TEMA 16. EL ADN Y LA INGENIERÍA GENÉTICA - Biología El Valle

Colegio El Valle Departamento de Biología• Bacterias transformadas con plásmidos recombinantes. Crecen, puesto que son resistentes a la ampicilina. Sus colonias son de color blanco, ya que no tienen actividad β-­‐galactosidasa, ya que el gen lacZ está desactivado. -Almacenamiento de los genes clonados. Genotecas: lugares donde se almacenan miles de clones que portan el gen de interés, mezclados con otros miles que no lo llevan. 3. Identificación de clones mediante sondas. Para localizar el ADN recombinante que lleva el gen de interés en una genoteca se utilizan sondas de ADN. Las sondas son pequeños oligonucleótidos de cadena sencilla, formados por unos 20 nucleótidos que se hibridarán con cualquier ADN recombinante que tenga una secuencia de bases complementaria. -Selección de clones con una sonda de ácidos nucleicos. 1. Se transfieren las bacterias con los plásmidos recombinantes a una placa Petri para que formen colonias visibles. 2. Se presiona la muestra con un filtro absorbente y las bacterias que forman los distintos clones se transfieren a éste, obteniendo una imagen especular de las colonias, que a continuación serán numeradas. 3. Se trata el filtro de nitrocelulosa con un detergente para romper las membranas celulares y que las células liberen su contenido, las moléculas de ADN se desnaturalicen y se unan fuertemente a la nitrocelulosa. 4. El filtro se incuba con una sonda de ADN preparada específicamente para que se hibride únicamente con los ADN recombinantes que hayan incorporado el gen de interés. El resto se eliminan mediante lavado. 5. Se coloca el filtro debajo de una película fotográfica que luego se revela. Quedará ennegrecida en los lugares donde se ha producido la hibridación. 6. Se compara la película revelada con la placa original, para así localizar las colonias portadoras del gen de interés. 4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Técnica in vitro que permite obtener de forma rápida un elevado número de copias de un fragmento pequeño de ADN. Materiales necesarios: • Muestra de ADN. • Secuencia de nucleótidos (cebador). • Fuente de calor. • ADN polimerasa resistente al calor. • Nucleótidos. El proceso se desarrolla por ciclos: 1. Desnaturalización por calor de la doble cadena de ADN para separarla en dos hebras. Cada hebra servirá de molde para formar una nueva cadena complementaria. 2. Hibridación. Se enfría la muestra para permitir que los cebadores se unan mediante puentes de hidrógeno a cada uno de los extremos de las dos hebras de ADN. 3. Extensión. Gracias a la ADN polimerasa se van agregando nucleótidos en el extremo 3´ del cebador y se forman las dos hebras nuevas. - Aplicaciones de la PCR • Fragmentos de ADN antiguos. Se ha amplificado el ADN de un mamut lanudo congelado que vivió hace 40.000 años, para compararlos con genes semejantes de organismos actuales y hecer estudios evolutivos. Otro ejemplo son las momias de antiguas civilizaciones, para estudiar, por ejemplo, enfermedades genéticas. • ADN obtenido en la escena de un crimen. Se recoge en pequeñas cantidades de sangre, tejidos, pelo o semen. Se aplica en medicina forense para identificar al autor de un delito. 3