centrifugándose a continuacióndurante 20 min a 10000 rpm. Se recogió el precipitadoobtenido y se solubilizó en el tampón Tris pH 8.0conteniendo 6M de urea y 1 M de thiourea. Se tomoel volumen necesario de este extracto para fraccionar2,5 mg de proteínas totales por isoelectroenfoque enel intervalo de pH 4-7 empleando un fraccionadorOFFGEL 3100 (Agilent). De la fracción donde selocalizó la cadena ligera de mosina 3 se tomaron 20µL para realizar una digestión con tripsina. Despuésmuestra a 30 µL, analizando los péptidos contenidosen este extracto mediante LC-ESI-MS/MS (Thermorealizó a partir de los espectros MS/MS empleandoMASCOT como algoritmo y la base de datos deseleccionado como biomarcador de la especie aviaren distintas mezclas de carne conteniendo diferentesporcentajes de carne de pollo se realizó mediantela adición de 5 picomoles del péptido seleccionadomarcado con isótopos estables 13 C6/ 15 N (Técnicacoscorrespondientes tanto al péptido nativo como alpéptido pesado se realizó manualmente. La cantidadde péptido nativo en cada muestra se determinó porcomparación de las áreas de cada pico.El método que se ha desarrollado en el presentetrabajo se esquematiza en la Figura 1. Las proteínasde los distintos extractos de carne se fraccionaronmediante isoelectroenfoque en medio líquido. Ennasobtenido en SDS-PAGE para las fraccionesOFFGEL correspondientes a los valores de pH másácidos. Como se puede apreciar, las fracciones 3y 4 contienen una sola banda de proteína, correspondientea la cadena ligera de miosina 3 (MLC3).líquido como vía adecuada para el enriquecimientode MLC3 como proteína diana para la posteriorhidrólisis con tripsina y generación de péptidos po-Figura 1. Resumen esquemático del método desarrolladopara detectar cuantitativamente la presencia de la carne depollo en las distintas mezclas de carne.Figura 2. SDS-PAGE al 12 % correspondiente a las nueveprimeras fracciones obtenidas después de separar las proteínasde una mezcla de carne (1 % de pollo en carne decerdo) con el fraccionador de proteínas en solución OFF-GEL 3100 de Agilent. El isoelectroenfoque se realizó en elintervalo de pH 4-7. Se indica la posición en el gel de lacadena ligera de miosina 3 (MLC3).

172 tenciales biomarcadores de cada especie animal. Elpresente trabajo se ha centrado en la selección deun péptido biomarcador para detectar la presenciade pollo en mezclas de carne. Como criterios deselección se tuvo en cuenta que el péptido elegidosu detección fuera posible aun en aquellos casosen los que la carne de pollo esté presente en bajascantidades en el producto. De este modo, se llevóa cabo el protocolo de trabajo de la Figura 1 empleandouna mezcla de carne conteniendo un 1%de pollo en carne de cerdo. Después de realizar lahidrólisis con tripsina de las fracciones OFFGEL 3y 4 (Figura 2), el análisis mediante LC-ESI-MS/MSaviar 37 ALGQNPTNAEINK 49 procedente de MLC3.carne conteniendo distintos porcentajes de carnede pollo (0, 0,5, 1, 2, 5 y 10 %) se realizó mediantela adición de su homólogo marcado con isótoposestables (+7 Da) al extracto enriquecido en MLC3después del fraccionamiento en OFFGEL (Figura1). De este modo se obtuvo una buena correlaciónlineal (R 2 = 0,9921) entre el porcentaje de carne depollo añadido a la mezcla y la cantidad del péptidobiomarcador seleccionado, determinada por LC-ESI-MS/MS. El método desarrollado en el presenteel análisis de alimentos sometidos a un tratamientotérmico elevado. Los resultados obtenidos permitenuna alternativa de interés a los métodos empleadosactualmente para resolver el problema de la determinaciónde las especies cárnicas.ReferenciasDNA technology to combat misdescription andfraud. Trends in Biotechnology 2004; 22 (5):222-6.Péptidos inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina I generadosen la digestión in vitro de la carne de cerdoElizabeth Escudero 1 , Miguel Angel Sentandreu 1 , Keizo Arihara 2 , Fidel Toldrá 11Instituto de agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC). 2 Faculty of Animal Science, School ofVeterinary Medicine and Animal Sciences, Kitasato UniversityResumenEl objetivo principal de este trabajo se ha centradoen la generación de péptidos inhibidores dela Enzima Convertidora de Angiotensina I (ECA)después de la digestión de carne de cerdo mediantela acción secuencial de pepsina y pancreatina, simulandolas condiciones del sistema digestivo. Elhidrolizado fue analizado directamente mediantenanoLC-ESI-MS/MS, estudiando seguidamente lassecuencias obtenidas a partir de los espectros MS/el potencial de las proteínas de la carne de cerdocomo fuente de péptidos antihipertensivos despuésde la digestión gastrointestinal.Estudios recientes han demostrado el potencialde la carne de cerdo al generar péptidos biologicamenteactivos con capacidad para regular numerososprocesos en el organismo [1], lo que otorga a lacarne un valor añadido. En trabajos anteriores se handescrito péptidos con acción antioxidante, antimicrobianao antihipertensiva por ejemplo [2]. La acciónantihipertensiva ejercida por algunos péptidoses debida a su capacidad para inhibir la actividadECA. En el presente estudio, se ha investigado laposibleactividad inhibidora de la ECA de los péptidosgenerados en la digestión de las proteinas delmúsculo esquelético del cerdo por acción de lasenzimas gastrointestinales. El proceso de digestiónfue simulado in vitro usando pepsina y pancreatina

173de manera secuencial. El hidrolizado obtenido fueposteriormente analizado mediante nanoLC-ESI-MS/MS utilizando un sistema Ultimate nano-LCacoplado a una fuente de iones nanoelectrospray yun espectrómetro de masas cuadrupolo-tiempo devuelo (Q-TOF) QSTAR XL. Todos los espectrosMS/MS fueron interpretados utilizando los algoritmosMASCOT y Paragon. De este modo se lograronen el hidrolizado; sin embargo, sólo aquellos con losrequerimientos de tamaño y estructura adecuadospara ser potenciales inhibidores de la ECA fueronsintetizados. La actividad inhibidora de la ECA delos péptidos sintetizados se realizó según el métododesarrollado por Sentandreu y Toldrá [3].lizadoy fueron posteriormente sintetizados paraconocer su capacidad de inhibir la actividad ECAse muestran en la Tabla 1. A modo de ejemplo, en laFigura 1 se muestra el espectro de MS/MS correspondienteal péptido KAPVA.Este pentapéptido mostró la mayor inhibiciónde la actividad ECA con un valor de IC 50de 46.56µM. KAPVA contiene una alanina en posición C-terminal. Éste amino ácido parece desempeñar unpapel importante en su unión con la ECA [4]. Lapresencia de prolina en la antepenúltima posicióndel extremo C-terminal también parece promoverla unión del péptido con la enzima [5]. Por su parte,el péptido PTPVP también mostró una notable inhibiciónde la ECA, con un valor de IC 50de 256.41µM. Éste péptido contiene un residuo de prolinaen último y antepenúltimo lugar (Tabla 1). El restode secuencias ensayadas mostraron moderadainhibición de la ECA. Se sabe que los péptidos depequeño tamaño presentan una mayor facilidad paraser absorbidos en el tracto intestinal que los péptidosgrandes [6]. Además, los péptidos que contienenprolina son generalmente más resistentes a ladigestión enzimática [7]. En consecuencia, cabeesperar que los pentapéptidos KAPVA y PTPVP quemostraron una notable inhibición de la ECA y queademás contienen residuos de prolina en sus secuencias,puedan mostrar una actividad antihipertensivain vivo [8]. Los resultados obtenidos sugieren quede cerdo puede promover la generación de péptidosbioactivos, apoyando la idea de que la carne decerdo puede ser una buena fuente de constituyentessaludables. No obstante, son necesarios estudios inpueden ejercer una acción antihipertensiva real.AgradecimientosFigura 1. Espectro MS/MS del ion 527.32 1+ obtenido delanálisis del hidrolizado de cerdo mediante nanoLC-ESI-MS/MS. Se muestran los iones y y b encontrados por MASCOT(resaltados en negrita).Damos las gracias al Centro de InvestigaciónPríncipe Felipe (CIPF) Proteomics core facility(miembro de Proteored), y en especial a Luz Valero,por su valiosa contribución en el análisis deespectrometría de masas.

174 Tabla 1. digestión enzimática de la carne de la carne de cerdo. La actividad inhibidora in vitro de la ECA está expresada como IC 50(concentración de péptido necesaria para inhibir el 50% de la actividad ECA original).tiempoderetenciónmasa calc masa obs secuenciaproteína origen de cerdo(NCBI accesion no. )posiciónIC50(µM)25,2 589,29 589,96 MMVPI cytocromo P450 3A46 (NP001128296) 394-398 >100028,54 445,26 446,26 IGGSI beta-actina (ABI29185) 343-347 n.a a31,6 526,31 527,32 KAPVA titina (XP001925902) 4784-4788 46,5635,43 509,28 511,33 PTPVP titina (XP001925902) 4216-4220 256,4136,01 519,27 520,28 YPGIA beta-actina (ABI29185) 308-312 n.a36,89 526,32 527,32 NIIPA GAPDH b (ABI29187) 203-207 >100047,18 650,32 651,33 MYPGIA beta-actina (ABI29185) 307-312 641,0259,06 569,34 570,35 VIPEL GAPDH (ABI29187) 218-222 799,2460,35 603,35 604,36 INDPF GAPDH (ABI29187) 31-35 n.a64,87 569,34 570,36 VLPEI titina (XP001925902) 4316-4320 >1000aActividad inhibidora de la ECA no encontrada. b Gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenasaReferencias[1] Arihara, K. Functional properties of bioactivepeptides derived from meat proteins. AdvancedTechnologies for Meat Processin. CRC Press(Boca Raton) 2006; 245-246.[2] Yamamoto, N.; Ejiri, M.; Mizuno, S. Biogenicpeptides and their potential use. Curr. Pharm.Design 2003; 9 (16): 1345-1355. based protocol for quantifying angiotensin-Iconverting enzyme activity. Nature Protocols2006; 1 (5): 2423-2327. Enzyme Inhibitory Peptides from Simulatedin Vitro Gastrointestinal Digestion of CookedEggs. Journal of Agricultural and. Food Chemistry2009; 57 (2): 471-477. vineAngiotensin-Converting Enzyme. Journalof Biological. Chemistry 1981; 256 (1): 225-230.[6] Hara, H.; Funabiki, R.; Iwata, M.; Yamazaki,K. I. Portal Absorption of Small Peptides inRats Under Unrestrained Conditions. Journalof Nutrition 1984; 114 (6): 1122-1129. hydrolyses on the brush border and solublefractions of small intestinal mucosa of rat andman. Journal of Clinical Investigation 1972; 51:1419-1430.[8] Nakashima, Y.; Arihara, K.; Sasaki, A.; Mio, H.;Ishikawa, S.; Itoh, M. Antihypertensive activitiesof peptides derived from porcine skeletal musclemyosin in spontaneously hypertensive rats. Journalof Food Science 2002; 67 (1): 434-437.

175Péptidos derivados de la troponina T generados en jamón curadoLeticia Mora, Miguel Angel Sentandreu, Fidel ToldráInstituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), Apartado de correos 73, 46100, Burjassot,Valencia, EspañaResumensenteen el músculo estriado con importantes funcionesestructurales y reguladoras. Esta proteínase degrada fácilmente durante el condicionamientopost-mortem de la carne aunque todavía se desconocenlos detalles de su degradación y la secuenciade los péptidos generados en procesos más largoscomo el curado del jamón.La degradación de la troponina T (TnT) se hacorrelacionado positivamente con el ablandamientopost-mortem de la carne [1], relacionándola tambiénque sufren las proteínas musculares durante el procesadodel jamón curado han sido ampliamente estudiados,observándose cambios en proteínas estructuralescomo la TnT [4]. La hidrólisis observada enlas proteínas estructurales ayudan a entender comocuatro péptidos generados a partir de la proteolisisde la TnT durante el curado del jamón haciendo usode la tecnología proteómica.Se tomaron 50 g de músculo Biceps femoris deuna pieza de jamón curado para realizar una extraccióny posterior desproteinización, obteniendo unextracto de péptidos. Parte del extracto obtenido (5mL) se fraccionó por medio de cromatografía de exclusiónmolecular en una columna Sephadex G-25.Las fracciones correspondientes a un mayor tamañomolecular se concentraron e inyectaron en unsistema de cromatografía líquida de alta resoluciónequipado con una columna Symmetry C18 (250 x4.6 mm) y un colector de fracciones automático. Lasfracciones obtenidas después de esta cromatografíase analizaron posteriormente en un espectrómetrode masas MALDI-TOF/TOF empleando el ácidoα-ciano-4-hidroxicinámico como matriz. La inter-pretación de los espectros se realizó utilizando elalgoritmo MASCOT y la base de datos NCBInr.De los resultados obtenidos se evidencia la intensadegradación proteica que tiene lugar durantela elaboración de jamón curado. La Figura 1 muestrael espectro de masas MALDI-TOF de la fraccióneluida a una concentración del 20% de acetonitriloen la cromatografía de fase reversa. El espectro demasas muestra las masas moleculares de los ionesmonocargados ([M + H] + ) 2811.42, 2690.42,los péptidos 1, 2, 3, y 4. En la Tabla 1 se muestranlas secuencias de los cuatro fragmentos de TnT iden-por espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF apartir de las fracciones de jamón curado.Figura 1. Espectro de masas MALDI-TOF obtenido a partirde la fracción eluída al 20% de acetonitrilo en cromatografíade fase-reversa.Las calpaínas (EC 3.4.22.17) participan en laproteolisis del músculo post-mortem principalmentedurante la primera etapa del proceso de curado debidoa su baja estabilidad en presencia de elevadasconcentraciones de sal y pH ácidos, tal como ocurreen las etapas posteriores del curado. De acuerdo conlos resultados obtenidos por algunos autores trasincubar TnT de músculo esquelético de conejo bajocondiciones de baja temperatura y alta fuerza iónica[5], la enzima µ-calpaina podría ser la responsabledel sitio de corte Leu 81-Met 82,correspondiente al

176 Table 1. TOF/TOF.Péptido Masa observada (Da) Residuo en P 1 Secuencia Identificada Residuo en P' 11 2912.48 56 L57 TAPKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL 81 M 822 2811.42 57 T58 APKIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL 81 M 823 2643.37 59 P60 KIPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL 81 M 824 2515.27 60 K61 IPEGEKVDFDDIQKKRQNKDL 81 M 82en el presente estudio (Tabla 1). Sin embargo, aun-corte Thr 57-Ala 58, no podemos asegurar que estaenzima sea la responsable del extremo N-terminaldel péptido 2, ya que este mismo péptido tambiénel extremo N-terminal (péptido 1, Tabla 1), lo quesugiere una posible acción de las aminopeptidasasen la generación de este sitio de corte. El efecto dela m-calpaína en músculo de cerdo ha sido tambiéncorte Thr 57-Ala 58.que pueden tener las calpaínas en la hidrólisis de laTnT durante el curado del jamón. De hecho, parteotros autores.AgradecimientosBeca FPU del Ministerio de Educación y Ciencia(España), beca AGL2007-65379-C02-01/ALI del Ministeriode Educación y Ciencia (España) y FEDER.Especialmente al Servicio de Proteómica del Centrode Investigación Príncipe Felipe (CIPF) por su contribuciónal análisis por MALDI-TOF/TOF.ReferenciasD. E. Effect of Postmortem Storage and CalciumvineSkeletal-Muscle. Journal of Food Science1977;42: 117-124.[2] Laville, E.; Sayd, T.; Sante-Lhoutellier, V.;Morzel, M.; Labas, R.; Franck, M.; Chambon,C.; Monin, G. Characterisation of PSE zones insemimembranosus pig muscle. Meat Science2005; 70: 167-172.[3] Hwang, I. H.; Park, B. Y.; Kim, J. H.; Cho, S. H.;Lee, J. M. Assessment of postmortem proteolysisby gel-based proteome analysis and its relationshipto meat quality traits in pig longissimus.Meat Science 2005;69: 79-91.[4] Toldrá, F.; Rico, E.; Flores, J. Cathepsin B,D, H and L Activities in the Processing of Dry-Cured Ham. Journal of the Science of Food andAgriculture 1993; 62: 157-161. -Sweeney, P. L. H.; O’Neill, E. E. Characterizationof peptides released from rabbit skeletalmuscle troponin-T by mu-calpain under conditionsof low temperature and high ionic strength.Meat Science 2001; 59: 61-69.[6] Kitamura, S. I.; Muroya, S.; Tanabe, S.; Okumura,T.; Chikuni, K.; Nishimura, T. Mechanismof production of troponin T fragments duringpostmortem aging of porcine muscle. Journalof Agricultural and Food Chemistry 2005; 53:4178-4181.[7]. Muroya, S.; Kitamura, S.; Tanabe, S.; Nishimura,T.; Nakajima, I.; Chikuni, K. N-terminalamino acid sequences of troponin T fragments,including 30 kDa one, produced during postmortemaging of bovine longissimus muscle. MeatScience 2004; 67: 19-24.

177Instrucciones a los autoreshttp://www.cbm.uam.es/seprot/Envío de los manuscritos: Mediante correo electrónico bf1jonoj@uco.esProteómicaro-febreroy julio-septiembre) y será publicada por el Servicio de Publicaciones de la Universidad de Córdoba.Esta revista publicará artículos originales y comu-así como artículos de revisión, tutoriales y opiniones,notas, resúmenes de tesis doctorales o comentariossobre cualquier aspecto relacionado con la proteómica.Incluirá información sobre nuestra Sociedad ysobre los socios, grupos e instituciones que la componen.El idioma será el castellano, aunque se admitiráncontribuciones en otras lenguas, preferentemente elinglés. Aunque Proteómica se distribuirá preferentementeen España y Latinoamérica, pretende tener uncarácter internacional, extendiendo su distribución aotros países. Esta revista se envía, sin coste alguno, alos socios de la SEProt, a Unidades y Servicios quetrabajen en este campo, y a instituciones y organizacionespúblicas o privadas vinculadas a la sociedad ocon actividad relevante en el campo de la proteómica.Existirá una versión impresa, editada por el Serviciode Publicaciones de la UCO, y una versión “on-line”que aparecerá en la página web de la SEProt y de laUniversidad de Córdoba.Todas las contribuciones serán revisadas por elcomité editorial, y su formato deberá ajustarse a lasinstrucciones que se adjuntan. Los artículos originales,las comunicaciones breves, las revisiones y losdos revisores elegidos por el comité editorial. Todasy no necesariamente la opinión del Comité Editorialni de la Junta Directiva de la SEProt.Los manuscritos se enviarán por correo electrónico,a la dirección bf1jonoj@uco.es Los artículosoriginales, las revisiones y los tutoriales deberánir acompañados de una carta de presentación deltrabajo (cover letter) y tendrán una extensión máximade 15 páginas A4; las comunicaciones brevestambién deberán incluir una carta de presentación ytendrán una extensión máxima de 8 páginas A4. Losresúmenes de las Tesis Doctorales pretenden ser unaforma de comunicar el trabajo realizado durante elperiodo doctoral, a la vez que os ayudará a daros aconocer, por lo que el resumen debe de ir acompaña-investigación. La extensión no debe de ser superiora 4 páginas. El resto de las contribuciones tendráuna extensión máxima de 4 páginas. Para el cálculode la extensión se tendrán en cuenta, además delreferencias. No se considera la publicación en coloren la versión impresa, por lo que las ilustraciones,Deberán enviarse, en archivos separados, por una la calidad requerida y que el texto que incluyan lastexto. El texto debe ajustarse al siguiente formato:letra Times New Roman, tamaño 12, doble espacio,Los artículos originales deben tener las siguientessecciones:Portada. Incluirá el título, la lista de autorescompletos del autor con el que se mantendrá lael caso de que exista más de una, se indicarámediante un símbolo en formato superíndicedetrás del nombre de cada autor.Resumen (máximo de 250 palabras) y palabrasclave (máximo de 6, separadas por comas).Introducción. Deberá evitarse una revisión de-adecuadamente el contenido del trabajo.

178 Materiales y métodos. Esta sección deberá serbreve, limitándose a describir los procedimientosque sean novedosos y referenciando aquellos yadetalle para permitir la repetición de los experimentos.Resultados.Discusión. Los Resultados y la Discusión podránagruparse en una única sección.Referencias.Agradecimientos.Las abreviaturas se incluirán como nota al piéde página la primera vez que aparezcan en el texto.Como norma general, no deben incluírse abreviaturasni en el título ni en el resumen.a partir del número 3 de la revista, será un formatobasado en la revista Journal of Proteomics. Las referenciasse citarán en el texto mediante números entrecorchetes cuadrados de acuerdo a su orden de citación:cita simple[1], cita de varias referencias[2-4],cita de referencias alternadas[1, 3-5]. Todas las referenciasdeben ser numeradas de forma consecutiva.Las referencias a trabajos que no hayan sido publicadosno se incluirán en la sección de Referencias;dichos trabajos deberán citarse, en el texto y entreparéntesis de acuerdo al siguiente formato: (CorralesF, Jorrín J, resultados no publicados), (CorralesF, Jorrín J, manuscrito enviado), (Jorrín J, CorralesF, comunicación personal).Las publicaciones serán citadas en la secciónde Referencias según su orden de aparición y deacuerdo a los siguientes ejemplos: for genomewide studies. Proc Natl Acad Sci US A 2003;100:9440-5.[2] Ong SE, Blagoev B, Kratchmarova I, KristensenDB, Steen H, Pandey A, et al. Stable isotope labelingby amino acids in cell culture, SILAC, as asimple and accurate approach to expression proteomics.Mol Cell Proteomics 2002;1:376-86.tideMass Searching of a Sequence Database enMass Spectrometry in the Biological Sciences(editores: Burlingame A.L. y Carr S.A.), HumanaPress, Totowa, New Jersey 1996, pp. 151-70.[4] Kyte J. Mechanism in Protein Chemistry, GarlandPublishing, Inc., 1995.[5] Castillejo MA. Análisis de los cambios de expresiónproducidos por un inhibidor de quinasas encélulas endoteliales. Tesis Doctoral, Universidadde Córdoba, 2005.Con objeto de facilitar la edición de los manuscritosEndNote denominado Proteomica.ens, accesible desdeque colocarlo en el subdirectorio Styles del EndNote.y se citarán en el texto en el siguiente formato: ta-podrán incluir notas a pie de tabla, que se referiránal contenido de la tabla usando símbolos en formatoleyenda conteniendo un titulo lo más representativotexto explicativo lo más conciso posible; la descrip-caso, deberá hacerse en el texto del manuscrito.Las comunicaciones breves deben ajustarse almismo formato que los artículos originales, y contendránun resumen (máximo 250 palabras), una lista depalabras clave (máximo de 6, separadas por comas),una única sección conteniendo el texto principal,y las referencias y agradecimientos, además de lasadecuadamente el tema, explicar la metodología utilizada,y comentar y discutir los resultados.Los artículos de revisión y los tutoriales tendránun formato libre pero deberán incluír un Resumen(máximo 250 palabras) y una lista de palabras clave(máximo de 6, separadas por comas). El resto delas contribuciones tendrá un formato libre. Todaslas contribuciones deberán respetar el formato deabreviaturas y referencias.Los resúmenes de las Tesis Doctorales incluiránlos siguientes apartados: título de la tesis, autor, dirección web donde se puede consultar la tesiscompleta, si existe, resumen del trabajo (este apartadopuede organizarse según el criterio del autor),en la tesis, bibliografía, reseña del grupo de investigaciónen el que se ha realizado el trabajo (máximo200 palabras). Se puede incluir una foto del grupo.