Control y Diagnóstico de Micoplasmas en el Complejo ... - WPSA

Puntos prácticos en el controlde la Micoplasmosis Aviar47º Seminario AECA, Barcelona 2010RAÚL L O. CERDÁ , PhD*Facultad de Ciencias VeterinariasUniversidad Nacional de La Plata*ECO Animal Health, Inglaterra

Puntos a desarrollar• Definición n de Micoplasmosis Aviar (MA)• Puntos epidemiológicos más m s relevantes• Diagnóstico• Situación n de la MA en el mundo y LATAM• Prevención n y Control• Erradicación n ?????• Conclusiones

Definición• Micoplasmosis Aviar:• M. gallisepticum (MG): ERC (pollos); SI (pavos)• M. synoviae (MS): ERC y Sinovitis Infecciosa (pollos ypavos)• Entre las principales enfermedades de la producciónavícola• Amplia distribución n mundial• Grandes pérdidas peconómicas• Importantes agentes del complejo respiratorio de lasaves

Complejo Respiratorio de las Aves• Asociación n de factores múltiplesm• Medio ambiente (humedad, temp.,amoníaco, aco, etc.)- Manejo• Densidad animal (estrés)s)• Micotoxinas• Virus inmuodepresores (Gumboro, AI, EM,Reovirus)• Virus respiratorios (EN,BI,IA,LT,NV)• Bacterias (E. coli, Coriza, ORT, Pasteurella)• Micoplasmas (MG, MS)

Puntos epidemiológicosmás s relevantes

Factores que dificultan sucontrol y erradicación• Concentración n de granjas en regiones• Granjas de edades múltiplesm• Deficiencias de manejo• Fallas de bioseguridad• Transmisión n vertical y horizontal• Fallas en técnicas tde diagnóstico

Características diferenciales delos Micoplasmas• Bacterias procariotas (Mollicutes)• Extremadamente pequeños (300-600 nm)• Carencia de pared celular• Pleomórficas y flexibles• Carencia de elementos de resistencia y antigenicidad(capsulas, cilias, esporas, plásmidos, toxinas, etc.)• Muy lábiles lal medio ambiente y desinfectantes (¿?)(

“Mejor ejemplo de parasitismo animal”Artículo de la IOM(Organización n Internacional de Micoplasmología)a)

Tracheal mucoseMGcilias

MG capability of entering nonphagocytic host cells(Winner et al, Infect. Immun. 2000)

• Transmisión:• lateral por contacto directo (equipos, personal,aves silvestres, gallos)• aerógena por gotitas• vacunas contaminadas• vertical por huevo (10-40%) 100% ennacedora y primeros días en granja• Incubación• muy variable (6-21 días)

Formación n de biofilms• comunidades bacterianas englobadas en una matriz de exopolisacáridossobre una superficie viva o inerte• constituyen un modo de crecimiento y supervivencia bacteriana en lanaturaleza

Biofilms por Mycoplasmas

Desarrollo de biofilm por Myoplasmay su relación n con el aumento deresistencia

Importancia de biofilms(MacAuliffe et al, 2006)• Medio ambiente:• Resistencia a desinfectantes• Resistencia a factores estresantes• Calor• Desecación• Hospedador:• Protección n contra antibióticosticos

DIAGNÓSTICOCLÍNICO

Prueba Pipp

Interpretación n de los resultadosdel análisis Pip´sGrados de lesiones Pip´sGrado 1: 0%Grado 2: 1-10%Grado 3:11-20%Grado 4: >20%InterpretaciónTransmisión vertical negativa o muy bajaTransmisión vertical bajaTransmisión vertical mediaTransmisión vertical alta

Evaluación n de Pip´s s en granja dereproductoras pesadas en LATAMINFORME PIP'S JUNIO 09 INFORME PIP'S JULIO 09LOTEPORCENTAJETOTALPORCENTAJESCORE DE LESIONES ANALIZADOSSCORE DE LESIONESTOTAL0 1 2 30 1 2 3 ANALIZADOS1 0,0% 13,9% 44,4% 41,7% 36 0,0% 18,9% 48,6% 32,4% 37 100,0%2 0,0% 5,0% 45,0% 50,0% 20 0,0% 38,0% 34,2% 27,8% 79 100,0%3 0,0% 0,0% 55,0% 45,0% 20 0,0% 18,9% 51,6% 29,5% 95 100,0%4 0,0% 0,0% 30,0% 70,0% 20 0,0% 23,9% 26,8% 49,3% 71 100,0%5 0 0,0% 20,8% 45,8% 33,3% 24 100,0%6 0,0% 0,0% 10,9% 89,1% 46 0,0% 39,5% 39,5% 20,9% 43 100,0%7 0,0% 0,0% 23,6% 76,4% 55 0,0% 26,7% 50,0% 23,3% 30 100,0%8 0,0% 42,4% 40,7% 16,9% 59 0,0% 82,8% 6,9% 10,3% 29 100,0%9 0,0% 38,1% 44,4% 17,5% 63 0,0% 91,3% 8,7% 0,0% 23 100,0%10 0,0% 48,4% 38,7% 12,9% 31 0,0% 61,8% 35,3% 2,9% 34 100,0%11 0,0% 69,6% 21,7% 8,7% 23 0,0% 48,6% 42,9% 8,6% 35 100,0%12 0,0% 76,9% 15,4% 7,7% 13 0,0% 46,2% 46,2% 7,7% 39 100,0%13 0,0% 38,2% 35,3% 26,5% 34 0,0% 48,4% 27,4% 24,2% 62 100,0%14 0,0% 70,0% 30,0% 0,0% 20 0,0% 50,0% 20,0% 30,0% 10 100,0%15 0 81,1% 15,6% 2,2% 1,1% 90 100,0%16 76,5% 0,0% 0,0% 23,5% 17 97,5% 2,5% 0,0% 0,0% 40 100,0%

DIAGNÓSTICO DELABORATORIO

Factores que dificultan eldiagnóstico de laboratorio• Ubicación n superficial e intracelular• Adopción n de Ag de superficie del hospedador• Cambio de Ag de superficie• Actividad inmunodepresora• Acortamiento de edad de sacrificio• Uso de antibióticosticos• Altos requerimientos de cultivo• Problemas de sensibilidad y especificidad

PRUEBAS• Aislamiento e identificación n (IFD)• Técnicas serológicas :• Aglutinación n Rápida Ren Placa (ARP)• Inmunoensayos (ELISA)• Inhibición n de la Hemoaglutinación n (HI)• Técnicas de biología a molecular:• Reacción n en Cadena por la Polimerasa (PCR)

Pruebas serológicas• ARP (Aglutinación n Rápida Ren Placa)• ELISA• HI (Inhibición n de la Hemaglutinación)n)• Diagnóstico indirecto• Diferencias de sensibilidad y especificidad• Equipos, reactivos, kits, personal entrenado• Dificultad de interpretación n (manejo, ATB, vacunasvivas)

Título de InmunoglobulinaIg M (ARP)CURVAS DE Ig PRODUCIDASPOSTINFECCION DE MG O MSIg G (ELISA-HI)5-7 d 10-15 d2-3 meses 8-10 meses

Perfil serológico más común enreproductoras infectadas con MG/MSIg MSAR +ELISA-HI +Ig GSem 18 22 26 30 34 3842 46

Situación más común en progenie dereproductoras infectadas con MG/MSIgG (Elisa/HI)IgM (SAR)1-3 d15 d 20 d 25 d 40 d

Diagnóstico de MG mediante prueba de PCRconvencionalEvans J. et al, Int. J. Poult. Sci., 2009

Real Time PCR para diagnóstico de MG y MS

Detección n de infeccióntemprana por PCR(Fiorentin, L. et al)Lote PCR Aislamiento SAR HI31/01 27* 27 22 2753/00 11 27 32 3259/00 22 28 22 33*semanas de vida

Diferenciación rápida de cepas de MSmediante Real Time-PCR“Classification of Mycoplasma synoviae strains usingsingle-strand strand conformation polymorphism and high-resolution melting-curve analysis of the vlhA gene single-copy region”Nathan Jeffery, Robin B. Gasser, Penelope A. Steer and Amir H.NoormohammadiMicrobiology 153 (2007), 2679-26882688

“Classification of Mycoplasma synoviae strainsusing single-strand conformation polymorphismand high-resolution melting-curve analysis ofthe vlhA gene single-copy region” (Nathan J. etal, 2007)a)Análisis de la curva de Melting de losproductos de PCR para el gen vlhA de variascepas aisladas de MSb)Curvas normalizadas de HRM de losproductos de PCR para el gen vlhA de variascepas aisladas de MS

AFLP “fingerprints” para 34 cepas de campo y vacunales de MG

RAPD-PCR PCR para diferenciación n de cepasMPM 19 20 R 6/85 ts-11(Sansalone et al, 2003)

Estrategias de control• Empleo de vacunas:• Bacterinas (MG-MS)MS)• Vacunas vivas (cepa F, 6/85, ts-11 y MS-H)• Vacunas recombinantes para MG• Antibióticoterapias:ticoterapias:• Preventivas• Curativas• Macrólidos (tilosina, tilvalosina, josamicina),pleuromutilinas (tiamulina, valnemulina), lincosamidas(lincomicina), fluoroquinolonas (enrofloxacina), tetraciclinas(clortetraciclina, oxitetraciclina, doxiciclina)

VACUNAS VIVAS COMERCIALESCONTRA MG Y MSCARACTERISTICASVENTAJASDESVENTAJAS

Cepa F• Ventajas:• Amplia diseminación n horizontal• Fácil aplicación n (ocular, nasal, agua de bebida,aerosol)• Disminución n de transmisión n vertical• Disminución n de pérdidas pde huevo• Aves portadoras por largo tiempo• Desplazamiento de cepas de campo

Cepa F• Desventajas:• Virulenta para pavos y pollos jóvenesj• Mayor virulencia en combinación n con vacunasvirales vivas• Infección n horizontal de granjas vecinas• Transmisión n vertical (alrededor del 1%)• Marcada seroconversión

Cepas 6/85 y ts-11Ventajas:• Son prácticamente avirulentas• Pueden ser utilizadas en pavitos, pollos parrilleros opollas reproductoras• Se diseminan muy poco o no lo hacen en formahorizontal• Generan reacciones serológicas pobres o nulas• Disminuyen las lesiones ocasionadas por cepas decampo

Cepas 6/85 y ts-11Desventajas:• Deben ser aplicadas en lotes libres entre las 6 y 8semanas de vida• No desplazan cepas de campo ya instaladas• Parecen perder protección n en aves adultas (45-5050sem)• Problemas de diagnóstico por seroconversión• Sensibilidad a mayoría a de los antibióticosticos

Cepa MS-H(Marham et al, 1998)Características:• Buena protección n de lesiones (87.5%)• Rápida seroconversión n en el 100% de las aves (5tasemana PV)• A mayor dosis mayor protección• Asociación n directa entre grado de aglutinación n ygrado de protección• Se requieren entre 2-323 semanas para obteneradecuada inmunidad• Alta seguridad (dosis 10 veces superiores)

Cepa MS-H(Marham et al, 1998)• Seguridad en la combinación n con otras vacunas (ts-11, IB, ILT)• Transmisión n horizontal 2 sem PV• No se transmite verticalmente• Se observó un retraso en seroconversión n por SAR de16 a 20 semanas PV para el 100%• Observación n de reversión n en fenotipo determosensibilidad en 9 de 50 cepas reaisladas

Vacuna recombinante de MG• Vacuna viva de viruela modificadagenéticamente para expresar antígenos deMG• Compatibilidad con programasmedicamentosos• Buena protección n local (?)• Seroconversión n (-)(• Costo elevado (?)

Es posible la erradicación n demicoplamsas???• Antecedentes en programas estratégicos convacunas vivas (Kleven et al, 1998; Turner et al,1998)• Cepa F t-11 t6/85• Programa medicamentosos• Enrofloxacina continua en el agua (Stanley(et al,2001)• Experiencias personales (macrólido premix)

PROGRAMA DE ERRADICACION DE MSREPRODUCTORAS PESADAS MS + POR SAR (35-58 sem)+ + + -75ppm A300ppm CTC75ppm A300ppm CTC75ppm A300ppm CTC75ppm A300ppm CTCsemPT1 2 3 4 5 6 7 8 950ppm A300ppm CTC50ppm A300ppm CTC50ppm A300ppm CTC- - -50ppm A300ppm CTC13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ….

Control de MG en una granja de reproductoraspesadasLote 1 Lote 2TratamientoEdadSerología a por SAR1 díad- -10 sem - -15 100% + MG30% + MS- A 20 mg/kg/3 díasd25 100% + MG A 20 mg/kg/3 díasd18-28A 50 ppm/7 díasd22-32A 50 ppm/7 díasd26-36100% - 100% - 400 ppm CHTC30-40A 50 ppm/7 díasd34-4444 400 ppm CHTC38-48A 50 ppm/7 díasd42-5246-56BB 100% -

CONCENTRACIONES INHIBITORIAS MINIMAS de cepas deMS aisladas en Argentina(Cerdá et al, Avian Diseases 2002)MIC (ug/ml)MS Tilvalosina Tilosina Tiamulina Enro Kita Chlor Oxi100 0.006 0.006 0.05 0.78 1.56 1.56 1.56117 0.012 0.012 0.05 1.56 0.78 1.56 0.39128 0.006 0.012 0.024 0.78 0.39 0.39 0.39173 0.006 0.012 0.05 1.56 0.39 0.39 0.39178 0.012 0.024 0.012 0.39 0.78 3.12 1.56211 0.006 0.012 0.024 0.78 0.39 0.39 1.56311 0.006 0.012 0.05 1.56 1.56 ≥12.5 3.12312 0.006 0.012 0.05 1.56 0.78 3.12 1.562AS 0.006 0.006 0.12 0.39 0.39 0.39 0.39wvu1853 0.012 0.024 0.05 0.39 0.39 3.12 1.56RC2008 0.75 ≥12.5 - - - - -

“Estudio de la Farmacocinética yFarmacodinamia de Aivlosin ® en unModelo Experimental de EnfermedadRespiratoria Aviar”Resultados de Tesis DoctoralMayo de 2007

Concentraciones (promedio ± SD) de A (µg/ml)(en plasma, tejido pulmonary lavado bronquial en pollos de 8 semanas tras su administración n oral enel agua de bebida a la dosis de 20 mg/kg en forma continua (■)() y de pulso(♦)) (n=2)PLASMAConcentración (ug/ml)65432100-120 40 60 80Tiempo (h)PULSOCONTINUO

LAVADO BRONQUIALTEJIDO PULMONARConcentración(ug/ml)6543210-10 20 40 60 80Tiempo (h)PULSOCONTINUOC oncentración( u g /m l)-1 0123456 0 20 40 60 80Tiempo (h)PULSOCONTINUO

ATB Solubles• Aplicación n principalmente como curativos• Rápida absorción n intestinal• Uso por pocos días da altas dosis (rápida acción n en procesosagudos)• Fácil manejo y aplicación• Control de otros patógenos (Cl.(perf., ORT, Staf., Strep.)• Características importantes:• Alta palatabilidad• Buena disolución n en agua• Buena estabilidad

PROGRAMA DEBIOSEGURIDADDr. S. Bokhari, Universidad de California• Remover todos los elementos posiblemente contaminados(aves, camas, equipos, etc.)• Lavado completo de superficies internas (paredes, techos,vigas, conductos de aire, etc.) con abundante agua y a altapresión• Desinfectar el interior de galpones con soluciones de fenol oácido cresílico• Aplicar spray sobre la cama, los bordes y la entrada consolución n de glutaraldehido al 0,1% (1lt/m 2 ) y 1,5 a 3 mts. porfuera del galpón. Dejar cerrado 24 hs para que trabajen losgases• Aplicar programa de control de insectos• Introducir los equipos adecuadamente desinfectados

Programas de Bioseguridad• Dejar al menos dos semanas de descanso• Siempre considerar el área por fuera del edificiocomo contaminada• Obtener pollitos de lotes de reproductoras libres,incubados en forma separada de lotes contaminados,transportados en vehículos y por personal aparte• Movimiento de empleados desde aves jóvenes jamayores• Reforzar las regulaciones en vestimenta y calzado• Choferes de camiones de alimento, transporte dehuevos y otros, deben permanecer en los vehículos

MEDIDAS DE CONTROL• Adquisición n y mantenimiento de lotes libres• Medidas de bioseguridad estrictas• Elección n de programas de control• antibióticosticos• vacunas• MONITOREO DE LABORATORIO

CONCLUSIONES• Alta prevalencia de MS• Dificultad de prevención por bioseguridad• Baja prevención de infección por vacunas vivas• Persistencia en el medio ambiente (biofilms)• Importancia del lavado y desinfección• Uso apropiado de antibióticos en programas preventivos, decontrol, curativos y de erradicación• Control eficiente de otros agentes respiratorios einmunodepresores• Mayor inversión en laboratorios de diagnóstico• Importancia crítica del manejo de las parvadasBIENESTAR ANIMAL!!!