Tema 7. TECNICAS BASICAS DE BM.pdf - VeoApuntes.com

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoTema 7. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULARIntroducciónLa biología molecular es una herramienta multidisciplinar usada por varias ciencias para suavance, por ejemplo ciencias como:• Zoología • Botánica • MicrobiologíaRespecto a la zoología y botánica tiene especial importancia la descripción molecular deespecies, para distinguir una especie de otra, por ejemplo a la hora de identificar una nuevaespecie y detectar desplazamientos por la intrusión de especies no autóctonas.En microbiología tiene importancia para modificar el genoma de estos microorganismos ymodificar sus plásmidos (técnica del DNA recombinante). Esto se utiliza en biorremediación,que consiste en utilizar un organismo vivo para luchar contra un contaminante que suele serde origen químico.También puede utilizarse para crear transgénicos (OGMs) lo cual tiene distintas aplicacionescomo la ingeniería agroalimentaria, etc…Utilizamos la biología molecular por ultimo el análisis de productos para detectar fraudes, yotras diversas aplicaciones (aunque para ello requerimos células nucleadas en el producto)En medicina forense se utiliza para la identificación de individuos.En medicina y diagnostico clínico utilizamos la biología molecular en dos métodosdiagnósticos fundamentalmente: Diagnostico de enfermedades hereditarias. Para ello nos basaremos en las leyes deMendel y en nuestro conocimiento de las patologías que deseamos estudiar Diagnóstico de enfermedades infecciosas. Permite detectar microorganismosobservando la presencia del DNA patógeno en la muestra biológica del paciente, loque nos permite cuantificar la carga viral de un individuo.1

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoTécnicas básicas Extracción de ácidos nucleicosLos ácidos nucleicos se sacan o bien de muestras de tejidos o de fluidos, aunque la técnica esdistinta según de donde provenga nuestra muestra. Podemos extraer muestras de:• Tejido hepático• Tejido muscular• Tejido intestinal• Sangre periférica• Tejidos tumorales• Piel• Raíz de pelo• Saliva• Exudados bucales• Exudados vaginales• Medula ósea• Huesos• Pulpa de dientes• Semen• Liquido amniótico• Liquido cefalorraquídeo• OtrosLas técnicas de extracción sirven tanto para la extracción de DNA como para la de RNA, con ladiferencia que para trabajar con RNA es preciso la extracción en frío o con estabilizadores deRNA.Utilizamos el RNA para cuantificar la expresión de un RNA mensajero y por tanto laexpresión de determinadas proteínas, y cuantificar las respuestas celulares a determinadascircunstancias (diabetes, gestación…).Hemos de seguir un determinado protocolo:1. Lisis celular2. Precipitación de proteínas3. Centrifugación y separación de la fase acuosa con ácidos nucleicos4. Precipitación de DNA con alcoholes orgánicos ElectroforesisLa electroforesis se basa en la cualidad que tienen los ácidos nucleicos de desplazarse en unmedio con carga con una velocidad inversamente proporcional a su tamaño (esto es, losDNA grandes van mas despacio).Los ácidos nucleicos tienen carga negativa y por eso se desplazan hacia el catión (+).2

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoLos soportes utilizados tienen naturaleza de gel y pueden ser para ácidos nucleicos:• Agarosa • PoliacrilamidaNos permite separar fragmentos de tamaño parecido variando las concentraciones deagarosa o poliacrilamida. Cuanto mayor sea la concentración del gel, mayor será la capacidadde separación, de resolver entre dos fragmentos de tamaño muy similar.Antes los geles de secuenciación que diferenciaban fragmentos con 1 nucleótido de diferenciaeran de poliacrilamida, hoy se hace de otra manera con base electroforética quedescribiremos a continuación en esta misma unidad.Antes de realizar la electroforesis, el DNA irá disuelto en un colorante para cargarsatisfactoriamente los pocillos, pero no tiene afinidad por el DNA, por lo tanto una vez hemosllevado a cabo la electroforesis debemos usar un colorante que sea físicamente afín por elDNA para observar el bandeado.Los más utilizados son:• Poliacrilamida. Utilizamos el nitrato de plata.• Agarosa. Utilizamos bromuro de etidio.Ambos son agentes intercalantes del DNA y por tanto muy citotóxicos por lo que requierennumerosas normas de seguridad, a pesar de ello, aportan una resolución estupenda delbandeado.La electroforesis sirve para: Evaluar la cantidad y calidad (integridad) del DNA extraído de una muestra. Valorar el resultado de una PCR Observar el resultado de una digestión enzimática con enzimas de restricción (técnicadel fingerprinting) Análisis de restricciónEsta técnica aprovecha la capacidad natural de las endonucleasas de restricción presentes deforma natural en células procariotas de escindir los enlaces fosfodiéster de la cadena deácidos nucleicos.Lo más importante de estas enzimas es su gran especificidad a la hora de reconocer unasecuencia concreta diana dentro del DNA bicatenario que nos permiten cortar la molécula deDNA.Esta técnica es precisa entre otras cosas para construir plásmidos artificiales, ya que lasenzimas de restricción dejan extremos cohesivos en el DNA al cortar en zigzag.3

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoLas enzimas de restricción más conocidas son:Hae IIIBam HIEco RILos nombres de la enzima designan a la bacteria de la que proviene, y los números, el tipo deenzima o la cepa.• Clínica del fingerprintingHay enfermedades que identificamos utilizando digestión enzimática ya que son ocasionadaspor un cambio puntual en un nucleótido:‣ Hemofilia A (factor VIII). El alelo normal tiene una secuencia TCGA pero elalterado lo cambia por un TTGA. El cambio en este alelo produce que la enzima Taq Ino reconozca su diana.La hemofilia A ocasiona el defecto en el factor VIII de la coagulación, lo que impide lacorrecta hemostasia (hemorragias frecuentes). La información para el factor VIII seencuentra en el cromosoma X, lo que ocasiona que los hombres sean más proclives aesta patología ya que solo tendrán una copia de ese gen específico, con lo que siheredan un cromosoma con un gen dañado del factor VIII, es el único gen que recibeny no tienen información de respaldo, por lo que no podrán producir ese factor decoagulación.‣ Anemia falciforme. La hemoglobina está formada por cadenas y cadenas . Laanemia se produce por la mutación del gen de la -globina que se encuentra en elcromosoma 11 lo que produce un cambio de aminoácido que conlleva la perdida de ladiana para la enzima Mst I.La mutación del gen de la -globina da lugar a la hemoglobina S que produce daño enel eritrocito cambiando su forma de disco por forma de hoz, lo que provoca queademás de tener fallo en el transporte de oxígeno se queden atascados en loscapilares.La selección natural tiende a eliminar la prevalencia del alelo S, sin embargo enregiones endémicas de malaria, personas con el alelo funcional son afectados demalaria, sin embargo los heterocigotos para el alelo S se ven ligeramente afectadospor la anemia, pero tienen resistencia a la malaria, por ello hay una prevalencia altade esta enfermedad.4

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoTécnicas de BM aplicadas al diagnóstico1) REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)Técnica mediante la cual se puede obtener un diagnóstico directo.La PCR (Polymerase Chain Reaction) se trata de una técnica descubierta en 1983 por KaryMullis, cuyo objetivo es amplificar un fragmento del genoma que deseamos estudiar. Permitela replicación in Vitro de DNA y cDNA (DNA copia).La reacción de PCR requiere una serie de reactivos indispensables:- DNA molde suficientemente puro y en cantidad (pequeña) suficiente.- Enzima bacteriana (Taq Polimerasa). Está aislada de una bacteria termorresistente loque permite llevar a cabo las reacciones a altas temperaturas sin degradarse.- Desoxinucleótidos. Son los 4 nucleótidos necesarios para formar la cadena de DNA.Permiten ciertas modificaciones de marcaje como la unión de digoxina, biotina ofluoróforos.- Solución tampón. Contiene sales que mantienen el pH y la fuerza iónica del medio.- Mg 2+ . Es el cofactor de la Taq Polimerasa.- Cebadores. Los necesitamos para delimitar la región de todo el genoma que nosotrosqueremos amplificar. Necesitamos 2, uno que delimite la secuencia por arriba y otropor abajo. Los cebadores son oligonucleótidos de DNA que tienen un tamaño variable(18-25 pb).- Agua libre de enzimas nucleasas.Consta de tres etapas:1. Desnaturalización. Se separan ambas hebras de DNA molde para que se puedan unirlos cebadores a su secuencia en el paso siguiente. Necesitamos aumentar latemperatura a 95º C (30-60’’).2. Hibridación o anillamiento. Debe ser específica entre la hebra molde y el cebador.Cuanto más tiempo se deje, más probable es que el anillamiento sea inespecífico.También es importante la temperatura, lo bastante alta para que la unión seaespecífica y lo bastante baja para que sea estable, y es de unos 45-65º C (30-60’’).3. Replicación. Se inicia la elongación de la hebra de interés. Se lleva a cabo de formasimilar a una replicación de DNA estándar. Oscila entre 25-40 ciclos de temperaturas yse lleva a cabo a una temperatura de 68-72 ºC.5

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoLa velocidad de aparición del producto de ampliación (amplicón) es exponencial.- Primera fase de background: no detectamos la aparición del producto.- Segunda fase de crecimiento: el producto crece de forma exponencial ya que cadaproducto de la anterior reacción sirve de molde para la siguiente reacción.- Tercera fase de meseta (al final de la reacción de PCR): ya no aumentaapreciablemente el número de hebras de DNA debido al agotamiento de los sustratosy a un cierto impedimento estérico (es decir, falta de espacio dentro del tubo)• Variantes de la PCR:- PCR larga. Consiste en amplificar un fragmento largo (5-40 kilobases).- PCR anidada (nested). Consiste en dos reacciones de PCR una tras otra. En la segundautilizamos como molde el producto de la primera. Nos sirve para detectar especiespatógenas, ya que en una primera reacción amplificamos el género y en la segunda laespecie (WTF????)- RT-PCR. Se basa en la retrotranscripción, y utiliza una transcriptasa inversa(polimerasa que parte de mRNA maduro como molde) y lo transforma en cDNA. ElcDNA permite que trabajemos con él con una PCR común.- PCR en caliente (Hot Start). Es la que se utiliza normalmente y aumenta mucho elrendimiento de las reacciones, se basa en el uso de temperaturas elevadas durante laamplificación. Además permite no ser tan cuidadoso con las temperaturas previas yaque la actividad de la polimerasa esta inhibida por un anticuerpo, que solo la va asoltar cuando la temperatura aumente a 95º durante 10 minutos.6

Alberto Gómez Esteban & Laura del Olmo• Clínica en la PCR‣ Enfermedad de Huntington (baile de San Vito). Es una enfermedadneurológica degenerativa autosómica dominante que conlleva una alteraciónconductual, motora y de percepción de la realidad.Esta enfermedad está causada por una expansión de triplete (CAG) que en función delnúmero de veces en que aparezca se da una determinada gravedad de la enfermedad.En todos los individuos existe una expansión de este triplete pero:- Si hay 10-35 copias (normalmente 15-20) el individuo es sano.- Si hay 36-121 repeticiones el individuo está afectado por la enfermedad deHuntington.Cuantas más repeticiones existan del CAG más grave será la enfermedad.Estas secuencias se denominan puntos calientes debido a que son altamentemutables en cada replicación de generación a generación. La edad de aparición sesitúa sobre 40-50 años, pero en una expansión muy grande de la secuencia adelanta laaparición de esta patología.2) PCR A TIEMPO REAL: (A) CUANTITATIVA y (B) CUALITATIVAEsta PCR se lleva a cabo en una máquina que permite además de amplificar un producto dePCR cuantificarlo y hacer un análisis cualitativo, aumentando enormemente la sensibilidad delproceso.La característica principal de esta técnica es que se va a monitorizar continuamente laaparición del producto amplificado midiendo la fluorescencia de las cadenas sintetizadas, quees proporcional a la cantidad de amplicones.La cantidad de material de partida se cuantifica mediante el llamado Crossing Point, que setrata de un punto en la gráfica (producto/tiempo) que cuantifica el tiempo que tarda encruzarlo una cantidad de DNA. El tiempo que tarde nos informa de la cantidad de productoinicial.7

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoEn esta grafica podemos comprobar que la muestra verdetiene menor material genético que las otras dos debidoa que tarda más ciclos en cruzar el crossing point.La PCR a tiempo real cuantitativa sirve para cuantificar la carga viral de un paciente(averiguar la cantidad de material genético viral presente en sangre).La PCR a Tiempo Real es una PCR tradicional en la que se va cuantificando el producto deampliación a medida que se genera con fluorescencia.Posibilidad de construir rectas de calibrado conociendo la concentración exacta del DNA einterpolando el resultado de fluorescencia obtenido en la muestra cuantificando la cantidadde DNA.A. PCR a Tiempo Real Cuantitativa: cuantifica cargas virales humanas.Hay que construir rectas de calibrado midiendo las fluorescencias que generan muestras deconcentraciones conocidas.En una batería de diluciones seriadas de concentración conocida medimos la concentraciónhaciendo una recta, e interpolando en la recta calculamos la concentración de productoamplificado de PCR que hay en mi muestra.Aplicaciones de la PCR a tiempo real cuantitativa: Detección de organismos genéticamente modificados en los cuales se detectadirectamente el DNA del transgen o DNA extraño. En realidad se detecta el promotory el terminador de ese transgen para determinar GMOs (Organismos GenéticamenteModificados).8

Alberto Gómez Esteban & Laura del Olmo Cuantificación de cargas microbianas en alimentos. Detección de citopatógenos en la industria agraria, especialmente en plantas que vandestinadas a grandes plantaciones para el consumo humano.Aplicaciones relacionadas con la clínica médica: Cuantificación de las cargas virales de hepatitis B o VIH. Muy importante paraconocer su eficacia exacta, la cual se puede averiguar cuantificando las cargas virales.Si estos virus disminuyen será que la carga es la adecuada. Cuantificación de la expresión génica: REAL TIME – Q – PCR (RT-Q-PCR). Paracuantificar la expresión génica necesitamos partir de todo el RNA (mRNA) del tejidoque se esté estudiando. Lo extraemos, lo pasamos a cDNA mediante laretrotranscripción y éste se podrá cuantificar de 2 maneras:I. En valores absolutos, empleando rectas de calibrado.II.En valores relativos, empleando un gen de referencia denominado genHouseKeeping, que codifica por una proteína cuya función es básica y que seva a expresar siempre en todas las situaciones fisiológicas (ej.: glicerofosfatoDH). Considerando a este gen como la expresión basal lo comparamos con laexpresión del gen que queremos estudiar para ver si la expresión estáaumentada o disminuida.Mide cambios en la fluorescencia relacionados con el producto de PCR que estásaliendo. Realmente lo que se compara son cantidades de fluorescencia.B. PCR a Tiempo Real CUALITITAVA: genotipan una muestra.- Objetivo: genotipar una muestra, es decir, averiguar su secuencia y qué nucleótidohay en una posición concreta. En prácticas lo hacíamos acoplando una reacciónenzimática con enzimas de restricción o con técnicas de hibridación.- ¿Cómo se hace? Siempre realizando una curva de “melting” y monitorizando lafluorescencia. Con la curva de “melting” somos capaces de obtener diferencias entreun fragmento amplificado que contenga la mutación y otro que no la contenga, lo quese consigue monitorizando la fluorescencia (la cual suele ir disminuyendo; se obtienenpicos de fluorescencia que serán fáciles de interpretar: solo habrá 2, uno quecorresponde a la mutación y otro que corresponde al "wild type" o tipo salvaje).9

Alberto Gómez Esteban & Laura del Olmo- ¿En qué consiste la curva de “melting”? La curva de “melting” consiste en aumentar latª hasta 95º de forma lenta y progresiva, de medio grado en medio grado, hasta lacompleta desnaturalización del producto de PCR (que va a ir separándose ydesnaturalizando).Una curva de “melting” será el aumento progresivo de tª de forma que se produce ladesnaturalización del producto de PCR.- ¿Qué es el PUNTO DE “MELTING” o “CROSSING POINT”? Es la tª a la cual la mitad delproducto de PCR está desnaturalizado y la otra mitad todavía no. Si la tª sigueaumentando finalmente todo el producto se desnaturaliza.El punto de “melting” es característico de la secuencia, es decir, depende de lasecuencia de nucleótidos que el “Crossing point” esté a tª mayor o menor. Un solonucleótido de diferencia es capaz de desplazar algo el “Crossing Point”. La tª escaracterística de cada fragmento amplificado, que depende de sus nucleótidos.- ¿Cómo se obtiene el “Crossing Point”? Para saber cuál es el punto de “melting” habráque hacer la primera derivada de la fluorescencia. Cuando cambia la fluorescencia auna tª concreta nos sale un pico y hacemos su derivada para conocer el “CrossingPoint”.Solo hay un pico por fragmento de amplificación.‣ TIPOS DE FLUORÓFOROS: (I) INTERCALANTES (SYBR Green) y (II) SONDAS(FRET y TaqMan)Los distintos tipos de fluoróforos que emiten fluorescencia para que podamos medir son de 2tipos:I. Intercalantes: SYBR Green inespecífico (de forma mayoritaria) / EvaGreen (de última generación)El SYBR Green se intercala, se mete dentro de toda doble hebra de DNA,independientemente de su secuencia, por lo que es inespecífico (siempre que haya unadoble hebra se va a intercalar) y emite fluorescencia cuando está intercalado.Lo normal es que nuestro producto de amplificación esté en doble hebra. La fluorescencia seva a medir y se va a correlacionar con la cantidad de producto amplificado. Se intercala hastaque comienza una nueva fase de desnaturalización.Si la doble hebra está separada/desnaturalizada el SYBR Green no se une y no se recogeráfluorescencia.10

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoLa fluorescencia producida por el SYBR Green será máxima al final de laelongación, y será cuando vamos a medirla.II.Sondas específicas: FRET y TaqManSon específicas de la secuencia (al contrario que los intercalantes). Pueden ser de 5 tipospero las 2 que más se emplean son las siguientes:- Sondas FRETAprovechan la tecnología FRET, que es un análisis de trasferencia de energías resonantesfluorescentes.Para cada punto polimórfico que queramos estudiar vamos a necesitar 2 sondas: Una va marcada con un fluoróforo donante. La otra con un fluoróforo aceptor/receptor.Las sondas van a hibridar complementariamente en la secuencia de DNA (si encuentrancomplementariedad) y si hibridan las 2 van a quedar situadas muy próximas la una de laotra, a una distancia entre 1-5 Nt o 1-5 pb. Si esto sucede el fluoróforo donante excita alfluoróforo aceptor y en este momento (en el que las sondas han quedado próximas entre sí)se produce un cambio en la longitud de onda de la fluorescencia que está recibiendo nuestroaparato detector. El cambio en la longitud de onda nos indica que las sondas han hibridado ensu sitio correcto.- Sondas TaqMan de hidrólisis Extremo 3´ de la sonda: tiene un fluoróforo. Extremo 5´ de la sonda: tiene un bloqueante de la fluorescencia llamado “quencher”.En la etapa de anillamiento de la hibridación se hibridan tanto cebadores como las sondas,que están diseñadas para hibridar en la mitad de la sonda. Cuando llega la polimerasacomienza a elongar el producto y se topa con el “quencher” de la sonda TaqMan, el cuallibera (hidroliza), y en este momento se produce el desbloqueo de la fluorescencia queentonces podrá empezar a ser recogida.11

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoDiferencia entre sondas FRET – TaqMan- Sondas FRET: miden la fluorescencia mientras están hibridadas.- Sondas TaqMan: tiene que actuar la polimerasa para hibridar la sonda para poder comenzar adetectar la fluorescencia.- Sondas marcadas con un fluoróforo: mide la fluorescencia al final de la etapa de hibridación..- Sondas marcadas con un fluoróforoEmiten el color que nosotros queramos. En este caso tengo una sonda específica que se va aunir al producto de PCR que contiene el punto polimórfico de mi estudio.Aplicación: para amplificar más de un producto de PCR dentro de la misma reacción/mismotubo, es decir, para hacer una reacción multiplex, ya que si marcamos cada sonda con uncolor distinto seremos capaces de diferenciar hasta 5 productos de PCR distintos dentro delmismo tubo (5 puntos polimórficos de interés). Cada sonda con su color se hibrida en la sondacon su producto.*Otras sondas menos empleadas son: Scorpions y Molecular Beacons.• Caracterización del producto de PCR‣ INTERCALANTE SYBR GREEN: NO ES CAPAZ DE REGISTRAR UN CAMBIO DEFLUORESCENCIA SI HAY UN NT CAMBIADO (al contrario que la HRM).Mediante el intercalante SYBR Green (que solo se intercala en determinados puntos, deforma salteada y dejando espacios, no en cada pb como en la HRM), intercalado en elproducto de PCR, como la fluorescencia está monitorizada se puede observar que a medidaque se hace la curva de "melting" la fluorescencia disminuye (mientras el producto se vaseparando).Una vez recogidos los cambios de fluorescencia y que ya se ha hecho la PCR tenemos queidentificar si la muestra contiene el genotipo "wild type" o salvaje o si contiene la mutaciónen homocigosis o es portador/heterocigótico, pero esto no se podrá hacer mediante esteintercalante, como explicaremos a continuación.En el caso de que utilicemos la sonda SYBR Green, al hacer la curva de “melting” (que es loúnico que caracteriza a un producto de amplificación, por tanto habrá que hacerla siempre),para identificar mi producto de PCR tendremos que ver su tª o punto de "melting"característica.12

Alberto Gómez Esteban & Laura del OlmoPero este intercalante NO será capaz de distinguir cambios en un Nt, y estos cambiosprovocan que la tª o punto de "melting" no sea la misma para un cambio en un Nt, ya que latª a la cual tengo que llegar cuando hay una G es superior a cuando hay una A (por lospuentes de H).El SYBR Green sirve para cuantificar y para ahorrar la electroforesis de después, puesestamos obteniendo temperaturas de “melting” que corresponden con mi fragmento deamplificación, por tanto sé que he obtenido un producto amplificado y sé que es el quequiero, pero NO somos capaces de genotiparlo/obtener su secuencia (esto se hará consondas, ya que los cambios que se producen cuando tengo las sondas unidas al producto dePCR son suficientemente grandes en las temperaturas de "melting" como para ser detectadas).Como ya hemos explicado anteriormente, los valores de fluorescencia van disminuyendo amedida que se aumenta la tª. El producto de PCR se va desnaturalizando poco a poco y lasfluorescencias obtenidas van disminuyendo y se van registrando continuamente, lo que nosda lugar a las curvas.Habrá diferencias en la curva de fluorescencia según la secuencia que tenga nuestroproducto, y al hacer la primera derivada obtendremos unos picos que nos permitirándiferenciar un genotipo salvaje o “wild type” de uno mutado, y si es mutado nos permitirádistinguir entre homocigoto o portador heterocigoto.‣ “HIGH RESOLUTION MELTING” (HRM): ES CAPAZ DE REGISTRAR CAMBIOS DEFLUORESCENCIA CUANDO SOLO CAMBIA UN NT.Haciendo la HRM con sondas somos capaces de genotipar, de separardistintas temperaturas de “melting” debidas a cambios en nucleótidos.Hay una nueva técnica, la High Resolution Melting (HRM), que consiste en utilizar un agenteintercalante fluorescente equivalente al SYBR Green pero a modo de saturación, es decir, seintercala en cada pb, a diferencia del SYBR Green que se intercala a saltos.Al hacer la HRM SÍ seremos capaces de genotipar, pues obtendremos en función de lasecuencia de Nt que tenga el fragmento amplificado, distintos cambios de fluorescencia.13

Alberto Gómez Esteban & Laura del Olmo3) ANÁLISIS DE FRAGMENTOSTanto el análisis como la secuenciación de DNA se basan en la electroforesis capilar;electroforesis porque va a ser una electroforesis normal, en la que las moléculas de DNA semoverán gracias a su carga negativa empujadas por un campo electromagnético hacia el polopositivo y se van a ir separando en función de su tamaño; capilar porque la electroforesis va atener lugar a través de un capilar de silicio y no de un gel de agarosa o poliacrilamida.Con el análisis de fragmentos podemos obtener resultados equivalentes a los queobteníamos con los geles de agarosa y de poliacrilamida.Cuando analizamos fragmentos lo que tenemos marcado con fluorescencia es el cebador,que unido al producto de amplificación emite una señal cuando llega al final del capilar, y asívamos a ir obteniendo unos resultado en forma de picos, que al compararlos con un estándarde tamaño conocido (como el marcador de peso molecular que metíamos en el gel deagarosa) seremos capaces de determinar si ha habido o no amplificación, y si la ha habido dequé tamaño ha sido.Es muy útil para estudiar muchos polimorfismos a la vez (“screaming”) ya que con unamisma reacción somos capaces de analizar varios puntos polimórficos del genoma. Porejemplo se realiza con la enfermedad de la fibrosis quística y en las pruebas de paternidadpara la identificación de individuos.4) SECUENCIACIÓN DE DNALo que queremos es averiguar cuál es la secuencia de un fragmento de DNA desconocido.Hay diferentes métodos de secuenciación:1. Terminadores fluorescentes. Basado en el método tradicional SANGER.Se utilizan nucleótidos terminadores (les falta el –OH en posición 3´), losDIDESOXINUCLEÓTIDOS. Cuando se incorpora en una cadena esta se interrumpe, se para ahíporque no se puede crear el enlace fosfodiéster por ese lado.‣ Requisitos: 4 tubos distintos con la muestra que deseamos secuenciar y a cada tubo con lamuestra le añadimos los 4 nucleótidos: A, C, G y T. Un cebador. Una enzima polimerasa modificada.14

Alberto Gómez Esteban & Laura del Olmo‣ Procedimiento:1) Añadimos un didesoxi terminador diferente a cada tubo:- T1: didesoxi con A (dd-A)- T2: didesoxi con T (dd-T)- T3: didesoxi con C (dd-C)- T4: didesoxi con G (dd-G)2) Comienza la reacción, se une el cebador y la polimerasa comienza la elongación.Con esa mezcla de nucleótidos la adenina con didesoxi compite con la adenina normal ycuando se mete en la cadena hace que pare la reacción. Según la dd-A se meta antes odespués obtenemos fragmentos de distinto tamaño, todos terminados en A. En cada uno delos otros tubos ocurrirá lo mismo.3) A continuación marcamos con un color diferente cada didesoxi, es decir, esenucleótido terminador didesoxi va tener un color diferente según sea dd-A, dd-T, dd-Co dd-G.4) Hacemos una electroforesis capilar y obtendremos fragmentos de distinto tamañoque llegaran a una determinada distancia (los más pequeños llegan antes al final delcapilar y los de tamaño mayor se quedarán al final). Juntamos los resultados de los 4tubos y como tienen distinta longitud nos van a dar un patrón de bandeo para asípoder descifrar el orden de nucleótidos que hay en la secuencia.La electroforesis que vamos a realizar ahora es a través de un capilar (no de un gel). El tubocon todo lo que necesitamos (incluidos los 4 didesoxiterminadores marcados con fluoróforosdistintos) van a generar fragmentos de distintos tamaño. Con la electroforesis los fragmentosse ordenan en tamaño y al salir del capilar hay un láser de argón que excita a los fluoróforoscon los que he marcado los didesoxi, dándonos un cromatograma, es decir, picos de coloressegún en qué didesoxiterminador acabe el fragmento (dd-A = color rojos, dd-T = color azul…).Con este procedimiento podremos identificar el cambio en un nucleótido, es decir, podemosdistinguir una mutación en el “wildtype”.Solo podemos secuenciar unos 1000 nucleótidos seguidos, porque habrá unmomento en el que el cromatograma no podrá resolverlo.15

Alberto Gómez Esteban & Laura del Olmo2. SHOT GUN. Consiste en fragmentar el DNA y clonarlo en plásmidos distintos; cadacual tiene en su interior un inserto de DNA de distinto tamaño al azar y flanqueando aese fragmento tiene un promotor y un terminador. Empezamos a secuenciar por esepromotor con una secuencia que conocemos y así obtenemos distintas secuencias decada clon. Finalmente necesitamos un análisis informático que nos dé los resultados.3. PIROSECUENCIACIÓN. Consiste en microgotas donde va a tener lugar la reacción(…) y un software nos dará los resultados. Se realiza para genomas muy grandes.5) MICROARRAYSPara finalizar el tema cabe añadir que el estudio molecular esposible porque conocemos la secuencia del genoma. Sin estasecuencia base no sería posible realizar ningún estudio. CONCEPTO DE EPIGENÉTICALa regulación epigenética consiste en la modificación de la expresión génica pero sin resultarmodificada la secuencia de DNA.Hay distintos fenómenos de regulación epigenética y todos son heredables.Podemos modular la expresión de un gen (sobre todo genes multifactoriales) regulando suexpresión pero no a nivel de la molécula de DNA, si no a nivel de los factores epigenéticosque están muy influenciados por factores ambientales.Tiene lugar principalmente a nivel de fenómenos de metilación en la cadena de DNA, siendomodificadas también las histonas.16