BACTERIAS ANTAGONISTAS DE HONGOS FITOPATÓGENOS ...

BACTERIAS ANTAGONISTAS DE HONGOS FITOPATÓGENOS ASOCIADAS A LA RAÍZ DEVanilla planifolia AndrewsJacel Adame García 1Mauricio Luna Rodríguez 2Ángel Rafael Trigos Landa 2RESUMENLa vainilla es una orquídea tropical que se establece mediante segmentos de tallo que nopresentan variación genética. Por ello, se ve amenazada por plagas y enfermedades, enparticular por la pudrición de raíz y tallo causada por Fusarium. El hongo crece rápidamente enel tejido y en pocos días puede destruir completamente la raíz. El uso excesivo de fungicidas enlos cultivos de vainilla contra estos patógenos ha perturbado el ciclo de interacción entre hongosmicorrizógenos nativos que integran la rizósfera, disminuyendo la capacidad de absorción denutrientes por las raíces adventicias. Por lo que sería muy útil encontrar soluciones alternativasque disminuyan el uso de productos químicos, como las basadas en las interaccionesmicrobianas benéficas con las raíces de las plantas, para reducir la incidencia deenfermedades. Razón por la que se propuso en el presente trabajo obtener a partir de mediosenriquecidos con quitina, cepas bacterianas nativas asociadas al cultivo de vainilla, concapacidad para el control de especies fúngicas patógenas. A partir de tallos y hojas de vainillacon daños por pudriciones, se identificaron 3 especies: F. oxysporum, F. solani y F. moniliformecon patogenicidad en hojas de vainilla variable. Paralelamente, se seleccionaron 19 cepasbacterianas de rizósfera de vainilla desarrolladas en medio de cultivo agar-cáscara de jaiba. Seevaluó in vitro e in vivo la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas mediante lainoculación simultánea del hongo y la bacteria. Seis cepas bacterianas fueron capaces deinhibir in vitro en más del 90%, el desarrollo de F. oxysporum y F. solani. Las pruebas in vivomostraron que las bacterias en estudio inhibieron de manera eficaz el desarrollo de F. solanisolo en tallo y que F. oxysporum presentó mayor resistencia que F. solani, al antagonismomicrobiano.PALABRAS CLAVE: Vainilla, rizósfera, competencia, biocontrol, Fusarium.INTRODUCCIÓNLa vainilla es una fuente natural de saborizantes y aromatizantes, la cual es una orquídeatropical con orígenes en México y Centroamérica (Funk y Brodelius, 1990). Vanilla planifoliaAndrews es originaria de la parte norte de la zona costera del estado de Veracruz y norte dePuebla, específicamente de la zona conocida como el Totonacapan, donde se presentan lascaracterísticas de clima y suelo necesarias para la explotación.Debido a que este cultivo se establece mediante segmentos de tallo (clones) que no presentanvariación genética (Lee-Espinoza et. al., 2008), es una especie susceptible a un gran número deenfermedades fúngicas, entre ellas aquellas causadas por los géneros Calospora vanillae(antracnosis), Fusarium sp. (pudrición de raíz y fruto), Phytophthora sp. (pudrición de fruto),1 Instituto de Biotecnología y Ecología Aplicada, Universidad Veracruzana: jadameg@gmail.com2 Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa, S.C., Universidad Veracruzana

Colletotrichum sp. y Gloeralla vanilliae (pudrición de raíz). Particularmente, Vanillae planifolia esmuy susceptible al ataque de F. oxysporum (Nielsen y Siegismund, 1999).Para prevenir las enfermedades en este cultivo se recomiendan métodos basados en productosquímicos (Anilkumar, 2004). Sin embargo, no existe alguno específico para el control de lapudrición ocasionada por Fusarium y los empleados, son inefectivos (Xia-Hong, 2007).Por otro lado, en la agricultura actual el uso indiscriminado de productos químicos, además deocasionar contaminación del ambiente, ocasiona problemas tales como resistencia de lasplagas y enfermedades a dichos productos, aparición de organismos oportunistas perjudicialespara las plantas, daños a los animales y sobre todo, riesgos para la salud humana (Daoubi etal., 2005; Liu et al., 2000).De allí que, se plantea que es necesaria la búsqueda de alternativas no tóxicas para combatirlas enfermedades, por lo que se han empleado a los “biopesticidas”, organismos y/obioproductos obtenidos de microorganismos competidores naturales, debido a que estosgeneralmente no provocan contaminación al ambiente y son de baja toxicidad para el serhumano (Liu et al., 2000).Por otra parte, se ha demostrado que las enfermedades de las plantas se suprimen de maneranatural debido a la interacción de la microflora nativa con el vegetal, protegiéndola del ataquede los patógenos (Alabouvette et al., 1993). Algunas cepas bacterianas asociadas a raíces,denominadas rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPR) (Kloepper y Schroth, 1978),pueden ser empleadas como control biológico de enfermedades causadas por hongos, dondeademás de disminuir el ataque de estos patógenos (Barea et al., 2005), pueden estimular elcrecimiento aumentando la producción (Jiménez et al., 2001). El uso de PGPR está ganandoimportancia debido a los beneficios que han aportado a la agricultura, sin embargo en lo querespecta al cultivo de vainilla no se ha encontrado información al respecto, por lo que seconsidera que no se han realizado.Por todo lo anterior, bajo la hipótesis de que bacterias nativas asociadas a la rizosfera yrizoplano de la vainilla, poseen propiedades controladoras de especies fúngicas patógenas deeste cultivo, se propuso llevar a cabo este trabajo con el objetivo de obtener a partir de mediosenriquecidos con quitina, cepas bacterianas nativas asociadas al cultivo de vainilla en el estadode Veracruz, con capacidad para el control de especies fúngicas patógenas aisladas deproblemas fitosanitarios locales.MATERIALES Y MÉTODOSAislamiento de hongos fitopatógenosSe aislaron hongos patógenos de tallos y hojas de vainilla con daños por pudriciones. Lostejidos infectados se lavaron con agua corriente y la superficie se desinfectó por inmersión ensolución de hipoclorito de sodio comercial al 2 % durante 1 min, y enjuagues posteriores conagua destilada estéril, y secado con papel absorbente. Se cortaron fragmentos de tejido (~2 x 2x 2 mm) no deteriorado, a partir del límite de la lesión. 2 fragmentos de tejido se colocaron encajas Petri con medio papa-dextrosa-agar (PDA) y medio Czapek Dox. Las cajas fueronincubadas a 26° C ± 1 durante 5 días en incubadora microbiológica (BG ® ).Parte de los micelios desarrollados se transfirió a medio PDA mediante inoculación con agujade disección. Cada cepa desarrollada se resembró hasta asegurar su purificación. Las cepasaisladas fueron caracterizadas por morfología y se identificaron empleando los criterios deRomero (1988).Se comprobó la patogenicidad de las cepas mediante la inoculación en hojas de vainillaincubados en cámara humeda a 22º C y 100 % de humedad relativa. Un disco de agar (5 mmde diámetro) con micelio de 7 días de incubación se colocó en la superficie de las hojas, yfueron incubados durante 20 días bajo 12 h de oscuridad y 12 h de luz.Aislamiento de cepas bacterianas asociadas a la rizósfera de vainilla

Durante el mes de marzo de 2009 se llevó a cabo la recolección de rizósfera de vainilla encultivos establecidos en la localidad de Francisco Sarabia, municipio de Papantla, Veracruz. Lasmuestras se colocaron en bolsas de plástico y se transportaron al Laboratorio de AltaTecnología de Xalapa, S. C. (Universidad Veracruzana). En el laboratorio, las raíces se cortaronen fragmentos de 5 mm y se colocaron 10 g en 90 de solución estéril de fosfatos 0.25 M (NOM-110-SSA1-1994). La solución fue agitada a 120 rpm durante 10 min en un agitador orbital (LabLine ® ).A partir de dicha solución se hicieron cinco diluciones adicionales (1:9); se dispersaron 100 µLde las diluciones 10 -5 y 10 -6 en medio de cultivo cáscara de jaiba (3, 6 y 9%), y se incubaron a26º C ± 1 durante 72 h.Evaluación de la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas, sobre lasespecies fitopatógenasSe evaluó in vitro e in vivo la capacidad antifúngica de las colonias bacterianas que presentaronmejor desarrollo en medio de cáscara de jaiba, sobre las especies fitopatógenas aisladas detallos y hojas de vainilla.La capacidad antifúngica in vitro se probó en medio agar nutritivo y PDA mediante el método decaja vaciada, que consistió en inocular 100 µL de solución bacteriana (1x10 8 UFC) y adicionar20 mL de medio, girando hacia la derecha e izquierda para distribuir el inóculo. Se dejósolidificar el medio y se colocó una muestra de micelio con aguja de disección, guardando larelación de dos cajas por cepa fúngica a evaluar.Para las pruebas in vivo, se consideraron solo 2 cepas fúngicas que mostraron mayoragresividad (H2 y H9) y 6 aislados bacterianos que presentaron capacidad antifúngica en laprueba in vitro, probados en conjunto (6 aislados) y uno (B15), de manera independiente,considerado por mostrar la mejor respuesta inhibitoria in vitro. Se emplearon fragmentos de tallo(esquejes) de 15 cm de longitud de Vanillae planifolia Andrews, colectados en la localidad deFrancisco Sarabia, Veracruz. Se evaluaron 8 tratamientos y se consideraron 7 controles(Cuadro 1).Cuadro 1. Tratamientos para probar la capacidad antifúngica de las cepas bacterianasseleccionadas contra los hongos fitopatógenos en plantas de vainilla.No. Abreviatura Descripción1 Bp+H2*+R Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 2 en la raíz2 Bp+H2+T Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 2 en el tallo3 Bp+H9*+R Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 9 en la raíz4 Bp+H9+T Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 61) + Hongo 9 en el tallo5 B15+H2+R Bacteria 15 + Hongo 2 en la raíz6 B15+H2+T Bacteria 15 + Hongo 2 en el tallo7 B15+H9+R Bacteria 15 + Hongo 9 en la raíz8 B15+H9+T Bacteria 15 + Hongo 9 en el tallo9 C1-1 Bacterias (1, 12, 15, 22, 29, 34, 61)10 C1-2 Bacteria 1511 C2-1 Hongo 2 raíz12 C2-2 Hongo 2 tallo13 C2-3 Hongo 9 raíz14 C2-4 Hongo 9 tallo15 C3-1 Planta raíz*H2=Fusarium oxysporum, H9=Fusarium solaniSe indujo a la producción de raíces de los esquejes mediante su inmersión en agua corrientedurante un mes. Para la prueba en tallo, se inoculó el tallo de 12 esquejes con dispersiónsuperficial de 1 ml de una solución acuosa de esporas fúngicas de 1×10 6 esporas/mL; y para la

prueba en raíz, se inocularon 10 ml de la solución de esporas indicada en suelo esterilizado (15psi/120° C/30 min) contenido en recipientes de plástico de 2 L.Posteriormente, para la prueba en tallo, se asperjó a cada esqueje, 1 ml de una solución acuosabacteriana de 1x10 8 UFC/ml, mismos que fueron sembrados en recipientes plásticos de 2 L sininóculo (fúngico y bacteriano). En tanto que para la prueba en raíz, se aplicaron 10 ml de lasolución bacteriana indicada, por cada recipiente con suelo inoculado con esporas fúngicas, yse sembraron en él, esquejes sin inóculo (fúngico y bacteriano), en relación de un esqueje porrecipiente. Los recipientes fueron colocados en vivero a temperatura ambiente (± 30° C). Cadarecipiente se colocó separadamente para evitar la interferencia entre ellos, y cada tratamientose repitió dos veces. Se evaluó la respuesta de la vainilla (pudrición), siguiendo el desarrollo dela enfermedad cada 5 días durante 1 mes.RESULTADOS Y DISCUSIÓNAislamiento de hongos fitopatógenosSe aislaron 37 cepas de hongos a partir de micelios desarrollados a los tres días después de lasiembra de los tejidos enfermos en cajas con medio PDA y Czapek Dox. Estas, fueronagrupadas para su identificación en 9 hongos diferentes, de acuerdo a las característicasmorfológicas macroscópicas del micelio (color, forma, consistencia).La evaluación microscópica reportó que 7 de los hongos correspondían al género Fusarium sppy 2, al género Colletotrichum spp.Los aislamientos de Fusarium sp., mostraron diferencias en las características macro ymicroscópicas, a partir de lo cual, se identificaron 3 especies: F. oxysporum, F. solani y F.moniliforme.La patogenicidad de estos aislamientos en hojas de vainilla fue variable, donde el aislamientode F. oxysporum mostró mayor capacidad patogénica al provocar pudrición del tejido en unradio de 7 mm alrededor del inóculo a los 5 días después de la siembra. En tanto que, a los 10días después de la inoculación, F. solani produjo un daño de similar intensidad al provocado porF. oxysporum a los 5 días, sin embargo, el desarrollo del daño fue más acelerado, lograndoabarcar la totalidad de la superficie foliar a los 12 días, a diferencia de los 15 días necesariospara F. oxysporum. El aislamiento de F. moniliforme no ocasionó daño durante los 20 días delexperimento.De acuerdo con Nielsen y Siegismund (1999), Vanillae planifolia es muy susceptible al ataquede F. oxysporum, donde el hongo crece rápido y en pocos días puede destruir completamenteel tejido colonizado. Xia-Hong (2007) aisló a partir de tejidos de vainilla infectados y suelo, tantoa F. oxysporum como a F. solani, indicando que F. oxysporum es primaria y frecuentementecolonizador de tejidos de vainilla, en tanto que F. solani tiene menor frecuencia.Aislamiento de cepas bacterianas asociadas a la rizósfera de vainillaSe seleccionaron 19 cepas bacterianas, a partir de 61 colonias morfológicamente distintas,desarrolladas en las tres concentraciones de cáscara de jaiba empleadas en la preparación delmedio. El desarrollo de colonias bacterianas se observó a partir de los 4 días después de lasiembra del inóculo.Evaluación de la capacidad antifúngica de las cepas bacterianas aisladas, sobre lasespecies fitopatógenasA los 5 días de incubación, 6 de las 19 cepas bacterianas probadas, mostraron capacidad deinhibición in vitro del desarrollo micelial. Las cepas 1, 12, 29 y 22 inhibieron en un 90% elcuerpo micelial de los aislamiento de F. oxysporum y F. solani, en tanto que la cepa 61 inhibió

en un 95 % el crecimiento de ambos hongos. Fue sobresaliente, el hecho de que la cepabacteriana 15 mostró mayor poder de inhibición, 96 % para F. oxysporum y 98 % para F. solani.La evaluación in vivo de la capacidad antifúngica reportó que a los 30 días de duración delensayo, los tratamientos 1, 2, y 5, así como los controles 11, 12, 13 y 14, el daño a las plantasde vainilla fue del 100%. En tanto que, para los tratamientos 3, 4, 6, 7 y 8, y los controles 9 y 10,los esquejes de vainilla no presentaron daño. Al respecto, se resalta el hecho de que F. solanifue inhibido eficazmente en tallo tanto por el conjunto de bacterias como por el aislamiento B15,sin embargo para la prueba en raíz, solo se evidenció respuesta satisfactoria empleando elconjunto de bacterias, considerando resultados similares tenidos para la prueba con F.oxysporum en raíz. Lo anterior puede tener como explicación que la acción de la cepa B15 fueafectada por las características del suelo (agua, temperatura y microflora) (Davies y Whitbread,1998) o bien que, la combinación de los microorganismos eleva el nivel y consistencia de lasupresión de hongos fitopatógenos de acuerdo a Raupach y Kloepper (1998), Whipps (2001) yLutz et al. (2004). Al respecto, Pierson et al. (1998), Lutz et al. (2004) y Maurhofer et al. (2004),mencionan que la producción de antibióticos por bacterias antagonistas del suelo se puedeincrementar cuando éstas son confrontadas con otros microorganismos.La prueba in vivo de la actividad bacteriana inhibitoria sobre F. oxysporum mostró queúnicamente el tratamiento en tallo con la cepa B15 tuvo resultados satisfactorios, lo quedemuestra que este patógeno presenta mayor resistencia que F. solani al antagonismomicrobiano. En concordancia con lo señalado por Duffy et al. (2003), al indicar que, así comolos antagonistas microbianos utilizan un arsenal diverso de mecanismos para dominar lasinteracciones con los patógenos, los patógenos tienen sorpresivamente diversas respuestaspara contrarrestar el antagonismo.Lo antes expuesto, conlleva a establecer nuevas estrategias de ensayo, entre estas, asegurarpreviamente una interacción directa entre las bacterias y el tejido vegetal antes delenfrentamiento con el fitopatógeno, así como, el uso de combinaciones de bacteriasaparentemente no antagonistas desarrolladas a partir de la rizosfera, o bien, tratamientos deltejido vegetal con productos de la fermentación bacteriana.CONCLUSIONESSe identificaron tres especies de Fusarium: F. oxysporum, F. solani y F. moniliforme, a partir depudriciones de hojas y raíz de Vanilla planiflolia Andrews. F. oxysporum mostró, in vivo, mayorcapacidad patogénica.El uso de medios de cultivo adicionados con quitina a partir de cáscara de jaiba, permiten elaislamiento de bacterias con capacidad antagonista ante hongos fitopatógenos.Se aislaron de la rizosfera de vainilla, seis cepas bacterianas capaces de inhibir in vitro en másdel 90%, el desarrollo de F. oxysporum y F. solani.Las bacterias en estudio inhibieron de manera eficaz el desarrollo de F. solani en tallo.F. oxysporum mostró mayor resistencia que F. solani, al antagonismo microbiano.LITERATURA CITADAAlabouvette, C., P. Lemanceau and C. Steinberg. 1993. Recent advances in the biologicalcontrol of Fusarium wilts. Pesticide Science 37: 365-373.

Anilkumar, A. S. 2004. Vanilla cultivation: A profitable agri-based enterprise. In Kerala Calling,26-30.Barea, J. M., M. J. Pozo, R. Azcon and Azcon-Aguilar. 2005. Microbial co-operation in therhizosphere. Journal of Experimental Botany. 56:1761–1778.Daoubi, M., R. Hernández-Galán, A. Benharref and I. G. Collado. Screening study of leadcompounds for natural product-based fungicides: antifungal activity and biotransformation of6α,7α-dihydroxy-β-himachalene by Botrytis cinerea. J. Agric. Food Chem. 53 (17): 6673–6677Davies, K. G. and R. Whitbread. 1998. Factors affecting the colonization of a root system byfluorescent pseudomonads: the effects of wáter, temperatura and soil microflora. Plant soil.116:247-256Duffy, B., A. Schouten and J. M. Raaijmakers. 2003. Pathogen self-defense; mechanisms tocounteract microbial antagonism. Ann. Rev. Phytopathol. 41:501-538.Funk, C. and P. Brodelius. 1990. Influence of growth regulators and an elicitor onphenylpropanoid metabolism in suspension cultures of Vanilla planifolia. Phytochemistry265(29): 845-848.Jiménez-Delgadillo, R., G. V. Calleros, S. T. Franco y V. Olalde-Portugal. 2001. Bacteriaspromotoras del crecimiento de plantas: agro-biotecnología. Avance y Perspectiva. 20: 395-400.Kloepper, J. W. and M. N. Schroth. 1978. Plant growth promoting rizobacteria on radishes.Pages 879-892 in Proceedings of the fourth International Conference on Plant PathogenicBacteria, volume 2. Argers, France.Lee-Espinoza, H. E., J. Murguia-Gonzalez, B. Garcia-Rosas, A. L. Cordova-Contreras, A.Laguna-Cerda, J. O. Mijangos-Cortes, L. F. Barahona-Perez, L. G. Iglesias-Andreu and N.Santana-Buzzy. 2008. In vitro clonal propagation of vanilla (Vanilla planifolia 'Andrews').HortScience. 43(2): 454-458Liu, B. L., T. Yew-Min and W. Chao-Te. 2000. Recovery of solubilized delta -endotoxin fromBacillus thuringiensis subsp kurstaki fermentation broth. Pest Management Science 56 (5): 448-454.Lutz, M. P., S. Wenger, M. Maurhofer, G. D´efago and B. Duffy. 2004. Signalling betweenbacterial and fungal biocontrol agents in a strain mixture. FEMS Microbiol Ecol 48: 447–455.Maurhofer, M., E. Baehler, R. Notz, V. Martinez and C. Keel. 2004. Cross talk between 2,4-diacetylphloroglucinol-producing biocontrol pseudomonads on wheat roots. Appl EnvironMicrobiol 70: 1990–1998.Nielsen, L. R. and H. R. Siegismund. 1999. Interspecific differentiation and hybridization invanilla species (Orchidaceae). Heredity 83, 560-567.Norma Oficial Mexicana. NOM-110-SSA-1994. Preparación y dilución de muestras de alimentospara su análisis microbiológico.

Pierson, E. A., D. W. Wood, J. A. Cannon, F. M. Blachere and L. S. Piersson. 1998.Interpouplation signaling via N-acyl-homoserine lactones among bacteria in the wheatrhizosphere. Mol Plant Microbe Interact. 11: 1078–1084.Raupach, G. S. and J. W. Kloepper. 1998. Mixtures of plant-growth promoting rhizobacteriaenhance biological control of multiple cucumber pathogens. Phytopathology 88: 1158–1164.Romero, C. S. 1988. Hongos fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo. México. 347p.Whipps, J. M. 2001. Microbial interactions and biocontrol in the rizosphere. Journal ofExperimental Botany. 52:487-511.Xia-Hong, H. E. 2007. Bio-control of root rot disease in vanilla. Thesis for the degree of Doctor ofPhilosophy. University of Wolverhampton, U. K. 265 p.