(IBV) presentes en el mercado chileno y de 3 a - Tesis Electrónicas ...

Facultad de Ciencias
Escuela de Ciencias
Caracterización molecular de vacunas contra el virus de la Bronquitis
infecciosa (IBV) presentes en el mercado chileno y de 3 aislados de
campo históricos.
JOSÉ RODRIGO WALDEMAR MARTÍNEZ SOLIS
VALDIVIA-CHILE
2008
PROFESOR PATROCINANTE:
Dr. Jorge Ulloa
Instituto de Patología Animal
Facultad de Ciencias Veterinarias.
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar al
grado de Licenciado en Ciencias
biológicas.

A mi Familia
Al Padre Dios
y a la Madre Ciencia

AGRADECIMIENTOS
En primer lugar quiero agradecer a mi profesor patrocinante, el Dr Jorge Ulloa,
por su apoyo y ayuda, por las incontables carta que hubo que hacer y por financiar este
trabajo, gracias Dr. Quiero agradecer también al Dr Alex Romero, por su apoyo, sus
enseñanzas, sus tirones de orejas y su paciencia, y por que ha estado ahí desde el
primer y hasta el último momento, gracias Alex.
Junto con Alex, fueron fundamentales en mi crecimiento en la biología
molecular, todos aquellos quienes trabajan (y trabajaron) en el Laboratorio de
Biotecnología y Patología acuática, todos aportaron un granito en mi aprendizaje y
serán un grato recuerdo en mi paso por ese laboratorio.
Quiero agradecer también a los amigos que hice durante mi periodo de la
Universidad, si, gracias a la generación 2002 de Ciencias, por ser única en su clase, por
las largas jornadas de estudio en el casino y el botánico, por las bromas en las clases,
en fin, por hacer de los años de universidad de los mejores de mi vida.
No pueden faltar los amigos de la vida, Marco, Roxana, Esteban, Natalia, Vane,
Carolina, gracias por el apoyo y la comprensión. A la gente del “Techo pa’ Chile” que
han acompañado mis años de universidad y me dieron el estrés necesario en la vida.
Gracias también al Coro Uach por ser mi terapia “anti- estrés” en los últimos años y por
las enseñanzas de la vida y los amigos que ahí gané.
He dejado para el final a mi familia, a quienes debo agradecer su comprensión,
por llegar tarde o no estar en cumpleaños, fines de semana y vacaciones, agradecerles
por ser el pilar en el cual me he apoyado, en fin, por muchas cosas, gracias papá,
mamá, Roberto y Julio. Gracias a todos, Gracias Totales.

Agradecimientos
INDICE DE CONTENIDOS
I
Páginas
INDICE DE CONTENIDOS I
INDICE DE FIGURAS IV
ABREVIATURAS VI
1. RESUMEN 1
2. SUMMARY 2
3. INTRODUCCIÓN 3
4. MATERIALES Y MÉTODOS 12
4.1 Muestras 12
4.2 Extracción de RNA viral 14
4.3 Cuantificación de RNA viral por espectrofotometría 15
4.4 Determinación de la Integridad del RNA extraído 15
4.4.1 Electroforesis en gel de agarosa/formaldehído 15
4.5 Amplificación del gen de la Proteína S1 por RT-PCR 16
4.5.1 Electroforesis en geles de agarosa 17

4.6 Clonamiento de productos de PCR correspondientes al gen S1 en vector
pGEMT-easy 21
4.6.1 Purificación de productos de PCR desde gel de agarosa 21
4.6.2 Preparación de Bacterias Competentes (E.coli JM109) 22
4.6.3 Ligación de productos de PCR en vector pGEMT-easy 23
4.6.4 Transformación de células competentes 24
4.6.5 Purificación DNA plasmidial utilizando lisis por calor 26
4.6.6 Purificación de plásmidos 27
4.7 Determinación del Polimorfismo de la Longitud del Fragmento de
restricción. 28
4.8 Análisis de la secuencia y construcción de filogenia 29
4.9 Análisis del perfil de proteínas de las cepas de vacunas y de los
aislados de campo por electroforesis de proteínas en condiciones
denaturantes con SDS (SDS-PAGE) 30
4.9.1 Preparación de geles de poliacrilamida 30
4.9.2 Preparación de las muestras 31
4.10 Análisis de los determinantes antigénicos de las cepas de vacunas
y de los aislados de campo mediante transferencia de proteínas a membranas
de nitrocelulosa (Western Blot) por sistema semidry (BIORad) 31
5. RESULTADOS 34
5.1 Extracción e integridad del RNA Viral 34
5.2 Amplificación del gen de la proteína S1 por RT-PCR 36
II

5.3 Determinación del polimorfismo de la longitud del fragmento de
Restricción (RFLP) 39
5.4 Análisis filogenético y molecular de los aislados de campo
secuenciados 44
5.5 Análisis de las proteínas de las vacunas y los aislados de
campo. 49
5.6 Análisis de los determinantes antigénicos de las vacunas y los aislados
de campo. 51
6. DISCUSIÓN 53
7. BIBLIOGRAFÍA 63
III

INDICE DE FIGURAS
IV
Página
Figura 1: Esquema de una partícula de IBV 6
Figura 2: Mapa genómico de IBV 7
Figura 3: Mapa parcial del genoma de IBV y sitios de corte de los partidores 19
Figura 4: Secuencia nucleotídica y aminoacídica del producto de PCR de IBV 20
Figura 5: Mapa del Vector pGEM-T ® Easy 25
Figura 6: Análisis de la integridad del RNA viral extraído 35
Figura 7: Amplificación por RT- PCR del gen de la proteína S1 37
Figura 8: Digestión enzimática del vector pGEM-T easy con la enzima
de restricción EcoR I para liberar el producto de PCR insertado 38
Figura 9: Digestión de los productos de PCR con la enzima de
restricción Hae III 41

Figura 10: Digestión de Productos de PCR con la enzima de
restricción Xcm I 42
Figura 11: Digestiones enzimáticas del gen S1 de IBV amplificado por RT-PCR
y clonado en pGEM-T Easy de cepas de campo y cepa de vacuna Fort Dodge 43
Figura 12: Secuencia nucleotídica y aminoacídica de los aislados de campo 45
Figura 13: Análisis de la secuencia aminoacídica de los aislados de
campo de IBV con la cepa Mass 46
Figura 14: Alineamiento aminoacídico de los aislados de campo con cepas
referenciales 47
Figura 15: Árbol filogenético de las cepas de referencia y aislados de IBV
analizados 48
Figura 16: Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
denaturantes (PAGE) teñido con azul de Coomasie 50
Figura 17: Western blot de vacunas y aislados de campo de IBV 52
V

ABREVIATURAS
RT Reacción de Transcripción Reversa
PCR Reacción en Cadena de la polimerasa
RFLP Polimorfismo de la Longitud del Fragmento de Restricción
D.O. Densidad óptica
IBV Virus de la Bronquitis infecciosa
HVR Región hipervariable
Mass Massachusetts
NDV Virus de la Enfermedad de Newcastle
ILTV Virus de la Laringotraqueitis infecciosa
RNA Ácido Ribonucléico
DNA Ácido Desoxiribonucléico
VNT Test de neutralización viral
Abs Absorbancia
UV Ultravioleta
rpm Revoluciones por minuto
mA miliamperes
mM milimolar
ml mililitro
g gramos
μg microgramos
μl microlitros
VI

ng nanogramos
S Proteína de espícula
S1 Subunidad S1 de la proteína de espícula
S2 Subunidad S2 de la proteína de espícula.
M Proteína de membrana
N Nucleoproteína
E Proteína de envoltura
VII

1. RESUMEN
La Bronquitis infecciosa es una enfermedad altamente contagiosa que afecta el
tracto respiratorio alto en las aves de corral, que genera grandes pérdidas económicas
en la industria avícola ya que disminuye la eficiencia alimenticia en aves de engorda y
provoca una disminución en la cantidad y calidad de los huevos en aves ponedoras.
Esta enfermedad es provocada por el virus de la Bronquitis infecciosa (IBV)
perteneciente a la familia Coronaviridae. Este virus posee 4 proteínas estructurales:
nucleoproteína (N), proteína de membrana (M), proteína de envoltura (E) y proteína de
espícula (S).
El objetivo de este trabajo fue caracterizar molecularmente las vacunas contra
IBV presentes en el mercado, para lo cual se analizaron 5 vacunas contra Bronquitis
infecciosa utilizando la técnica de RT-PCR-RFLP, además se analizaron 3 aislados de
campo nacionales, Austral 3, Austral 5 y Austral 14, los cuales fueron estudiados
serológicamente en 1988 sin encontrar similitud con las cepas referenciales. Se
analizaron los perfiles de proteínas y los determinantes antigénicos de las muestras por
electroforesis en geles de poliacrilamida y westernblot. Un fragmento de 900 pb de los
aislados Austral 5 y Austral 14 fue secuenciado y comparado con cepas referenciales
encontradas en el banco de genes.
Los resultados obtenidos por RT-PCR-RFLP muestran concordancia entre las
vacunas analizadas y el patrón esperado para la cepa Massachussets, no presentaron
similitud con Massachussets (Mass) los aislados de campo analizados, siendo distintos
incluso de las demás cepas de referencia.
1

2. SUMMARY
The infectious Bronchitis is a highly contagious disease that affects the upper
respiratory in yard birds, which provokes big economic loses in the poultry industries,
because it makes alimentary efficiency goes down in broiler chicks and also provokes an
quantity and quality decrease in laying bird’s eggs.
The illness is provocated by infectious Bronchitis virus (IBV), which belongs to
Coronaviridae family. This virus has 4 structural proteins: a nucleocapsid protein (N), a
membrane protein (M), the envelope protein (E), and the spike (S).
The aim of this investigation was molecularly characterize the vaccine against IBV
presents in the market. To do this, 5 vaccines against IBV where analyzed using the
Reverse Transcriptase–Polymerase Chain Reaction–Restriction Fragment Length
Polymorphism (RT-PCR-RFLP) technique. Besides, 3 country isolated were analyzed,
which were serologically studied in 1988, without finding any similarity with referential
strains. Protein profiles and antigenic determinatives of the pattern were analyzed with
electrophoresis in poliacrilamida gels and western blot. A fragment of 900 pb of 2
country isolated was sequenced and compared with the referential strains found in the
Genbank.
The results for RT-PCR-RFLP shows concordance between analyzed vaccine
and the pattern waited for Massachusetts (Mass) type. The country isolated analyzed
not shown concordance with Mass type, even being different of the other referential
strains.
2

3. INTRODUCCIÓN
La bronquitis infecciosa es una enfermedad aguda altamente contagiosa que
afecta principalmente el tracto respiratorio superior en pollos, produciendo tos,
estornudos y estertores traqueales. Esta enfermedad es provocada por un Coronavirus
denominado Virus de la Bronquitis infecciosa (IBV).
Aunque la Bronquitis infecciosa no tiene importancia en salud pública, a nivel
mundial provoca grandes pérdidas económicas en la industria avícola. En lotes de
postura y planteles reproductores afectados, se registra una caída violenta de la
producción de huevos, produciendo alteraciones en su calidad externa (huevos
malformados, con cáscara rugosa o blanda) y calidad interna donde se presentan
claras acuosas. Los lotes afectados casi nunca recuperan su nivel de producción
anterior. En pollos de engorde se obtiene un deficiente rendimiento debido a un
deterioro en la conversión alimenticia y reducción en la ganancia de peso. Además, el
virus puede producir mortalidad en pollos jóvenes.
El primer caso de Bronquitis infecciosa fue identificado en 1931 en la localidad de
Dakota del norte en los Estados Unidos por Schalk y Hawn (1931). Beach y Schalm
(1936) establecieron la etiología del virus y Beaudette y Hudson (1937) fueron los
primeros en cultivar el virus en huevos embrionados y en demostrar que IBV no se
relacionaba a ningún otro virus conocido hasta el momento.
Aunque Bronquitis infecciosa fue indicada en los primeros informes como una
enfermedad de polluelos, durante la década del 40’ se manifestó como una importante
3

enfermedad respiratoria en gallinas ponedoras, que provocaba una gran caída en la
producción de huevos.
La expresión de la enfermedad se ve afectada por varios factores como la edad,
sexo, alimentación y temperatura ambiente (Cumming, 1969; Cumming y Chubb, 1988),
así como también por infecciones concurrentes con otros agentes patógenos como el
virus de la Enfermedad de Newcastle (NDV), virus de la Laringotraqueitis infecciosa
(ILTV), y la bacterias Escherichia coli y Mycoplasma gallisepticum, provocando
síndromes complejos (Matthijs et al, 2003; Landman & Feberwee, 2004).
El IBV afecta a una gran cantidad de tejidos, pero la infección comienza en las
células epiteliales de la tráquea donde se multiplica para luego infectar otros órganos.
Hofstad y Yoder, (1966) informaron una gran concentración de virus en tráquea,
pulmones y sacos aéreos posterior a una inoculación por aerosol y una pequeña
concentración en riñones, hígado, páncreas y bolsa de Fabricio, estableciendo una
permanencia del virus en los tejidos de entre 24 horas y 8 días. Posteriormente Jones y
Jordan (1972) descubrieron que el virus podía ser aislado desde los pulmones sobre 21
días postinfección y sobre 14 días desde tráquea, riñones y sangre.
Una condición nefrogénica asociada a algunos brotes de IBV fue comunicada por
Winterfield y Hitchner en 1962, este síndrome también fue reportado en Australia
(Cumming, 1962), siendo más severo que en los Estados Unidos, esta condición está
asociada en la actualidad a algunas cepas de IBV y ha sido descrita en varios países.
El IBV es un Coronavirus del grupo 3, perteneciente a la familia Coronaviridae,
es un virus envuelto, pleomórfico de entre 80-120 nm de diámetro y rodeado por una
corona de proyecciones o espículas de 20 nm de largo (Berry et al., 1964). Su ácido
4

nucleico es un RNA de hebra simple de sentido positivo. El tamaño del genoma de IBV
es de alrededor de 27500 pares de bases y posee cuatro proteínas estructurales: una
nucleoproteína (N) que está unida al genoma del virus formando una nucleocápside
helicoidal (Stohlman et al., 1983), una proteína de envoltura (E), una proteína de
membrana (M) cubierta casi completamente por la envoltura (Cavanagh et al., 1986a) y
la glicoproteína de espícula (S), la cual está conformada por 2 subunidades, S1 y S2
(Stern y Sefton, 1982; Cavanagh et al., 1986b) (Figura 1).
El extremo 5’ del genoma de IBV posee 1 gran gen, que corresponde a casi dos
tercios del genoma y que codifica proteínas que ayudan en la replicación y
transcripción del RNA. El resto del genoma codifica para las 4 proteínas estructurales,
S, E, M y N. Además se encuentran 2 genes, 3 y 5, que codifican para las proteínas no
estructurales 3a, 3b, 5a y 5b. La proteína E está codificada en el tercer marco de lectura
del gen 3 (Cavanagh, 2005) (Figura 2).
5

Figura 1. Esquema de una partícula de IBV. Se aprecian las proteínas estructurales
M, N, E y S, de esta ultima se señalan además las subunidades S1 y S2 (Cavanagh,
2005).
6

5’ UTR
Rep
Codificante para proteínas
no estructurales
3a 3b
5a 5b
S E M N
S1 S2
3’ UTR
Figura 2. Mapa genómico de IBV. S: gen de la proteína de Espícula, se aprecian las subunidades S1 y S2; E: gen de
la proteína de Envoltura; M: gen de la proteína de Membrana y N: gen de la Nucleoproteína. (Cavanagh, 2005).
7

De todas las proteínas estructurales de IBV, la glicoproteína S es la más
importante y la más estudiada, ya que juega un rol muy gravitante en la unión del virus
a la superficie de la célula y su posterior penetración, así como también en la infección.
Estudios han mostrado que la infectividad del virus se ve afectada al remover la
subunidad S1 de la glicoproteína S, pero no se afecta su capacidad de unirse a la
superficie celular, sugiriendo entonces que, aunque la subunidad S2 está involucrada
en la unión del virus, la subunidad S1 es fundamental en el momento de la penetración
del virus (Cavanagh y Davis, 1986).
Además, la subunidad S1 induce la producción de anticuerpos inhibidores de la
hemoaglutinación y anticuerpos virus neutralizantes, ya que es el antígeno mayor de
IBV envuelto en la protección, utilizándose por esto para diferenciar cepas de IBV. En
este sentido, antes de 1956 sólo se conocía una cepa patógena de IBV, la cepa
Massachussets (Mass 41), pero ese mismo año Jungherr et al (1956) identificaron
otros serotipos antigénicamente distintos a IBV. Desde ese entonces el informe de
nuevas cepas o serotipos ha sido más constante a nivel mundial (Meulemans et al.,
2001; Farsang et al., 2002; Liu y Kong, 2004; Cavanagh et al., 2005; Gelb et al., 2005).
El test de neutralización viral (VNT) ha sido la base para la clasificación por
serotipificación del virus. Sin embargo, en la actualidad se ha implementado la
clasificación del virus por genotipificación y por la comparación de la secuencia de
aminoácidos del gen de la glicoproteína S1, debido a que presenta 3 regiones
hipervariables (HVR) localizadas entre los aminoácidos 38-67, 91-141 y 274-387
(Cavanagh et al, 1988; Moore et al, 1998).
8

La aparición de nuevas cepas variantes de IBV puede deberse a mutaciones al
azar y/o recombinaciones. La circulación de cepas de campo y la vacunación de aves
con más de una cepa de IBV atenuada, crea condiciones que favorecen la
recombinación del virus en el campo. Análisis secuenciales de los genes estructurales
de IBV indican que el mecanismo por el cual se generan cepas variantes es la
recombinación (Cavanagh y Davis, 1988; Kusters et al., 1989, 1990; Cavanagh et al.,
1992a; Wang et al., 1993, 1997; Jia et al., 1995). Los eventos de recombinación podrían
resultar por saltos de la polimerasa desde un templado a otro en la síntesis de cada
hebra negativa o positiva de RNA (Tolskaya et al., 1987). Esto puede sugerir que la
recombinación de los Coronavirus puede ocurrir aleatoriamente, y no requiere de
secuencias específicas (Banner y Lai, 1991).
El diagnóstico de IBV se puede hacer mediante el aislamiento e identificación del
virus o mediante la detección de anticuerpos contra IBV en el suero de las aves. Una de
las técnicas más utilizadas para la detección de IBV es el aislamiento del virus en
huevos embrionados, donde se confirma la presencia de IBV por lesiones típicas en los
embriones, pero este método es laborioso y toma tiempo realizarlo (King y Cavanagh,
1991).
Otra forma de diagnosticar IBV es por métodos serológicos como el test de
neutralización viral (VNT), pero implica mucho trabajo y tiempo. Además es necesario
disponer de cepas de referencia y sus antisueros, lo que hace difícil diagnosticar cepas
emergentes del virus utilizando este método (Koch et al, 1985; Wainright et al, 1989;
Ignjatovic y McWaters, 1991). Sin embargo, el VNT es la prueba de elección para
serotipificar IBV.
9

En los últimos años se ha empleado la técnica de Transcripción Reversa y
Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT/PCR) para diagnosticar IBV, ya que es una
técnica rápida y fácil de ejecutar, así como además confiable, a tal punto que, en
conjunto con el Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP),
se utiliza para caracterizar nuevos tipos de IBV (Kwon et al¸ 1993; Gelb et al, 2005).
También se ha avanzado en el uso de el RT-PCR en tiempo real (RRT-PCR) para
diagnosticar e identificar aislados de IBV (Callison et al, 2005).
En Chile IBV fue detectado por primera vez en 1967 (García y Norambuena,
1969), y en 1975 se aisló desde pollos de engorde (Hidalgo et al, 1976), mostrando
relación antigénica con la cepa Massachusetts.
En 1991 se informó la tipificación de nueve aislados de IBV mediante la técnica
de seroneutralización cruzada, señalando que cinco de ellos se relacionaban con el tipo
Massachussets, uno con el serotipo Connecticut y los otros 3 aislados no presentaban
relación antigénica con cepas de referencia del virus, ni con aislados procedentes
desde otros países y caracterizados a través de varios años (Cubillos et al, 1991).
En Chile el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) sólo reconoce la existencia de
cepas tipo Massachusetts de IBV, por lo cual sólo permite la importación de vacunas
vivas de este serotipo.
10

Para la creciente industria avícola nacional y mundial, el IBV es un problema
prevalente, por lo que es fundamental contar con un diagnóstico rápido para realizar un
plan de inmunización efectivo contra IBV. En este sentido el presente trabajo trata de
aportar mayores conocimientos respecto a la calidad de las vacunas utilizadas en Chile
y el reconocimiento de la existencia de cepas variantes de IBV, con este fin las
hipótesis de trabajo son
objetivos:
Hipótesis 1: “Todas las vacunas contra IBV utilizadas en el presente trabajo
corresponden al genotipo Massachusetts”
Hipótesis 2: “Los aislados de campo históricos de IBV se diferencian
molecularmente de la cepa tipo Massachusetts”
En base a las hipótesis antes mencionadas se desarrollaron los siguientes
Objetivo General:
� Utilizar técnicas moleculares para identificar y caracterizar vacunas y aislados
chilenos de IBV
Objetivos Específicos:
1.- Genotipificar las vacunas contra IBV presentes en el mercado chileno.
2.- Caracterizar por medio de técnicas moleculares, 3 aislados de campo
históricos chilenos que se diferencian antigénicamente de cepas de IBV tipo Mass.
11

4. MATERIALES Y MÉTODOS
Los objetivos del presente trabajo fueron la genotipificación de vacunas contra
IBV presentes en el mercado chileno, y la caracterización de 3 aislados de campo
históricos nacionales por medio de técnicas moleculares, para lo cual se utilizó la
técnica de RT-PCR para amplificar el gen S1 de IBV en conjunto con un análisis de
RFLP con las enzimas de restricción Hae III y Xcm I. Asimismo, se realizó un análisis
del perfil de proteínas y determinantes antigénicos de las vacunas y los aislados de
campo por medio de geles de poliacrilamida y westernblot, y se analizó también la
secuencia de los aislados de campo Austral 5 y Austral 14.
4.1.- Muestras
En el estudio se utilizaron 5 vacunas contra el virus de la bronquitis infecciosa
(IBV) presentes en el mercado chileno (Tabla 1) y 3 aislados de campo conservados en
el Laboratorio de Patología Aviar del Instituto de Patología Animal: Austral 3, Austral 5 y
Austral 14, (Ver tabla 2) las cuales fueron caracterizadas anteriormente y catalogadas
como antigénicamente diferentes a Mass (Cubillos et al, 1988).
Tanto las vacunas como las cepas de campo utilizadas estaban liofilizadas y
fueron resuspendidas en 1ml de buffer fosfato salino (PBS) 1X estéril, alicuotadas y
almacenadas a -80ºC previo a su análisis.
12

Tabla 1. Vacunas virus Bronquitis infecciosa (IBV) analizadas en el presente trabajo.
Laboratorio tipo de vacuna Cepa Dosis Nº registro SAG
Ceva Laboratories (C) Liofilizada Viva, Mixta (IBV, NDV) IBV Mass B48, NDV Hitchner B1 2500 dosis 0405-B
Fort Dodge Lab.(F) Liofilizada Viva IBV Mass 1000 Dosis S/A
Nobilis (N) Liofilizada Viva IBV Mass 5 5000 Dosis 1155-B
Bronipra (B) Liofilizada Viva IBV Mass H120 1000 Dosis 0003-B
Merial (M) Liofilizada Viva IBV Mass 5000 Dosis 1176-B
S/A : Sin antecedentes
Tabla 2. Antecedentes de aislados de Campo de virus Bronquitis infecciosa recolectados en Chile (Cubillos et al, 1987)
Nombre aislado Fecha de recolección Tipo de Aves Edad Signos y Lesiones
Austral 3 Junio de 1984 Leghorn 53 semanas Ronquera, postura disminuida, cáscara delgada y diarrea
Austral 5 Agosto de 1984 Broiler 18 días Ronquera, neumonía y uratos en riñones.
Austral 14 Mayo de 1986 Pollas 35 días Respiratorio, ronquera y ahogos.
13

4.2.- Extracción de RNA viral
La extracción de RNA viral se llevó a cabo con el Kit de extracción de RNA Viral
QIAamp (QIAGEN) siguiendo las instrucciones del fabricante que se indican a
continuación:
Se mezclaron 140 µl de cada una de las muestras (vacunas y aislados de campo
resuspendidos) con 560 µl de buffer de lisis AVL con carrier RNA en un tubo de
microcentrífuga estéril y se incubó a temperatura ambiente por 10 minutos y se
centrifugó para eliminar grumos.
Luego se agregaron 560 µl de Etanol 100% y se mezcló por inversión 6 veces.
De la mezcla se tomaron 630 µl y se agregaron a una columna de extracción de RNA
con tubo de recolección. Luego se centrifugó la columna a 6.000 x g por 1 minuto y se
eliminó el sobrenadante. Se repitió la operación con el resto de la mezcla.
Posteriormente, a la columna de extracción se adicionó 500 µl de buffer de
lavado AW1, se centrifugó a 6.000 x g por un minuto y se eliminó el sobrenadante.
Posteriormente a la misma columna se agregaron 500 µl de buffer de lavado AW2 y se
centrifugó a 20.000 x g por 3 minutos. El sobrenadante fue eliminado y la columna de
extracción se colocó en un tubo de microcentrífuga estéril.
El RNA fue eluído con 50 µl de agua desionizada estéril tratada con
dietilpirocarbonato, agregada justo en el centro de la columna de extracción y se incubó
por un minuto a 70ºC. Luego se centrifugó a 6.000 x g por un minuto y se eliminó la
columna de extracción. Los RNA virales extraídos se almacenaron a -80ºC hasta su
utilización.
14

4.3.- Cuantificación de RNA viral por espectrofotometría.
Se estimó la concentración de RNA viral extraído por medición de la absorbancia
a una longitud de onda de 260 nm en un espectrofotómetro Spectronic Genesys 8. La
determinación de la concentración se realizó con la siguiente fórmula, donde 1D.O.260
corresponde a 40 μg/ml para un ácido nucleico de hebra simple:
Concentración de RNA: Abs260 nm x 40 μg/ml x Factor de dilución x 1 D.O.260
4.4.- Determinación de la integridad del RNA extraído
3.4.1. Electroforesis en geles de agarosa / formaldehído.
Para comprobar la integridad del RNA extraído se realizó una electroforesis en
gel de agarosa 1% / formaldehído 6,7%.
Para la preparación del gel de agarosa/formaldehído se disolvieron 0,3 g de
agarosa en 19 ml de agua destilada estéril, luego se agregaron 6,0 ml de buffer MOPS
5X (ácido 3-(N-morfolino) propansulfónico 0,02 M (MOPS), acetato de sodio 8 mM,
EDTA 1mM �pH 8,0�) y 5,0 ml de formaldehído el cual fue agregado bajo campana.
Como tampón de corrida se utilizó MOPS 1X. Las muestras se prepararon mezclando
4,5 µl de RNA total, MOPS hasta 1x, formaldehído hasta 6,7% y formamida hasta 50%.
15

Esta mezcla fue denaturada a 65ºC durante 15 min y luego mantenida en hielo,
entonces se agregó 2,0 µl de buffer de carga 10X (glicerol 50%, EDTA 1mM, azul de
bromofenol 0,25% y xylen cyanol FF 0,25%) y bromuro de etidio hasta una
concentración de 0,5 �g/ml. Antes de cargar las muestras en el gel, el cual se precorrió
a 5V/cm 2 por 5 minutos. La electroforesis se llevó a cabo a 70 mA. El RNA se visualizó
en un transiluminador de luz ultravioleta.
4.5.- Amplificación del gen de la proteína S1 por RT-PCR.
El gen de la proteína S1 completa se amplificó por medio de la reacción RT-PCR,
para lo cual se usaron los partidores S1OLIGO5’ (5'TGAAAACTG AACAA AAGACA3')
(forward) y S1OLIGO3’ (5'CATAACTAACA TAAG GGC AA 3') (reverse), con los cuales
se obtuvo un producto de PCR de 1720 pares de bases (Figuras 3 y 4) (Kwon et al,
1993). Los partidores fueron elaborados por Bios Chile S.A.
Para la reacción de Transcripción Reversa se preparó una mezcla con 2,0 µl de
10 mM de cada dNTP, 1,5 µl del primer S1OLIGO3’ 25 mM, 5,0 µl de RNA y 6,0 µl de
agua desionizada estéril tratada con dietilpirocarbonato. Esta mezcla fue desnaturada a
65ºC por 10 minutos. Posteriormente se agregaron a esta mezcla 4,0 µl de buffer RT 5X
(250mM Tris-HCl [pH 8.3 a 25ºC], 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT), 200
unidades de M-MLV RT (Promega, Madison, Wis), y 20 unidades de RNasin (Promega,
Madison, Wis) obteniendo un volumen total de 20,0 µl. La mezcla fue incubada por 1
hora a 45ºC, y luego a 95ºC por 5 minutos para detener la reacción. El cDNA producido
fue almacenado a -20ºC.
16

La mezcla de reacción para PCR se preparó con 5,0 µl de Buffer de PCR 10X
(10 mM Tris-HCl [pH 9.0 a 25ºC], 50 mM Kcl y 0.1% Triton ® X-100), 6,0 µl de MgCl2 25
mM, 2,0 µl de 10 mM de cada dNTP, 1,5 µl del primer S1OLIGO3’ 25 mM, 1,5 µl del
primer S1OLIGO5’ 25 mM, 0,25 µl de Taq DNA polimerasa (Promega, Madison, Wis),
5,0 µl de cDNA y agua desionizada estéril tratada con dietilpirocarbonato hasta
completar un volumen final de reacción de 25,0 µl.
La reacción de PCR consistió en 35 ciclos de denaturación a 94ºC por 1 minuto,
alineamiento a 45ºC por 2 minutos y polimerización a 74ºC por 5 minutos. La
denaturación inicial fue a 94ºC por 5 minutos y la polimerización final a 74ºC por 6
minutos. Tanto la reacción RT como el PCR se llevaron a cabo en un termociclador
Perkin Elmer gene Amp (PCR System 2400). Los productos de PCR fueron
almacenados a -20ºC.
3.5.2. Electroforesis en geles de agarosa.
Las preparaciones, purificaciones y digestiones del DNA plasmidial y los
productos de RT-PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa, cuya
concentración fluctuó entre 1,0 y 1,5%, dependiendo del tamaño de los fragmentos que
se deseaba visualizar. Antes que gelificaran los geles se tiñeron con bromuro de etidio a
una concentración final de 0,25 �g/ml. Como tampón de corrida se utilizó TAE 1x (Tris-
acetato 40 mM �pH 8,0�, EDTA 2 mM y acetato de sodio 20 mM). Las muestras de DNA
se aplicaron al gel mezcladas con tampón de carga 6X (azul de bromofenol 0,25%,
glicerol 30% y TAE 6x). La corrida electroforética se llevó a cabo entre 60 - 80 mA.
17

fotografiaron.
Finalmente, las bandas de DNA se visualizaron en un transiluminador UV y se
La reacción de PCR de los aislados de campo no generó suficiente producto de
PCR para las digestiones enzimáticas, por lo cual el producto de PCR se ligó al vector
pGEM-T easy (Promega) para transformar la cepa de E. coli JM109.
18

S1OLIGO5’
S1OLIGO3’: 5’CATAACTAACATAAGGGCAA3’
S1OLIGO5’: 5’TGAAAACTGAACAAAAGACA3’
Rep S E M N
S1OLIGO3’
S1 S2
Figura 3. Mapa del genoma de IBV y los sitios de hibridación de los partidores.
19
S: Gen de la proteína de espícula
S1: Segmento S1 de la proteína de espícula
S2: Segmento S2 de la proteína de espícula
E: Gen de la proteína de envoltura
M: Gen de la proteína de Membrana
N: Gen de la nucleoproteína

S1OLIGO5’
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P V I T R H N Y N N I T L N T C V D Y N I Y G
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G T R R F R R S I T E N V A N C P Y V S Y
S1OLIGO3’
Figura 4. Secuencia nucleotídica y aminoacídica del producto de PCR de IBV
Cepa tipo Mass 41. En amarillo aparecen los partidores, y en rojo las 3 regiones
hipervariables.
20
HVR1
HVR 2
HVR 3

4.6.- Clonamiento de productos de PCR correspondientes al gen S1 en vector
pGEMT-easy
Para aumentar la cantidad de producto del gen S1 y posteriormente clonarlo en
el vector plasmidial pGEMT-Easy se procedió a purificar el producto de PCR desde
geles de agarosa.
4.6.1.- Purificación de productos de PCR desde gel de agarosa.
Los productos de PCR correspondiente al gen de la proteína S1 se purificaron
con el sistema E.Z.N.A ® Gel Extraction Kit (OMEGA) para ser clonados en el vector
pGEM-T Easy. Se siguieron las instrucciones del fabricante que se indican a
continuación:
Se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1% disuelto en Buffer TAE 1X
(Tris-acetato 40 mM �pH 8,0�, EDTA 2 mM y acetato de sodio 20 mM) teñido con
bromuro de etidio para separar los fragmentos de DNA.
Una vez separadas las bandas e identificado el producto de PCR se cortó un
trozo de gel conteniendo el fragmento de PCR y se depositó en un tubo eppendorf.
Luego se determinó el volumen aproximado del gel por peso y se asumió una densidad
de 1 g /ml de gel. Se agregó una cantidad igual de Binding buffer y se incubó la mezcla
entre 55º y 60º por 7 minutos o hasta que el gel se disolviera completamente, el tubo se
agitó cada 2 ó 3 minutos y se centrifugó brevemente para colectar el líquido en el
fondo.
21

Se aplicaron 700 µl de la solución DNA/agarosa en una columna de extracción
HiBind ® ensamblada a un tubo de recolección de 2 ml, se centrifugó en
microcentrífuga a 10.000 x g por un minuto a temperatura ambiente. El filtrado obtenido
fue descartado y se agregaron 300 µl de Binding buffer a la columna. Se centrifugó
nuevamente a 10.000 x g por 1 minuto a temperatura ambiente.
Luego se agregaron 700 µl de SPW buffer diluido con etanol absoluto a la
columna y se incubó 3 minutos. Una vez transcurrido el tiempo se centrifugó a 10.000 x
g por 1 minuto a temperatura ambiente para lavar la columna (este paso se realizó 2
veces). Posteriormente la columna se centrifugó vacía a 10000 x g por 1 minuto para
secar la matriz. Para finalizar, se trasladó la columna a un tubo eppendorf limpio, se
agregaron 50 µl de buffer de elusión y se centrifugó a 10000 x g por 1 minuto a Tº
ambiente. La concentración se estimó por espectrofotometría usando la fórmula antes
señalada con 1 O.D. correspondiente a 50 µg/ml de DNA hebra doble. El DNA
plasmidial obtenido se almacenó a -20ºC.
4.6.2.- Preparación de Bacterias Competentes (E. coli JM109)
Para la preparación de las células competentes se siguió el procedimiento
descrito por Hanahan (1987). Con este fin, 30 ml de medio LB se inocularon con una
colonia de E. coli DH-5α y se incubaron a 37ºC por 16 horas con agitación (225 rpm).
Se tomó 2.5 ml de cultivo y se agregó a matraces de 2 litros conteniendo 250 ml de
medio LB y se incubó a 37ºC con agitación (225 rpm) hasta que alcanzó una densidad
22

óptica de 0.5 (D.O.600 ≈ 0.5), luego se mantuvieron en hielo por 20 minutos y se
centrifugaron a 2000 rpm por 5 minutos a 4ºC para recuperar las células.
El sedimento bacteriano fue resuspendido en ¼ del volumen inicial de la solución
en una solución fría de MgCL2 100 mM (62.5 ml) y se centrifugó nuevamente a
2000 rpm por 5 minutos a 4ºC.
Una vez centrifugado se resuspendieron las células en 12.5 ml de una solución
fría de CaCl2 100 mM, luego se agregó 112,5 ml de la misma solución fría de CaCl2
100 mM y se dejó incubando en hielo por 20 minutos, pasado ese tiempo se centrifugó
por 5 minutos a 4ºC a 2000 rpm. El sedimento obtenido fue resuspendido en 1.5 ml de
una solución fría de 85% Cacl2 y 15% glicerol. Las bacterias permeabilizadas se
distribuyeron en alícuotas de 100 µl y fueron almacenadas a -80ºC.
4.6.3.- Ligación de productos de PCR en vector pGEMT-easy.
Los productos de PCR purificados fueron preincubados 30 minutos a 72ºC con
0,5 µl de Taq Polimerasa y con 1,0 µl de dNTP’s 10 mM justo antes de la ligación.
Para la reacción de ligación se realizó una mezcla de reacción con 5,0 µl de
Buffer de ligación 2X (60mM Tris-Hcl [pH 7,8], 20 mM MgCl2, 20 mM DTT, 2 mM ATP,
10% PEG), 1,0 µl de vector pGEM-T Easy (figura 5), 3,0 µl de producto de PCR y 1,0 µl
de T4 DNA ligasa obteniéndose un volumen final de reacción de 10,0 µl. La mezcla de
ligación fue incubada a 4ºC durante toda la noche.
23

4.6.4.- Transformación de células competentes
Se unieron 10 µl de la mezcla de ligación con 100 µl de células competentes E.
coli JM109 las cuales fueron descongeladas en hielo por 15 minutos. Esta mezcla fue
incubada en hielo por 30 minutos y luego se aplicó un golpe térmico a 42ºC por 45
segundos, el tubo fue enfriado en hielo por 2 minutos y se le agregaron 0,9 ml de medio
S.O.C. estéril (triptona 2%, extracto de levadura 0,5%, NaCl2 10 mM, KCl 2,5 mM)
suplementado con Mg 2+ y glucosa ambos a una concentración final de 20 mM.
La mezcla fue incubada a 37ºC por 60 minutos con agitación de 225 rpm y
posteriormente se sembraron alícuotas de 200 µl en placas Petri de 9 cm de diámetro
conteniendo medio sólido LB/ampicilina (50 µg/ml), suplementado con IPTG (0.5 mM) y
X-Gal (80 µg /ml), lo que provocó una coloración azul en las colonias sin inserto y una
coloración blanca en las colonias con producto de PCR insertado.
Las bacterias fueron incubadas a 37ºC por 16 horas, después de la incubación
se aislaron colonias blancas en medio líquido LB/Ampicilina (50µg/ml) y fueron
incubadas a 37ºC con agitación 225 rpm durante toda la noche.
24

Figura 5. Mapa del Vector pGEM-T ® Easy. (Promega, Madison, Wis)
25

4.6.5.- Purificación DNA plasmidial utilizando lisis por ebullición
La purificación del DNA plasmidial se realizó a pequeña escala, como se
describe en Sambrook et al (1989). Las colonias de E. Coli recombinantes fueron
sembradas en 1,5 ml de cultivo, e incubadas durante toda la noche a 37ºC.
Posteriormente las bacterias fueron cosechadas por centrifugación a 12.000 x g por
5 minutos a temperatura ambiente y el sedimento bacteriano resultante fue
resuspendido en 100 µl de solución STET (sacarosa 8%, Tris 50 mM [pH 8.0], EDTA 50
mM y Tritón X-100 5%) conteniendo lisozima (50 µg/ml) e incubado en un baño de
agua a 100ºC por 60 segundos. Luego el tubo se centrifugó a 12.000 x g por 10
minutos a temperatura ambiente, y el sobrenadante obtenido puesto en un nuevo tubo.
El DNA plasmidial contenido en el sobrenadante fue precipitado con 100 µl de
isopropanol y se mezcló por agitación. El DNA precipitado fue sedimentado por
centrifugación a 12.000 x g por 15 minutos a 4ºC.
El sobrenadante obtenido fue descartado y el sedimento con DNA fue lavado con
0,5 ml de etanol 70% v /v a -20ºC y centrifugado a 12.000g por 3 minutos a temperatura
ambiente. El sobrenadante se eliminó y el sedimento se dejó secar al aire. Una vez
seco, el DNA plasmidial fue resuspendido en 30 µl de agua desionizada estéril hasta
crear una mezcla homogénea. La concentración se determinó por medición de la
densidad óptica a 260 nm en espectrofotómetro Spectronic genesys 8, como se
describió anteriormente.
En el DNA plasmidial purificado se confirmó la presencia del inserto por medio de
su liberación con la enzima de restricción EcoR I. Para la mezcla de reacción se
26

utilizaron 2 unidades de enzima EcoR I (Fermentas), 1,0 μl de buffer O + (50 mM Tris-
Hcl [pH 7.5], 10 mM MgCl2, 100 mM Nacl y 0,1 mg /ml BSA) y 3,0 μl de DNA plasmidial,
se ajustó el volumen de la reacción a 10,0 μl con agua desionizada estéril, se visualizó
en un gel de agarosa al 1% teñido con Bromuro de Etidio.
Los vectores con el inserto fueron purificados con el Miniprep Kit E.Z.N.A. para
su secuenciación.
4.6.6.- Purificación de plásmidos con el sistema Plasmid Miniprep Kit E.Z.N.A
(OMEGA).
Se inoculó 5 ml de LB/ampicilina (50 μg/ml) con bacterias E. Coli que contenían
el plásmido con el inserto y se incubó a 37ºC con agitación de 225 rpm toda la noche.
Las bacterias fueron sedimentadas a partir de 1,5 ml de cultivo bacterial por
centrifugación a 10.000xg por 1 minuto a Tº ambiente, descartando el sobrenadante.
Luego se agregaron al tubo 250 μl de solución I/RNase A, y se agitó para resuspender
el sedimento. Una vez que el sedimento fue resuspendido, se agregó al tubo 250 μl de
solución II y se mezcló por inversión 4 a 6 veces, hasta obtener un lisado claro. A la
mezcla anterior se le agregó 350 μl de solución III y se mezcló por inversión varias
veces hasta formar un precipitado blanco, luego se centrifugó a 10.000xg por 10
minutos a Tº ambiente.
Después de la centrifugación, el sobrenadante fue aspirado cuidadosamente y
puesto en una columna Type I HiBind Miniprep limpia con tubo de recolección. Se
27

centrifugó a 10.000xg por un minuto, el sobrenadante fue descartado y la columna
lavada con 500 μl de Buffer HB, se centrifugó nuevamente a 10.000xg por 1 minuto
descartando el sobrenadante. Luego la columna vacía fue centrifugada por 1 minuto a
10.000xg para secar la matriz. Posteriormente la columna se colocó en un tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml limpio y se agregó 50 μl de buffer de elusión directamente en
la matriz de la columna y se centrifugó a 10.000xg por 1 minuto. El DNA plasmidial
extraído fue almacenado a -20ºC, y además secuenciado en el Laboratorio de
Genómica, Laboratorio de Virología de Peces, CSIC, España.
4.7.- Determinación del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de
Restricción (RFLP)
Los productos de PCR obtenidos desde los plasmidios recombinantes,
conteniendo el gen S1 de las vacunas y los aislados de campo fueron digeridos con las
enzimas de restricción Hae III y Xcm I para identificar los genotipos de IBV (Kwon et
al,1993).
Para la reacción con la enzima Hae III se utilizaron 5,0 μl de producto de PCR,
0,5 μl de enzima de restricción Hae III (GibcoBRL), 1,0 μl de Buffer React2 (GibcoBRL)
y 3,5 μl de agua desionizada estéril. Para la reacción con la enzima Xcm I se utilizó 5,0
μl de Producto de PCR, 0,5 μl de enzima de restricción Xcm I (New England Biolabs),
1,0 μl de NeBuffer2 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Hcl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol
[pH 7.9 a 25ºC]), y 3,5 μl de agua desionizada estéril. Ambas reacciones se realizaron a
28

37ºC por 3 horas, y los productos de digestión se resolvieron en geles de agarosa al
1,5% teñidos con Bromuro de etidio.
El patrón de restricción obtenido se comparó con los descritos en la bibliografía.
(Kwon et al, 1993).
4.8.- Análisis de la secuencia y construcción de filogenia.
El análisis filogenético y molecular de los aislados de campo secuenciados se
llevó a cabo con el software MEGA versión 4 (Tamura et al, 2007).
Para realizar el análisis se utilizaron las siguientes secuencias de cepas de IBV
obtenidas desde el Genbank : Beaudette (X02342), Conn (L18990), D41 (AF036937)
DE 072 (U77298), Florida (AF027512), GA980470 (AF274437), Gray (L14069), H120
(M21970), JMK (L14070), Mass41 (X04722), KB8523 (M21515), aislado español
(DQ386104).
29

4.9.- Análisis del perfil de proteínas de las cepas de vacunas y de los aislados de
campo por electroforesis de proteínas en condiciones denaturantes con SDS
(SDS-PAGE)
Para analizar el patrón de proteínas de las distintas cepas de vacunas y aislados
de campo se procedió a realizar una electroforesis en condiciones denaturantes con
SDS (SDS-PAGE), siguiendo básicamente el protocolo descrito en Sambrook et al.
(1989).
4.9.1.- Preparación de geles de poliacrilamida
El gel separador fue de poliacrilamida al 12% y pH 8,7, preparado a partir de una
solución patrón de acrilamida 30%/bisacrilamida 0,8%, buffer Tris-Hcl 1,5M pH 8,8 y
SDS 10%. Sobre el gel separador, se polimerizó un gel espaciador al 4% pH 6,8, con el
objeto de reunir todas las proteínas en un frente común. La electroforesis se desarrolló
en buffer de corrida (Tris-HCl 25 mM �pH 8,3�, glicina 192 mM y SDS 0,1%). Durante la
entrada y migración de la muestra en el gel espaciador la corrida electroforética se llevó
a cabo a 15 mA, y posteriormente, a 20 mA cuando la muestra ingresó en el gel
separador.
Finalizada la corrida, el gel fue teñido 1 hora con una solución compuesta de azul
de Coomasie R-250 al 0,3%, metanol 50% y ácido ácetico 10% y se destiñó con una
solución de formulada con 25ml de Metanol 100%, 35 ml de ácido acético glacial y 440
ml de agua destilada.
30

4.9.2.- Preparación de las muestras
En un tubo eppendorf estéril de 1,5 ml se mezclaron 20 μg de Proteínas de cada
muestra, 7,5 μl de Buffer de Carga para proteínas y agua destilada estéril hasta
completar 30 μl, las muestras fueron denaturadas a 100ºC por 5 minutos y
posteriormente puestas en hielo, luego se centrifugaron brevemente para colectar toda
la muestra en el fondo del tubo para ser cargadas.
Las muestras fueron cargadas en el gel espaciador en la cámara electroforética
y corridas a 15mA usando la fuente de poder power pac 1000 de BioRad. Cuando las
muestras pasaron al gel separador se aumentó la carga eléctrica a 20mA.
4.10.- Análisis de los determinantes antigénicos de las cepas de vacunas y de los
aislados de campo mediante transferencia de proteínas a membranas de
nitrocelulosa (Western Blot) por sistema semidry (BIORad).
Para identificar y comparar los determinantes antigénicos de las vacunas y los
aislados de campo se utilizó la técnica de Western blot utilizando el siguiente
procedimiento:
El gel de poliacrilamida se equilibró junto con dos papeles filtros y una membrana
de nitrocelulosa, cortados del mismo diámetro que el gel, en Buffer de Transferencia
(formulación buffer) con agitación constante por 20 minutos.
31

Luego se colocaron en la cámara de electrotransferencia sistema semi-dry
(BioRad) los papeles filtro, la membrana y el gel en el siguiente orden: papel filtro,
membrana de nitrocelulosa, gel de poliacrilamida y papel filtro. La electrotransferencia
se realizó a 5,5 mA por cm 2 de gel por 20 minutos.
Terminada la electrotransferencia se incubó la membrana con solución de
bloqueo TBS-T (Tris-HCl 20 mM �pH 7,5�, NaCl 150 mM y 0,1% de Tween-20)
suplementada con 5% p /v de leche descremada por 1 hora con agitación a temperatura
ambiente.
Posteriormente la membrana fue puesta en una bolsa plástica y se le agregó 3 ml
de solución de bloqueo TBS-T suplementada con 5% de leche descremada
conteniendo una dilución 1 /250 del anticuerpo primario anti IBV cepa Massachussets
(formulado en gallina), luego la bolsa plástica fue sellada y se dejó en incubación con
agitación continua toda la noche.
Transcurrido el tiempo se sometió la membrana de nitrocelulosa a 3 lavados de
10 minutos cada uno en agitación continua con TBS-T suplementado con leche
descremada 5% p /v para eliminar el exceso de anticuerpos. Finalizados los lavados se
transfirió la membrana de nitrocelulosa a una bolsa plástica y se le agregó el anticuerpo
secundario anti IgY de gallina en una dilución 1 /500 en TBS-T con leche descremada 5%,
se selló la bolsa y se dejó en agitación continua por 3 horas.
Terminada la incubación con el segundo anticuerpo se sometió la membrana de
nitrocelulosa a 2 lavados de 10 minutos cada uno en agitación continua con TBS-T
suplementado con leche, y luego se procedió a realizar un tercer lavado con PBS 1x
para eliminar los residuos de leche.
32

Para visualizar las bandas inmunoreactivas se dejó la membrana en 10 ml de
solución de revelado compuesta por 10 mg de DAB y 10 �l de peróxido de hidrógeno
30% completando el volumen con TBS, la reacción fue detenida con abundante agua
destilada.
33

5.1.- Extracción del RNA Viral
5. RESULTADOS
El RNA se extrajo desde las alícuotas de las vacunas y de los aislados de campo
con el kit de extracción de RNA viral QiAmp (QIAgen), obteniéndose un volumen total
de 50 μl. En todas las muestras se obtuvo una concentración suficiente para realizar la
reacción de RT/PCR (sobre 50 ng/ μl).
La evaluación de la integridad del RNA viral extraído, por medio de una
electroforesis en condiciones denaturantes, reveló bandas características de un RNA
íntegro en 5 de las 6 vacunas y en los aislados de campo. La vacuna Merial, no
presentó la banda de RNA (Figura 5).
34

1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 6. Análisis de la integridad del RNA viral extraído desde vacunas de IBV y
aislados de campo. Fraccionamiento en gel de agarosa/formaldehído al 1%. Carril 1:
Ceva, Carril 2: Fort Dodge, Carril 3: Nobilis, Carril 4: Bronipra, Carril 5: Merial, Carril 6:
Austral 14, Carril 7: Austral 3, Carril 8: Austral 5.
RNA
Extraído
35

5.2.- Amplificación del gen de la proteína S1 por RT-PCR.
La reacción de RT/PCR, usando los partidores específicos S1OLIGO3’ y
S1OLIGO5’, fue positiva tanto para las vacunas como para los aislados de campo,
siendo amplificado un producto de 1.720 pares de bases correspondiente al gen de la
proteína S1 de IBV (Figura 7a).
En la figura 8 se muestra el producto de la digestión del plásmido con el producto
de RT-PCR insertado, correspondientes a los aislados de campo, con la enzima de
restricción EcoR I, la cual libera el producto insertado en el vector, confirmando la
presencia del inserto correspondiente al producto de PCR.
Para verificar que el producto insertado corresponda al producto de PCR
esperado, se realizó una reacción de PCR con una dilución 1/50 de DNA plasmidial de
cada aislado de campo con los partidores específicos S1OLIGO3’ y S1OLIGO5’. Esta
reacción confirmó la presencia del producto de PCR esperado de 1720 pares de bases,
correspondiente al gen S1 clonado, de los 3 aislados de campo (Figura 7b).
36

a)
b)
1500 pb
1000 pb
500 pb
1720 pb
1500 pb
1000 pb
500 pb
1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5
1720 pb
Figura 7. Amplificación por RT-PCR del gen de la proteína S1 desde RNA de
vacunas y aislados de campo. En negro se muestran las bandas de 500 pb, 1000 pb
y 1500 pb del marcador molecular, la flecha azul muestra el producto de PCR de 1720
pb. a) carril 1: Marcador molecular de 100 pb, carril 2: Ceva, Carril 3: Fort Dodge, Carril
4: Nobilis, Carril 5: Bronipra, Carril 6: Merial, Carril 7: Control negativo. b) Carril 1:
Marcador molecular de 100 pb, Carril 2: Austral 14, Carril 3: Austral 3, Carril 4: Austral
5, Carril 5: control negativo.
37

1500 pb
1000 pb
500 pb
1 2 3 4 5
3015 pb
1720 pb
Figura 8. Digestión enzimática del vector pGEM-T easy con la enzima de
restricción EcoR I para liberar el producto de PCR insertado. Fragmentado en un
gel de agarosa al 1,5%. La flecha verde muestra el vector pGEM-Teasy, y la flecha roja
el producto de PCR insertado. Carril 1: Marcador Molecular, Carril 2: Austral 14, Carril 3:
Austral 3, Carril 4: Austral 5, Carril 5: Control negativo correspondiente al vector sin
inserto.
38

5.3.- Determinación del Polimorfismo de la Longitud del Fragmento de Restricción
(RFLP),
Los productos de PCR clonados de las vacunas y de los aislados de campo
fueron digeridos con las enzimas de restricción Hae III y Xcm I para analizar el
polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción.
El resultado obtenido con la enzima de restricción Hae III reveló que las 5
vacunas presentan un patrón de restricción idéntico a la cepa Mass, pero que los
aislados de campo analizados presentan un patrón distinto no sólo a Mass, sino que
también a todos los patrones de restricción descritos para las cepas de referencia
(Figura 9) (Kwon et al, 1993).
La digestión con la enzima de restricción Xcm I mostró un patrón idéntico a Mass
para las 5 vacunas estudiadas, pero un patrón completamente nuevo y diferente para
los aislados de campo (Figura 10). El resumen de los tamaños de los fragmento
obtenidos por la digestiones con las enzimas de restricción se presenta en la tabla 3.
Tabla 3. Resumen de los fragmentos de restricción obtenidos por RFLP. Los
tamaños de los fragmentos de restricción son aproximados y están en pares de bases.
Muestras Mass Tipo Vacunas Austral 14 Austral 3 Austral 5
Enzima HaeIII XcmI HaeIII XcmI HaeIII XcmI HaeIII XcmI HaeIII XcmI
Fragmentos 970 960 970 960 960 1540 960 1540 980 1720
de 430 600 430 600 320 180 320 180 340
Restricción 320 180 320 180 240 240 240
200 200 160
39

Para descartar que los resultados de las digestiones enzimáticas de los aislados
de campo tengan relación con la inserción del producto en el plasmidio, se ligó un
producto de PCR correspondiente al gen S1 de la vacuna Fort Dodge en el vector
pGEM-T Easy.
Al digerir el producto de PCR de la vacuna insertado, con las enzimas de
restricción Hae III y Xcm I, no se presentaron variaciones con los resultados obtenidos
anteriormente para esa vacuna, es decir, presentó el patrón del genotipo Mass en
ambas digestiones enzimáticas (Figura 11).
40

a)
b)
1500 pb
1000 pb
500 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4
1720 pb
Figura 9. Digestión del gen S1 de IBV con la enzima de Restricción Hae III. (a) Los
productos de digestión fueron separados en un gel de agarosa al 1,5%. Las flechas
amarillas señalan los fragmentos de restricción obtenidos por las vacunas, las flechas
rojas señalan los fragmentos de restricción obtenidos por los aislados de campo. Carril
1: Marcador Molecular 100 pb, Carril 2: Ceva, Carril 3: FortDodge, Carril 4: Nobilis,
Carril 5: Bronipra, Carril 6: Merial, Carril 7: Austral 14, Carril 8: Austral 3, Carril 9:
Austral 5, Carril 10: Control negativo sin digerir. (b) Esquema de las digestiones del gen
S1 con la enzima de restricción Hae III. Carril 1: Vacunas (tipo Mass), Carril 2: Austral
14, Carril 3: Austral 3 y Carril 4: Austral 5.
41

a)
b)
1500 pb
1000 pb
500 pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4
1720 pb
Figura 10. Digestión del gen S1 de IBV con la enzima de restricción Xcm I. (a) Los
productos de digestión fueron resueltos en un gel de agarosa al 1,5%. Las flechas
amarillas señalan las bandas obtenidas por las 5 vacunas y las flechas rojas señalan
los fragmentos obtenidos en los aislados de campo. Carril 1: Marcador Molecular 100
pb, Carril 2: Ceva, Carril 3: Fort Dodge, Carril 4: Nobilis, Carril 5: Bronipra, Carril 6:
Merial, Carril 7: Austral 14, Carril 8: Austral 3, Carril 9: Austral 5, Carril 10: Control
negativo sin digerir. (b) Esquema de la digestión del gen S1 con Xcm I. Carril 1:
Vacunas (tipo Mass), Carril 2: Austral 14, Carril 3: Austral 3 y Carril 4: Austral 5.
42

a)
b)
1500 pb
1000 pb
500 pb
Hae III XcmI
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Hae III
XcmI
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Figura 11. Digestiones enzimáticas del gen S1 de IBV amplificado por RT-PCR y
clonado en pGEM-T Easy de cepas de campo y cepa de vacuna Fort Dodge.
(a) Resuelto en un gel de agarosa al 1,5%. Las flechas amarillas indican los fragmentos
de restricción obtenidos por la vacuna digerida con Hae III y Xcm I, mientras que las
flechas rojas señalan los fragmentos de restricción obtenidos por los aislados de
campo. (b) Esquema de las digestiones enzimáticas. Carril 1: Marcador molecular 100
pb, Carril 2: Austral 14, Carril 3: Austral 3, Carril 4: Austral 5, Carril 5: Vacuna (Fort
Dodge), Carril 6: Austral 14, Carril 7: Austral 3, Carril 8: Austral 5, Carril 9: Vacuna (Fort
Dodge).
43

5.4.- Análisis filogenético y molecular de los aislados de campo secuenciados.
De los 3 aislados de campo enviados para secuenciación sólo 2 lograron ser
secuenciados, Austral 5 y Austral 14, por lo cual sólo se analizó molecularmente estos
aislados. El tamaño de la secuencia obtenida para Austral 5 fue de 978 pares de bases
y para Austral 14 de 909 pares de bases (Figura 12), ambos correspondientes al
extremo 3’ del gen S1. Dentro del segmento secuenciado se encuentra la tercera región
hipervariable (HVR3). El análisis de la secuencia aminoacídica del HVR3 mostró
diferencias en la composición de los aislados de campo con respecto a la cepa Mass
(Figura 13). Al comparar los aislados de campo con otras cepas de referencia y con
aislados de otros países, se encontró que Austral 5 y Austral 14 están más relacionados
con aislados de campo de España, Escocia y China (este último nefropatogénico), que
con las demás cepas de referencia utilizadas (Figura 14).
La construcción de la filogenia se realizó con un trozo de 806 pares de bases de
las secuencias de cepas de referencia y de campo previamente alineadas. Este
análisis se realizó con el método UPGMA y se utilizó un bootstrap con 1000 réplicas
arrojando un árbol de consenso, el cual muestra diferencias cercanas a las 100 pares
de bases entre los aislados de campo y las demás cepas de IBV analizadas (Figura 15).
Se utilizó a un coronavirus humano (SARS) como control.
44

Austral 5
atactggtaatttttcagacggtttctatccttttactaatgatactattgttaaggataga
T G N F S D G F Y P F T N D T I V K D R
ttcattgtttatcgtgaaggtagtgttaatactactttgtcgttaactaattttactttc
F I V Y R E G S V N T T L S L T N F T F
aaaaaccaaagtagtgcccctcctaacacaggnggtgtcaatacttttgttctgtatcag
K N Q S S A P P N T X G V N T F V L Y Q
acacaaacagctcagagtggttattataattttaatttttcctttctgagtagttttgtg
T Q T A Q S G Y Y N F N F S F L S S F V
tataagagttctgattttatgtatgggtcgtaccatccaggatgcgcttttagacctgag
Y K S S D F M Y G S Y H P G C A F R P E
acacttaataatggcctgtggtttaattctttatcagtctcactcacttatggacctcta
T L N N G L W F N S L S V S L T Y G P L
cagggtgggtgtaagcagtctgtttttaaaggcagagcaacttgttgttttgcctattct
Q G G C K Q S V F K G R A T C C F A Y S
tacaatggccctcgtgagtgtaaaggtgtttatgctggtgagttaggtagtaaatttgaa
Y N G P R E C K G V Y A G E L G S K F E
tgtggtttgctggtttatgttactaagagcgatggctctcgtatacaaactagaaatgaa
C G L L V Y V T K S D G S R I Q T R N E
cccttagttttaactcaacacaattataataatattactttaaataagtgtgtggactat
P L V L T Q H N Y N N I T L N K C V D Y
aatatatatggtagggtaggccaaggttttattactaatgtaacagattcagttgctggt
N I Y G R V G Q G F I T N V T D S V A G
tataactacttacaggaaggtggattagctattttagatacttcaggtgccatagatatc
Y N Y L Q E G G L A I L D T S G A I D I
ttccttgtacaaggtaaatatggtcctaattattacaaggttaatccttgtgaggatgtt
F L V Q G K Y G P N Y Y K V N P C E D V
aaccagcagtttgtggtgtctggtggcaaattagttggcatccttacttcacgtaatgaa
N Q Q F V V S G G K L V G I L T S R N E
tccaattctcaacttattgagaatcggttttatgttaaactcactaatgattcgcgtcgt
S N S Q L I E N R F Y V K L T N D S R R
tttagacgtgctgttagtgagaatgttacaagttgcccttatgttagttatgaatcgaat
F R R A V S E N V T S C P Y V S Y E S N
tcccgcggccgccatggcggc
S R G R H G G
Austral 14
ccaaagtagtgcccctcctaatacaggtggtgtcgaaactttcgttctttatcagacacag
Q S S A P P N T G G V E T F V L Y Q T Q
acagctcagagtggttattataattttaatttttcctttctgagcagttttgtatataag
T A Q S G Y Y N F N F S F L S S F V Y K
ccttctgattttacgtttgggtcttatcatcctaaatgtagttttagacctgagacactt
P S D F T F G S Y H P K C S F R P E T L
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N N D L W F N A L S V S L T Y G P L Q G
gggtgtaagcaatcggtttttagtggcagagctacttgttgttttgcctattcatacaat
G C K Q S V F S G R A T C C F A Y S Y N
ggccctcgtgagtgtaaaggtgtttatgctggtgagttacgtaataaatttgaatgtggt
G P R E C K G V Y A G E L R N K F E C G
ctgctggtctatgttactaagagcgatggctcccgtatacaaactagatctaaaccctta
L L V Y V T K S D G S R I Q T R S K P L
gtgttaatgcagtataattataataacattactttaaacaagtgtgttgaatataatata
V L M Q Y N Y N N I T L N K C V E Y N I
tatggtagagtaggacaaggttttattactaatgtaactgattcagctgctggttataat
Y G R V G Q G F I T N V T D S A A G Y N
tatttagcggatgctgggttagctattttagacacttcaggtgccatagacacctttgtt
Y L A D A G L A I L D T S G A I D T F V
gtacaaggtaattatggccttaattattacaaggttaacccttgtgaagacgttaatcag
V Q G N Y G L N Y Y K V N P C E D V N Q
caatttgtagtgtctggtggcaacatagttggcatccttacttcacgtaatgaatctaat
Q F V V S G G N I V G I L T S R N E S N
tcgcaacttgttgagaatcgattttatgttaaattatttaatgacactcgtcgttccagg
S Q L V E N R F Y V K L F N D T R R S R
cgttctatttctcagaatgttac
R S I S Q N V
Figura 12. Secuencia nucleotídica y aminoacídica de los aislados de campo. En
rojo se señala la tercera región hipervariable (HVR3),
HVR3
HVR3
45

Mass41 MLVTPLLLVT LLCALCSAVL YDSSSYVYYY QSAFRPPSGW HLQGGAYAVV NISSEFNNAG SSSGCTVGII HGGRVVNASS
Austral 5 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Austral 14 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Mass41 IAMTAPSSGM AWSSSQFCTA HCNFSDTTVF VTHCYKHGGC PLTGMLQQNL IRVSAMKNGQ LFYNLTVSVA KYPTFRSFQC
Austral 5 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Austral 14 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------
Mass41 VNNLTSVYLN GDLVYTSNET IDVTSAGVYF KAGGPITYKV MREVKALAYF VNGTAQDVIL CDGSPRGLLA CQYNTGNFSD
Austral 5 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----......
Austral 14 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -------...
Mass41 GFYPFTNSSL VKQKFIVYRE NSVNTTCTLH NFIFHNETGA NPNPSGVQNI QTYQTKTAQS GYYNFNFSFL SSFVYKESNF
Austral 5 .......DTI ..DR...... G.....LS.T ..T.K.QSS. P..TG-.NTF VL...Q.... .......... ......S.D.
Austral 14 .....V.DT- ..ER.V.... -.F...LS.T .YT.K-QSS. P..TG..ETF VL...Q.... .......... ......P.D.
Mass41 MYGSYHPSCK FRLETINNGL WFNSLSVSIA YGPLQGGCKQ SVFKGRATCC YAYSYGGPSL CKGVYSGELD HNFECGLLVY
Austral 5 .......G.A ..P..L.... ........LT .......... .......... F....N..RE .....A...G SK........
Austral 14 TF.....K.S ..P..L..D. ...A....LT .......... ...S...... F....N..RE .....A...R NK........
Mass41 VTKSGGSRIQ TATEPPVITQ NNYNNITLNT CVDYNIYGRT GQGFITNVTD SAVSYNYLAD AGLAILDTSG SIDIFVVQGE
Austral 5 ....D..... .RN..L.L.. H........K .........V .......... .VAG....QE G......... A....L...K
Austral 14 ....D..... .RSK.L.LM. Y........K ..E......V .......... ..AG...... .......... A..T.....N
Mass41 YGLNYYKVNP CEDVNQQFVV SGGKLVGILT SRNETGSQLL ENQFYIKITN GTRRFRRSIT ENVANCPYVS YGKFCIKPDG
Austral 5 ..P....... .......... .......... ....SN...I ..R..V.L.. DS.....AVS ...TS..... .ESNSRGRH.
Austral 14 .......... .......... ...NI..... ....SN...V ..R..V.LF. D...S....S Q..------- ----------
Mass41 SIATIVPKQL EQF
Austral 5 G--------- ---
Austral 14 ---------- ---
Figura 13. Alineamiento de las secuencias aminoacídicas deducidas de los aislados de Campo y de la cepa
Mass. En rojo se indica la tercera región hipervariable (HVR3).
46

#Mass_41 RGLLACQYNT GNFSDGFYPF INSSLVKQKF IVYRENSVNT TFTLHNFTFH NETGANPNPS GVQNIQTYQT QTAQSGYYNF
#Beaudette .......... .......... T......... .......... .C.....I.. .......... .......... K.........
#H120 .......... .......... T......... .......... .......... .......... .......... ..........
#Florida .......... .......... T......... ..H....I.. .LK....... ........LG .......... ..........
#Conn .......... .......... T......... .......I.. .LK....... ........L. .......... ..........
#D41 .......... .......... T......... .......... .......... .........N .......... ..........
#DE072 K.R....... ......L..V YEEPVASNFT F.PLDI.STS YGV......N .V..VE..GK HIARFN---I S.IPE..V..
#JMK .......... .......... T.GTI..DR. .....T.... .L..T....R ..SA.P..NG ..DTFIL... ....N.....
#Gray .......... .......... T.GTI..DR. .....T.... .L..T....R ..SA.P..NG ..DTFIL... ....N.....
#GA047098 K.R....... ......L..V YEEPVASNFT F.SLDT.STS YGV......N .V..VA..QN YIARFN---I S.ISE..V..
#KB8523 .......... .......... T......... .......... .......... .......... .......... ..........
#nefropat_chino .......... .......... T......E.. .....S.... .L..T....T .QSN.P..SG S..TFVL... ..........
#saislado español .......... .......... T.A....DR. V....S.... .LE.T....S ..SN.P..SG ..NTFVL... H.........
#aislado_escocés .......... .......... V.DTS..ER. V....S.F.. .LS.T.Y..N .QSN.P..TG ..ETFVL... ..........
#austral_5 ---------. .......... T.DTI..DR. .....G.... .LS.T....K .QSS.P..TG -.NTFVL... ..........
#austral_14 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- -QSS.P..TG ..ETFVL... ..........
#Mass_41 NFSFLSSFVY KESNFMYGSY HPS----CNF RLETINNGLW FNSLSVSIAY GPLQGGCKQS VFSGRATCCY AYSYGG-PSL
#Beaudette .......... .......... ...----.K. .......... .......... .......... ..K....... ......-...
#H120 .......... .......... ...----... .......... .......... .......... .......... ......-.L.
#Florida ......G... .......... ...----... .P........ .......... .......... .......... ......-...
#Conn ......G.F. .......... ...----... .P........ .......... .......... .......... ......-...
#D41 .......... .......... ...----... .......... .......... .......... .......... ......-.L.
#DE072 K.N..N..T. V..D.DR... YGKPGSR... .P.S..R..S ....T...G. ..IS...... .WQNE....F ..K.N.GSRN
#JMK ......D... .A.D...... ..H----.S. .P..L..... ........T. .......... .......... ....R.-...
#Gray ......D... .A.D...... ..H----.S. .P..L..... ........T. .......... .......... ....R.-...
#GA047098 K.N..N..T. V..D.DR... YGKPGSR... ...S..R..S ....T...G. ..IS...... .WKNE....F ..K.N.GSRN
#KB8523 .......... .......... ...----.S. .......... .......... .......... .......... ......-.L.
#nefropat_chino .L...N.... .A.D...... ..A----.H. .P........ .......LT. .......... .....T.... ....N.-.RA
#aislado español .L........ .P.D...... ..K----... .P.N...... .......LT. ..I....... ...N...... ....S.-.TK
#aislado_escocés .......... .P.D..F... ..K----.S. .P..L..D.. ..A....LT. .......... .........F ....N.-.RE
#austral_5 .......... .S.D...... ..G----.A. .P..L..... .......LT. .......... ..K......F ....N.-.RE
#austral_14 .......... .P.D.TF... ..K----.S. .P..L..D.. ..A....LT. .......... .........F ....N.-.RE
#Mass_41 CKGVYSGELD LNFECGLLVY VTKSGGSRIQ TATEPPVITR HNYNNITLNT CVDYNIYGRT GQGFITNVTD SAVSYNYLAD
#Beaudette .......... H......... .......... .........Q N......... .......... .......... ..........
#H120 .......... H......... .......... .........Q .......... .......... .......... ..........
#Florida .........I SD........ ....D..... .........Q .......... .......... .......... ..........
#Conn .....L...K SD........ ....D..... .........Q .......... .......... .......... ..........
#D41 .......... H......... .......... .........H .......... .......... .......... ..........
#DE072 .....NFDK. V.Y..V...F IS.TD....R ...S...Y.N N.VI..S.GL .....V..I. .R.L...I.E .VHPG-..DH
#JMK .........L R......... ....D..... ....Q....Q Y......... .........I ...L...... L.......S.
#Gray .........L R......... ....D..... ....Q....Q Y......... .......... .......... L.......S.
#GA047098 ...L.TFDS. V.Y..V...F IS.TD....R ...S...YSN N.-V..N.GL .....V..I. .R.L...I.E .VHPG-..DH
#KB8523 .......... H......... .......... .........Q .......... .........I .......... ..........
#nefropat_chino .........R KD........ ....D..... .RS..L.L.Q ........DK ..E......V .......... ..GNF.....
#aislado español .....T..FS RD........ I...D...V. .RS..L.L.Q Y........K ..E......F .........G A.AN.G....
#aislado_escocés .....A...L NK........ ....D..... .RSK.L.LMQ Y........K ..E......V .......... ..AG------
#austral_5 .....A...G SK........ ....D..... .RN..L.L.Q .........K .........V .......... .VAG....QE
#austral_14 .....A...R NK........ ....D..... .RSK.L.LMQ Y........K ..E......V .......... ..AG......
47
Figura 14. Análisis
comparativo de la
secuencia
aminoacídica
deducida de los
aislados de campo
de IBV con cepas de
referencia. Los
cuadros rojos señalan
la tercera región
hipervariable (HVR3),
y los cuadros azules
muestran zonas de
gran similitud de los
aislados de campo
nacionales con
aislados de otros
países.

150
59
100
100
93
40
50
100
100
79
83
100
49
100
93
99
100
0
H120
D41
KB8523
Mass 41
Beaudette
Florida
Conn
JMK
Gray
nefropat chino
spain isolated
aislado escocia
austral 5
austral 14
DE072
GA047098
Figura 15. Árbol filogenético de las cepas de referencia y aislados de IBV
analizados (Austral 5 y Austral 14) . Se utilizó un coronavirus humano (SARS) como
grupo externo. La escala inferior indica el número de diferencias nucleotídicas.
sars
48

5.5.- Análisis de las proteínas de las cepas vacunas y de los aislados de campo.
Por medio de la técnica de tinción de geles de poliacrilamida con azul de
Coomasie, se pudo apreciar los perfiles de proteínas de las vacunas y de los aislados
de campo, observándose las proteínas estructurales S (140-160 KDa), S1 (70-80 KDa),
S2 (70-80 KDa), M (20-35 KDa) y N (40-50 KDa) en todas las muestras (Parr y
Collison, 1993).
En el caso de la vacuna Bronipra se lograron distinguir sólo las proteínas
estructurales S1, S2 y M, ya que esta vacuna posee una gran cantidad proteínas
degradadas en su composición. Además se encontró 2 proteínas de aproximadamente
30 KDa en las vacunas Ceva, Fort Dodge y Nobilis, que no aparecen en los aislados de
campo ni en las vacunas Merial y Bronipra. En el perfil de proteínas de la vacuna Ceva,
Merial y en los aislados de campo se encuentra una proteína muy pequeña, que puede
corresponder a la proteína de envoltura (E). (figura 16)
49

KDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9
117
90
49
35
26
19
Figura 16. Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida en condiciones
denaturantes (PAGE) teñido con azul de Coomasie. Las flechas rojas señalan la
proteína de membrana (M), las flechas azules señalan la proteína de espícula (S), las
flechas verdes señalan las proteínas S1 y S2, las flechas amarillas señalan la
nucleoproteína (N), las flechas blancas indican proteínas que no corresponden a
proteínas estructurales de IBV. Carril 1: Marcador de proteínas, Carril 2: Ceva, Carril 3:
Fort Dodge, Carril 4: Nobilis, Carril 5: Bronipra, Carril 6: Merial, Carril 7: Austral 14,
Carril 8: Austral 3, Carril 9: Austral 5.
50

5.6.- Análisis de los determinantes antigénicos de las cepas de vacunas y de los
aislados de campo.
El análisis de los determinantes antigénicos por Western blot muestra que la
vacuna Ceva posee al menos 3 proteínas que reaccionaron contra el anticuerpo anti-
Mass. En el caso de Austral 3 se aprecian determinantes antigénicos similares a los
encontrados en la vacuna Ceva, pero con una menor cantidad. Para Austral 14 se
observan 2 determinantes antigénicos, también similares a los encontrados en la
vacuna Ceva, pero con una mayor exprersión.
Tanto las vacunas Fort Dodge, Nobilis y Bronipra, como el aislado de campo
Austral 5, no muestran determinantes antigénicos contra el serotipo Mass en la
concentración utilizada (40 μg de proteínas). (figura 17)
51

Figura 17. Western blot de vacunas y aislados de campo de IBV.
Las flechas rojas señalan los determinantes antigénicos de Austral 14, las flechas
verdes señalan los determinantes antigénicos de la vacuna Ceva y las flechas azules
muestran los determinantes antigénicos de Austral 3. Carril 1: Ceva, Carril 2: Fort
Dodge, Carril 3: Nobilis, Carril 4: Bronipra, Carril 5: Austral 14, Carril 6: Austral 3, Carril
7: Austral 5.
1 2 3 4 5 6 7
52

6. DISCUSIÓN
En Chile no se había realizado un estudio molecular de las vacunas contra IBV,
siendo el presente trabajo de importancia, ya que permite caracterizar algunas de las
vacunas contra IBV disponibles en el mercado y establecer la relación molecular de
cepas de vacunas tipo Mass con aislados históricos de IBV, sino que también en el
ámbito del diagnóstico, permitiendo la identificación de nuevos aislados y su
diferenciación de cepas tipo Mass.
El RNA viral extraído presentó concentraciones similares en todas las muestras
(vacunas y aislados). La integridad del RNA por electroforesis en condiciones
denaturalizantes indicó la presencia de un RNA integro en la mayoría de las muestras,
excepto la vacuna Merial, que no presentó banda, esto puede deberse a una baja en la
concentración del RNA, ya que sí se pudo amplificar el gen S1 por RT-PCR.
El uso del la amplificación del gen de S1 de IBV por RT-PCR, con los partidores
S1OLIGO3’ y S1OLIGO5’, y su posterior análisis de RFLP fue descrito por Kwon et al
(1993), quien utilizó esta técnica para identificar cepas referenciales de IBV con 3
enzimas de restricción: Hae III, Xcm I y BstY I.
La amplificación del gen S1 ha mostrado limitaciones, debido a que puede
presentar mutaciones en los sitios de hibridación de los partidores, bloqueando la unión
de éstos e impidiendo la amplificación del gen S1, lo que produce un subdiagnóstico de
algunos aislados de IBV (Lee et al, 2000), por lo cual el uso de partidores que
amplifican una porción de la nucleoproteína (N) parece ser una herramienta más
efectiva de diagnóstico de IBV, debido a que es una región mucho más conservada
53

(Alvarado et al, 2005). Sin embargo por el hecho de tratarse de una región más
conservada hace necesario utilizar un mayor número de enzimas de restricción para
identificar las cepas por RFLP (Lin et al, 1991).
Pese a las limitaciones antes mencionadas con respecto a la amplificación del
gen S1, todas las muestras, vacunas y aislados de campo, resultaron positivas al RT-
PCR, logrando amplificar un segmento específico para IBV de 1.720 pares de bases,
resultado que concuerda con lo obtenido por Kwon et al (1993).
El hecho que los aislados de campo hayan presentado una menor cantidad de
producto de PCR puede deberse a la antigüedad de las muestras, ya que estuvieron
almacenadas liofilizadas por cerca de 20 años, disminuyendo probablemente la calidad
del RNA extraído.
En el estudio realizado por Kwon et al (1993), la enzima de restricción Hae III
permitió diferenciar las cepas de referencia Holte, Arkansas, Iowa 97, SE 17 y de las
cepas referenciales Connecticut (Conn), Florida (Flor) y Mass las que presentaron un
mismo patrón de restricción. Más aún, Hae III permitió diferenciar además las cepas
JMK y Gray de los otros grupos de estudio. En el mismo trabajo, la enzima de
restricción Xcm I permitió diferenciar la cepa Mass de las cepas Conn y Florida. La
enzima de restricción BstY I también diferenció las cepas Conn y Florida.
Basados en la estrategia de Kwon et al, 1993, la digestión con la enzima de
restricción Hae III de las vacunas, mostró un patrón de restricción idéntico al descrito
por este autor para el serotipo Mass, con fragmentos de 970, 430 y 320 pares de bases.
En el caso de los aislados de campo, el patrón de restricción con la misma enzima no
presentó relación con el patrón descrito para Mass, ni tampoco mostró relación con
54

alguno de los patrones de restricción de cepas de referencia (Kwon et al,1993) y con
cepas de campo descritas anteriormente (Gelb et al, 2005).
Específicamente, en los aislados de campo se puede apreciar un sitio de
restricción adicional para Hae III en S1 respecto de las cepas de vacunas y las demás
cepas de referencia utilizadas en el análisis. Sin embargo, los aislados de campo
muestran una estrecha relación entre ellos, particularmente los aislados Austral 3 y
Austral 14, los que presentaron un mismo patrón de restricción, con fragmentos de 960,
320, 240 y 200 pares de bases, sugiriendo que estos 2 aislados de campo estarían muy
relacionados entre ellos o se trata de la misma cepa. Por su parte, Austral 5 presentó
un patrón de restricción de 980, 340, 240 y 160 pares de bases, similar al de los otros 2
aislados de campo.
La digestión con la enzima Xcm I confirmó que las 5 vacunas analizadas
corresponden a la cepa Mass, ya que el patrón de restricción obtenido concuerda por el
descrito por Kwon et al (1993) para esta cepa, que corresponde a 950, 600 y 170 pares
de bases. Este resultado comprueba la hipótesis que se refiere a las vacunas,
afirmando que las vacunas contra IBV presentes en el mercado chileno utilizadas en
este trabajo corresponden a la cepa Mass. En el caso de los patrones de restricción de
los aislados de campo, usando Xcm I, se puede observar una tendencia similar a los
resultados descritos para Hae III. Específicamente, los patrones de restricción
entregados por los aislados de campo se diferencian del patrón de restricción de Mass y
de las demás cepas referenciales (Kwon et al, 1993) y de campo utilizadas en el trabajo
(Gelb et al, 2005). Austral 3 y Austral 14 presentan nuevamente un mismo patrón de
55

estricción de 1.540 y 180 pares de bases, mientras que interesantemente Austral 5 no
muestra sitios de restricción para la enzima Xcm I (Figura 10).
Las diferencias entre los patrones de restricción de las vacunas y el presentado
por los aislados de campo puede ser explicado por una mutación puntual en el sitio de
restricción de Xcm I. En este sentido, el hecho que los aislados de campo presenten un
patrón de restricción distinto al patrón de las vacunas, no significa necesariamente que
se traten de cepas distintas de IBV, ya que pueden poseer un alto porcentaje de
identidad de las secuencias. En el caso específico de Austral 3 y Austral 14, las
diferencias en los patrones de restricción, pueden corresponder a una mutación puntual,
ya que las vacunas y los aislados de campo mostraron un fragmento de 180 pares de
bases, lo que sugiere que poseen un sitio de restricción en común. En el caso de
Austral 5, la pérdida de todas las regiones de restricción para la enzima Xcm I puede
ser explicada, también, por mutaciones puntuales.
Los resultados de RFLP mostrados por los aislados de campo podrían haberse
provocado al momento de ser insertados los productos de PCR del gen S1 de IBV en el
vector pGEM-T easy. Sin embargo, esto fue descartado, ya que al insertar un producto
de PCR del gen S1 de la vacuna Fort Dodge, esta no alteró su patrón de restricción, lo
que indica que la inserción en el vector del gen S1 de los aislados de campo no afectó
su secuencia.
Los resultados del RFLP para los aislados de campo revelaron que el patrón de
restricción mostrado por estos aislados no concuerda con el patrón de la cepa Mass,
confirmando preliminarmente la hipótesis de trabajo que dice que los aislados de campo
no corresponden a la cepa Mass. Además, el patrón de restricción de los aislados de
56

campo con las enzimas de restricción Hae III y Xcm I no se relaciona con el patrón de
restricción de ninguna cepa de referencia descrita previamente, lo que no sólo sugiere
que los aislados nacionales sean diferentes a Mass, sino que también corresponderían
a nuevas cepas de IBV. En este sentido, la relación encontrada entre los patrones de
restricción de los aislados Austral 3 y Austral 14 sugiere que se tratan de una misma
cepa nacional, pero diferente a la cepa Mass.
En un estudio realizado por Gelb et al (2005) se utilizó esta misma técnica, (RT-
PCR-RFLP) junto con secuenciación del gen S1, para identificar aislados de campo
israelíes y norteamericanos y compararlos con vacunas presentes en ambos
mercados. Tanto el análisis de la secuencia del gen S1 como el análisis de RFLP
pueden ser utilizados para identificar cepas de campo relacionadas a vacunas y nuevas
cepas variante. Pero, la posibilidad de realizar un análisis de secuencias de aislados de
campo desconocidos, y compararlos con cepas de referencia para establecer el grado
de relación entre estos, es una ventaja importante de la secuenciación sobre el RFLP.
Desde el año 2000, se considera un genotipo variante de IBV cuando existe un
porcentaje de identidad, en la secuencia parcial del gen S1, menor o igual que 75%
comparado con cepas de referencia o vacunas (Kingham et al,2000).
Los aislados de campo pueden ser agrupados en cuatro categorías: aislados
altamente relacionados a vacunas; aislados altamente relacionados a cepas de
referencia; aislados derivados desde cepas de referencia o vacunas (porcentaje de
identidad mayor a un 75%); o variantes no relacionadas a vacunas o cepas de
referencia (Gelb et al, 2005).
57

El análisis de la secuencia aminoacídica deducida de los aislados de campo
Austral 5 y Austral 14 reveló que existen grandes diferencias entre éstos y la cepa Mass
(Figura 13).
Se logró establecer un porcentaje de identidad de sólo 63% entre los aislados de
campo y la cepa Mass, mientras que entre Austral 5 y Austral 14 se estableció un
porcentaje de identidad de un 94%. Este resultado confirma a nivel aminoacídico la
hipótesis, indicando que los aislados de campo no corresponden a la cepa tipo Mass, y
ubica a los aislados de campo analizados en la categoría de variantes de IBV, no
relacionadas a cepas de referencia o vacunas. Los resultados obtenidos son de gran
importancia, ya que el grado de protección otorgado por las vacunas, disminuye con la
disminución de la homología del gen S1 entre la vacuna y la cepa infectante (Cavanagh
et al¸ 1997; Gelb et al, 1997).
El control de IBV se puede lograr más eficientemente si la cepa de campo que
causa la enfermedad y la vacuna empleada poseen un alto grado de identidad en la
secuencia del gen S1. En este sentido, en el trabajo realizado por Gelb et al¸ 2005, se
observó que la vacunación con la cepa H120 otorgó sólo un 36% de protección al ser
desafiada con un aislado con un 65% de identidad en la secuencia de S1. Esto sugiere
que a menor porcentaje de identidad del gen S1 entre virus vacuna y aislado de campo,
menor será el porcentaje de protección de la vacuna.
El porcentaje de identidad de los aislados de campo Austral 5 y Austral 14 con
la cepa Mass (63%), sugiere que las vacunas tipo Mass otorgan un bajo porcentaje de
protección contra los aislados de campo, pero es necesario realizar más estudios al
58

especto, enfrentando a planteles de pollos vacunados con vacuna Mass con los
aislados de campo analizados en el presente trabajo.
Un segundo alineamiento aminoacídico (Figura 14) realizado con aislados de
campo de Corea, España, Escocia y China (este último nefropatogénico), mostró a nivel
de la tercera región hipervariable,similitudes de los aislados de campo nacionales con
los aislados de campo de España, Escocia y China, esta relación no se ve reflejada en
el porcentaje de identidad, ya que los aislados Austral 5 y Austral 14 presentaron un
porcentaje de identidad menor al 75%, tanto con los aislados de campo de otros países
como con las cepas de referencia.
El bajo porcentaje de identidad de aminoácidos mostrado por los aislados Austral
5 y Austral 14, en comparación con las cepas referenciales analizadas, sugiere que
tienen un origen desconocido, y no habrían derivado de cepas de referencia o vacunas
comerciales.
El análisis de RFLP presentó un patrón de restricción único para los aislados de
campo Austral 3, Austral 5 y Austral 14, además, el hecho que tengan un bajo
porcentaje de identidad con genotipos conocidos, ubican a los aislados de campo en la
categoría variantes de IBV no relacionados a cepas de referencia o vacunas.
La reconstrucción filogenética de Austral 5 y Austral 14 (figura 15) ubica a estos 2
aislados en un grupo nuevo, distanciado por más de 100 pares de bases de las cepas
referenciales de IBV, lo cual confirmaría la hipótesis de trabajo e indicaría que nos
encontramos frente a 2 nuevas variantes de IBV propias de nuestro país.
El análisis de los perfiles de proteínas de los aislados de campo y las vacunas en
gel de poliacrilamida con tinción con azul de Coomasie (figura 16) permitió apreciar un
59

perfil de proteínas similar en todas las muestras, además se aprecian las proteínas
estructurales S (140-160 KDa), las subunidades S1 y S2 de la proteína S (entre 70 y 80
KDa), la nucleoproteína N (alrededor de 50 KDa) y la proteína de membrana M (15-40
KDa).
Este análisis además mostró que la vacuna Bronipra posee una gran cantidad
de proteínas degradadas, lo que podría afectar al momento de generar protección
efectiva contra IBV. Además se aprecian proteínas en las vacunas Ceva, Fort Dodge y
Nobilis, de aproximadamente 30 KDa que no aparecen en los aislados de campo ni en
el resto de las vacunas, estas proteínas se encuentran en el rango de la proteína de
membrana, Sin embargo, el hecho de que sólo aparezcan en las vacunas antes
mencionadas y no en las demás muestras, sugiere que, estas proteínas, pueden
corresponder a proteínas de huevos embrionados o de tejidos en los cuales se elaboran
las vacunas. Desafortunadamente, no podemos saber que porcentaje del total de
proteínas de las vacunas y aislados de campo corresponde a proteínas estructurales de
IBV usadas como determinantes antigénicos, y qué porcentaje corresponde a proteínas
de tejidos desde los cuales se formula la vacuna.
El análisis de los determinantes antigénicos de las vacunas y los aislados de
campo por Western blot, reveló que la vacuna Ceva presenta 3 determinantes
antigénicos, los cuales son similares a los determinantes antigénicos encontrados en
Austral 14, esto sugiere que los determinantes antigénicos de este aislado de campo se
relacionan con los de la cepa Mass. Austral 3 presentó 2 determinantes antigénicos,
con una alta expresión, los cuales se relacionan a los determinantes antigénicos de
Ceva, sugiriendo una posible relación antigénica de este aislado con el serotipo Mass.
60

Tanto el resultado obtenido por Austral 3 como por Austral 14 sugiere que existe
una relación antigénica entre estos aislados y la cepa Mass, relación que no existe a
nivel genético.
La diferencia en la expresión de los determinantes antigénicos en los aislados
Austral 3 y Austral 14 puede deberse a diferencias en la secuencia aminoacídica, que
pueden provocar diferencias en los epítopes neutralizantes, aumentando o
disminuyendo la afinidad de los anticuerpos. El aislado Austral 5 no reaccionó a la
técnica, pese a que la formulación y la concentración de proteínas son similares a la de
los aislados Austral 3 y Austral 14, esto puede deberse a diferencias genéticas puestas
en evidencia por los resultados del RFLP y por el análisis secuencial, que sugieren la
existencia de determinantes antigénicos distintos a los demás aislados de campo y que
no se relacionan con la cepa Mass. En este sentido, un estudio realizado por Cavanagh
et al, reveló que las diferencias en sólo unos cuantos aminoácidos en la proteína S1
pueden modificar los epítopes neutralizantes, ya que estos son formados con los
aminoácidos localizados en el primer y tercer cuarto de la proteína S1. Esta
modificación además puede generar nuevos serotipos de IBV (Cavanagh et al, 1992b).
Las demás vacunas no reaccionaron a la concentración de proteínas utilizada
(40 µg), lo que puede deberse a una baja concentración de proteínas virales
estructurales en la formulación de la vacuna. Otra posible causa para este resultado es
que la detección del antígeno por el anticuerpo se haya realizado con una baja afinidad,
o simplemente no se haya realizado en las condiciones experimentales utilizadas. En
algunos casos ocurre que los virus con los cuales se formuló la vacuna hayan sufrido
61

alteraciones antigénicas al momento de ser atenuados, y tales alteraciones no permitan
desarrollar una respuesta inmune efectiva.
Los resultados referentes a los aislados de campo confirman lo señalado por
Cubillos et al. (1988) lo que sugiere la existencia de 2 nuevas variantes de IBV propias
de nuestro país, ya que poseen un patrón de restricción único y poseen un bajo
porcentaje de identidad con los genotipos conocidos hasta el momento.
En lo que respecta a las vacunas contra IBV, si bien se comprobó la hipótesis,
los resultados obtenidos revelan la importancia de evaluar la eficacia de la vacunación
contra aislados variantes únicos, como los son Austral 5 y Austral 14. En este sentido
sería de gran utilidad el realizar un estudio más detallado sobre la calidad de la
protección de las vacunas frente a aislados tipo Mass y frente a las nuevas cepas
nacionales de IBV, para lo cual sería necesario desafiar aves vacunadas con las
vacunas tipo Mass con aislados con un alto grado de identidad a la vacuna y también
con aislados poco relacionados, como los variantes de IBV encontrados en este
estudio.
Dentro de las proyecciones del trabajo se encuentra la posibilidad de diseñar
partidores específicos para aislados de campo, facilitando de esta manera un rápido
diagnóstico de cepas variantes de IBV.
Además, se pretende utilizar la misma técnica aquí empleada para identificar la
presencia de aislados nefropatogénicos de IBV en nuestro país, y el diseño de
partidores específicos por medio de análisis secuenciales para el diagnóstico de la
variante nefropatogénica de IBV
62

7. BIBLIOGRAFÍA
Alvarado, I. R., Villegas, P., Mossos, N., y Jackwood, M.W. (2005) Molecular
characterization of avian infectious bronchitis virus strains isolated in Colombia during
2003. Avian Dis. 49:494–499.
Banner, L.R., Lai, M.M.C. (1991). Random nature of coronavirus RNA recombination in
the absence of selection pressure. Virology. 185: 441-445.
Beach, J.T., Schalm, O.W. (1936). A filterable virus distinct from that of laryngotracheitis,
tha cause of a respiratory disease of chicks. Poult Sci. 15: 199.
Beaudette, F.R., Hudson, C.B. (1937). Cultivation of the virus of infectious bronchitis. J
Am Vet Med Assoc. 90: 51-60.
Berry, D.M., Cruickshank, J.G., Chu, H.P., Wells, R.J.H. (1964). The structure of
infectious bronchitis virus. Virology. 23: 403-407.
Callison, S.A., Hilt, D.A., Jackwood, M.W. (2005). Rapid differentiation of avian
infectious bronchitis virus isolates by sample to residual quantitation using real-time
reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Jour of Virol Met. 124: 183-190.
63

Cavanagh, D., Davis, P.J. (1986). Coronavirus IBV: removal of spike glycopeptide S1 by
urea abolishes infectivity and haemagglutination but not attachment to cells. J Gen Virol.
67: 1443-1448.
Cavanagh, D., Davis, P.J., Pappin, D.J.C. (1986a). Coronavirus IBV glycopeptides:
locational studies using proteases and saponin, a membrane permeabilizaer. Virus Res.
4: 145-156.
Cavanagh, D., Davis, P.J., Pappin, D.J.C., Binns, M.M., Boursnell, M.E.G., Brown,
T.D.K. (1986b) Coronavirus IBV: partial amino terminal sequencing of the spike
polypeptide S2 identifies the sequence Arg-Arg-Phe-Arg-Arg at the cleavage site of the
spike precursor polypeptide of infectious bronchitis virus strains Beaudette and M41.
Virus Res. 4: 133-143.
Cavanagh, D., Davis, P.J. (1988). Evolution of avian coronavirus IBV: sequence of the
matrix glycoprotein gene and intergenic region of several serotypes. J Gen Virol. 69:
621-629.
Cavanagh, D., Davis, P.J., Mockett, A.P. (1988). Amino acids within hypervariable
region 1 of avian coronavirus IBV (Massachusetts serotype) spike glycoprotein are
associated with neutralization epitopes. Virus Res. 11: 141–150.
64

Cavanagh, D., Davis, P.J., Cook, J.K.A. (1992a). Infectious Bronchitis Virus: evidence
for recombination within the Massachusetts serotype. Avian Pathol. 21:401-408.
Cavanagh, D., Davis, P.J., Cook, J.K.A., Li, D., Kant, A., Koch, G. (1992b). Location of
aminoacid differences in the S1 spike glycoprotein subunit of closely related serotypes
of infectious bronchitis virus. Avian Path. 21:33-43.
Cavanagh, D., Ellis, M.M. y Cook, J.K.A. (1997). Relationship between sequence
variation in the S1 spike protein of infectious bronchitis virus and the extent og cross-
protection in vivo. Avian Path. 26:63-74.
Cavanagh, D. (2005). Coronaviruses in poultry and other birds. Avian Pathol. 34(6): 439-
448.
Cavanagh, D., Picault, J.-P., Gough, R.E., Hess, M., Mawditt, K. y Britton, P. (2005).
Variation in the spike protein of the 793/B type of infectious bronchitis virus, in the field
and during alternate passage in chickens and embryonated eggs. Avian Pathol, 34: 20-
25.
Cubillos, A., Ulloa, J., Cubillos, V. (1988). Proyecto Fondo Desarrollo Productivo (FDP)
CORFO: Bronquitis infecciosa aviar, tipificación de asilados de campo.
65

Cubillos, A., Ulloa, J., Cubillos, V., Cook, J. (1991). Characterization of strains of
infectious bronchitis virus isolated in Chile. Avian Pathol. 20: 85-99.
Cumming, R.B. (1962). The aetiology of uraemia in chickens. Aust Vet J. 38: 554.
Cumming, R.B. (1969) The control of avian infectious bronchitis/nephrosis in Australia.
Aust vet J. 45: 200-203)
Cumming, R.B., Chubb, R.C. (1988). The pathogenesis of nephritis evoked by
Australian infectious bronchitis viruses. 1 st International Symposium on Infectious
Bronchitis; Rauishholzhausen, Alemania. Pp: 129-132.
Farsang, A., Ros, C., Renstrom, L.H.M., Baule, C., Soo´ s, T. y Bela´k, S.(2002).
Molecular epizootiology of infectious bronchitis virus in Sweden indicating the
involvement of a vaccine strain. Avian Pathol, 31: 229-236.
García, A, Norambuena, M. (1969). Diagnóstico preliminar de la Bronquitis infecciosa en
Chile. Rev Soc Med Vet Chile. 19: 27-33.
Gelb, J., Jr., Keeler, C.L., Nix, W.A., Rosenberger, J.K. y Cloud, S.S. (1997). Antigenic
and S-1 genomic characterization of the Delaware variant serotype of infectious
bronchitis virus. Avian Dis. 41:661-669.
66

Gelb, J., Jr., Weisman, Y., Ladman, B.S. & Meir, R. (2005). S1 gene characteristics and
efficacy of vaccination against infectious bronchitis virus field isolates from the United
States and Israel (1996 to2000). Avian Pathol, 34:194-203.
Hanahan, D. (1987). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.
J.Mol.Biol. 166: 557-580
Hidalgo, H., Gallardo, R., Toro, H. (1976). Isolation of infectious bronchitis virus from
broiler chickens in Chile. Avian Dis. 20: 601-603.
Hofstad, M.S., Yoder, H.W. (1966). Avian infectious bronchitis virus distribution in the
tissues of chicks. Avian dis. 10: 230-239.
Ignjatovic, J., McWaters, P.G. (1991). Monoclonal antibodies to three structural proteins
of avian IBV: characterization of epitopes and antigenic differentiation of Australian
strains. J Gen Virol. 72:2915-2922.
Jia, W., Karaca, K., Parriah, C.R., Naqi, S.A. (1995). A novel variant of avian infectious
bronchitis virus resulting from recombination among three different strains. Arch Virol.
140: 259-271.
67

Jones, R.C., Jordan, F.T.W. (1972). Persistance of the virus in tissues and development
of the oviduct in the fowl following infection at day-old with infectious bronchitis virus.
Res Vet Sci. 13: 52-60.
Jungherr, E.L., Chomiak, T.W., Luginbuhl, R.E. (1956) immunological differences in
strains of infectious bronchitis virus. Proceedings of the 60 th Meeting of the U.S.
Livestock Sanitary Association. Pp: 203-209.
Kingham, B.F., Keeler, C.L., Jr., Nix, C.A., Ladman, B.S., y Gelb, J., Jr. (2000).
Identification of avian infectious bronchitis virus by direct automates cycle sequencing of
the S1 Gene. Avian Dis. 44: 325-335.
King, D.J., Cavanagh, D. (1991). Infectious Bronchitis. En: Calnek B.W., Barnes H.J.,
Beard C.W., Reid W.M., Yoder H.W., Jr. (eds). Disease of Poultry: 471-484. Iowa State
University Press, Ames, Iowa.
Koch, G., Hartog, L., Kant, A., Van Roozelaar, D., De Boer, G.F. (1985). Antigenic
differentiation of avian infectious bronchitis virus variant strains employing monoclonal
antibodies. Israel Journal of Vet Med. 42:89-97.
Kusters, J.G., Niesters, H.G.M., Lenstra, J.A. Horzinek, M.C. Van Der Zeijst, B.A.M.
(1989). Phylogeny of antigenic variants of avian coronavirus infectious bronchitis virus.
Virology. 169: 217-221.
68

Kwon, H.M., Jackwood, M.W., Gelb, Jr.J. (1993). Differentiation of infectious bronchitis
virus serotypes using polymerase chain reaction and restriction fragment length
polymorphism analysis. Avian Dis. 37:194–202.
Landman, W.J.M., Feberwee, A. (2004). Aerosol-induced Mycoplasma synoviae
arthritis: the synergistic effect of infectious bronchitis virus infection. Avian Pathol. 33:
591-598.
Lee, C. W., Hilt, D. A., y Jackwood, M. W. (2000). Redesign of primer and application of
the reverse transcriptase–polymerase chain reaction and restriction fragment length
polymorphism test to the DE072 strain of infectious bronchitis virus. Avian Dis. 44:650–
654.
Lin, Z., Kato, A., Kudou, Y. y Ueda, S. (1991). A new typing method for the avian
infectious bronchitis virus using polymerase Caín reaction and restriction enzyme
fragment length polymorphism. Arch Virol. 116: 19-31.
.Liu, S. & Kong, X. (2004). A new genotype of nephropathogenic infectious bronchitis
virus circulating in vaccinated and non-vaccinated flocks in China. Avian Pathol, 33: 321-
327.
Matthijs, M.G.R., van Eck, J.H.H., Landman, W.J.M., Stegema, J.A. (2003). Ability of
Massachusetts-type infectious bronchitis virus to increase colibacillosis susceptibility in
commercial broilers: a comparison between vaccine and virulent field virus. Avian
Pathol. 32: 473-481.
69

Meulemans, G., Boschmans, M., Decaesstecker, M., van den Berg, T.P.,Denis, P. &
Cavanagh, D. (2001). Epidemiology of infectious bronchitis virus in Belgian broilers: a
retrospective study, 1986 to1995. Avian Pathol, 30: 411-421.
Moore, K. M., Bennett, J. D., Seal, B. S., Jackwood, M. W. (1998). Sequence
comparison of avian infectious bronchitis virus S1 glycoproteins of the Florida serotype
and five variant isolates from Georgia and California. Virus Genes. 17:63–83.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory
Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
Schalk, A.E., Hawn, M.C. (1931). An apparently new respiratory disease of baby chicks.
J Am Vet Med Assoc. 78: 413-422
Stern, D.F., Sefton, B.M. (1982). Coronavirus proteins: biogenesis of avian infectious
bronchitis viron proteins. J Virol. 44: 794-803.
Stohlman, S.A., Fleming, J.O., Patton, C.P., Lai, M.M.C. (1983). Synthesis and
subcellular location of the murine coronavirus nucleocápsida protein. Virology. 130: 527-
532.
70

Tamura, K, Dudley, J, Nei, M. & Kumar, S. (2007). MEGA4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution
10.1093/molbev/msm092.
Tolskaya, E.A., Romanova, L.I., Blinov, V.M., Victoria, E.G., Sinyakov, A.N., Romanova,
M.S., Agol, V.I. (1987). Studies on recombination between RNA genomes of poliovirus
primary structure and non random distribution of cross over regions in the genomes of
poliovirus recombinants. Virology. 161:54-61.
Wang, L., Junker, D., Collisson, E.W., (1993). Evidence of natural recombination within
the S1 gene of infectious bronchitis virus. Virology. 192: 710-716.
Wainright, P.V., Villegas, P., Brugh, M., Lukert, P.D. (1989). Characterization of
infectious bronchitis virus using monoclonal antibodies. Avian Dis. 141:1677-1688.
Winterfield, R.W., Hitchner, S.B. (1962). Aetiology of an infectious nephritis-nephrosis
syndrome of chickens. Am J Vet Res. 23: 1273-1279.
71