CLASE 3 Detección de Anticuerpos - Hospital Privado

Anticuerpos y Trasplante“crossmatch”Bioq. Luciana MasLab. HistocompatibilidadHospital Privado. Centro Médico de Córdoba

Sensibilización• Persona que experimenta eventossensibilizantes, como transfusiones,embarazos o un trasplante anteriorriesgo para el desarrollo anticuerpos anti-HLA.• 10-30% de los pacientesen lista de espera están “sensibilizados”BARRERA EN EL TRASPLANTE DE ÓRGANOS

Sensibilización y trasplanteReceptorsensibilizadoReceptorno sensibilizadoDESENSIBILIZACIÓNTRASPLANTEPlasmaféresisIVIGRituximabBortezomib(combinaciones)Elevado Riesgo de RechazoBaja sobrevida del injertoAnticuerpos anti-HLA DSAnticuerpos anti-HLA no DSAnticuerpos DS no anti-HLA

Crossmatch (XM)Busca anticuerpos anti-HLA en el suero del receptor que reaccionencon los Antígenos HLA del donante.Suero del receptor + Células del donanteXM + : Presencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contralas células del donante contraindica el trasplante.XM - : Ausencia de anticuerpos en el suero del receptor dirigidos contralas células del donante permite el trasplante.

Crossmatch• Objetivos:*Detectar Anticuerpos*Identificar Especificidad• Métodos:*CDC (Citotoxicidad Dependiente Complemento)*ELISA*Citometría de Flujo*Luminex

CrossmatchVariantes:*Contra panel PRA (Panel Reactive Antibodies) pre y posttx. CDC, ELISA, CF, LUMINEX*Contra donante vivo (DV) pre y post txCDC-AHG en LT y LB, CF, LUMINEX*Contra donante cadavérico (DC)CDC-AHG en LT y LB, CF

Métodos

Citotoxicidad dependiente de C’ (CDC)

Reacción CDC

Score de las reacciones de CDC% cel muertas valor asignado interpretación0–10 1 negativo11–20 2 borderline negativo21–50 4 positivo débil51–80 6 positivo80–100 8 positivo fuerteUnreadable 0 sin cel.,contaminación

CDC + Antiglobulina Humana> sensibilidad

Crossmatch: ELISA• Ag solubles purificados unidos a los pozos de placas deTerasaki.• Cubren todas las especificidades• No se requieren cel. viables• Detecta sólo IgG• Detecta Ac contra Ag de clase I y II• Detecta Ac HLA específicos y Ac HLA que no unencomplemento (IgG2,IgG4)• > sensibilidad , detecta Ac de bajo título• Se puede realizar el XM después del trat. con anti-CD3,anti-timogl, anti-CD20• Más objetvo• No detecta Ac no HLA específicos

Crossmatch por ELISA

Citometría de Flujo

Fundamento

SSC vs FSCComplejidadinternaGranulocitosMonocitosTamañoRestos celularesLinfocitos

FluorocromosFITC: Isocianato deFluoresceínaPE: FicoeritrinaPerCP: peridininchlorophyll proteinAPC:allophycocyanin

Principio del cross-matchAntígenoSuperficie celular

Procedimiento• Suero del paciente y linfocitos totales del donante.• Tratamiento de los linfocitos con Pronasa: eliminar receptores Fc delinf. B que unirían IgG inespecíficamente aumentando elbackground.• Incubación suero- células/ CN-células/ CP- células 45’ a temp amb.• Marcación con anti IgG humana marcada con FITC 30’ a temp amben oscuridad• Marcación con anti CD3 PE, anti CD19 PerCP y anti CD45 APC 20’temp amb oscuridad• Adquisición.

XM (+) y XM (-)B+ B-T+ T-

Expresión de resultados y puntos de corteDot plot : media del suero del paciente / mediadel control negativoLT y LB > ó = 2 Positivo1.7-1.9 Cuestionable< 1.7 Negativo

Variantes

Crossmatch contra panel

Crossmatch vs Panel (PRA)% de reactividad del suero del pacientefrente a un panel de células (antígenos)• Medida del grado de sensibilización*Pacientes bajo riesgo : PRA < 20%*Pacientes elevado riesgo : PRA > 30%*Pacientes hipersensibizados : PRA > 70%• Fuerza• Especificidad

Crossmatch Contra Panel• PRA por CDC.• PRA por CF (screening clase I/II).• PRA por Luminex (screening clase I/II).

Crossmatch Contra Panel (CDC)Células:cel 1 cel 2 cel 3 cel 4cel nSuero Receptor: + - - +Reacción:30/30 = 100% PRA15/30 = 50% PRA0/30 = 0% PRA

Crossmatch Contra Panel (CF)• Antígenos purificados acoplados amicroperlas que pueden ser detectadas enun citómetro de flujo.• Detección de anticuerpos IgG, IgM o IgA• Detecta sólo Ac a-HLA• Determinación de %PRA e identificaciónde especificidad de los anticuerpos.

Crossmatch Contra Panel (CF)

Sensibilidad en detección deanticuerpos anti-HLAMayor sensibilidadFlowPRAELISACDCMenor sensibilidad

Crossmatch contra donante

Cross-match pre Tx por CF• Técnica de mayor sensibilidad: detecta nivelesmínimos de Ac no detectados por CDC.• Es indicativo en pacientes con preTx por CDCnegativo, con antecedentes de Tx previos, FPhistórico positivo, transfusiones, embarazos.• Diferencia IgG/IgM anti linfocitos B y linfocitos Tdel donante.

Crossmatch T y B contra donanteComponentes• Linfocitos T y B del posible donante• Suero del paciente, diluciones, duplicados• Tratamiento del suero con DTT• AHG• Complemento de conejo (activado e inactivado)• Controles positivo y negativo• Colorantes vitales: carboxifluoresceína diacetada / bromuro de etidio

Alo/Autoanticuerpos?Aloanticuerpos: IgGAutoanticuerpos: IgMDTT: Rompe enlaces disulfuro que unenal pentámero de IgM.Suero + DTTPOSITIVONEGATIVOIgGIgM

Autoanticuerpos• Pac.con LES• Pac.tratados con antiarrítmicos candidatos a tx cardíaco• Pac.tratados con medicación antihipertensiva• PRA mayor 80% no específico y reacción fuerte• Crossmatch positivo entre hnos idénticos• Crossmatch positivo ,c/DTT negativo• Mayor reactividad al frío• Mayor reactividad a los LB

Obtención de células del donante• Linfocitos totales: gradiente de ficoll-triyosom• Linfocitos T y B: sangre : 10-15% LB , ganglio : 25% LB,bazo: 50% LB• Linfocitos T: esféras inmunomagneticas revestidas de ac.monoclonales CD2 o CD8• Linfocitos B: esféras inmunomagnéticas revestidas deac.monoclonales CD19 o CD20• Monocitos gradiente de percoll

Separación de poblaciones de linfocitosDispense 2 ml of wholeblood into a 5 cc tube. Add 100 µl of Beads. Cap tube and rotate for3 minutes.Add 2 ml of developer. Captube and invert 2-3 times.Uncap tube and place inmagnet for 3 minutesRemovesupernatantWash beads by removingtube from magnet andadding 1-2 ml of PBSPlace tube on magnetfor 1 minute. Removesupernatant. Repeatwash step twicePure Tlymphocytes

Crossmatch T y B contra donanteSin DTTLi T (-)Li B (-)Li T (+)Li B (+)Li T (+)Li B (+)Li T (-)Li B (+)Li T (-)Li B (+)Con DTT(-)(-)(+)(-)(+)InterpretaciónAusencia de AnticuerposProblable Autoanticuerpos (Ig M)Antic. anti clase I o anti clase II IgG(aloanticuerpos)Probable autoanticuerpos (IgM)Ac clase I (no se detecto en los LT) o ac.clase II (DR) (IgG)

Resultados vs. RiesgoCitotoxicidad Citometría InterpretaciónRiesgoLinf TLinf BLinf TLinf B++++PosPosPosPosNo TX alto riesgo de rechazohiperagudo?PosNegPosNegAnticuerpos no anti HLA??Caracterizarlos++ a+++NegPosPosPosClase I bajo tít. Clase II? Riesgo derechazo hiperagudo con anti claseII de alto título,riesgo incr rechagudo/acelerado+ a ++NegNegPosPosBajo Título clase I y clase II0 a +NegPosNegPosAnti clase II y/o muy bajos títulosanti clase I, riesgo increm rechazoagudo0NegNegNegNegBajo riesgo para el Tx

Seguimiento inmunológico delpaciente sensibilizadoPre y Post Trasplante

Paciente sensibilizadoFuentes de sensibilización:- Embarazos- Trasplantes- TransfusionesNivel de sensibilización: PRACitotoxicidadElisa/LuminexEl protocolo de monitoreo debe ser coordinadoentre el centro de trasplante y el laboratorio dehistocompatibilidad

¿Qué estudiamos en el pacientesensibilizado?Cómo varía eltítulo deanticuerposContraqué HLAestándirigidos

Tecnología Luminex

LABScan 100® System

PMTPhoto Multiplier Tube/RepReporter LaserClassification LaserAvalanche PhotoDiodes/CL

Common Laser LinesExcitationFITCuv argon dye diode350 488 595 635300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm495Emission520 nmR-PEPI480536578 nm613 nmAllophycocyaninTexas Red650589660 nm615 nmPerCP TM490675 nmAPC-Cy7 (PharRed)650767 nmadapted frpm Purdue University Cytometry Laboratories

Descripción>712nm575nm675nmExcitation (Reporter)Excitation (Classification)Emission(Reporter)532nmEmission(Classification)635nm

Waste2-WayBubbleTrapVentValve3-wayValve2-WaySheathValveCuvetteSample Loop3-wayValveSheathBubbleTrapSyringeSampleProbeLuminex FluidicsSample

LABMAS

Detección de Anticuerpos• Sets de microesferas pre-conjugadas consondas únicas o antígenos

Principio BásicoAloanticuerpoPE anti-IgGAntígenoPerla Luminex

Procedimiento: Método Tubo o Placa20 µl suero 5µl Perlas ClaseI y/o IIIncubación 30 minutos a TALavados x3Anticuerpo Secundario30 minutos a TALavados x2LS1+ LS2PRA =40ul test serumLS1A01 + LS1A02= 20ul test serumAnálisis conLabScan 100

Detección por R-PhycoerythrinConjugado AnticuerpoPE anti-IgGA2AnticuerposB27Perla #26 con losantigenosconjugados.A2 A226A24 A24B7 B7B27 B27

Detección por R-PhycoerythrinConjugado AnticuerpoPositivo PositivoA2A24 A24A226Perla #26 Perla #26B27B27B7 B7

LSM - Class I and II Screening

LS12PRA – Class I and II PRA and ID.

The cell surface is a jungle!

XM VirtualLos resultados de un crossmatch hoyes posible predecirlo con laposibilidad del conocimiento de lasespecificidades de los Ac de lospacientes en lista de espera y en casode un potencial donante tenga algúnAg inaceptable, el paciente con Acpara ese Ag es descartado

XM Virtual

cPRA (calculated PRA)– Estima el porcentaje de donantes que seríaincompatible con el receptor, basado en losantígenos inaceptables que este tenga y en lasfrecuencias que estos Ag tengan en esapoblaciónEjemplo: un paciente con un PRA de 50% paraclase I y 60% para clase IISi consideramos los Ag inaceptables, el cPRA vaa ser mayor del 80%, ese paciente puede recibirptos extras por considerarlo hiperinmunizado

cPRA (calculated PRA)http://www.unos.org/resources/frm_CPRA_Calculator.asp?index=78

cPRA (calculated PRA)

Acs vs sobrevida del injerto•Ac donante específico ( DSA )anti –HLAanti cel endotelialesanti MICA y MICBanti contra antígenos específicos de tejidoABO isoaglutininas•Ac No donante específico (NDSA )anti-HLAanti MICA

Anti-HLAMorales Buenrostro et al. Gac Med Mex 2008

Anticuerpos y clínica del txPo-Chang Lee et al. Transplantation 2009

Anticuerpos y clínica del txPo-Chang Lee et al. Transplantation 2009

Anti-MICANEJM 357 (13) 2007

Anti-MICAMorales Buenrostro et al. Gac Med Mex 2008

Anticuerpos vs tiempo post-txPo-Chang Lee et al. Transplantation 2009