THÈSE - Université Bordeaux 1

N° d’ordre : 4494
UNIVERSITÉ BORDEAUX I
Ecole doctorale : Sciences et Environnements
THÈSE
présentée par :
M. Guillaume MEISTERHANS
Pour obtenir le grade de docteur
Spécialité : Biogéochimie et Ecosystèmes
Dynamique de la structure génétique des communautés
procaryotes en zone benthique côtière : caractérisation de
la microflore des sédiments et des bivalves fouisseurs par
empreintes moléculaires.
Devant la commission d'examen formée de :
Soutenue le : 8 Mars 2012
Antoine GREMARE, Professeur, Université Bordeaux 1 Président
Robert DURAN, Professeur, Université de Pau et des Pays d’Adour Rapporteur
Daniel GUIRAL, Directeur de recherche, IRD, Marseille Rapporteur
Marc BALLY, Chargé de recherche, CNRS, Marseille Examinateur
Frédéric GARABETIAN, Professeur, Université Bordeaux 1 Directeur de thèse
Florence JUDE-LEMEILLEUR, Maître de Conférences, Université Bordeaux 1 Co-directrice de thèse
Natalie RAYMOND, Maître de Conférences, Université Bordeaux 1 Co-encadrante de thèse

REMERCIEMENTS
A quelques jours de déposer mon manuscrit, au moment où mes chefs sont plongés dans
leurs dernières relectures, je profite de quelques heures de répit pour me remémorer mes trois
années de thèse. En trois ans, je suis passé de l’enthousiasme de commencer un nouveau projet, aux
doutes et au découragement face aux nombreuses difficultés et à l’exigence de ce travail, à la
satisfaction enfin de le voir progresser, et évoluer. En Janvier 2009 a débarqué à Arcachon un jeune
étudiant timide, il en repartira en Mars prochain un jeune chercheur débutant beaucoup plus
confiant en lui-même. Cette évolution est le fruit de nombreuses rencontres que je souhaite
remercier ici pour toute l’aide, le soutien, les conseils qu’elles m’ont apportés ou tout simplement
pour leur bonne humeur et leur joie de vivre qui ont fait de ces trois années, une aventure
incroyable.
Tout d’abord, je souhaite remercier le directeur de l’école doctorale Sciences et
Environnements, le Professeur Richard Michalet et le directeur par intérim, le Professeur Pascal
Murail.
Ce travail a été réalisé au sein de l’UMR EPOC (Environnements et Paléoenvironnements
Océaniques et Continentaux). Je souhaite remercier le directeur à mon arrivée en 2009, le Docteur
Philippe Bertrand. Un grand remerciement à son successeur, le Professeur Antoine Grémare, ancien
directeur de la station marine d’Arcachon et je l’espère futur directeur du POA, qui a également
accepté de siéger à mon jury de thèse. Merci à vous Antoine d’avoir consacré du temps à éclaircir ma
vision du traitement de données et de l’analyse statistique.
Un grand merci à l’équipe ECOBIOC (ECOlogie et BIOgéochimie des systèmes Côtiers) qui
m’a permis de partir compléter ma formation au Danemark au travers d’une école d’été en écologie
microbienne et moléculaire. Par son soutien financier ECOBIOC m’a également permis d’aller
présenter mes travaux de recherche au colloque européen « EUROLAG » au Portugal et également au
colloque de l’AFEM, spécialisé en écologie microbienne. Merci de m’avoir permis de vivre ces
expériences enrichissantes. Je souhaite en remercier les deux directeurs successifs le Docteur Guy
Bachelet et le Docteur Xavier de Montaudouin. Merci également à vous Xavier de votre implication
dans mes travaux sur les communautés bactériennes associées aux bivalves au travers de vos
relectures, de votre analyse critique, de vos précieux conseils et de votre aide sur le terrain. Merci
également de m’avoir fait découvrir la beauté du Banc d’Arguin et celle des côtes et vallées
portugaises.

J’adresse mes profonds remerciements au Professeur Robert Duran de l’Université de Pau et
des Pays de l’Adour ainsi qu’au Docteur Daniel Guiral, directeur de recherche IRD à l’IMBE de
Marseille, d’avoir accepté d’être rapporteurs de ma thèse et de bien avoir voulu évaluer ce travail
dans les courts délais que nous avons sollicités. Merci également au Docteur Marc Bally de
l’Université de Marseille d’avoir accepté d’évaluer la qualité de mon travail en tant qu’examinateur.
Ce travail n’existerait pas sans la confiance qu’ils m’ont accordée, sans l’immense aide et soutien
qu’ils m’ont apportés au cours de ces trois années. Je parle bien évidemment de mes trois directeurs
de thèse Frédéric Garabetian, Florence Jude-Lemeilleur et Natalie Raymond.
Tout d’abord un incommensurable merci à mon maître Jedi. J’espère ne pas avoir été un trop
mauvais Padawan. Les débuts ont été durs, je me souviens des premières réunions au cours
desquelles je ne comprenais qu’un mot sur cinq. Tu parlais dans un langage qui m’était
complètement inconnu d’écotone, de déterminisme de la dynamique spatiale des communautés, de
touchdown PCR. Au travers de nos heures de réunion, j’ai commencé à apprivoiser petit à petit ce
dialecte si complexe de la science. Avec patience tu as réussi à me transmettre un peu de ta Force.
Merci également de m’avoir sacrifié un certain nombre de tes soirées et week-end, de t’être
transformé aussi bien en vasouilleur pour me prêter main forte sur le terrain, qu’en psychologue
pour me faire relativiser certaines choses. Grâce à toi, je me sens plutôt bien armé pour partir vers de
nouvelles aventures.
Mille fois merci à toi Florence d’avoir été mon épaule au quotidien, dans la gestion des
commandes, dans les casse-têtes des PCR qui marchent qui ne marchent plus et qui remarchent à
nouveau, mais aussi dans les casse-têtes des résultats à interpréter. Mille fois car c’est au moins le
nombre de fois où je suis venu te déranger pour te poser des questions en tout genre dont un grand
nombre de questions bêtes. Tu as toujours su y répondre avec gentillesse et avec le sourire. Merci
pour ton soutien et pour tes pdf comiques et toutes les histoires drôles transmises par mail qui m’ont
offert quelques moments de détente dans ces longues heures de rédaction.
Natalie, merci de t’être impliquée dans ce travail, de t’être toi aussi transformée en vasouilleuse
pour ramener toutes ces palourdes. Qu’elles ont été nombreuses ces palourdes et ces heures durant
lesquelles avec minutie tu les as toutes disséquées. Merci pour ce travail fastidieux et pour avoir pris
le temps entre deux coups de scalpel de m’expliquer la physiologie de ces bébêtes. Merci également
d’avoir partagé le bureau avec moi pendant un peu plus de deux ans et d’avoir supporté mes

cultures mycéliennes sur milieu liquide caféine-sucrose. Merci enfin pour tes longues heures de
relecture à éplucher entre autre mes listes de références biblio anarchiques au possible.
Merci également à vous trois de m’avoir offert l’opportunité de faire mes premiers pas dans
l’enseignement. Vous avoir tous les trois à mes côtés m’a permis d’apprendre énormément. Merci
pour tout le temps que vous m’avez consacré.
Les analyses d’abondance et de diversité procaryotes présentées dans ce manuscrit ont été
réalisées en collaboration avec le Docteur Claude Courties de la plateforme Imagerie-Cytométrie de
Banyuls sur mer et le Docteur Franck Salin de la plateforme Génome-Transcriptome de Pierroton. Je
tenais donc à les remercier ainsi que leurs équipes pour m’avoir accueilli dans leur laboratoire et/ou
réalisé ces analyses. Je remercie également le Docteur Christophe Lambert et son équipe pour avoir
réalisé les mesures des paramètres hémocytaires présentés dans ce manuscrit et le Docteur Martin
Plus de l’IFREMER d’Arcachon d’avoir fait fonctionner son modèle MARS 3D pour chacun des sites
du Bassin d’Arcachon que j’ai étudié.
Mes premiers traitements d’arisogrammes me prenaient près d’une semaine avant d’obtenir une
matrice d’abondance relative. Puis ma route a croisé celle d’une ancienne Padawan, Emilie Lyautey
(dont je tairai ici le surnom, que dis-je, le titre que lui a valu son implication dans IDFEC, par peur de
croiser son regard noir qui tue !) et tout est devenu beaucoup plus simple. Merci Emilie de m’avoir
transmis toutes ces petites astuces, ces petits programmes qui ont facilité mon quotidien. Je n’ai
croisé personne d’autre qui manie aussi bien l’écouvillon à étron que la notion d’opéron ! Ni
quelqu’un qui peut parler de diversité, les mains dans le lisier ! Je garderai de super souvenirs de
notre excursion au point S, de notre virée nocturne sur le port d’Arcachon, et de cette gourmande
soirée jurassienne.
Le programme ORIQUART a beaucoup apporté à cette thèse. J’en remercie l’ensemble des
participants et plus particulièrement Sophie Dubois, Hugues Blanchet et Nicolas Savoye.
Sophie, merci pour l’organisation pratique des deux « cartos » et de m’avoir transmis un large
jeu de données environnementales qui m’ont permis d’expliquer la structure des mes p’tites
communautés procaryotes. Merci surtout d’avoir été présente durant ces trois années. Tu as
beaucoup contribué à mon intégration au sein de la station marine. Plus qu’une collègue, tu es
devenue une amie. Merci pour toutes les soirées que l’on a passées ensemble, pour nos longues

discussions sur la plage arcachonnaise, pour nos pauses café défouloirs, nos craquages, nos batailles
d’eau et de vase ; il y a bien trop de souvenirs pour que je puisse tout résumer ici en quelques lignes.
A quelques semaines près, nous avons commencé ensemble, à quelques semaines près nous
terminons ensemble. Courage pour ta dernière ligne droite !
Hugues, un grand merci pour tes conseils en analyse des communautés et en utilisation de
Primer. Et un immense merci pour m’avoir apporté une aide financière qui m’a permis de ne pas
restreindre mes travaux à l’analyse des communautés bactériennes mais d’accéder également aux
communautés archéennes, ce qui contribue fortement à l’originalité de mes travaux sur les
communautés procaryotes des sédiments.
Nicolas, merci de m’avoir intégré à ce programme et de m’avoir permis de bénéficier des
données sur la qualité de la MO. Merci également pour nos festifs et costumés nouvel an chez toi
ainsi que pour nos soirées barbecue avec ou sans alarme déclenchée.
Ces « cartos » n’auraient pu être sans une équipe de préleveurs de choc. A commencer par petit
Benoit (i.e. Benoit Gouilleux), le vasouilleur de l’extrême. Merci à toi d’avoir, entre autre, passé
quinze jours sous la pluie et dans la vase à remplir des sacs, des barquettes en alu et des carottes en
plastique de sédiments. Merci également à Pascal Lebleu, Henri Bouillard, Christian Portier, pour
leur aide précieuse sur l’eau, sur la vase et aussi sur terre avec plus de 400 seringues de 50mL sciées
et limées et tout autant de seringues de 2mL. Merci également à Michel Parra et à Flora Salvo de
s’être joints à cette équipe de vasouilleurs. Des kilos de mercis à Lilou/Marcellus pour tout autant de
sédiments tamisés et de macro-invertébrés triés et identifiés.
Une part importante des résultats sur les communautés bactériennes des bivalves présentés
dans ce manuscrit, résulte de ma collaboration avec Ika Paul-Pont et Emilie Girault.
Merci Ika de t’être investie dans ce travail et d’avoir tenu compte de la deadline qu’imposait
la fin de ma thèse. Notre rencontre restera certainement gravée par ma vision « particulière » de ta
façon « particulière » de manger un café liégeois ! Merci d’avoir supporté mes blagues ou gaffes
toutes aussi « particulières » : mon « et toi Ika t’en penses quoi » chez Fanfan ou encore mon « Ika
dans BucephaLus, phalus ca prend qu’un L sinon ce n’est pas le même ! ».
Emilie, merci à toi la shbammeuse aquabikeuse, surnommée Miss Caca 2011 pour ton
implication dans le projet IDFEC et IDFEColi (pour les curieux, il faut savoir que deux Miss ont déjà
porté ce titre avant Emilie ; Miss Caca début 2010 apparait précédemment de manière « anonyme »),

pour ton travail à la paillasse comme sur Primer qui m’a permis d’avancer sur l’analyse des
déterminismes des communautés bactériennes de la palourde.
Mon travail s’est également inscrit dans le programme BIOMIN, je souhaite en remercier le
responsable Bruno Deflandre ainsi que Florian Cesbron pour m’avoir transmis des nombreuses
données biogéochimiques sur les sites étudiés. J’espère que nous aurons l’opportunité de travailler
ensemble pour valoriser ultérieurement ce travail.
Le second étage de la station marine serait bien triste sans les deux techniciennes avec qui
j’ai partagé un bureau pendant un an : Line Bourasseau et Sabrina Bichon.
Merci Line de m’avoir aidé tout au long de ces trois années passées tant par la gestion du
labo (je n’ose même pas compter le nombre de lave-vaisselles et d’autoclaves mis en route !) que par
les heures passées à extraire et purifier de l’ADN. Merci également d’avoir sacrifié ton jean’s à la
science lors de la campagne d’échantillonnage d’avril !
Sabrina, quelle prise de tête ce spectrofluo !!! On aura quand même réussi à le dompter.
Merci de m’avoir aidé à mettre en place la manip de dosage d’ADN. Merci pour ta bonne humeur et
pour tes histoires drôles du midi surtout celles sur tes filles.
Les nombreux prélèvements de sédiments et de palourdes ont pu être réalisés grâce aux deux
marins du Planula IV, Francis Prince et Laurent Letort. Merci à vous deux de m’avoir emmené aux
quatre coins du Bassin sous le soleil comme sous la pluie et le vent.
Je finis mes trois années de thèse avec une certaine sérénité grâce au Docteur Christine
Michel du Freshwater Institute de l’Université de Winnipeg au Canada. Elle m’offre avant même que
je n’ai remis ce manuscrit, un post-doctorat d’un an pour travailler sur les communautés
procaryotes des glaces arctiques. Merci infiniment Christine de m’offrir cette opportunité et d’avoir
accepté de m’attendre quelques mois le temps que je finisse ma thèse.
Je ne peux finir mes remerciements sans remercier tous les stationmarinnes et les
stationmarins, d’un jour ou de toujours, que j’ai côtoyés ces trois dernières années.
Un immense merci à Isa d’avoir été présente dans mes moments de doutes et de craquages ;
de m’avoir remonté le moral et encouragé à ne pas laisser tomber. Ton soutien a été précieux et je

n’ai jamais eu l’occasion de te le dire et de t’en remercier. Je n’ai pas eu non plus l’occasion de te dire
que tu avais été élue Miss Caca fin 2010, succédant et précédant à une Emilie et une autre Emilie.
Un tout aussi grand merci à Christelle qui m’a permis de m’intégrer au groupe. Merci pour
les nombreuses soirées chez toi, pour m’avoir conduit un peu partout, pour les sessions badminton,
les cinés gratuits et j’en oublie. Je ne serais probablement plus là pour célébrer le mariage de
Monsieur Teillet et Madame Patricia Barbé, tu penseras à m’envoyer quelques photos !
Un immense merci également à la plus addict des shbammeuses. Merci Cindy pour cette
année passée ensemble, pour nos soirées belotes, pour nos excursions au sorbet d’amour, pour nos
séances salle de sport-hammam, pour nos aprem crêpes, pour toutes les soirées et sorties que tu as
organisées.... Et surtout merci d’avoir toujours le sourire et la bonne humeur. Bon courage pour la
suite de ta thèse, d’ici peu il y aura peut être un Picornavirus biniasii .
Il y a deux ans, je n’avais jamais entendu parler d’Intechmer et d’Intechmériens. J’ai eu la
chance d’en croiser deux d’exceptions. Merci Deb et Loïc pour toutes ces soirées passées ensemble,
pour tous nos fous rires et nos délires, nos batailles de sables et nos plongées en PMT. Je vous
souhaite d’enfin trouver chacun un boulot qui vous plaise et pas loin l’un de l’autre. J’espère que nos
routes se recroiseront bientôt. Un merci aussi à un autre intechmérien tout aussi déjanté, Germain,
pour les quelques apéros plages passés ensemble.
Une bonne continuation au plus touffu des thésards (faut dire que ce n’est pas moi qui vais
lui faire concurrence) et à celle qui sera d’ici peu la seule thésarde es procaryote. Merci Fanfan et
Cécile pour vos soirées vins fromages, pour les leçons de bad et de tennis, pour les blagues
fanfounesques lors des apéros plages.
Les stationmarinnes et les stationmarins sont nombreux, merci à vous tous :
- Wioletta et Céline pour votre accueil souriant le matin et pour nous faciliter le quotidien,
- Cerise, tes boulets liégeois sont une merveille
- Nico Lavesque et Guillaume B, merci pour vos conseils sur Primer et sur R
- Val, merci pour les Nouvel an passés chez toi, pour tes conseils en stat à 4h du matin
- MC, merci de ne pas m’avoir laissé m’enliser dans les marécages de l’administration
universitaire
- Merci à tous les autres et en particulier à tous les stagiaires qui m’ont donné un coup de
main : Jenifer Garcia et Stéphanie Pasquier, Morganne, Pierre, les deux mini miss caca
Manon et Mathide et tous ceux qui pour quelques semaines ou quelques mois ont contribué
à l’ambiance de la station marine

Mes derniers mots (avant les scientifiques), je les adresse à ma famille : mes parents, mes deux
sœurs, mes deux nièces Emma et Malaury et mes deux neveux Erwan et Bryan. Merci à vous d’avoir
supporté mon éloignement et mon peu de disponibilité au cours de ces trois dernières années.

PLAN
Avant-propos.......................................................................................... 1
CHAPITRE I: Synthèse bibliographique............................................ 7
1. La biodiversité...................................................................................................... 9
1.1 Définitions............................................................................................................ 9
1.2 Les indices de diversité et de similarité................................................................ 11
1.3 Le concept d’espèce............................................................................................. 13
2. Les techniques d’étude des communautés procaryotes.................................... 15
1.1 Généralités........................................................................................................... 15
1.2 Approches culturales............................................................................................ 16
1.3 Approches moléculaires....................................................................................... 17
1.3.1 Numération des procaryotes....................................................................................... 18
1.3.2 Analyse de la diversité................................................................................................ 19
1.3.2.1 Analyses a priori: approches «Top to Bottom ».......................................................................... 19
1.3.2.2 Analyses sans a priori.................................................................................................................. 21
1.3.2.2.1 Séquençage et métagénomique.................................................................................................. 21
1.3.2.2.2 Techniques d’empreintes moléculaires...................................................................................... 23
1.3.2.2.2.1 Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA)................................................ 23
1.3.2.2.2.2 Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)....................................... 24
1.3.2.2.2.3 Rapide aperçu d’autres techniques utilisées en écologie microbienne................................ 25
1.3.2.2.2.4 Choix des techniques pour la caractérisation de la structure génétique des
communautés bactériennes et archéennes............................................................................. 26
1.3.2.2.2.5 Contraintes et limites des techniques moléculaires.............................................................. 26
3. Les théories expliquant la structuration des communautés procaryotes....... 30
4. Les communautés procaryotes des sédiments benthiques marins.................. 30
5. Les communautés bactériennes associées aux invertébrés marins
benthiques............................................................................................................ 34
5.1 Généralités............................................................................................................ 34
5.2 Communautés bactériennes associées aux bivalves.............................................. 38
6 Les zones de transition: un modèle d’étude pertinent pour l’étude de la
dynamique des patrons structuraux des communautés procaryotes............. 40
6.1 Généralités............................................................................................................ 40
6.2 Les communautés procaryotes des zones de transition......................................... 41
6.2.1 Généralités.................................................................................................................. 41
6.2.2 Principal modèle d’étude : les communautés procaryotes
du Bassin d’Arcachon................................................................................................. 41
6.2.2.1 Présentation du Bassin d’Arcachon.............................................................................................. 43
6.2.2.2 Les procaryotes du Bassin d’Arcachon........................................................................................ 44
7 Références............................................................................................................. 47

CHAPITRE II: Patrons spatiaux de diversité génétique des
communautés procaryotes du sédiment en zone littorale................... 63
1. Dynamique spatiale inter-habitat des procaryotes d’un sédiment de
surface à l’échelle d’un écosystème, le Bassin d’Arcachon ............................ 67
2. Dynamique spatiale inter-écosystèmes.............................................................. 103
2.1 Introduction........................................................................................................... 103
2.2 Sites d’étude et méthodologies............................................................................. 103
2.2.1 Sites d’étude................................................................................................................ 103
2.2.1.1 La vasière Ouest-Gironde............................................................................................................. 103
2.2.1.2 L’estuaire de la Gironde............................................................................................................... 105
2.2.2 Echantillonnages......................................................................................................... 107
2.2.3 Analyse des communautés bactériennes..................................................................... 108
2.2.4 Analyses statistiques................................................................................................... 108
2.3 Résultats................................................................................................................ 109
2.3.1 Abondance et structure des communautés bactériennes
du Bassin d’Arcachon.................................................................................................. 109
2.3.2 Abondance et structure des communautés bactériennes de la VOG............................ 109
2.3.3 Abondance et structure des communautés bactériennes
de l’estuaire de la Gironde............................................................................................ 110
2.3.4 Comparaison des trois écosystèmes............................................................................ 112
2.4 Discussion............................................................................................................. 114
2.5 Références............................................................................................................. 119
CHAPITRE III: Diversité des procaryotes à l’échelle d’un
organisme benthique : cas des bivalves fouisseurs.............................. 121
1. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un individu.......................................... 127
2. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organe : déterminisme d’hôte
ou d’habitat.......................................................................................................... 153
2.1 Introduction.................................................................................................. 153
2.2 Matériel et méthodes...................................................................................... 155
2.2.1 Les sites d’échantillonnage......................................................................................... 155
2.2.2 Dispositif experimental............................................................................................... 156
2.2.2.1 Etude de deux lots de palourdes dans leur habitat naturel........................................................... 156
2.2.2.2 Transplantation croisée................................................................................................................ 156
2.2.2.3 Echantillonnage de carottes de sédiment..................................................................................... 158
2.2.3 Traitement et analyses des échantillons..................................................................... 158
2.2.3.1 Echantillons de palourdes............................................................................................................. 158
2.2.3.1.1 mesures des indices de condition......................................................................................... 158
2.2.3.1.2 mesure du fractionnement isotopique.................................................................................. 159
2.2.3.1.3 mesures des paramètres hémocytaires................................................................................. 159
2.2.3.1.4 analyses de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes
des palourdes........................................................................................................................ 160
2.2.3.1.4.1 extraction/purification et dosage de l’ADN total.................................................................. 161

2.2.3.1.4.2 diversité des communautés bactériennes par ARISA........................................................... 161
2.2.3.1.4.3 abondance des communautés bactériennes........................................................................... 162
2.2.3.2 Echantillons de sédiments............................................................................................................ 162
2.2.3.2.1 analyse de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes
des sédiments......................................................................................................................... 163
2.2.3.2.1.1 extraction/purification et dosage d’ADN total...................................................................... 163
2.2.3.2.1.2 abondance des communautés bactériennes........................................................................... 163
2.2.3.2.1.3 diversité des communautés bactériennes par ARISA........................................................... 163
2.2.4 Traitement de données et analyse statistique.............................................................. 164
2.3 Résultats................................................................................................................ 165
2.3.1 Deux habitats contrastés : diversité β des communautés procaryotes
des sédiments............................................................................................................... 165
2.3.2 Deux lots de palourdes différenciés: description des caractéristiques
des individus................................................................................................................ 166
2.3.2.1 Indices de condition..................................................................................................................... 166
2.3.2.2 Fractionnement isotopique........................................................................................................... 167
2.3.2.3 Paramètres hémocytaires.............................................................................................................. 168
2.3.3 Caractérisation des communautés bactériennes des palourdes................................. 168
2.3.3.1 Etude des individus dans leur habitat naturel............................................................................... 168
2.3.3.1.1 comparaison entre les 2 lots de palourdes............................................................................ 168
2.3.3.1.2 comparaison des communautés bactériennes entre organes................................................ 169
2.3.3.1.3 comparaison des communautés bactériennes entre palourdes et sédiment........................ 169
2.3.3.2 Expérience de transplantation croisée.......................................................................................... 170
2.3.3.2.1 dépuration............................................................................................................................. 170
2.3.3.2.2 réimplantation/transplantation.............................................................................................. 171
2.3.3.2.2.1 comparaison des caractéristiques physiologiques des individus appartenant
aux différents lots de palourdes............................................................................................ 171
2.3.3.2.2.2 comparaison des communautés bactériennes des individus transplantés (A/B et B/A)
avec celles des individus réimplantés (A/A et B/B)............................................................. 173
2.4 Discussion.................................................................................................... 177
2.5 Conclusion................................................................................................... 180
2.6 Références............................................................................................................. 181
3. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organe : déterminisme d’espèce.. 185
CHAPITRE IV : Conclusion générale................................................. 219

Principales abréviations utilisées:
ADN: Acide DésoxyriboNucléique
ADNr: Acide DésoxyriboNucléique ribosomique
ANOSIM: Analysis Of SIMilarity
ARISA: Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis
ARN: Acide RiboNucléique
ARNr: Acide RiboNucléique ribosomique
Bm: Bucephalus minimus
pB/Bp: paire de Base/ Base pair
CBAB : Communautés Bactériennes Associées aux Bivalves
CBC: Cockle Bacterial Community
CBCA: Cockle Bacterial Community Abundance
CBCD: Cockle Bacterial Community Density
e.g.: ex gratis utilisé pour « exemple »
EMNF : Eau de Mer Naturelle Filtrée
et al. : et alii utilisé pour « et collaborateurs »
FIL: Flesh and Intervalval Liquid
IC/ CI: Indice de Condition/ Condition Index
i.e.: id est utilisé pour « c'est-à-dire »
ITS: Intergenic Transcribe Spacer
MDS: non-Metric Dimensional Scale
OTU: Operational Taxonomic Unit
PCR: Polymerase Chain Reaction
qPCR: quantitative Polymerase Chain Reaction
THC: Total Hemocyte Count
T-RFLP: Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism
VOG : Vasière Ouest-Gironde

Avant-propos
Avant-propos
Les travaux réalisés au cours de cette thèse s’inscrivent dans une thématique
d’écologie microbienne et moléculaire et ont pour but la caractérisation de la structure
génétique des communautés bactériennes et archéennes au sein de divers habitats benthiques,
à travers la mise en place de méthodes expérimentales et d’analyses de données adaptées à
l’étude de la diversité β via des approches de biologie moléculaire.
Cette thèse a été principalement financée par le projet Région Aquitaine « Diagnostic
de la qualité des milieux littoraux » (Responsable Antoine Grémare) et en particulier par le
volet « Caractérisation des communautés bactériennes ».
Elle a également bénéficié d’une implication dans un grand nombre de projets de
recherche portés par le laboratoire, nous amenant à appliquer notre questionnement sur deux
grands modèles d’habitat, le sédiment et les bivalves fouisseurs.
Trois programmes s’intéressaient à la biogéochimie benthique :
- le programme EC2CO-PNEC « ORIQUART » (Influence de l’ORIgine de la
matière organique particulaire sur la QUAlité du pool nutritif et son devenir dans
le Réseau Trophique d’un écosystème littoral semi fermé) porté par Nicolas
Savoye. Ce programme s’inscrit dans la recherche de déterminants dans la relation
biodiversité-fonctionnement à travers l’étude de l’impact d’une diversité de
producteurs primaires sur le mode de fonctionnement des écosystèmes à l’aide
d’une approche multiparamétrique combinant des analyses chimiques,
biochimiques et isotopiques. Plus précisément il a pour but d’évaluer la qualité des
milieux littoraux aquitains par la caractérisation de l’origine et la composition de la
matière organique particulaire pélagique et benthique au sein d’un système de
transition, le Bassin d’Arcachon. Notre intervention dans ce programme apporte
une vision de la dynamique des communautés procaryotes au sein de cet
écosystème en fonction de propriétés fonctionnelles des différents habitats qui le
composent. Ce programme nous a permis de bénéficier d’une large campagne
d’échantillonnage (29 sites, 2 périodes d’échantillonnages). Ainsi nous avons pu
comparer la diversité génétique des communautés bactériennes et archéennes au
niveau de ces sites hébergeant des communautés macrofaunistiques contrastées et
1

Avant-propos
mettre ces résultats en relation avec les paramètres biogéochimiques mesurés en
parallèle afin de mettre en évidence des facteurs environnementaux structurant ces
communautés procaryotes. Cette étude fait l’objet d’une publication en
préparation.
- le programme LEFE CYBER « BIOMIN » (Étude in situ de l’impact de la
diversité biologique sur la reminéralisation de la matière organique à l’interface
eau / sédiment) porté par Antoine Grémare et Bruno Deflandre, qui s’intéresse aux
liens entre la biodiversité/activité de la faune et la minéralisation de la matière
organique à partir de situation écologique diversifiée (qualité de la MO et de la
micro/macro faune) au niveau de divers écosystèmes modèles dont la Vasière
Ouest-Gironde (VOG). Le groupe des bactéries étant l’un des principaux
minéralisateurs de la matière organique, il s’agissait donc pour nous d’apporter une
vision du lien entre la diversité des communautés bactériennes et la qualité de la
matière organique, ainsi que d’étudier la dynamique des communautés
bactériennes à deux échelles spatiales: (i) une échelle horizontale, le long des
gradients de labilité de la matière organique et de peuplements benthiques et (ii)
une échelle verticale en lien avec l’activité de bioturbation de ces peuplements
benthiques mais également en fonction des profils de flux benthiques et en
particulier de diffusion de l’oxygène le long de la colonne sédimentaire.
- un programme porté par Hugues Blanchet dans le cadre de la thèse d’Aimé Roger
NZigou, visant à modéliser la biogéochimie de l'estuaire de la Gironde à travers la
caractérisation des principaux facteurs biotiques susceptibles d’influencer la
production primaire et la respiration au niveau de vasières intertidales de l’estuaire
de la Gironde. Notre intérêt était de caractériser la dynamique des communautés
bactériennes, le long d’un gradient de salinité.
Notre participation à ces trois programmes nous a permis d’accéder à
l’échantillonnage de trois écosystèmes présentant de nombreuses similitudes
environnementales. Tous trois sont situés en zone d’écotone du Golfe de Gascogne, sous
influence océanique venant de l’Atlantique et composés de sédiment vaso-sableux à sableux.
Nous avons pu également, à travers notre participation à ces programmes, acquérir de
nombreux paramètres descripteurs de la biogéochimie des sédiments. L’ensemble nous a
2

Avant-propos
permis alors de mener une réflexion sur la contribution de divers facteurs de contrôle des
assemblages bactériens à différentes échelles géographiques.
Deux autres programmes portaient sur l’état de santé et la dynamique de populations
de bivalves fouisseurs :
- le programme ANR Blanche « Multistress » porté par Xavier de Montaudouin. Ce
projet s’intéressait aux effets cumulés de différents stress toxiques, parasitaires ou
infectieux, sur des populations de bivalves d’intérêt économique (coques et
palourdes). A travers une approche intégrée de leurs interactions sur la réponse
génétique, protéique, cellulaire et populationnelle chez la coque Cerastoderma
edule et la palourde japonaise Ruditapes philippinarum le but de ce programme
était d’estimer la santé des populations (paramètres de dynamique de population),
de la mettre en rapport avec les niveaux de base des stress subis (métaux,
parasites) et d’évaluer les réponses adaptatives mises en place par les bivalves en
terme de détoxication et de défenses immunitaires. Une des réponses au stress
environnemental peut être une modification des communautés bactériennes
associées ; c’est dans ce cadre que s’inscrivit notre intervention. Ce programme
nous a permis de bénéficier d’une campagne d’échantillonnage réalisée en amont
de cette thèse (janvier à octobre 2007) permettant une étude sur la dynamique des
communautés bactériennes de coques infestées ou non par un parasite influant sur
la fitness du bivalve ; étude publiée dans Microbial Ecology (Meisterhans et al.,
2011).
- le programme LITEAU 3 « REPAMEP » (Réponse de la palourde japonaise aux
stress environnementaux, combinant métaux, efflorescences toxiques et
pathogènes) porté par Xavier de Montaudouin, et en continuité scientifique du
programme « Multistress ». Dans le cadre du volet « interaction palourdes-
bactéries-sédiment » notre objectif était de mieux comprendre le déterminisme de
la diversité des communautés bactériennes associées aux palourdes ainsi que les
interactions entre cette microflore et son hôte. Ce projet nous a permis de réaliser
deux études portant sur le microbiote de bivalves fouisseurs, l’une s’interrogeant
sur le lien entre le microbiote et l’état physiologique et/ou l’habitat de l’hôte, la
3

Avant-propos
seconde sur la spécificité d’hôte du microbiote. Cette seconde étude est en cours de
valorisation sous forme d’une publication soumis à FEMS Microbiology Ecology.
A travers la participation à ces différents projets, nous nous sommes donc intéressés à
caractériser les patrons des communautés procaryotes de l’habitat benthique via différentes
études à plusieurs échelles.
Ce projet s’est basé sur une analyse de la structure génétique des communautés
bactériennes et/ou archéennes via l’utilisation de techniques de biologie moléculaire de type
CE-fingerprinting (empreinte moléculaire à partir d’électrophorèse capillaire) permettant
d’accéder à la diversité taxonomique des communautés à travers le concept d’espèce
moléculaire ou OTU (Operational Taxonomic Unit). Une réflexion sur les techniques
moléculaires utilisées en écologie microbienne, nous a conduit d’une part, vers l’ARISA
(Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), méthode rapide et robuste pour accéder à
la structure des communautés bactériennes, et d’autre part vers l’utilisation de la T-RFLP
(Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism) pour caractériser les communautés
archéennes, certains taxons archéens ne possédant pas d’intergène 16S-23S amplifiable.
L’analyse de jeux de données complexes, générées par ces méthodes moléculaires,
nous a conduit à nous interroger sur le poids des différentes OTU dans l’analyse de la
diversité β: comment discriminer des OTU du bruit de fond ? Quelle est l’importance des
OTU ubiquistes, des OTU groupes dépendantes ou encore des OTU rares au sein de profils
d’empreinte moléculaire dont la complexification suit l’évolution des techniques de plus en
plus résolutives ?
Dans un premier temps, notre intérêt s’est porté sur l’habitat sédimentaire où les
procaryotes représentent le groupe le plus diversifié, dominant aussi bien en terme
d’abondance et de biomasse qu’en terme de richesses taxonomique et fonctionnelle. Nos
travaux se sont intéressés à la diversité génétique bactérienne et/ou archéenne à différentes
échelles spatiales, horizontale ou verticale, allant du centimètre à la centaine de kilomètres,
afin de mettre en évidence, par une analyse des patrons d’OTU, des processus d’assemblage
des communautés procaryotes habitat-dépendant à l’échelle intra-écosystème et/ou
biogéographique entre écosystèmes.
Nous nous sommes également intéressés aux communautés bactériennes d’un second
habitat à travers l’étude de bivalves fouisseurs où la dynamique des communautés
bactériennes s’avère plus complexe que dans le sédiment du fait du caractère « vivant » de cet
4

Avant-propos
habitat. En effet, les communautés bactériennes des bivalves (CBAB) résultent à la fois des
processus de transmission latérale par balnéation et filtration dans un habitat septique mais
également des processus de transmission verticale et/ou horizontale laissant supposer une
coévolution possible entre les CBAB et leur hôte. A travers une analyse de la diversité β, nous
avons recherché quels pouvaient être les déterminismes des OTU au sein des CBAB et en
particulier l’influence de l’habitat et des caractéristiques intrinsèques de l’hôte (appartenance
à une espèce, compartimentation fonctionnelle des organes, état physiologique de l’individu).
Ce manuscrit se structure donc en quatre grands chapitres :
- le premier chapitre, basé sur un état de l’art bibliographique, s’attache à définir d’une
part les concepts utilisés au cours de ces études et d’autre part présente la pertinence des
modèles d’études et des méthodologies choisies.
- le deuxième chapitre présente la caractérisation des communautés procaryotes de
l’habitat sédimentaire et nous permet de discuter des règles d’assemblages des communautés
à l’échelle locale et à l’échelle globale ainsi que de la mise en évidence des facteurs
environnementaux structurant ces communautés
- le troisième chapitre présente la caractérisation des communautés bactériennes des
bivalves fouisseurs et discute du déterminisme des populations bactériennes au sein de ces
CBAB.
- enfin un quatrième chapitre présente un bilan de ces travaux sur l’analyse de la
dynamique de la structure génétique des communautés procaryotes par l’approche
moléculaire.
5

Avant-propos
6

CHAPITRE I:
Synthèse bibliographique
7

Chapitre I: Synthèse bibliographique
Les approches moléculaires ont offert la possibilité de caractériser les populations et
communautés de micro-organismes avec des capacités de traitement compatibles avec les
impératifs de réplication et de diversification de l’échantillonnage des systèmes naturels. Ces
micro-organismes (micro-algues, bactéries, archées …) qui étaient jusque-là considérés
comme des compartiments types « boites noires », apparaissent désormais comme des
populations et communautés dont il convient d’appréhender la dynamique temporelle et les
patrons de répartition spatiale au même titre que ceux des macro-organismes. L’implication
de ces organismes dans des fonctions clés des écosystèmes (e.g. minéralisation de la matière
organique) renforce l’acuité de ce questionnement.
Ce chapitre a pour but de présenter au travers d’une revue des connaissances
conceptuelles et techniques, l’analyse de la structure génétique des communautés bactériennes
et archéennes. Il présente également un état de l’art des communautés procaryotes des deux
modèles d’habitats étudiés au cours des différents travaux présentés dans ce manuscrit : les
sédiments benthiques et les bivalves marins.
1. La biodiversité
1.1 Définitions
Le terme de biodiversité est une contraction de diversité biologique (Magurran, 2004). Il
fait donc référence à la variété du monde vivant mais décrit en réalité une notion plus
complexe se déclinant en fonction de trois échelles d’intégration : (i) la biodiversité génétique
décrivant la variété des gènes au sein des espèces (variété au sein de l’ensemble du vivant);
(ii) la biodiversité spécifique c'est-à-dire l’ensemble des espèces existantes (variété entre
espèces); et (ii) la biodiversité écosystémique décrivant l’ensemble des relations biotiques au
sein des écosystèmes.
De manière simple, la biodiversité représente le degré de variation du biote (i.e. biomasse
totale du vivant) c'est-à-dire l’ensemble de la diversité génétique d’un écosystème ou plus
largement de la biosphère. Ce degré de variation est dû à la capacité de spéciation de ce biote
à l’échelle globale.
La diversité taxonomique se définit comme la distribution des individus en taxons à un
moment donné au sein d’un écosystème donné. Cette diversité est décrite par trois
composantes: (i) la richesse taxonomique c'est-à-dire le nombre total de taxons présents, (ii) la
composition taxonomique c'est-à-dire l’identification des taxons présents, et (ii) la distribution
9

Chapitre I: Synthèse bibliographique
taxonomique c'est-à-dire l’abondance relative des taxons ou autrement dit comment se
répartissent, de manière quantitative, les individus en taxons (Magurran, 2004).
Dans la mesure de la biodiversité interviennent les échelles spatiale et temporelle. Ainsi,
plusieurs niveaux de diversité sont décrits (Figure I.1). La diversité α correspond à la diversité
locale c'est-à-dire à la diversité taxonomique d’un site donné. La diversité β s’attache à
comparer la diversité taxonomique de deux sites et par extension de la définition première, de
comparer la diversité taxonomique d’un même site à deux temps donnés différents. La
diversité γ reflète la diversité taxonomique d’un écosystème intégrant la diversité des habitats
le composant (Magurran 2004 ; Forney et al., 2004).
β 2
α 1
Figure I.1 : Illustration des liens entre la diversité α (diversité d’un habitat), β (diversité
comparative entre deux habitats) et γ (diversité d’un écosystème composé de plusieurs
habitats) (D’après Jurasinski et al., 2009). Les différentes couleurs de croix représentent les
différents taxons composant chaque communauté.
En pratique, les informations concernant la composition ou la distribution taxonomique
sont consignées sous forme de matrices croisant des échantillons et des taxons. Selon le
niveau d’inventaire réalisé, il peut s’agir de matrices de présence - absence (composition) ou
de matrices où figurent les abondances relatives (distribution taxonomique). Ces matrices sont
traitées pour extraire et résumer l’information qu’elles contiennent sous forme d’indices de
diversité ou de similarité. Comme nous le verrons, la spécificité des approches moléculaires
de la diversité développées en écologie microbienne s’arrêtent à la constitution de ces
matrices. En effet, une fois les unités taxonomiques opérationnelles (OTU) saisies sous forme
10
β 1
α 2
β 3
α 3
γ

Chapitre I: Synthèse bibliographique
de matrice, plus rien ne sépare la démarche adoptée pour les microorganismes de celle utilisée
depuis très longtemps pour les macro-espèces.
1.2 Les indices de diversité et de similarité
Le recours à des indices est une métrologie de la diversité permettant une
simplification de l’information sous une forme plus aisément manipulable qu’une matrice
complexe de plusieurs centaines de taxons par échantillon. Ainsi différents indices,
correspondant aux différentes échelles de la diversité ont été définis : (i) les indices de
diversité α synthétisent l’information de composition et/ou de diversité taxonomique d’un
échantillon en une seule valeur descriptive de la dominance ou de l’équitabilité des taxons au
sein de la communauté alors que (ii) l’indice de diversité β résume en une valeur la différence
de composition et/ou de diversité taxonomique entre les communautés de deux échantillons.
Quatre principaux indices de diversité permettent de caractériser la diversité α. Les
indices de Fisher (Fisher et al., 1943) et de Margalef (Margalef, 1951) se basent uniquement
sur la richesse taxonomique de la communauté (Krebs, 1998) et pour cette raison sont
beaucoup moins utilisés. Ils peuvent cependant présenter un intérêt dans le cas où l’estimation
de l’abondance relative s’avère peu fiable. Les indices de Simpson (Simpson, 1949) et de
Shannon (Shannon and Weaver, 1963) sont les plus couramment utilisés (Tableau I.1). C’est
le cas en écologie microbienne pour décrire la diversité bactérienne et archéenne quelle que
soit la technique de génotypage utilisée (Hill et al., 2003). Bien qu’ils se basent tous deux sur
le nombre et l’abondance relative des taxons présents au sein de la communauté étudiée, ils
restent complémentaires puisque l’indice de Simpson retranscrit principalement les
différences d’abondances relatives entre taxons au sein d’un échantillon alors que l’indice de
Shannon est beaucoup plus sensible à la richesse taxonomique de la communauté et ne prend
que peu en compte les taxons rares.
La caractérisation de la diversité β nécessite, quand à elle, le recours à divers indices
de similarité permettant de comparer les échantillons deux à deux en calculant le pourcentage
de ressemblance entre les communautés. Certains indices comme l’indice de Jaccard
(Jaccard, 1912) ou de Sorensen (Sorensen, 1948) se basent sur la comparaison des matrices de
présence/absence de taxons dans les échantillons ; d’autres, comme l’indice de Bray-Curtis
(Bray and Curtis, 1957) ou l’indice de Czekonowski (Czekonowski, 1909) se basent sur la
comparaison des matrices d’abondance relative des taxons présents dans les échantillons
(Tableau I.1). En écologie l’indice de Bray-Curtis est l’un des indices les plus utilisés car il
11

Chapitre I: Synthèse bibliographique
présente l’avantage d’être indépendant (i) de l’unité de mesure, (ii) de l’inclusion et/ou de
l’exclusion de taxons absents des deux échantillons, ainsi que (iii) de l’inclusion et/ou de
l’exclusion d’autres échantillons. Cet indice est donc non sensible à la standardisation des
données (Clarke and Warwick, 2001).
Diversité α
Diversité β
Tableau I.1: Indices de diversité α et β. NS : nombre d’individus par taxon ; NT : nombre
total d’individus; S : nombre de taxons ; a : nombre de taxons de la communauté A ; b :
nombre de taxons de la communauté B ; c : nombre de taxons communs entre les
communautés A et B
Ces divers indices, souvent complémentaires sont donc des outils permettant d’estimer
et de comparer les diversités entre échantillons à partir d’une matrice de présence/absence ou
d’abondance relative de taxons. Comme nous le verrons dans les paragraphes suivants
consacrés aux techniques de mesure elles-mêmes, le choix de l’un ou l’autre des indices
dépend grandement de limites méthodologiques dues à l’appréciation des abondances
relatives (cf biais d’amplification) ou au rapport entre la détection de taxons inédits et le
nombre de réplicats possibles (cf notion d’espèces rares ou communes).
De manière générale, appréhender la diversité taxonomique nécessite donc de définir
l’unité taxonomique de base qui est dépendante du modèle biologique étudié et des techniques
disponibles.
Indice Formule
12
Diversité
minimale
Diversité
maximale
Référence
Simpson D = Σ (NS / NT)² 1 0 Simpson (1949)
Shannon H = - Σ [(NS / NT) x log2 (NS / NT)] 0 ∞ Shannon and Weaver (1963)
Fisher S = α ln (NT / α) 0 ∞ Fisher et al. (1943)
Margalef d = (S - 1) / ln NT 0 ∞ Margalef (1951)
Jaccard J = [c / (a+b-c)] 0 1 Jaccard (1912)
Sorensen S = [2c / (a+b)] 0 1 Sorensen (1948)
Bray-Curtis
BC=100 x [1 – (Σ|OTUi,a – OTUi,b| /
ΣOTUi,a + OTUi,b)]
0 1 Bray and Curtis (1957)
Czekonowski C = [2a/(2a + b +c)] 0 1 Czekonowski (1909)

1.3 Le concept d’espèce
Chapitre I: Synthèse bibliographique
L’espèce est un niveau fondamental d’organisation biologique. L’écologie des populations
s’intéresse au nombre d’individus appartenant à une espèce, alors que l’écologie des
communautés étudie le nombre d’espèces au sein d’un habitat.
La définition la plus communément utilisée de nos jours est celle du concept d’espèce
biologique défini par Mayr en 1963: deux individus sont considérés comme appartenant à la
même espèce s’ils ont la capacité de se reproduire entre eux en donnant des descendants
fertiles. L’incapacité d’interfécondité entre individus d’espèces différentes serait due à la
présence de barrières postcopulatoires ou postzygotiques (Palumbi, 1994) empêchant la
recombinaison génétique induisant l’isolement génétique et/ou reproductif des espèces. Bien
qu’il existe plus de 20 définitions différentes du concept d’espèce et qu’aucune ne soit
parfaitement satisfaisante pour l’ensemble des organismes pluricellulaires (Mayden, 1997),
cette définition est relativement bien adaptée à la majorité de ces organismes. Cependant, le
critère d’interfécondité, par définition, est inadapté à des organismes asexués comme les
procaryotes (mais aussi quelques micro-organismes eucaryotes) qui se reproduisent par
division cellulaire.
Le concept d’espèce morphologique proposé par Cohn en 1972 est une des alternatives à
la définition de l’espèce par Mayr (1963). Des individus sont alors considérés comme
appartenant à la même espèce s‘ils possèdent un nombre suffisant de traits morphologiques
communs qui les différencient d’autres individus. C’est sur cette définition que reposent les
tables d’identification taxonomique des macro-organismes animaux et végétaux. Mais ce
concept est lui aussi limité, d’une part par la plasticité morphologique de certaines espèces
(différenciation morphologique en fonction de conditions environnantes) mais également dans
le cas des procaryotes par la faible diversité morphologique existante (coques, bacilles …).
Les critères morphologiques sont alors souvent couplés à d’autres traits phénotypiques
(concept d’espèce phénotypique) et en particulier pour les micro-organismes, la capacité de
métaboliser divers substrats (Rossello Mora and Amann, 2001). Cette approche nécessite de
savoir cultiver ces micro-organismes ce qui n’est actuellement pas le cas pour la grande
majorité des espèces : actuellement seuls 10% de ces micro-organismes sont cultivables
(Torsvick et al., 1998). De plus, les procaryotes sont également capables de transferts
génétiques horizontaux via des mécanismes de conjugaison, de transformation ou de
transduction qui peuvent avoir lieu aussi bien entre individus d’une même espèce qu’entre
individus d’espèces différentes, leur conférant ainsi une grande plasticité phénotypique intra-
13

Chapitre I: Synthèse bibliographique
spécifique. Il est donc important de distinguer au sein d’un pan-génome, le génome cœur
(core genome en anglais) qui est l’ensemble des gènes communs à toutes les souches du
taxon, du génome accessoire (dispensable genome en anglais) qui est l’ensemble des gènes
qui ne sont présents que chez une ou quelques souches du taxon. Le génome cœur soutient à
la fois les aspects basiques de la vie biologique du taxon et ses traits phénotypiques. Il
correspondrait donc aux gènes essentiels dans la plupart des circonstances et pourrait ainsi
servir de base pour la définition de l’espèce puisqu’il maintient une cohérence génomique
entre individus (de Bruijn, 2011). Le génome accessoire est formé de gènes codant pour des
propriétés biochimiques supplémentaires (e.g. adaptation de l’espèce à des fluctuations des
conditions environnementales, résistance aux antibiotiques …). Cet ensemble génomique
permettrait à des individus d’une même espèce de coloniser des habitats différents et par
conséquent est l’un des principaux arguments allant à l’encontre de l’espèce écologique de
Cohan (2002) qui définit l’espèce comme un ensemble d’individus occupant une même niche
écologique (de Bruijn, 2011).
Nous voyons donc que le concept d’espèce est rendu complexe chez les procaryotes par
l’absence de reproduction sexuée, les grandes plasticités phénotypiques (critères
morphologiques et biochimiques) et génotypiques (notion de core et pangénome, transferts
horizontaux de gènes) et la nécessité de recourir à la culture de spécimens pour en définir les
principales caractéristiques. Par contre, le niveau taxonomique de l’espèce chez ces
organismes peut être considéré à travers l’utilisation d’approches basées sur l’étude des acides
nucléiques.
Depuis les années 1970, la caractérisation des espèces procaryotes se base classiquement,
sur la technique d’hybridation ADN/ADN. Des individus sont alors considérés comme
appartenant à la même espèce phylogénétique ou « genomospecies » si leur génome s’hydride
au moins à 70% ou si leurs séquences d’ADN ribosomal 16S présentent au moins 97 % de
similarité. Ces valeurs arbitraires ont été choisies en s’appuyant sur la taxonomie
phénotypique (Stackebrandt and Goebet, 1994).
Couplant l’analyse phylogénétique aux analyses morphologique et phénotypique, la
taxonomie polyphasique, définit l’espèce phylo-phénotypique comme un ensemble
d’individus cohérents d’un point de vue génomique et présentant un fort dégré de similarité
sur de nombreux caractères morphologiques et biochimiques (Vandamme et al., 1996). La
taxonomie polyphasique, base des deux grands ouvrages de référence pour la classification
des procaryotes, le « Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology » (Holt et al. 1994) et le
« The Prokaryotes » (Dworkin et al., 2006), est l’actuelle référence pour la taxonomie des
14

Chapitre I: Synthèse bibliographique
procaryotes. Pour être nommé en tant que nouvelle espèce, un genomospecies préalablement
caractérisé par hybridation ADN/ADN doit être individualisé et présenter des caractères
phénotypiques le distinguant des autres genomospecies. Cependant définir l’espèce par cette
approche nécessite d’une part la capacité de cultiver les espèces, et d’autre part un travail
onéreux et fastidieux. Cette approche est donc inadaptée à l’étude à grande échelle des
communautés (assemblage d’espèces en interactions dans un même écosytème, milieu, habitat
et/ou qui partagent une même fonction).
En pratique, la majorité des études récentes sur les communautés procaryotes s’affranchit
des techniques basées sur la culture des procaryotes afin d’accéder au mieux à la méta-
communauté procaryote. Ces études sont basées sur la systématique moléculaire et utilisent
soit des approches multi-locus (screening et phylogénie de plusieurs gènes), soit des
approches de criblage et de phylogénie des gènes ribosomaux. De ces méthodes est né le
concept d’espèce moléculaire ou OTU (Operational Taxonomic Unit) où les espèces se
différencient par leur «empreinte moléculaire» basée sur le polymorphisme de taille ou de
séquence de ces gènes ribosomaux. Cependant, du fait de la présence d’opérons ribosomiques
multiples généralement entre 1 et 15 opérons (Klappenbach et al., 2000), une espèce phylo-
phénotypique peut posséder plusieurs OTU et inversement, une même OTU peut se retrouver
chez plusieurs espèces différentes (Kovacs et al., 2010; Ramette, 2009). L’OTU est donc un
proxi pragmatique de l’espèce phylo-phénotypique, qui permet l’étude de la diversité des
communautés procaryotes à travers des approches moléculaires.
2. Les techniques d’étude des communautés procaryotes
2.1 Généralités
Les procaryotes forment le phylum dominant sur Terre aussi bien en terme de densité
estimée à 4-6 x 10 30 individus qu’en terme de biomasse évaluée à 350-550 10 15 grammes de
carbone (Whitman et al., 1998; Forney et al., 2004). Les procaryotes forment un groupe
paraphylétique regroupant deux groupes monophylétiques les bactéries et les archées qui sont
ubiquistes dans l’environnement. Si l’importance des bactéries dans l’environnement est
connue depuis de nombreuses années, les archées, quant à elles, ont longtemps été perçues
comme des organismes adaptés uniquement aux milieux extrêmes, hostiles aux eucaryotes et
aux bactéries (Herfort et al., 2007). Mais depuis une vingtaine d’années le développement de
méthodes d’analyses moléculaires a permis de démontrer la présence d’archées aussi bien
15

Chapitre I: Synthèse bibliographique
dans les sols (Bintrin et al., 1997), dans les milieux aquatiques (Delong, 1992; Dumestre et
al., 2002) que dans le tractus digestif animal (Janssen and Kirs, 2008) Les crenarchées
constituent 20 à 30 % de l’abondance totale des procaryotes dans les zones aphotiques
océaniques alors que les euryarchées semblent dominer dans les eaux de surface (Massana et
al., 2000; Karner et al., 2001; Herndl et al., 2005). Il parait alors important de considérer à
égalité les communautés archéennes et les communautés bactériennes lorsque l’on s’interroge
sur la diversité des communautés procaryotes dans l’environnement. La diversité des
communautés procaryotes peut être estimée à différents niveaux de résolution selon les outils
et les techniques utilisées (Figure I.2).
Figure I.2: Approches méthodologiques en écologie microbienne (Caron, 2005)
2.2 Approches culturales
Comme nous l’avons vu précédemment, la discrimination des espèces bactériennes, selon
le « Bergey’s Manual of Determination Bacteriology » (Holt et al. 1994) et le
« The Prokaryotes » (Dworkin et al., 2006), repose en grande partie sur la mise en évidence
de particularités phénotypiques. La recherche de ces caractères se base sur des approches
culturales c'est-à-dire mimer in vitro des conditions proches de l’environnement des espèces
afin de permettre le développement à partir d’une cellule d’une biomasse, génétiquement
identique à celle-ci, aux mutations près (population clonale). Cette biomasse clonale rend
16

Chapitre I: Synthèse bibliographique
alors possible l’étude des propriétés structurales (structure de la paroi), métaboliques et
enzymatiques de l’espèce via différents outils comme la coloration différentielle de Gram, les
tests biochimiques miniaturisés des galeries API, les tests de présence d’enzymes
(e.g. oxydase, catalase). Ces tests fonctionnant sur le même principe que les classifications par
dichotomie, sont encore très usités, en particulier pour des applications médicale et sanitaire
dans l’identification des espèces présentes.
Les approches culturales permettent également, par la méthode des dilutions successives
utilisée en milieu gélosé ou en milieu liquide [méthode du nombre le plus probable (NPP) ou
most probable number (MPN)] d’accéder à l’abondance totale de la fraction cultivable des
communautés ainsi qu’à l’abondance de la fraction cultivable de certains taxons (Escherichia
coli, Vibrio sp. …) ou groupes fonctionnels (bactéries sulfato-réductrices, halotolérantes, …)
via l’utilisation de milieux spécifiques dits sélectifs.
Cependant, une faible proportion d’espèces procaryotes et en particulier archéennes est
actuellement cultivée, majoritairement due à la difficulté de reproduire aussi fidèlement que
possible en laboratoire les ressources et les conditions physiques et chimiques auxquelles sont
soumis les procaryotes dans leur environnement. Par exemple, les milieux de culture utilisés
sont souvent trop riches par rapport au milieu marin oligotrophe et conduiraient donc à des
stress nutritifs et osmotiques. L’absence d’éléments essentiels non déterminés est aussi une
hypothèse forte. Pour tenir compte de ces particularités, des milieux de culture ont été
développés à partir d’eau de mer naturelle, d’extrait de sédiments ou encore d’extrait de
poissons ou de mollusques (Brisou, 1980).
Les approches culturales s’avèrent donc peu adaptées à l’étude de la diversité des
communautés hormis lorsqu’elles sont couplées à des techniques moléculaires dites alors
culture-dépendantes (e.g. microbial source tracking, Scott et al., 2002). Ces approches restent
cependant la clé de voûte de la biologie moléculaire à travers les collections de souches qui
ont permis le développement des sondes taxonomiques et fonctionnelles.
2.3 Approches moléculaires
Une alternative à la culture et à ses biais (sélection de moins de 10% des taxons présents)
(Amann et al., 1995) est l’utilisation de techniques basées sur des approches moléculaires.
En écologie microbienne, ces approches ont permis de révéler de nouveaux génomes
associés à de nouvelles fonctions biogéochimiques (e.g. l’oxydation anaérobie de
l’ammonium (annamox) des planctomycétales, Kuenen, 2008; chimiohétérotrophie de
17

Chapitre I: Synthèse bibliographique
l’oxydation du CO des Roseobacter, Moran and Miller, 2007), ou bien même plus simplement
des génomes constituant l’essentiel de la biomasse bactérienne et restés jusqu’alors cryptiques
(e.g. Pelagibacter ubique, Morris et al., 2002). Le développement de la biologie moléculaire
permet de prendre en compte la diversité structurale et fonctionnelle, afin d’aborder la
question du « qui fait quoi ? » pour un compartiment biologique que l’on avait jusque là
coutume de considérer comme une « boite noire »,
2.3.1 Numération des procaryotes
Les études des communautés procaryotes se sont longtemps limitées à la caractérisation
de l’abondance des individus au sein des communautés via des approches culturales ou
l’utilisation de la microscopie optique.
Des méthodes de numération basées sur l’utilisation de marqueurs fluorescents appelés
fluorochromes (acridine orange, DAPI, SYBR Green) permettent de déterminer le nombre
total de procaryotes présents dans un échantillon. Ces marqueurs fluorescents en s’intercalant
entre les bases des acides nucléiques (ADN, ARN) rendent fluorescentes les cellules sous
l’effet d’une lumière incidente. Les fluorochromes excités émettent une fluorescence qui peut
être détectée par plusieurs types d’instruments : (i) la microscopie à épifluorescence (MEF) ou
(ii) la cytométrie en flux (CMF) qui est réputée permettre une mesure rapide et automatisée de
l’abondance procaryote en particulier en milieu aquatique (Lemarchand et al., 2001 ; Marie et
al., 2001 ; Lavrentyev et al; 2004). La CMF s’avère par conséquent adaptée à des études à
grande échelle (Jacquet et al., 1998) qui génèrent un nombre important d’échantillons. Mais
une adaptation de protocole est indispensable lorsque l’on travaille sur des communautés
benthiques. En effet les procaryotes sont fixés sous forme de biofilm aux particules
sédimentaires (Hall-Stoodley et al., 2004). Il est donc impératif de les désorber de cette
matrice et de désagréger les éventuels agrégats cellulaires. Pour cela, des protocoles ont été
développés, basés sur (i) l’extraction par une action physique comme la sonication (Danovaro
et al., 2001), pouvant être couplée à l’action chimique d’un agent dispersant comme le sodium
pyrophosphate (Weinbaueur et al., 1998 ; Klauth et al., 2004), puis sur (ii) la séparation des
procaryotes de la matrice par décantation (Weinbaueur et al., 1998) , par centrifugation
(Duhamel and Jacquet, 2006), ou par migration forcée sur un gradient de densité (e.g. gel de
Nycodenz; Amalfitano and Fazi., 2008).
Des méthodologies similaires ont été développées pour accéder à la microflore associée
aux tissus de bivalves (Caro et al., 2009) mais ne s’avèrent efficaces que par la présence de
18

Chapitre I: Synthèse bibliographique
globules de soufre élémentaire au sein des bactéries endosymbiontes des branchies qui en
modifiant la densité cellulaire permettent la séparation entre les bactéries et les cellules
animales.
2.3.2 Analyse de la diversité
L’analyse de la diversité des espèces procaryotes est rendue possible grâce à l’utilisation
de techniques ciblant les gènes ribosomaux (e.g. gènes de l’ARNr 16S chez les procaryotes,
ITS chez les bactéries). Ces gènes, du fait du rôle fondamental des ribosomes dans la synthèse
protéique, sont très conservés et partagés par l’ensemble des organismes vivants.
D’autres molécules ont également été utilisées en tant que marqueur taxonomique comme
la cytochrome c oxydase (Hebert et al., 2003), la ribulose diphosphate carboxylase
(Mummenhoff and Koch 1994), ou l’ARN polymérase à facteur sigma (Mittenhuber, 2002).
Mais l’utilisation de ces molécules restant très controversée, en particulier du fait de la non
présence chez tous les organismes, le marqueur taxonomique de référence reste l’ARNr
(Amann et al., 1995).
Les techniques utilisant les séquences des gènes codants pour l’ARNr comme marqueur
taxonomique sont nombreuses (FISH, DGGE, TGGE, RFLP, ARISA….) 1 et permettent soit
la recherche de taxons d’intérêts prédéfinis (Approches « Top to Bottom ») soit la
caractérisation de la composition et/ou la structure de communautés.
2.3.2.1 Analyses a priori: approches «Top to Bottom »
Des approches utilisant des sondes taxonomiques ou fonctionnelles ont été développées
afin de quantifier l’abondance de groupes taxonomiques ou fonctionnels.
La technique FISH est une de ces approches basée sur l’hybridation d’une sonde sélective
au niveau des ARN ribosomiques. Cependant les ARNr ne sont abondants qu'en début de
phase exponentielle de croissance. Cette technique est donc limitée par le taux de croissance
des procaryotes, mais aussi par le nombre de copies d'opérons ARNr par cellule et par
l'accessibilité de la sonde sur la séquence cible (Ferrari et al., 2006). Cette technique apparait
donc assez peu adaptée à une détection des procaryotes de l’environnement (i.e. par
1 FISH: Fluorescence In Situ Hybridization ; DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis; TGGE:Temperature
Gradient Gel Electrophoresis; RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism; ARISA: Automated Ribosomal
Intergenic Spacer Analysis.
19

Chapitre I: Synthèse bibliographique
opposition aux procaryotes issus de cultures) et particulièrement des procaryotes aquatiques
dont la taille et le faible taux de croissance entrainent fréquemment un signal de détection
situé sous la limite du seuil de détection de cette technique. L'intensité de fluorescence étant
l'un des principaux facteurs limitants, l'utilisation d'une méthode d'amplification de la
fluorescence permet une estimation par MEF plus fiable. L'utilisation du CARD-FISH
(Catalyzed Reporter Deposition-FISH) permet l'augmentation de l'intensité de fluorescence et
du ratio signal/bruit de fond, grâce à l'amplification du signal par une sonde couplée à une
peroxydase de type HRP (Horseradish peroxidase) et donc une meilleure détection des
bactéries à faible taux d'ARNr (Lebaron et al., 1997; Pernthaler et al., 2002; Schönhuber et
al., 1997).
Une méthode équivalente mais automatisée est l’utilisation des biopuces. Elles permettent
d’analyser rapidement l’expression de plusieurs milliers de gènes en un seul essai. Cette
méthode consiste d’une part à fixer sur un support inerte des sondes de gènes d’intérêt
taxonomique ou fonctionnel, sous forme de spots (plusieurs milliers) répartis de manière
homogène sur le support. D’autre part l’ensemble des ARNm de l’échantillon sont
rétrotranscrits en ADN complémentaire (ADNc) couplés à des fluorochromes de type cyanine
(Cy3 ou Cy5). Les ADNc sont mis en contact avec la biopuce et vont pouvoir s’hybrider avec
les sondes présentes. L’analyse de cette fluorescence sur chaque spot permet de déterminer le
niveau d’expression des gènes d’intérêts recherchés. Cette technique relativement coûteuse est
utilisée en écologie microbienne pour rechercher la présence simultanée de plusieurs taxons
ou de différentes capacités métaboliques (Günther et al., 2006; Yergeau et al., 2007).
Il est également possible d’estimer l’abondance d’un groupe taxonomique ou fonctionnel
au travers de la quantification du nombre de copies de gène via la technique de quantitative
Polymerase Chain Reaction (qPCR). Cette technique se base sur l’amplification d’une
séquence d’ADN cible couplée à l’utilisation d’un marqueur fluorescent. L’intensité de la
fluorescence à chaque cycle est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons
produite, elle-même directement proportionnelle à la quantité initiale d’ADN présente dans le
milieu réactionnel (Brouwer et al., 2003). La valeur absolue du nombre de copies de gène est
déterminée grâce à l’utilisation d’une gamme étalon d’un gène d’intérêt dont on connaît les
concentrations initiales.
20

Chapitre I: Synthèse bibliographique
2.3.2.2 Analyses sans a priori
Ces techniques se basent toutes sur l’amplification d’un marqueur taxonomique par
PCR. Cette étape d’amplification est indispensable puisqu’elle permet à la fois de générer une
quantité d’ADN nécessaire aux analyses mais également de discriminer le marqueur d’intérêt
au sein du pool d’ADN métagénomique.
Parmi ces techniques, on peut distinguer d’un côté les techniques adaptées à l’étude
de la diversité α (clonage séquençage et métagénomique) dont l’utilisation permet d’accéder à
la composition de la communauté (liste des espèces) et de l’autre, les techniques adaptées à
l’étude de la diversité β, basée sur la comparaison de profils génomiques (empreintes
moléculaires) reflétant les structures des communautés.
2.3.2.2.1 Séquençage et métagénomique
La génomique et la métagénomique sont des approches basées sur le séquençage de
l’ensemble des génomes d’un échantillon (Handelsman et al., 1998 ; Singh et al., 2008, Xu,
2006). Elles permettent d’avoir un aperçu complet de la diversité des communautés ainsi que
de l’ensemble des fonctions métaboliques potentielles (Hugenholtz and Tyson, 2008).
Ce n’est que depuis une dizaine d’années que l’évolution des techniques de
séquençage a rendu possible le séquençage d’un mélange de molécules d’ADN. Avant cela il
était nécessaire d’isoler et d’amplifier la séquence nucléique d’intérêt (principe du
clonage/séquençage).
Le clonage / séquençage est une approche très utilisée en écologie microbienne pour
déterminer la diversité de communautés procaryotes (Olsen et al., 1986; Head et al., 1998).
Cette méthode se base sur la création d’une banque de fragments d'ADNr 16S chacun cloné
dans le génome d’une cellule compétente (en général Escherichia coli) qui une fois mise en
culture sur gélose générera un grand nombre de copies du gène au sein de chaque colonie. Les
différents clones seront alors analysés par séquençage de Sanger (Sanger et al., 1977). Une
séquence se présente sous forme d’un électrophorégramme dont il est possible d’extraire une
séquence en base ATGC sous format FASTA via des logiciels d’analyse dédiés
(e.g. Chromas, Technelysium Pty Ltd). Une étape de correction par visualisation de
l’électrophorégramme est souvent nécessaire afin d’éliminer les parties de séquence sur
lesquelles subsistent un doute quand à l’assignement de la base. Les séquences corrigées sont
ensuite alignées entre elles (i.e. calées les unes par rapport aux autres à partir de séquences
21

Chapitre I: Synthèse bibliographique
conservées communes entre toutes les séquences) à l’aide d’un logiciel spécifique (e.g. CAP3
Sequence Assembly Program ; http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php). Cette étape permet
d’améliorer la fiabilité de la comparaison entre séquences (Grimont, 1995). A partir de ces
séquences corrigées et alignées, des calculs de distances (e.g. neighbor-joining ; Saitou and
Nei, 1987) sont réalisés afin de comparer les séquences. Les résultats se présentent
principalement sous forme de dendrogramme ou arbre phylogénétique où la distance entre les
branches représente la dissimilarité entre les séquences. Ces séquences peuvent également
être comparées à des séquences de clones issues de base de données (e.g. Ribosomal
Database Project, http://rdp.cme.msu.edu/; Basic Local Alignment Search Tool,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Il sera alors possible de situer
phylogénétiquement l’organisme étudié. Cette technique permet donc d’identifier les espèces
présentes, et de caractériser la composition des communautés procaryotes.
Cependant, la diversité procaryote d’un échantillon étant généralement très
importante, accéder à l’ensemble de la composition taxonomique requiert l’analyse d’un
grand nombre de clones. Le prix et le coût en temps de l’analyse est donc important. Elle n’est
par conséquent que très rarement utilisée pour l’analyse de la diversité β et γ d’un écosystème.
De nouvelles techniques de séquençage massif, comme le pyroséquençage (Margulies
et al., 2005) présentant d’importants avantages par rapport au séquençage de Sanger ont été
développées. Parmi ces techniques, le pyroséquencage dont la technologie 454 (Life Sciences)
est l’une des plus performantes et plus usitées, apparait comme un choix de méthode pertinent
puisqu’il permet d’accéder à un nombre de séquence d’ADN plus important que le
traditionnel séquencage par la technique de Sanger (Sogin et al., 2006). Il permet à la fois
d’accéder à la diversité taxonomique et à la diversité fonctionnelle, avec une très haute
résolution. En effet il s’agit d’un séquencage dit massif pouvant générer plus de 20 millions
de paires de bases (soit 4-5 fois le génôme complet d’une espèce comme Escherichia coli) en
4h (Margulies et al., 2005; Binladen et al., 2007), Ce haut débit est possible grâce à un
couplage de technologies de pointes dont l’utilisation de plaques en fibre optique picotitrées
(i.e. billionième de litre), qui contient 1.6 millions de puits. L’amplification du marqueur est
réalisée par PCR en émulsion (emPCR) à partir d’ADN génomique nébulisé, dans des
microréacteurs (i.e. microgoutellettes) (300 000 réactions PCR en parallèle avec un jeu
d’amorces variées). Contrairement aux techniques de PCR classique, les nucléotides ne sont
pas ajoutés tous ensemble mais les uns après les autres. Lorsqu’un nucléotide est incorporé au
brin de synthèse, il libère un pyrophosphate qui est alors transformé en ATP par une
ATPsulfurylase contenu dans le milieu réactionnel. Ce milieu réactionnel contient également
22

Chapitre I: Synthèse bibliographique
de la luciférase et de la luciférine. En présence d’ATP la luciférase transforme la luciférine en
oxyluciférine ; réaction chimique produisant une émission de lumière. Les séquences sont
obtenues à partir du traitement de profils de luminescence (Ronaghi et al., 1998). Pour
permettre le traitement d’un grand nombre de profil en simultané, l’ensemble est couplé à des
technologies informatiques de pointes pour l’acquisition, le traitement et l’analyse des images
(Margulis et al., 2005). Le pyroséquencage est à l’heure actuelle une technique en plein essor
en écologie microbienne. Il a entre autre permis de révéler un grand nombre d’espèces jusque
là inconnues car appartenant à ce qui est appelée la « biosphère rare » c'est-à-dire formée
d’espèces très peu abondantes dans l’environnement (Pedros-Alio, 2006 ; Galand et
al., 2009).
2.3.2.2.2 Techniques d’empreintes moléculaires
Contrairement aux autres techniques (séquençage, biopuce), les empreintes
moléculaires permettent d’accéder rapidement à l’ensemble de la diversité des communautés
d’un grand nombre d’échantillons. Ces méthodes sont les plus couramment utilisées pour faire
des comparaisons de structure de communautés (diversité β). Elles se basent sur le
polymorphisme de taille ou de composition de séquences nucléiques d’intérêt comme le gène
codant pour l’ARNr 16S.
Ces méthodes nécessitent le recours à des techniques de séparation des séquences par
migration forcée appelées électrophorèse, soit sur un gel classique d’agarose ou d’acrylamide
soit sur un gel en capillaire via un séquenceur. On parle alors de Capillary Electrophoresis-
fingerprinting (CE-fingerprinting). Les techniques en capillaire sont plus précises, plus
reproductibles, moins coûteuses et plus rapides que les techniques sur gel (Hong et al., 2007;
Hori et al., 2006). Cependant elles ne permettent pas de récupérer les bandes afin de les
séquencer et ne permettent donc pas une identification taxonomique (Costa et al., 2006 ; Mohr
and Tebbe, 2006; Schmalenberger and Tebbe, 2003).
2.3.2.2.2.1 Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA)
L’ARISA est une méthode de CE-fingerprinting basée sur le polymorphisme de taille
des séquences intergéniques ADNr 16S-23S appelées ITS (Intergenic Transcribed Spacer).
L’ITS est considéré comme l’unité taxonomique opérationnelle (OTU) (Fisher and Triplett,
1999 ; Ranjard et al., 2000). Cette méthode consiste donc à amplifier les régions intergéniques
23

Chapitre I: Synthèse bibliographique
des espèces présentes dans un échantillon à l’aide de deux amorces situées respectivement sur
la partie aval de l’ADNr 16S et sur la partie amont de l’ADNr 23S. L’une des deux amorces
(en général celle s’hybridant sur l’ADNr 16S) est couplée à un fluorochrome permettant la
détection de l’amplicon par fluorimétrie. Les différents ITS, générés par amplification, sont
séparés en fonction de leur taille par migration électrophorétique en capillaire via un
séquenceur. Au niveau du séquenceur les différents fragments sont détectés lors de leur
passage devant un photomultiplicateur, leur temps de migration est enregistré permettant
d’estimer la taille des fragments grâce à une courbe étalon interne. Un profil de pics de
fluorescence appelé arisogramme est alors généré où le nombre de pics représente la richesse
taxonomique en OTU ; la taille du pic, la composition en OTU et l’intensité de fluorescence
l’abondance relative des OTU présentes.
Cependant l’absence d’ITS chez un grand nombre d’archées ou de planctomycètes par
exemple restreint en écologie des procaryotes, l’utilisation de cette technique à l’étude de la
diversité bactérienne.
2.3.2.2.2.2 Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)
Comme l’ARISA, la T-RFLP est une méthode de CE-fingerprinting mais basée sur le
polymorphisme de taille de séquences d’ADNr 16S après restriction enzymatique c'est-à-dire
après coupure de la séquence d’ADN au niveau de motifs nucléiques particuliers dépendants
du choix de l’enzyme (Avaniss-Aghajani et al., 1994 ; Liu et al., 1997). L’ADNr 16S est
amplifié à l’aide d’un couple d’amorces situées de part et d’autre de l’ADNr 16S, et dont
l’amorce amont est couplée à un fluorochrome permettant comme pour l’ARISA la détection
des fragments par le séquenceur. Lors de la restriction enzymatique, les fragments d'ADN
sont chacun clivés en plusieurs fragments de tailles différentes mais seul le fragment couplé
au fluorochrome pourra être détecté d’où l’appellation « Terminal » de cette technique de
RFLP.
Le choix de l’enzyme de restriction est prépondérant car choisir l’enzyme qui permet
de générer un maximum de fragments de tailles différentes, conditionne la diversité générée
par cette technique et donc sa résolution. En général les enzymes à site de restriction
tétramérique sont les plus utilisées. Les enzymes AluI, HaeIII et HhaI sont décrites comme les
plus résolutives aussi bien pour l’étude de la diversité des communautés bactériennes
qu’archéennes (Danovaro et al., 2009 ; Luna et al., 2009)
24

Chapitre I: Synthèse bibliographique
2.3.2.2.2.3 Rapide aperçu d’autres techniques utilisées en écologie
microbienne
Il existe de nombreuses autres techniques d’empreintes moléculaires se basant pour la
plupart sur le polymorphisme de taille, de séquence ou de conformation d’un marqueur
moléculaire.
La SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) et son équivalent automatisé
CE-SSCP est une technique de différenciation de l’ADN (en général ADNr 16S) selon les
propriétés de conformation de cette molécule, c’est-à-dire sa structure secondaire, sous sa
forme simple brin. Les fragments d'ADN de même taille mais de séquence différente sont
séparés grâce aux différences de mobilité induites par les différences de structure secondaire
(Hebenbrock et al., 1995, Lee et al., 1996).
La DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) et la TGGE (Temperature
Gradient Gel Electrophoresis) sont des méthodes basées sur la séparation électrophorétique
sur gel d’acrylamide à gradient dénaturant (urée et formamide pour la DGGE, température
pour la TGGE) (Myers et al., 1985 ; Muyzer and Smalla, 1998). Contrairement à la SSCP, ces
techniques se basent sur le polymorphisme de composition en bases nucléiques d’un
marqueur d’ADN double brin. Les séquences nucléiques double brin sont d’abord amplifiées
par PCR. Puis ces séquences sont séparées par migration sur gel d’acrylamide en conditions
dénaturantes. La séparation est basée sur la diminution de la mobilité électrophorétique de
l’ADN lors du changement de conformation de la molécule double brin induit par une
augmentation soit de la température (TGGE) soit de la concentration en un agent dénaturant
(DGGE). Afin de maintenir une structure en double-brin, l’amplification est réalisée à l’aide
d’une amorce clampée (possédant un motif GC répété entre 20 et 50 fois) permettant
d’incorporer aux fragments d’ADN néosynthétisés un long motif très difficilement
dénaturable. La dénaturation des brins (i.e. rupture des liaisons hydrogène entre les bases
appariées des deux brins d’ADN) est dépendante de la composition en bases nucléiques de la
séquence d’ADN et en particulier de son % GC mais également de la présence ou non d’une
suite plus ou moins importante de bases GC. Cette technique basée sur l’utilisation de gels de
polyacrylamide est limitée par les contraintes de reproductibilité mais présente l’avantage de
pouvoir exciser certaines bandes d’ADN d’intérêt et les séquencer.
25

Chapitre I: Synthèse bibliographique
2.3.2.2.2.4 Choix des techniques pour la caractérisation de la structure
génétique des communautés bactériennes et archéennes
La T-RFLP et l’ARISA sont les deux méthodes les plus couramment utilisées en
écologie du fait de leur robustesse et de leur grande capacité à révéler une large diversité (e.g.
Fisher and Triplett, 1999 ; Ranjard et al., 2000; Fuhrman et al., 2008 ; Luna et al., 2009 ;
Collins et al., 2010). L’ARISA est souvent préférée à la T-RFLP pour l’étude des
communautés bactériennes car elle permet de détecter un plus grand nombre de taxons et ainsi
de révéler une plus large diversité bactérienne (Danovaro et al., 2006). Cependant comme
indiqué précédemment l’ARISA n’est pas adaptée à l’étude des communautés archéennes,
d’une part par l’absence d’ITS chez certains taxons archéens et d’autre part par le faible
nombre de données répertoriées sur les ITS archéens. Du fait de la richesse des bases de
données sur l’ADNr 16S aussi bien bactérien qu’archéen, et de la plus grande sensibilité de
cette méthode par rapport à la DGGE par exemple (Moeseneder et al., 1999), la T-RFLP
apparait alors comme la technique la plus adaptée à l’étude de la structure des communautés
archéennes. C’est donc logiquement pour ce choix de méthodes que nous avons opté pour
caractériser les structures génétiques bactériennes et archéennes au cours des différents
travaux présentés dans les chapitres II et III.
2.3.2.2.2.5 Contraintes et limites des techniques moléculaires
Les techniques moléculaires pré-citées peuvent présenter des biais à différentes étapes
(Tableau I.2) qu’il est important d’évaluer afin de mettre en place une méthodologie limitant
leurs impacts.
26

Chapitre I: Synthèse bibliographique
Avantages Inconvenients
ARISA Permet de détecter de très légères Ne cible pas l'ensemble des taxons archéens
T-RFLP
différences de population bactérienne
Hautement résolutive pour l'analyse de la
diversité bacterienne et archéenne
Tableau I.2: Avantages et inconvénients des techniques moléculaires utilisées pour
l’étude de la diversité microbienne.
Tout d’abord la mesure de la diversité des communautés procaryotes à partir d’un
même échantillon varie en fonction de la méthode d’extraction de l’ADN utilisée (Luna et al.,
2009; Martin-Laurent et al., 2001; Stach et al., 2001 ; Tang et al., 2008). Pour limiter cet effet,
il est possible de faire des réplicats d’extraction en utilisant des kits d’extraction/purification
d’ADN différents mais les coûts financiers engendrés limitent cette possibilité. La majorité
des études en écologie microbienne utilise un seul kit d’extraction/purification d’ADN, choisi
en fonction de la nature de l’échantillon: eau (e.g. Newby et al., 2004), sol (e.g. Baniulyte et
al., 2009), biofilm (e.g. Lyautey et al., 2005), tissu animal (e.g. Kellogg et al., 2009) ou
végétal (e.g. Andreote et al., 2009). Afin d’améliorer le rendement d’extraction d’ADN
(e.g. 83 % d’ADN supplémentaire extrait dans un sol (Bürgmann et al., 2001)), des méthodes
de lyse mécanique (e.g. bead beating) sont souvent couplées à celles des lyses chimiques
contenues dans les kits d’extraction/purification d’ADN (Bürgmann et al., 2001).
Le choix des amorces PCR est également crucial car les amorces ciblées sont à
l’origine de la sélection des espèces qui seront amplifiées (Zhu et al., 2002). Il est nécessaire
que les amorces soient spécifiques afin de sélectionner un maximum d’espèces au sein de la
communauté ciblée et un minimum d’espèces non-ciblées (Zhu et al., 2002). Cette technique
peut conduire à des amplifications préférentielles, en particulier une meilleure amplification
des fragments courts ou des fragments pour lesquels les amorces ont une meilleure affinité.
27
Moins résolutive que l'ARISA dans l'analyse des
communautés bactériennes
Biais du signal si restriction enzymatique
incomplète
DGGE/TGGE Excision des bandes d'ADN permettant Moyennement résolutive
SSCP
Séquencage
le séquençage des gènes isolés Nécessite des amorces clampées
par électrophorèse Biais de reproductibilité des conditions de
migration électrophorétique
Ne nécessite pas d'amorces clampées Signal biaisé par un taux élevé de réappariement
des brins d'ADN
La plus haute résolution phylogénétique Complexité des données à traiter nécessitant le
recours à la bioinformatique
Permet d'identifier l'espèce Prend du temps si recours à une étape de clonage

Chapitre I: Synthèse bibliographique
Cependant ces biais de PCR semblent être d’autant moins importants que la communauté
étudiée est diversifiée (Suzuki and Giovannoni, 1996).
Comme nous l’avons vu précédemment les techniques de biologie moléculaire permettent
de décrire la diversité des communautés procaryotes à travers des méthodes de
(méta)génomique qui génèrent une liste de séquences nucléiques reflétant la composition en
espèces ou à travers des techniques d’empreinte moléculaire mettant en évidence des
variations de structure des communautés basées sur la comparaison des OTU présentes.
Cependant, avec l’essor technologique, ces jeux de données deviennent de plus en plus
complexes allant jusqu’à plusieurs centaines de milliers de séquences à analyser pour le
pyroséquencage. Mais quel poids doit-on donner à chaque séquence, à chaque OTU lorsque
l’on s’intéresse à la dynamique des patrons de diversité des communautés procaryotes ?
Quelle fraction du signal doit-on considérer: la fraction dominante, la fraction rare,
l’ensemble ? Quel seuil imposer pour discriminer une fraction dominante d’une fraction rare ?
Ce sont ces questions que de récentes études soulèvent et qui sont l’enjeu actuel des
développements méthodologiques pour le traitement de ces données.
La présence d’OTU rares et leurs rôles en écologie microbienne sont très controversés,
certains auteurs les considérant comme un artéfact du fait de leur caractère aléatoire (Kunin et
al., 2010). D’autres auteurs au contraire soutiennent l’importance de cette biosphère rare
pouvant potentiellement soutenir une fonction encore méconnue au sein des écosystèmes
(Galand, 2009; Pedros Alio, 2006; Sogin et al., 2006). Cependant Gobet et al., (2011) ont
montré par une approche « Multivariate Cutoff Level Analysis (MultiCoLA) » qu’en éliminant
35-40% des OTU rares, les patrons écologiques sont maintenus, montrant la robustesse des
l’analyse de la diversité β à la présence ou non de ces OTUs rares.
Si distinguer les OTU les plus abondantes ne présente pas de difficultés particulières,
distinguer en revanche, les OTU minoritaires peut s’avérer plus complexe en particulier si la
quantité d’ADN analysée est faible. En effet l’intensité de ces OTU peut se situer au niveau
voire en dessous de la limite de détection de la méthode. Il est donc important d’avoir recours
à une méthode de détermination de la ligne de base afin de ne pas induire d’artéfacts (bruit de
fond) dans l’analyse des données. Trois grands types de calcul de la ligne de base sont utilisés
pour des données issues des deux techniques d’empreintes moléculaires, l’ARISA et la
T-RFLP. La première méthode discrimine le bruit de fond par un calcul basé sur un
pourcentage de contribution constant (Sait et al., en 2003) où les pics (i.e. amplicons émettant
une fluorescence proportionnelle à leur abondance) ayant une abondance relative inférieure à
ce pourcentage sont éliminés. L’élimination du bruit de fond peut également être fondé sur un
28

Chapitre I: Synthèse bibliographique
calcul basé sur une intensité de fluorescence minimale (Dunbar et al., 2000). Les pics
présentant une intensité de fluorescence inférieure à cette valeur sont ainsi éliminés. Enfin
Osborne et al. (2006) émettent l’hypothèse que le bruit de fond se traduit par une relation de
proportionnalité entre le nombre d’amplicons et l’intensité de fluorescence totale. Ils
proposent alors un calcul dérivé du calcul de Sait et al. (2003) où plusieurs valeurs de
pourcentage de contribution (appelé « divisor ») sont testées a priori. Le « divisor » amenant
à la plus faible relation de proportionnalité entre la fluorescence initiale et le nombre de pics
restants est appelé « optimal divisor » et définit la valeur de la ligne de base.
Enfin, pour prendre en compte la variabilité technique de l’assignation des tailles de pics
due majoritairement aux variations entre analyses, un traitement de données appelé
« binning » peut être appliqué. Le binning consiste à assigner au sein d’un profil de taille
d’amplicon PCR, une même taille d’OTU à des amplicons présentant des tailles voisines;
l’amplitude de la gamme de taille est appelée « window size» ou taille de fenêtre. Cette taille
de fenêtre est estimée de trois manières dans la littérature : (i) de manière a priori, Brown et
al. (2005) estiment la taille de la fenêtre à 3 bp pour des fragments de taille inférieure à
700bp, 5bp pour les fragments compris entre 700 et 100bp et 10 bp pour les fragments
supérieurs à 1000bp; Hewson et al. (2006) se basent sur une fenêtre de 2 bp (ii) de manière
empirique en analysant plusieurs réplicats d’un échantillon contrôle : Ramette en 2009 met en
évidence une variation de taille d’amplicon d’une même souche contrôle de 1bp l’amenant à
appliquer une valeur de fenêtre de 2bp ou (iii) in silico à l’aide d’un algorithme implémenté
sur R (automatic binning, Ramette, 2009) qui détermine la valeur optimale de la fenêtre par
un compromis entre une forte résolution de l’analyse (valeur de fenêtre faible, nombre d’OTU
important) et une similarité élevée entre les profils étudiés (valeur de fenêtre large, nombre
d’OTU plus faible).
Si les corrections des données ont longtemps été réalisées « manuellement », le
développement de script comme l’ « interactive binner » par Ramette (2009) permet
d’automatiser le traitement de données.
Aujourd’hui, le traitement des données de diversité génétique procaryote passe donc
obligatoirement par une étape de traitement informatique plus ou moins complexe; les besoins
en bioinformatique deviennent de plus en plus croissants avec le développement des
techniques de séquençage massif.
29

Chapitre I: Synthèse bibliographique
3. Les théories expliquant la structuration des communautés procaryotes
Différentes théories, dépendantes de l’échelle d’observation à laquelle on se place, ont été
proposées afin d’expliquer la structure des communautés procaryotes.
A l’échelle globale, la théorie du cosmopolitanisme (Delong and Pace, 2001) prône
l’ubiquité des espèces procaryotes, du fait de leur fort taux de dispersion résultant du nombre
important d’individus composant les populations et du court temps de génération individuel.
La faible taille des procaryotes serait également un facteur facilitant les phénomènes de
dispersion sur de longues distances. Les faibles taux d’extinction et de spéciation de ces
organismes, limitant la diversification spécifique à l’échelle locale, viennent également
renforcer la théorie du cosmopolitanisme. Le faible taux de spéciation s’expliquerait par
l’importante plasticité génotypique et phénotypique des espèces ainsi que l’absence apparente
de barrière de dispersion et par conséquent d’isolement géographique, source de spéciation.
Cependant, selon les études de Horner-Devine et al. (2004) et de Ramette and Tiedje (2007)
certains taxons procaryotes auraient une aire de distribution plus réduite du fait d’une capacité
de dispersion moindre. Ces études mettraient ainsi en évidence une structuration spatiale de la
biodiversité procaryote.
A l’échelle locale, les assemblages des communautés procaryotes sont principalement
expliqués par deux théories. D’un côté, la théorie neutre proposée par certains écologistes
comme Hubell (2001) qui soutient que l’apparition, la migration, et l’extinction des espèces
sont les principaux facteurs contrôlant la richesse spécifique au sein d’une communauté
(Hubell, 2001; Zhou and Zhang 2008). D’autre part, la théorie de l’assemblage par la niche
écologique définie par Beijerinck (1904) reprise plus tard par Baas-Becking (1918) affirme
que seules des espèces utilisant des ressources différentes peuvent coexister au sein d’une
communauté (de Wit and Bouvier, 2006).
4. Les communautés procaryotes des sédiments benthiques marins
Au sein des écosystèmes marins, les sédiments constituent le réceptacle ultime de la
plupart des apports de matières organiques terrigènes mais également d’une large proportion
des flux de particules d’origine marine (Freese et al., 2008). Les particules organiques
sédimentaires sont soumises à d’importants processus d’altération appelés diagenèse précoce
(Figure I.3) diminuant la labilité de la matière organique le long de la colonne sédimentaire
(Berner, 1980; Canfield et al., 2005 ; Middelburg, 1989; Middelburg et al., 1993 ;
30

Chapitre I: Synthèse bibliographique
Sundby, 2006). Ces processus biogéochimiques sont contrôlés par la dégradation de la
matière organique par les bactéries et les archées à partir de différents oxydants contenus dans
les sédiments et/ou l’eau porale.
Figure I.3: Profil diagénétique dans les sédiments : minéralisation de la matière
organique (Emerson and Hedges, 2003).
Le long de la colonne sédimentaire, les communautés procaryotes vont se répartir en
fonction de i) de l’accepteur terminal d’électrons utilisé dans l’oxydation de la matière
organique et ii) du rendement énergétique du métabolisme impliqué. Ainsi de la surface des
sédiments vers le fond, un microprofil d’accepteurs d’électrons en zones dû à la distribution
des métabolismes procaryotes mis en jeu dans l’oxydation complète de la matière organique
peut-être décrit : en premier lieu l’oxygène puis la zone des nitrates, la zone des oxydes de
manganèse puis de fer, la zone des sulfates et finalement la zone du dioxyde de carbone
(Van Capellen and Wang, 1996). La minéralisation de la matière organique est l’un des
principaux mécanismes par lequel les communautés procaryotes benthiques se développent
(Middelburg and Meysman, 2007). De manière plus générale, les communautés procaryotes
du sédiment jouent un rôle écologique et biogéochimique majeur dans les écosystèmes
benthiques, du fait de leur forte abondance (>10 8 cell.g -1 ) (Montagna, 1982) et de leur grande
variété métabolique. En plus de leur implication dans le turnover de la matière organique
sédimentaire (Schmidt, 1998; Danovaro et al., 2002 ; Ikenaga et al., 2010), les communautés
31

Chapitre I: Synthèse bibliographique
procaryotes forment l’un des principaux premiers échelons du réseau trophique en contribuant
pour environ 50% de la production primaire (Benlloch et al., 1995).
Appréhender la dynamique des communautés procaryotes et les facteurs qui la
contrôlent apparait donc comme primordial pour comprendre le fonctionnement des
écosystèmes benthiques. Pourtant ce n’est que récemment que des études se sont intéressées
aux liens entre les patrons de diversité des communautés bactériennes et les paramètres
environnementaux (Bertic and Ziebis, 2009; Boer et al., 2009; Hewson et al., 2007; Ikenaga et
al., 2010; Lasher et al., 2009; Sapp et al., 2010). Et, à ce jour, excepté quelques études sur les
sédiments abyssaux (Danovaro et al., 2009) ou sur des patrons de gènes d’activités
particulières (e.g. ammonium mono-oxygénase) (Singh et al., 2010), les études sur les
communautés archéennes du sédiment restent encore très succinctes.
La diversité des communautés procaryotes des sédiments marins est décrite comme
influencée par différents facteurs environnementaux comme les conditions physiques et
chimiques du sédiment incluant la localisation géographique (Green and Bohannan, 2006), la
taille des particules sédimentaires (Jackson and Weeks, 2008), la teneur en eau (Hewson et
al., 2007), le pH et le potentiel d’oxydo-réduction (Edlund et al., 2008), la température
(Pomeroy and Deibel, 1986), la pression (Kato et al., 1998) la salinité (Crump et al., 2004;
Prieur et al.,1987) ; mais également des facteurs biotiques comme la concentration en
chlorophylle a (Polymenakou et al., 2005), la disponibilité des ressources (Rowe et al., 1991;
Torsvik et al., 2002) c'est-à-dire la quantité et/ou la qualité de la matière organique (Bissett et
al., 2007, Cammen, 1982, Polymenakou et al., 2005) la teneur en nitrates et en phosphates
inorganiques (Rubin and Leff, 2007; Ikenaga et al., 2010).
Les procaryotes sont également soumis aux pressions trophiques comme la présence
d’organismes brouteurs (Sherr and Sherr, 1994; Simek et al., 2001) ou de virus (Fuhrman,
1992; Fuhrman and Suttle, 1993; Hewson et al., 2003; Schwalbach et al., 2004; Winter et
al., 2004) régulant les dynamiques des communautés procaryotes.
La dynamique des communautés procaryotes peut également être modifiée par la
présence d’invertébrés marins pouvant par exemple faciliter la colonisation des sédiments par
les procaryotes via des mécanismes de pré digestion ou de concentration de la matière
organique dans des pelotes fécales rejetées dans les sédiments (Hanson and Tenore, 1981;
Hargrave, 1976). Mais ces invertébrés marins peuvent également controler la croissance
procaryote soit par production de substances bactéricides soit en favorisant la croissance de
certains procaryotes à activités bactéricides (Amade et al., 1987, Gonzales et al., 2007 ;
Moriaty, 1990; Romanenko et al., 2008; Parisi et al., 2008; Wardlaw and Unkles, 1978).
32

Chapitre I: Synthèse bibliographique
Parmis ces invertébrés marins, la présence d’organismes ingénieurs du sédiment
comme le polychète terebellidae Melinna palmata ou le crustacé décapode thalassinidé
Upogebia pusilla, peut également modifier les profils de diversité des communautés
procaryotes benthiques à travers des mécanismes de remaniements sédimentaires. Le transport
des particules (bioturbation) et les mouvements d’eau (bioirrigation) créent des patrons de
zonations géochimiques entrainant des changements des conditions d’oxydo-réduction et la
formation de microenvironnements (Emerson and Hedge, 2003). Ces mécanismes peuvent
influer sur la diversité procaryote via (i) une modification de la biogéochimie des sédiments
(bioirrigation, oxygénation, pH), (ii) une remise en suspension des procaryotes des sédiments
ou (iii) un enfouissement des procaryotes dans des zones anoxiques du sédiment (Aller, 1994;
Bertics and Ziebis, 2009; Kristensen and Kostka, 2005; Kogure and Wada, 2005; Lohner et
al., 2007; Marinelli et al., 2002 ; Reichardt, 1989).
D’une part, on peut distinguer l’activité des organismes de la macrofaune benthique
dont les activités de ventilation et de forage peuvent affecter la minéralisation de la matière
organique, les cycles des nutriments, les interactions biogéochimiques ainsi que les flux
benthiques et pélagiques (Rhoads, 1974; Aller, 1982, 1988, 1994; Kristensen et al., 1991,
2000; Gilbert et al., 1998, 2003; Banta et al., 1999). Ces activités peuvent par exemple
conduire à un transport de l’oxygène jusqu’à 80 cm de profondeur (Ziebis et al., 1996), alors
que la pénétration de l’oxygène due à la diffusion moléculaire n’est que de quelques
millimètres dans les sédiments côtiers non bioturbés (Revsbech et al., 1980; Glud et al.,
1994). La construction de terriers augmente également la surface des zones d’interface eau-
sédiment offrant des surfaces supplémentaires pour la colonisation et la diversification
métabolique des procaryotes (Aller and Aller, 1986; Meyers et al., 1987; Reichardt, 1989;
Grossman and Reichardt, 1991; Marinelli et al.,2002).
D’autre part, la rhizosphère des plantes marines forme un réseau dense de racines et de
rhizomes affectant fortement les processus biogéochimiques benthiques et par conséquent la
diversité de la microflore des sédiments (Duarte and Chiscano 1999; Marbà et al., 2006). En
effet une activité microbienne distincte a été observée au niveau des apex des racines à
l’échelle micrométrique. Il a été également montré que les herbiers marins libéraient du
carbone organique dissous pouvant influer de manière significative sur la composition et
l’activité microbienne associées à la rhizosphère. De forts taux de fixation de l’azote, source
de compétition entre procaryotes et plantes, ainsi qu’une augmentation des activités de
sulfato-réduction, ont également été observés au niveau des rhizosphères. L’ensemble de ces
observations mettent en évidence un lien étroit entre les communautés procaryotes et la
33

Chapitre I: Synthèse bibliographique
rhizosphère à l’échelle micrométrique (Duarte et al., 2005 ; Kristensen et al. 2005 ; Larkum et
al., 2006).
Parmi les écosystèmes marins, les écosystèmes côtiers/littoraux présentent des
particularités du fait de leur position à l’interface océan-continent. Les communautés
procaryotes qui y vivent présentent donc des spécificités et sont soumis à des règles
d’assemblages propres à ces écosystèmes. L’ensemble de ces particularités est developpé dans
la partie 6 du chapitre I.
5. Les communautés bactériennes associées aux invertébrés marins benthiques
5.1 Généralités
Les invertébrés marins sont les hôtes d’une flore procaryote abondante et diversifiée,
formant un ensemble de communautés bactériennes et archéennes associées (Cavanaugh,
1994 ; Haygood et al., 1999). On peut distinguer trois voies d’acquisition de cette flore par les
invertébrés (Figure 4) (Dubilier et al., 2008; Bright and Bulgheresi, 2010): (i) la transmission
verticale c'est-à-dire la transmission des parents à la descendance qui se fait via
l’incorporation des procaryotes à la surface ou au sein des gamètes ; (ii) la transmission
horizontale par acquisition de procaryotes entre hôtes contemporains indépendamment des
mécanismes de reproduction ; (iii) la transmission latérale c'est-à-dire l’acquisition de la flore
directement via l’environnement à travers des mécanismes actifs de filtration ou
d’enfouissement ou de manière passive par simple balnéation dans un environnement
septique.
34

Modes d’acquisition
Interactions
Chapitre I: Synthèse bibliographique
Les communautés procaryotes d’un invertébré marin
Commensalisme ou
parasitisme bénin
(Flore de transit)
Transmission
latérale
Transmission
horizontale
Tube digestif Autres tissus
Relation trophique
(Flore du bol
alimentaire)
Figure I.4 : Communautés procaryotes associées à un invertébré : mode de transmission
et interaction flore associée/hôte
L’habitat, et en particulier la voie trophique, pourraient représenter le principal
déterminant de la composition des communautés procaryotes associées aux invertébrés marins
benthiques. En effet, ceux-ci se nourrissent entre autres de microorganismes planctoniques et
de microorganismes benthiques remis en suspension à l’interface sédiment - colonne d’eau
par des mouvements hydrodynamiques. Au niveau du système digestif, les procaryotes ainsi
ingérés peuvent être (i) lysés et absorbés (bol alimentaire), (ii) simplement transiter et être
rejetés dans les sédiments via les fèces, après prolifération ou non dans le système digestif
(bactéries allochtones) (ii) ou former une flore permanente et/ou intimement liée à l’épiderme
appelée flore résidente (bactéries autochtones) (Harris, 1993; Romero et al., 2002).
Au niveau des autres tissus, les communautés procaryotes associées sont formées d’un
consortia de taxons présentant des interactions symbiotiques plus ou moins étroites (endo- ou
ecto-symbiontes) et plus ou moins bénéfiques (mutualisme, commensalisme, parasitisme)
susceptibles d’affecter la fitness de l’hôte (Cavanaugh 1994). Le terme « symbiotique » est
utilisé dans le sens proposé par Taylor et al. (2007) et se réfère à deux ou plusieurs
35
Transmission
verticale
Mutualisme,
parasitisme
(Flore résidente)
X
Toutes interactions
jusqu’à l’endosymbiose
(Flore associée)

Chapitre I: Synthèse bibliographique
organismes associés vivant en sympatrie durant une longue période, sans impliquer de notions
de bénéfice ou de nuisance les uns envers les autres.
Ces interactions ne sont pas récentes puisqu’on estime la présence d’endosymbiontes chez
les éponges dès leur apparition au Précambrien. Les micro-organismes les plus étroitement
associés présentent donc une longue histoire évolutive commune avec leurs hôtes (Taylor et
al., 2007). C’est l’une des raisons pour laquelle, les communautés procaryotes des éponges
sont actuellement les plus étudiées. Au sein des éponges on dénombre en moyenne 10 8 à 10 10
bactéries par gramme de tissu frais ce qui peut représenter jusqu’à 40 % de la biomasse totale
de l’éponge conduisant certains chercheurs à parler de « bactériosponges » (Vacelet and
Donadey, 1977; Henstchel et al., 2006). L’étude de ces organismes a permis la découverte
d’un nouveau phylum bactérien baptisé « Poribacteria » signifiant étymologiquement
bactéries des éponges (Fieseler et al., 2004). De nombreuses archées symbiontes des éponges
marines ont également été caractérisées (Lee et al., 2003). Si les symbiontes acquis par
transmission verticale comme Zooxanthella sont présents dès les premiers stades de
l’évolution, une dynamique des patrons de diversité a également été mise en évidence par la
présence de ribotypes distincts à chaque stade de l’évolution. En effet, les symbiontes
transmis horizontalement ne sont souvent pas internalisés avant le développement complet de
la planula (Apprill et al., 2009). Il est possible que ces symbiontes particuliers jouent un rôle
important dans le recrutement benthique (Apprill et al., 2009). On aurait alors une succession
de processus qui conduirait au remplacement graduel des symbiontes des juvéniles au profit
des symbiontes des adultes. Le corail est également un modèle d’étude pertinent pour
comprendre les interactions entre les invertébrés et leurs communautés procaryotes. L’étude
de 3 espèces différentes de corail, révélant la présence de 6000 ribotypes associés, a montré
l’extrême diversité des communautés procaryotes coralliennes (Rohwer et al., 2002). La
plupart des espèces procaryotes associées au corail sont décrites comme appartenant à la
biosphère rare (Sogin et al., 2006).
De manière plus générale, aucun organisme marin n’a été décrit à ce jour comme ne
présentant pas de communautés procaryotes associées. Les bryozoaires (Zimmer and
Woollacott, 1983), les isopodes marines (Zimmer et al., 2001), les crabes (Rameshkumar et
al., 2009), les crustacés (Meziti et al., 2010), les gorgones (Harder et al., 2003) sont quelques
exemples déjà décrits illustrant la diversité des organismes qui hébergent une large diversité
de procaryotes.
Quelques chercheurs se sont penchés sur deux problématiques : (i) l’hôte est-il capable de
réguler ces communautés associées, face aux variations de l’environnement ? (ii) Existe-il des
36

Chapitre I: Synthèse bibliographique
procaryotes associés, hôtes dépendants ? La composition des communautés bactériennes du
corail vivant serait différente de celle du corail mort mais également de celle de l’eau
environnante suggérant une capacité de sélection de la part de l’hôte (Hansson et al., 2009).
Certaines ribotypes bactériens ont été retrouvés chez une espèce hôte du Panama et chez la
même espèce hôte présente aux Bermudes (Rohwer et al., 2002). Il a également été démontré
chez le corail Lophelia pertusa la présence de bactéries tissus dépendantes, comme
candidatus Mycoplasma corrallicola sur l’ectoderme des tentacules et quelques espèces
endodermiques de la cavité gastrique (Neulinger et al., 2009). Ces observations suggèrent
donc, chez certains invertébrés marins, un déterminisme d’hôte des communautés procaryotes
associées. Mais il a également été observé que certains procaryotes associés à Lophelia
pertusa variaient de manière dépendante de conditions environnementales régionales
(Schöttner et al., 2009). Il existe également des ribotypes associés à une même espèce
d’invertébré marin qui diffèrent selon la région géographique (Klaus et al., 2005; Littman et
al., 2009). Ces observations suggèrent donc un déterminisme d’habitat pour certaines
communautés procaryotes.
D’un point de vue fonctionnel, les communautés procaryotes semblent participer à la
digestion de la nourriture, comme montré chez la larve de l’huitre creuse Crassostrea gigas
(Prieur et al., 1990) mais aussi semblent procurer des facteurs de croissance (vitamines, acides
aminés) comme montré chez la palourde Calyptogena magnifica (Newton et al., 2008). Chez
les éponges, les symbiontes interviendraient dans les cycles biogéochimiques, incluant (i) la
fixation du carbone via la photosynthèse (cyanobactéries symbiotiques) (Wilkinson, 1983),
(ii) la nitrification (Corredor et al., 1988 ; Diaz and Ward, 1997), (iii) la fixation de l’azote
(Shieh and Lin, 1994 ; Wilkinsons et al., 1999), (iv) le métabolisme de l’azote secrété par
l’éponge et ses autres symbiontes (Hoffmann et al., 2009) ainsi que (v) le métabolisme
anaérobie comme l’anammox (Hoffmann et al., 2005). Certaines archées se transmettant par
transmission verticale via les larves d’éponges (Sharp et al., 2007; Steger et al., 2008) seraient
capables de réaliser l’oxydation de l’ammonium (Holmes and Blanch, 2007). C’est également
grâce à la présence de leurs communautés procaryotes que des mollusques, vivant sur le bois,
comme les tarets (ex : Teredo navalis) peuvent s’en nourrir. En effet, les bactéries
endosymbiontes de leurs branchies possèdent des enzymes (cellulase, nitrogénase) permettant
la digestion de la cellulose et la supplémentation du régime alimentaire de l’hôte, déficitaire
en azote (Norman, 1977; Waterbury et al., 1983 ; Distel, 2003 ; Zurel et al., 2011). Le rôle
fonctionnel des communautés procaryotes est particulièrement bien décrit chez le corail
(Mouchka et al., 2010). Certaines bactéries symbiotiques associées au mucus fourniraient une
37

Chapitre I: Synthèse bibliographique
protection contre les pathogènes au moyen de compétition interspécifique. En effet elles
occuperaient de manière préférentielle des niches du fait de leur rapide taux de croissance
empêchant ainsi l’installation d’autres bactéries (Mouchka et al., 2010). D’autres bactéries
seraient capables de sécréter certains antibiotiques comme mécanismes de défenses contre les
bactéries libres incluant les bactéries potentiellement pathogènes (Castro et al., 2002;
Ritchies, 2006). Les bactéries associées au corail incluant celles dans les tissus auraient une
fonction équivalente à celle du système immunitaire (hypothèse des bactéries probiotiques)
(Reshef et al., 2006). Les changements de diversité bactérienne pourraient donc affecter la
fitness du corail. En effet des phénomènes de blanchiment des éponges ont été observés dus à
la perte partielle ou totale des cyanobactéries associées (Vicente, 1990; Gammill and Fenner,
2005). La perte des symbiontes est souvent en lien avec des changements de conditions
environnementales comme la température (Webster et al., 2008).
5.2 Communautés bactériennes associées aux bivalves
Parmi les invertébrés marins, les bivalves fouisseurs comme la coque (Cerastoderma
edule) et la palourde (Ruditapes philippinarum) sont susceptibles d’avoir un impact important
sur les communautés procaryotes benthiques, du fait de leur double compétence, la remise en
suspension des sédiments par bioturbation et leur fort taux de filtration à l’interface eau-
sédiment. En effet il a été démontré en écosystème lacustre, une augmentation de la diversité
métabolique et de l’activité des micro-organismes par la présence de la moule zébrée
Dreissena (Lohner et al., 2007) mais également une stimulation des activités bactériennes de
nitrification, dénitrification ou de production d’ammonium en présence du bivalve Malcoma
balthica (Henriksen et al., 1983). Par ailleurs une augmentation de la richesse taxonomique
des biofilms estuariens est également observée en présence de récifs d’huîtres (Nocker et
al., 2004).
En tant que filtreurs, les bivalves marins sont également connus pour abriter une
grande variété de micro-organismes (parasites, virus, champignons, bactéries), micro-
organismes largement étudiés car responsables de toxi-infection chez l’homme (Mason and
McLean,1962) et d’altérations chez les bivalves (Farley, 1972; Alderman et Jones, 1969;
Bricelj et al., 1992). Parmi ces micro-organismes, les bactéries ont été plus particulièrement
étudiées. Ainsi, une abondante littérature rapporte l’occurrence de bactéries pathogènes pour
l’homme chez les bivalves (e.g. Clostridium botulinum, Salmonella sp., Vibrio
parahaemolyticus) mais également la présence de bactéries indicatrices de contamination
38

Chapitre I: Synthèse bibliographique
fécale (e.g. Escherichia coli) chez l’huître (Perry and Bayliss, 1936 ; Perreira et al., 2006), la
coque (Nicholson et al., 1989; Martinez et al., 2009) ou la palourde (Hood et al., 1983 ;
Hayati Hamdan et al., 2008). La détection d’Escherichia coli dans des palourdes issues de
sites contaminés et leur disparition quelques jours après la fin de l’épisode de contamination
suggère une relation dynamique entre la microflore des palourdes et celle de leur
environnement (Serais et al., 2010). Les bactéries sont également impliquées dans des
épisodes de mortalité massive de bivalves à l’état de larves (McGladdery, 1999; Sindermann,
1990; Paillard et al., 2004) ou dans le développement de pathologies comme la nocardiose
chez l’huître du Pacifique Crassostrea gigas (Friedman et al., 1998) et la maladie de l’Anneau
Brun chez la palourde japonaise Ruditapes philippinarum (Paillard et al., 2004). Les bactéries
impliquées sont le plus souvent des espèces à Gram négatif (Prieur et al., 1990). Le genre
Vibrio est le plus impliqué dans les mortalités de palourdes (Paillard et al., 2004). Ces
bactéries sont largement répandues dans les environnements aquatiques à travers le monde ;
elles sont « communes » dans les eaux chaudes, particulièrement quand la température est
proche de 17°C, et suivant les espèces, il existe une gamme de tolérance en salinité (Wright et
al., 1996). Bien que la littérature soit riche de travaux portant sur l’étude des pathologies de
mollusques et des agents infectieux associés pour les pathologies déclarées, il n’existe que
très peu de travaux faisant état de connaissances sur l’abondance et/ou la diversité de la
microflore procaryote (bactéries, archées) associée aux bivalves marins. Tanaka et al. (2004)
ont montré que la flore intestinale de l’abalone était très diversifiée, variable selon le régime
alimentaire et composée d’α, γ, et ε-Protéobactéries, de Fusobacteria et de Mollicutes. Si
certaines espèces associées affectent négativement la fitness des bivalves comme les bactéries
endoparasites qualifiées de « Mycoplasma-like » (Azevedo, 1993) et de « Rickettsia-like »
(Carballal et al., 2001), d’autres au contraire ont co-évolué avec les bivalves à travers des
relations bénéfiques. En effet, quelques études plus récentes montrent que des interactions
bactéries – bivalve peuvent s’avérer bénéfiques pour les deux partenaires chez des espèces
comme Codakia orbicularis et Myrtea sp. (Caro et al., 2007; Brissac et al., 2011) ou Solemya
velum (Scott and Cavanaugh, 2007). Dans ces symbioses mutualistes, des bactéries chimio-
autotrophes proliférant dans des cellules de la branchie appelées bactériocytes,
consommeraient les sulfures présents dans l'eau interstitielle du sédiment grâce à l’activité de
filtration de l'animal. En retour, ce dernier se nourrirait, au moins partiellement, du carbone
bactérien ainsi édifié en hydrolysant les bactéries du bactériocyte, et bénéficierait
indirectement de l’activité de détoxification des sulfures liée à l’activité bactérienne (Caro et
al., 2009).
39

Chapitre I: Synthèse bibliographique
De manière générale, les interactions entre les bivalves et leurs communautés procaryotes
associées semblent être diversifiées et complexes mais les connaissances sur la dynamique de
ces communautés procaryotes, la nature des interactions et les mécanismes d’acquisition de
ces communautés restent encore très sommaires.
6. Les zones de transition: un modèle d’étude pertinent pour l’étude de la
dynamique des patrons structuraux des communautés procaryotes
6.1 Généralités
Les zones de transition côtières sont des écosystèmes situés à l’interface océan-continent.
Parmi ces zones, on peut distinguer d’une part les embouchures de fleuves soumises aux
intrusions d’eau de mer liées aux phénomènes de marée et appelées estuaires; et d’autre part
les lagunes, des étendues d'eau plus ou moins saumâtres généralement peu profondes séparées
de la mer par un cordon littoral (Pérez-Ruzafa et al., 2011). L’hydrochimie des zones de
transition est directement liée à l’importance de la contribution des apports des bassins
versants et des apports océaniques. Ainsi s’établissent, des zones continentales vers les zones
océaniques, de nombreux gradients physiques et chimiques, comme la salinité, la température
des masses d’eau, les teneurs en sels nutritifs, en oxygène et en matière organique plus ou
moins labile influant sur les assemblages des organismes y vivant (e.g. poissons, macro-
invertébrés, procaryotes …) (Weinstein et al.,1980; Rakoconski et al., 1992 ; Giovannoni et
al., 1990 ; Crump et al., 2004 ). Ces gradients peuvent générer une forte hétérogénéité spatiale
et de ce fait une grande diversité γ et une forte diversité β entre les communautés au sein
d’habitats contrastés.
L’importance des vents dominants, associés à la circulation des masses d’eaux
(marées, débit des affluents, courants transverses …) entraine un taux journalier de
renouvellement des masses d’eau important, renforcé par les faibles hauteurs d’eau. Les taux
de sédimentation et d’évaporation élevés, couplés aux courants tidaux entraînent une anoxie
rapide des sédiments dès les premiers millimètres de profondeur (Danovoro and Pusceddu,
2007 ; Borin et al., 2009). Les faibles hauteurs d’eau ne permettent pas une minéralisation
complète de la matière organique au sein de la colonne d’eau entrainant une accumulation
importante de matière organique à la surface du sédiment qui constitue alors pour ces
écosystèmes, le lieu prépondérant de la minéralisation de la matière organique et du recyclage
des nutriments (Nedwell, 1984). Ces écosystèmes très productifs sont souvent dominés par
40

Chapitre I: Synthèse bibliographique
des macrophytes (e.g. Spartina spp. and Zostera spp.) et des macroalgues (e.g. Ulva spp.)
(Newell, 1982). La production primaire est excédentaire, et surpasse les capacités de
consommation par les herbivores ; la matière organique produite par la production primaire
devenant donc disponible pour les consommateurs. Lorsque les apports en matière organique
vers les sédiments excèdent les capacités d’utilisation des consommateurs, ils sont accumulés
dans les sédiments. Une grande partie de cette matière organique est réfractaire et donc non
consommable directement par les consommateurs (Pusceddu et al., 2003). De ce fait elle doit
être fragmentée pour entrer dans les hauts niveaux trophiques. Cette fonction clé est assurée
par les procaryotes benthiques (Tibbles et al., 1992; Fiordelmondo et al., 2003; Manini et
al., 2003).
D’autres part, ces écosystèmes fournissent d’importants services: régulation des
hauteurs d’eau limitant les inondations, stabilisation du littoral, rétention de nutriments et de
sédiment, qualité des eaux, réservoirs de biomasses et de biodiversité, zones récréatives et
touristiques (Levin et al., 2000; Moss, 2000). La valeur de leur potentiel économique a été
estimée à au moins 22.000 US dollars ha -1 an -1 (Costanza et al., 1997). Mais de ce fait ces
zones sont soumises à de nombreuses perturbations d’origine anthropique (Nogales et
al., 2007) liées au développement de l’ensemble des activités économiques (tourisme,
agriculture, industrie, pêche, urbanisation…). Ces perturbations peuvent être de différentes
natures, (i) enrichissement en matière organique d’origine allochtone, (ii) apport de pollutions
biochimiques (nitrates, nitrites, ammonium), (iii) apport de communautés allochtones (apports
de procaryotes via le rejet des eaux usées) ou (iv) modification physique de l’habitat (e.g.
endiguement, draguages). La dynamique des communautés procaryotes benthiques peut donc
être influencée par ces différentes perturbations (ou ces différents apports abiotiques et/ou
biotiques).
6.2 Les communautés procaryotes des zones de transition
6.2.1 Généralités
Au sein de ces environnements, les procaryotes et en particulier les procaryotes
benthiques jouent un rôle clé dans la reminéralisation de la matière organique permettant le
recyclage des nutriments nécessaire à la production primaire et représentant une importante
source trophique pour les brouteurs benthiques (Alongi, 1994).
41

Chapitre I: Synthèse bibliographique
Comme nous venons de le voir, les écosystèmes de transition se caractérisent par une
hydrodynamique importante et divers gradients biologique, physique et chimique. Il en résulte
donc, d’une part, d’importants phénomènes de dispersion des micro-organismes selon la
théorie du cosmopolitanisme ou « everything is everywhere » appliquée à l’échelle locale ; et
d’autre part, une structuration par l’environnement des communautés microbiennes le long
des gradients (de Wit, 2007). Aux communautés autochtones viennent s’ajouter de manière
transitoire, des communautés allochtones issues des apports océaniques et continentaux. Ces
communautés, bien qu’en conditions non-optimales, peuvent survivre voire se développer
lentement au sein des zones de transition et de ce fait participer au fonctionnement
biogéochimique de l’écosystème (Figure I.5).
Figure I.5 : Représentation des assemblages microbiens en zone de transition (de Wit,
2007).
Au sein de la colonne d’eau, les communautés procaryotes de ces écosystèmes
estuariens, peuvent présenter des populations « niche-dépendant » mais également des
populations capables de coloniser une large diversité d’habitats (e.g. plus ou moins saumâtres,
plus ou moins anoxiques …) comme décrits par la théorie neutre (Giovannoni et al., 1990;
Morris et al., 2002; 2004).
En revanche au niveau de l’habitat sédimentaire, les connaissances se réduisent à
certains groupes fonctionnels particuliers, les bactéries sulfato-réductrices (Devereux and
Mundfrom, 1994) ou les réducteurs d’acides humiques (Coates et al., 1999) et à certains
environnements particuliers comme les sédiments sulfidogéniques (Gray and Herwig, 1996),
42

Chapitre I: Synthèse bibliographique
oxiques (Li et al., 1999) ou les vases des écosystèmes tropicaux (Madrid et al., 2001; Todorov
et al., 2000).
Dans ce type de zone de transition la diversité procaryote est fonction de la salinité et
en particulier de la variation temporelle de ce paramètre (Prieur et al., 1987, Crump et al.,
2004 ). Par exemple, Dale et al. (2009) ont montré que les bactéries réalisant l’oxydation
anaérobie de l’ammonium (ANAMMOX) y étaient particulièrement sensibles : les bactéries
du genre Scalindua présentent un caractère ubiquiste, et sont adaptées aux fortes comme aux
faibles salinités et sont résistantes aux variations saisonnières. Au contraire celles du genre
Brocadia et du genre Kuenenia ne semblent être adaptées qu’aux environnements
dulçaquicoles à oligohalins pour le premier et qu’aux environnements salins pour le second.
6.2.2 Principal modèle d’étude : les communautés procaryotes du Bassin
d’Arcachon
6.2.2.1 Présentation du Bassin d’Arcachon
Bordant la côte atlantique française, le Bassin d’Arcachon est un écosystème lagunaire
de régime macrotidal situé à l’interface océan-continent. Il est donc le lieu d’un important et
permanent échange d’eau entre l’Océan Atlantique et le continent ; la circulation d’eau se
faisant via un réseau de chenaux, « les passes », à une vitesse moyenne de 2m/s soit 130
millions à 400 millions de m 3 d’eau échangés par marée. Le Bassin d’Arcachon est le
réceptacle de 3,45 millions de m 3 d’eau douce par jour apportés principalement par la Leyre
un affluent localisé dans la partie sud-est du bassin. Ces flux d’eau ainsi que son
hydrodynamique, entraînant un faible renouvellement de ses eaux internes, induisent la
formation de gradients de température et de salinité au sein du bassin (Bouchet, 1968; Fenies,
1984; Gassiat,1989 ; Auby,1991; D’Elbee et Castel 1995; Plus et al., 2009).
La zone intertidale de la lagune, représentant environ deux tiers de la surface totale
(110 km 2 ), est constituée de sédiments sableux à sablo-vaseux, principalement recouverts par
un herbier à zostère naine, Zostera noltii, considéré comme l’un des plus vastes herbiers de
phanérogames d’Europe avec une surface de près de 45,64 km 2 en 2007 (Auby et al., 2011).
Zostera noltii est une magnoliophyte largement répandue dans l'Atlantique Nord, de la Suède
jusqu'à la Mauritanie. Cette angiosperme est l’un des principaux producteurs primaires de cet
écosystème (Auby and Labourg, 1996), et est également décrite par Blanchet (2004) comme
espèce structurant les communautés de macro-invertébrés. Les fonds des différents chenaux
43

Chapitre I: Synthèse bibliographique
sont quant à eux tapissés par la zostère marine Zostera marina. Les herbiers sont importants
puisqu’ils interviennent en tant que stabilisateur de leur substrat en réduisant les contraintes
hydrodynamiques qui s’appliquent au niveau des sédiments et en limitant les effets de
l’agitation de l’eau sur le taux de remise en suspension des particules fines (Fonseca 1996 ;
Gacia and Duarte, 2001 ; Neumeier, 2007).
Le Bassin d’Arcachon est également un écosystème très productif qui permet une
exploitation de la ressource biologique, essentiellement orientée vers la conchyliculture
(16600 tonnes d’huîtres cultivées en 2009). Par ailleurs, on trouve de nombreux bivalves
d’intérêts économique et écologique dans le bassin : récifs d’huîtres sauvages (65177 tonnes
en 2010), palourdes (5773 tonnes en 2010), coques (tonnage non répertorié), moules (790
tonnes en 2011) ou encore crépidules (318 tonnes en 2011).
Ces caractéristiques font du Bassin d’Arcachon un site à fort intérêt socio-
économique, touristique et écologique. Il apparait donc comme un modèle d’étude pertinent
pour étudier la qualité d’un tel écosystème ainsi que le fonctionnement biologique de l’habitat
benthique et en particulier celui des communautés procaryotes y résidant.
6.2.2.2 Les procaryotes du Bassin d’Arcachon
Les procaryotes du Bassin d’Arcachon ont fait l’objet d’études préalables en
particulier dans le cadre de deux grands projets européens, le programme CLEAN (The
Coastal Lagoon Eutrophication and ANaerobic processes research programme, 1991-1994,
Responsable, P. Caumette) et le programme ROBUST (The ROle of BUffering capacities in
STabilising coastal lagoon ecosystems, 1996-1999, Responsable, R. de Wit), qui se sont
intéressés à la charge bactérienne des sédiments ainsi qu’à la diversité taxonomique et à la
diversité fonctionnelle des communautés procaryotes de cet écosystème.
Au sein de cet écosystème, il a pu donc être mis en évidence que la densité totale en
bactéries est plus importante dans les sédiments des estrans nus que dans ceux des estrans
colonisés par l’herbier à Zostera noltii. Cette différence de charge bactérienne pourrait être
due à la compétition entre les bactéries et les zostères, pour les ressources en matière
organique (Caumette, 1996). Une diminution progressive de la charge bactérienne en fonction
de la profondeur a été observée, dans les sédiments nus, et expliquée par l’accumulation de
matière organique provenant de la colonne d’eau à la surface des sédiments (Caumette, 1996).
En revanche, les communautés bactériennes présentaient une abondance maximale dans la
zone comprise entre 1 et 3 cm de profondeur, zone correspondant à la rhizosphère des
44

Chapitre I: Synthèse bibliographique
herbiers. Les racines sont à la fois une source de matière organique labile et jouent également
un rôle important dans le remaniement sédimentaire, favorisant la pénétration de la matière
organique vers les couches plus profondes du sédiment (Caumette, 1996).
La composition en espèces des procaryotes du sédiment, a également été caractérisée
au niveau d’une zone centrale du Bassin d’Arcachon (Ile aux Oiseaux) colonisée par de
l’herbier à Zostera noltii. D’une part, Benlloch et al. (1995) se sont intéressés à la diversité
des bactéries cultivables via une méthode de clonage/séquençage à partir d’ADN issu de
colonies isolées sur gélose nutritive marine. Ces auteurs ont mis en évidence la dominance des
Cytophaga, des Flexibacter et des Bacteroides, groupes ayant un rôle important dans le
turnover de la matière organique. Les α Protéobactéries étaient également très représentées.
Les SAR11, marine group A de Fuhrman ainsi que des bactéries d’origine continentale
(Gram+ et groupe de bactéries du sol nouvellement décrit par Liesch and Stockebrand en
1992) étaient également présentes bien que plus faiblement représentées. D’autre part,
Cifuentes et al., (2000) par une méthode de clonage/séquençage à partir cette fois ci, d’un
extrait d’ADN issu d’un échantillon de sédiment, ont mis en évidence huit grands taxons
bactériens: les α, β, δ, ε, et γ Protéobactéries, les Cytophaga, les Spirochètes et les Gram+ à
haut pourcentage GC. Contrairement à l’étude portant sur les bactéries cultivables de
Benlloch et al. (1995), cette étude a montré la dominance des δ Protéobactéries (44% des
clones) dont 36% présentaient la capacité de réduire les sulfates. Ces bactéries sulfato-
réductrices (BSR) appartenaient aux genres ou espèces Desulfospina joergensenii,
Desulfocapsa sulfoexigens, Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfobacula et Desulfobacterium.
Les γ Protéobactéries dont des Pseudomonas, des Aeromonas et des Photobacterium,
formaient le second groupe dominant (27% des clones). Parmi les quinze clones d’archées
présents, cinq ont été identifiés comme des Crenarchées dont trois proches de Crenarchaeum
symbiosum et deux proches de clones environnementaux des sources chaudes de Yellowstone
(USA).
Un intérêt a également été porté sur deux activités biogéochimiques clés dans le
fonctionnement de cet écosystème, la sulfato-réduction et la fixation de l’azote, via
l’utilisation de techniques culturales. Les BSR étaient abondantes aussi bien en présence
qu’en absence d’herbier (2.10 7 bactéries par cm 3 de sédiments), particulièrement dans les deux
premiers centimètres qui hébergaient 90% des BSR totales. Les BSR sont les témoins de la
richesse en matière organique du milieu. D’autres groupes ayant une implication dans le cycle
du soufre étaient également représentés : (i) les colorless sulfur bacteria, très abondantes dans
le milieu (10 9 bactéries par cm 3 de sédiment) et majoritairement présentes dans les deux
45

Chapitre I: Synthèse bibliographique
premiers centimètres du sédiment (99.5%), (ii) les phototrophic sulfur bacteria, faiblement
représentées par rapport aux colorless sulfur bacteria et également majoritairement présentes
dans les deux premiers centimètres des sédiments (90%) et (iii) les purple sulfur bacteria qui
sont des bactéries phototrophes anoxygéniques. Plusieurs nouvelles espèces de bactéries
pourpres comme Thiorhodococcus minus (Guyonaud et al., 1997) ou Roseospira marina
(Guyonaud et al., 2003) ont d’ailleurs été découvertes et décrites pour la première fois, dans
les sédiments anoxiques du Bassin d’Arcachon. Aucune green sulfur bacteria n’a été détectée.
Ces bactéries ne supportant pas l’oxygène, leur développement pourrait être inhibé par des
apports importants en oxygène via les mouvements tidaux (Caumette, 1996). La fixation de
l’azote a également été étudiée au niveau de l’herbier du Bassin d’Arcachon. Elle est décrite
comme faible (10 2 à 10 4 bactéries par mL de sédiments) par rapport aux autres écosystèmes
côtiers colonisés par des phanérogames marines (>10 6 bactéries par mL de sédiments). Les
BSR ont été décrites comme les principaux microorganismes responsables de la fixation de
l’azote (plus de 75% de l’activité). La croissance limitée des bactéries fixatrices d’azote
pourrait provenir (i) d’une faible épaisseur de la zone oxique dans les sédiments, (ii) d’une
faible teneur en ammonium de l’eau surnageante, (iii) de la compétition pour l’ammonium
entre les bactéries hétérotrophes et les micro-organismes phototrophes, (iv) de la compétition
pour l’ammonium et pour l’oxygène avec les plantes marines (v) de l’hydrodynamisme et/ou
de la bioturbation, qui remettent en suspension des bactéries ou les enfouissent dans des zones
anoxiques du sédiment, et enfin (vi), de l’inhibition à basse mer de cette activité par les hautes
températures et par la lumière (Caumette, 1996).
Bien que ces projets apportent une première analyse du fonctionnement microbien de
cet écosystème, l’état des connaissances sur les procaryotes du Bassin d’Arcachon reste
toutefois succinct. En effet, la plupart des approches ne concernaient que la fraction
bactérienne cultivée. De plus, aucune étude ne s’est pour le moment interrogée sur la structure
des communautés procaryotes incluant les communautés archéennes à l’échelle de
l’écosystème, bien que l’importance de comprendre les liens entre la diversité procaryote et le
fonctionnement des écosystèmes de transition soit soulignée dans plusieurs études de Wit
(2007; 2008).
46

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CHAPITRE II:
Patrons spatiaux de diversité génétique des
communautés procaryotes du sédiment en zone
littorale
63

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
La caractérisation des patrons de diversité des communautes procayotes est une étape
clé en écologie pour comprendre les facteurs qui structurent ces communautés. Les
procaryotes forment un groupe dominant sur Terre (Whitman et al., 1998; Forney et
al., 2004), et soutiennent un grand nombre de processus écologiques : minéralisation de la
matière organique, production primaire, par exemple (Bissett et al., 2007; Crump et al., 2004;
Hewson et al., 2006 ; Ikenaga et al., 2010; Rubin and Leff, 2007). Pourtant les lois qui
régissent la distribution des procaryotes sont encore peu connues et plusieurs théories
généralisatrices sur les modalités d’assemblage des communautés s’affrontent
(e.g. Langenheder and Szekely, 2011). Du fait de leur taille microscopique et de la spécificité
de leur mode de prolifération (dynamique des populations, plasticité métabolique) mais
également de leur appréhension, en écologie, comme des groupes fonctionnels (e.g. bactéries
dénitrifiantes, bactéries sulfato-réductrices), les procaryotes ont longtemps été considérés
comme des organismes à part. Les théories écologiques sur la distribution des macro-
organismes ne pouvaient donc, pensait-on, s’appliquer aux procaryotes. Au début du XX ème
siècle, les travaux de Beijerinck (1911) repris par Baas-Becking (1930), aboutissent à un
axiome toujours discuté « everything is everywhere but the environment selects » (de Wit and
Bouvier, 2006). Cette affirmation postule que les procaryotes ont un effectif et une capacité
de dispersion importante qui rend possible leur présence dans n’importe quel environnement,
mais que les contraintes environnementales locales ne favorisent que certaines espèces. La
sélection par l’environnement (species sorting) à l’échelle locale est communément admise
(exemple de la colonne de Winogradsky). Mais le débat oppose d’une part, la théorie de
l’assemblage par la niche qui soutient que des espèces ne peuvent vivre ensemble au sein
d’une communauté que si elles diffèrent entre elles dans l’utilisation des ressources et d’autre
part, la théorie neutre qui soutient que les assemblages relèvent d’un ensemble de
phénomènes complexes (extinction, immigration, spéciation …) incluant également une
composante aléatoire (Hubbell, 2001). En revanche, l’ubiquité des espèces à l’échelle globale
(« everything is eveywhere ») repris par Delong et Pace en 2001 sous le nom de théorie
cosmopolite, est beaucoup plus débattue. En effet, l’avènement de la biologie moléculaire a
permis de relancer l’étude de la diversité procaryote avec une capacité analytique
indéniablement plus adaptée (cultivables et non-cultivables, cadence de traitement des
échantillons). Contredisant l’idée d’un cosmopolitisme des espèces procaryotes, des études
suggèrent l’existence d’une biogéographie de ces espèces c'est-à-dire l’existence d’une
dispersion des espèces soumises à des barrières géographiques conditionnant leur spéciation.
Ce processus produisant une répartition inégale des espèces (ici les OTU) dans l’ensemble des
65

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
biotopes est perceptible expérimentalement, par une augmentation de la dissimilarité des
communautés procaryotes en fonction de la distance géographique notamment (Green and
Bohannan, 2006; Fulthorpe et al., 2008). Une « aire de répartition » serait donc observée, bien
que plus faible et plus difficile à mettre en évidence que chez les macro-organismes (Green
and Bohannan, 2006). Cependant, les connaissances sur la biogéographie des communautés
procaryotes est encore limitée et en particulier dans les sédiments benthiques côtiers.
chapitre.
C’est dans ce contexte que nous avons développé les travaux présentés dans ce
Références
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Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
1. Dynamique spatiale inter-habitat des procaryotes d’un sédiment de
surface à l’échelle d’un écosystème
Cette première partie s’intéresse à la dynamique spatiale inter-habitat de la structure
génétique des communautés procaryotes peuplant les sédiments de surface. Le Bassin
d’Arcachon apparait comme un bon modèle pour étudier les patrons spatiaux des
communautés procaryotes et les règles générales d’assemblage des communautés. En effet cet
écosystème est une zone d’écotone entre les écosystèmes marins côtiers (Golfe de Gascogne)
et les écosystèmes continentaux aquatiques et terrestres (bassins versants de ses affluents dont
La Leyre). Cette zone d’interface océan-continent est géographiquement délimitée et orientée
par l’entrée des masses d’eau marine sous l’influence du flux tidal à l’ouest, et une entrée
principale d’eau continentale à l’est. On y décrit traditionnellement un gradient de
confinement croissant d’ouest en est. C’est enfin une zone de sédimentation où les processus
benthiques intègrent le fonctionnement hydrobiogéochimique de la lagune.
Pour cette étude, nous avons saisi l’opportunité de coupler nos mesures à celles d’une
étude visant à améliorer notre connaissance de l’origine et de la qualité de la matière
organique au sein des sédiments de la lagune, cause attendue de la structuration des
communautés que nous étudions.
Ce travail est présenté sous forme d’un projet d’article en préparation pour publication.
67

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
68

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
TITLE: Bacterial and archaeal diversity patterns in the Arcachon Bay’s
surface sediments
Author names:
Guillaume Meisterhans 1 , Florence Jude-Lemeilleur 1 , Sophie Dubois 1 , Natalie Raymond 1 , Martin Plus 2 , Hugues Blanchet 1 , Antoine Grémare 1 ,
Nicolas Savoye 1 , Frédéric Garabetian 1
1 Université de Bordeaux UMR 5805 EPOC Bordeaux F-33000 France.
2 IFREMER, LER/AR, Quai du Cdt Silhouette, 33120 Arcachon, France
E-mail Addresses:
G. Meisterhans 1 (g.meisterhans@epoc.u-bordeaux1.fr),
F. Jude-Lemeilleur 1 (f.jude@epoc.u-bordeaux1.fr)
S. Dubois 1 (s.dubois@epoc.u-bordeaux1.fr)
N. Raymond 1 (n.raymond@epoc.u-bordeaux1.fr)
Abstract:
69
M. Plus 2 (Martin.Plus@ifremer.fr)
H. Blanchet 1 (h.blanchet@epoc.u-bordeaux1.fr)
A. Grémare 1 (a.gremare@epoc.u-bordeaux1.fr)
N. Savoye 1 (n.savoye@epoc.u-bordeaux1.fr)
F. Garabetian 1 (f.garabetian@epoc.u-bordeaux1.fr
Prokaryotic communities play a major ecological role in marine sediments but the
drivers of diversity patterns at large spatial scale are yet poorly documented. In transitional
waters both marked biogeochemical gradients (habitat hypothesis) and species dynamics
within an ecotone (biogeographic hypothesis) could affect spatial diversity patterns. To
address this question, triplicate sediment cores were collected on April and September 2009,
in 29 stations distributed among the various habitats of a macrotidal lagoon located on the
French Atlantic coast. Bacterial and archaeal assemblage compositions were assessed by
Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA) and 16S rDNA based Terminal
Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP), respectively. Data were analyzed
together with contextual environmental data using PRIMER 6 statistical software. This study
highlights the low gamma diversity of prokaryotic communities in Arcachon Bay sediment
that could be explained by the relative homogeneity of the habitat due to sediment reworking
by hydrodynamics. Consequently, only two prokaryotic sub-communities were differentiated
in April as in September by emersion frequency and granulometric parameters. A next step in
these investigations would be to determine the metabolic activities associated with these
different sub-communities.
Keywords: microbial assemblages; benthic biocenosis; transient ecosystem; molecular
diversity

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
70

Introduction
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
The ocean is the main organic carbon reservoir with more than 95% of total carbon on
earth (Watson and Orr, 2003). Part of the available fraction of this organic matter (OM) is
respired by bacteria (Robinson and Williams, 2005) which have long been assigned the role
of OM remineralizers (Cho and Azam, 1988). Thanks to their ecological importance bacteria
deserved special attention for studying the assemblages’ abundances, activity, and more
recently, structure using 16S ADNr culture-independent tools (Nealson, 1997). As a distinct
phylogenetic group archaea proved to share most oceanic biota with bacteria (e.g. De Long,
1992) and it is now admitted that bacteria and archaea form taxonomically diverse and
metabolically complex assemblages in most marine biota (Karl, 2007). Considering the entire
community dynamics and their drivers appears as an important key to understand the
ecosystem functioning.
Sediments are the ultimate receptacle of the oceanic organic matter fuelling a variety
of ecological and biogeochemical processes (Middleburg and Meysman, 2007). Inside,
bacterial and archaeal populations are the catalysts of various conversions forming
assemblages which are seemingly structured by local drivers, mainly redox gradients, linked
to organic matter diagenesis (Froelich et al. 1979; Berner 1980) and reshaped by bioturbation
(Aller and Yingst, 1985; Bertics and Ziebis, 2009; Pischedda et al. 2011). This fits to the
niche assembly theory which asserts that species live together in a community only when they
differ from one another in resource uses. As an alternative to the niche assembly theory,
Hubbell and other ecologists introduced a neutral model (Hubell, 2001; Zhou and Zhang
2008). They argued that the number of species in a community is controlled by species
extinction and immigration or speciation of new species. Both species sorting and neutral
processes affect the assembly of bacterial communities, the observation scale determining the
respective contributions of the species assembly mechanisms (Langenheder and
Szekely, 2011).
Studies to assess the link between bacterial community diversity patterns in sediments
and environmental parameters were conducted only few years ago (Bertics and Ziebis, 2009;
Boer et al., 2009; Hewson et al., 2007; Ikenaga et al., 2010; Lasher et al., 2009; Sapp et al.,
2010). However to date, archaeal community diversity patterns are still poorly documented
(Singh et al., 2010, Danovaro et al., 2009).
71

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Due to high interactions between abiotic and biotic parameters, and the difficulty to
quantify all of them the description of the prokaryotic habitat heterogeneity at large spatial or
temporal scale turns out to be difficult. Transitional environments represent relevant models
to question the influence of environmental parameters on prokaryotic community structure,
since environmental gradients such as salinity, continental discharges, sedimentation - erosion
zones, generate a high spatial heterogeneity (de Wit, 2007).
Previous studies on estuarine bacterioplanktonic community showed not only the
presence of niche dependent bacterial phylotypes but also phylotypes occurring in a broad
range of habitat agreeing the neutral assembly theory of bacteria (Giovannoni et al., 1990;
Morris et al., 2002; 2004). In estuarine sediments, previous studies focused on particular
functional bacterial group (e.g. denitrifying bacterial communities) (Scala and Kerkhof, 2000;
Burns et al., 2002; Bowman et al., 2005) or on particular environment (Madrid et al., 2001;
Todorov et al., 2000) but few at a large spatial-scale (Hewson et al., 2007). In the Arcachon
Bay, a temperate macrotidal lagoon on the French Atlantic coast, a low 16S rDNA bacterial
clone diversity was reported in the plankton collected in single central site as compared to a
Mediterranean lagoon (Benlloch et al., 1995). The clone library mainly included sequence
related to Cytophaga, Flexibacter, Bacteroides and alpha Proteobacteria. In the sediments of
the Arcachon Bay Zostera noltii meadow, a broad diversity of sulphate-reducing bacteria and
the occurrence of archaeal clones was reported (Cifuentes et al., 2000). No study questionned
the entire prokaryote community structure at the ecosystem-scale despite its importance for
ecosystem functioning (de Wit, 2007; 2008).
To address this question, bacterial and archaeal genetic diversity patterns were
assessed using molecular fingerprinting approaches [Automated Ribosomal Intergenic Spacer
Analysis (ARISA) and Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)],
respectively, on 29 sites in the Arcachon Bay that were visited twice. Fifteen contextual
environmental parameters were (i) to describe, at ecosystem-scale, the benthic bacterial and
archaeal community patterns again contrasted benthic macro-invertebrate habitats and (ii) to
assess the habitat specificity of prokaryotic communities linked with environmental factors
known to control their patterns.
72

Materials and methods
Study site: Arcachon Bay
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
The Arcachon Bay (44°40’N, 1°10’W) is a 180-km 2 semi-sheltered macrotidal lagoon
on the French Atlantic coast. This transitional ecosystem is strongly impacted by oceanic and
continental inputs depending on season and/or location. Atlantic oceanic-water inputs are
about 384 10 6 m 3 for spring tide cycles and annual mean fresh-water inputs 3.2 10 6 m 3 .d -1
(Plus et al., 2009). The major tributary (85%) is the River Leyre forming an internal delta in
the bay southern corner while 17 other tributaries form the remaining 25% of freshwater
hydric flux (Plus et al., 2009). Hydraulic and hydrodynamics control the dynamics of
nutrients (Rimmelin et al., 1998; Deborde et al., 2008) and sediments (Ganthy et al. in press),
leading to the formation of various habitats (e.g. Bouchet 1995, Blanchet, 2004). At low tide a
so-called intertidal area of 115 km 2 is emerged and differenciated from the remaining 65 km 2 ,
forming the subtidal area. About 46 km 2 of the 115 km 2 intertidal area are covered by Zostera
noltii meadow, a dominant primary producer in this ecosystem (Auby et al., 2011) that
seasonnaly stabilizises surface sediments (Ganthy et al., 2011). Finally, depending on the
spatial location, sediment composition can be affected by various factors like freshwater
inputs or resuspension processes.
Sampling design and operations
In April and September 2009, sampling operations based on a 29-sites selection where
conducted on board of R/V Planula IV by a multidisciplinary team aiming to study
simultaneously the origin and composition of sediment organic matter (Dubois et al., 2011);
the spatial patterns of Zostera noltii and benthic macrofauna biomasses (in prep) and the
bacterial and archeal community dynamics (this study).Site selection aimed to investigate
most of the habitats of the Arcachon Bay. Habitats were defined a priori based on a simplified
cartography of the benthic macro-invertebrates communities from Blanchet (2004) (Figure
1A).
73

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
A
B
GS
S
T
GV
GH
R
F
Intertidal Zostera noltii community
Intertidal low-level muddy sand and sandy mud community
Intertidal inner high-level sand community with reduced salinity
Subtidal sandy mud and muddy sands community
Subtidal muds and community
Subtidal high-energy sand community
E
L K
N
V
J
M
I
O
H
Q
P
A
B
CS
CV CH
D
PHI
X
Figure 1: Choice of the 29 sampling sites in Arcachon Bay.
A: Cartography of the benthic biocenoses drawn based on the structure of the benthic macro-invertebrates
communities in Blanchet (2004).
B: Localization of sites within the bay: black boxes indicate that the sites are in subtidal areas, white boxes in
intertidal areas.
The primary clustering factor was tide, discriminating subtidal communities (12 sites)
and intertidal communities (17 sites). Subtidal communities were differentiated based on the
sediment granulometry (i) the subtidal low-level muddy sand and sandy mud community
(7 sites: B, CS, F, GS, I, J and L) (ii) the subtidal mud community (4 sites: A, D, E, and H)
and (iii) subtidal high-energy sand community (1 site: K) (Figure 1B). The sediment type and
the occurrence of seagrass meadow discriminated intertidal communities: (i) the intertidal
inner high-level sand community with reduced salinity (2 sites: PHI and Z), (ii) the intertidal
low-level muddy sand and sandy mud community (9 sites: CV, GV, O, S, R, T, V, X and Y)
and (iii) the intertidal Zostera noltii community (6 sites: CH, GH, M, N, P and Q). The set of
sampled sites covers most of the internal part of the lagoon. The distances between the closest
74
Y
Z

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
and most far away sites are about 20 m (GH vs GV) and 14km (T vs Z), respectively. For
Zostera noltii and macro-invertebrate biomass assessment, sediment samples were collected
using a hand-core sampler (0.4 m 2 ) or a Van Veen sampler (0.1 m²) for intertidal and subtidal
sites respectively. For the microbiological analyses, the surface sediments (top 5mm) were
sampled as triplicate cores (diameter = 28.6 mm) collected manually by foot (intertidal sites)
or SCUBA diving (subtidal sites) within a 5m² area with truncated sterile 50 mL syringes.
Set of environmental variables
Different contextual environmental parameters were assessed (Table 1). The sediment
granulometry (median particle grain-size, pelite content and Trask index), the sediment
content in water or organic matter (sediment particulate organic carbon content (SOC),
sediment particulate organic nitrogen content (SON), the sediment Chlorophyll a content
(Chla) were analyzed by standard methods as described in Dubois et al. (2011). Accordingly,
parameter ratios (SOC/Chl.a, C/N ratio) were calculated to assess qualitative aspect of the
sediment organic matter. For Zostera noltii and macro-fauna, biomasses were determined as
ash-free dry weight (afdw) after desiccation (60°C, 48h) and calcinations (550°C, 2h).
Sediment oxic/reduce interface was determined by measuring with a graduated rulerthe depth
of oxic layer in the sediment cores. Salinity, temperature, current speed and emersion percent
data were outputs of the MARS (Model for Applications at Regional Scale) hydrodynamic
model developed for Arcachon Bay by IFREMER (Plus et al., 2009). A detailed description
of the model is provided in Lazure and Dumas (2008). In this model, cell dimensions are
235 x 235 m. Consequently each site is located in a different cell allowing the estimation of
the different parameters’ annual medians for 2009.
75

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Table 1: Description of Arcachon Bay's sampling sites including GPS localization, hydrodynamical
characterization, physico-chemical properties of surrounding water, sediment properties and abundances or
biomasses of sediment living organisms. “afdw” was used for ash-free dry weight and “dw” for dry weight.
Site Longitude Latitude
Emersion
frequency
76
Water current
velocity median
Salinity
median
Water
temperature
median
Annual Annual Annual Annual
Lambert Lambert % m∙s -1 ‰ °C
A 328721.659 1972211.34 0.0 0.15 29.14 16.59
B 327807.89 1970919.413 0.0 0.22 30.66 16.59
CH 329150.438 1969963.117 51.5 0.01 30.32 16.23
CS 327201.869 1969953.559 0.0 0.22 30.97 16.55
CV 328946.541 1970721.358 22.07 0.08 30.05 16.51
D 327429.82 1968659.983 0.0 0.18 29.86 16.54
E 323271.055 1975728.881 0.0 0.16 30.44 16.43
F 324072.462 1972866.398 0.0 0.24 31.13 16.57
GH 321663.704 1974767.367 27.7 0.09 31.45 16.47
GS 321833.31 1974064.179 0.0 0.15 31.35 16.48
GV 321619.416 1974841.691 5.7 0.11 31.36 16.60
H 326880.743 1974820.032 0.0 0.17 29.94 16.51
I 325612.308 1973315.858 0.0 0.24 30.42 16.57
J 324476.947 1968222.267 0.0 0.14 31.51 16.53
K 323122.852 1969836.762 0.0 0.39 32.56 16.46
L 319672.003 1970215.577 0.0 0.12 32.98 16.24
M 324955.526 1970605.123 18.7 0.12 32.01 16.54
N 324877.047 1974158.906 31.5 0.11 30.43 16.73
O 325468.442 1972338.172 26.0 0.10 30.67 16.62
P 327459.274 1973112.299 28.5 0.09 29.49 16.60
PHI 332895.843 1969780.966 28.5 0.06 20.44 16.26
Q 328965.908 1973354.427 31.6 0.10 28.59 16.54
R 322678.4 1971685.526 35.3 0.09 31.92 16.58
S 321893.505 1975766.182 33.6 0.12 31.25 16.53
T 323037.007 1976887.489 33.0 0.07 30.70 16.56
V 325521.876 1976573.328 29.8 0.09 29.54 16.45
X 326676.097 1968527.918 21.6 0.13 30.76 16.44
Y 328540.515 1968904.558 12.9 0.18 29.42 16.47
Z 331731.942 1966846.523 46.4 0.02 26.26 16.84

Table 1(continued):
Site
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
SOC content SOC content /Chl a SON content C:N ratio
April September April September April September April September April September
% % % ∙ µg -1 % ∙ µg -1
% % cm cm
A 2.13 3.21 0.09 0.13 0.34 0.34 6.32 0.06 0.0 2.0
B 0.09 0.51 0.14 0.83 0.01 0.05 1.85 0.03 0.0 0.0
CH 0.57 1.04 0.04 0.07 0.06 0.11 5.18 11.10 2.0 2.5
CS 0.68 0.87 0.24 0.31 0.08 0.09 7.56 11.70 3.0 1.0
CV 1.23 1.04 0.13 0.11 0.13 0.11 11.18 11.40 3.0 2.5
D 0.21 0.08 0.10 0.04 0.02 0.01 26.71 0.00 4.5 0.0
E 0.54 0.26 0.16 0.08 0.06 0.02 21.61 0.00 2.5 3.5
F 0.17 0.14 0.06 0.05 0.02 0.01 11.95 0.00 1.0 3.0
GH 0.30 0.63 0.04 0.09 0.04 0.06 5.00 11.40 2.0 0.0
GS 0.44 1.07 0.14 0.35 0.05 0.12 3.67 12.20 5.0 0.0
GV 0.14 0.29 0.03 0.06 0.02 0.03 4.67 11.30 6.0 0.0
H 0.39 0.17 0.15 0.06 0.04 0.02 22.24 0.00 2.5 0.5
I 0.13 0.36 0.07 0.18 0.01 0.03 3.78 0.01 0.0 0.0
J 1.97 0.66 0.18 0.06 0.23 0.06 30.45 0.00 1.0 3.0
K 0.11 0.20 0.08 0.16 0.01 0.02 6.33 0.00 2.0 2.0
L 1.49 1.15 0.17 0.13 0.13 0.12 12.01 0.01 5.0 4.0
M 0.74 1.87 0.08 0.20 0.08 0.19 3.97 0.05 2.0 0.0
N 0.87 2.93 0.06 0.19 0.12 0.33 2.60 0.15 2.0 0.0
O 0.58 0.62 0.07 0.07 0.06 0.06 9.63 0.01 2.0 2.0
P 3.22 1.83 0.57 0.32 0.31 0.18 17.89 0.01 1.0 2.0
PHI 0.58 1.13 0.08 0.16 0.05 0.12 4.72 0.03 0.0 1.0
Q 1.78 2.83 0.31 0.49 0.20 0.30 5.95 0.06 2.0 2.5
R 0.63 1.93 0.09 0.29 0.07 0.23 2.74 0.10 0.0 0.0
S 3.58 3.56 0.06 0.06 0.39 0.39 9.15 0.05 4.0 3.0
T 1.85 2.37 0.12 0.16 0.21 0.26 7.00 0.04 3.0 2.5
V 3.34 3.97 0.42 0.50 0.36 0.40 8.28 0.06 0.0 0.0
X 0.42 0.22 0.04 0.02 0.05 0.02 17.52 0,00 0.0 0.0
Y 2.19 1.92 0.30 0.26 0.22 0.19 11.78 0.02 0.5 1.0
Z 3.43 1.73 0.13 0.07 0.37 0.18 19.47 0.01 5.5 3.5
77
Sediment oxic/reduce
interphase

Table 1 (continued):
Site
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Water content Particle grain-size median Trask index
April September April September April September April September
µm µm % %
A 0.80 0.67 18.1 16.8 2.41 2.33 0.81 0.84
B 0.06 0.36 462.8 25.9 1.27 3.25 0.01 0.68
CH 0.42 0.39 24.6 50.4 2.96 3.35 0.72 0.55
CS 0.38 0.39 19.6 110.8 2.63 3.61 0.77 0.4
CV 0.55 0.39 22,0 57.9 2.64 3.2 0.77 0.52
D 0.20 0.19 407.5 288.6 1.39 2.82 0.15 0.2
E 0.35 0.23 256.2 351.8 3.18 1.30 0.28 0.26
F 0.44 0.22 338,0 165.0 1.30 1.59 0.14 0.09
GH 0.3 0.30 112.2 150.8 2.75 2.44 0.35 0.19
GS 0.45 0.35 131.8 215.2 2.82 1.34 0.34 0.23
GV 0.23 0.24 145.1 393.2 2.97 4.64 0.32 0.12
H 0.30 0.22 429.4 258.0 1.39 1.36 0.18 0.31
I 0.09 0.38 320.9 13.3 1.26 2.48 0.03 0.15
J 0.48 0.67 12.6 311.0 2.08 1.25 0.91 0.83
K 0.09 0.21 276.3 105.4 1.19 2.79 0.02 0.03
L 0.72 0.51 14.2 94.4 2.65 3.08 0.81 0.36
M 0.17 0.58 21.7 33.6 3.03 3.82 0.72 0.4
N 0.36 0.56 20.3 118.5 2.94 3.10 0.73 0.59
O 0.40 0.40 83.8 19.9 3.13 2.93 0.43 0.36
P 0.76 0.44 18.2 19.3 2.36 2.78 0.82 0.74
PHI 0.25 0.33 25.7 21.7 3.46 2.88 0.67 0.76
Q 0.50 0.63 17.1 87.1 2.45 3.62 0.81 0.73
R 0.31 0.34 65.9 24.3 3.22 2.64 0.49 0.43
S 0.68 0.70 17.1 25.4 2.19 2.92 0.85 0.74
T 0.38 0.52 21.3 30.2 2.78 2.35 0.74 0.7
V 0.76 0.68 25,0 89.4 2.34 3.87 0.77 0.73
X 0.30 0.22 129.1 261.2 3.53 1.52 0.35 0.07
Y 0.47 0.57 17.7 19.5 2.31 2.52 0.83 0.8
Z 0.80 0.59 21.3 41.5 2.58 4.13 0.77 0.58
78
Pelite content

Table 1 (continued):
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Site
Macrofauna
organism biomass
Zostera noltii
biomass
April April April September
g (afdw) ∙ m -2
sediment
mg (dw)∙ m -2
sediment
A 1.23 0 1.64 1.03
B 0.62 0 1.65 1.37
CH 14.78 14.5 2.57 2.03
CS 5.22 0 1.85 1.23
CV 15.11 0 3.41 2.49
D 12.19 0 1.93 2.69
E 9.82 0 4.2 2.07
F 5.53 0 3.22 2.42
GH 28.25 15.1 4.57 3.55
GS 7.67 0 2.44 1.44
GV 6.51 0 3.66 3.51
H 2.04 0 3.98 4.74
I 2.87 0 6.76 2.84
J 12.23 0 2.9 2.51
K 1.18 0 1.91 1.82
L 18.53 0 1.58 1.55
M 10.91 3.6 5.17 1.93
N 6.56 17.8 5.7 1.57
O 21.14 0 5.49 2.64
P 11.26 2.4 1.79 3.44
PHI 5.29 0 5.77 1.99
Q 113.15 25.1 3.07 1.98
R 16.9 0 5.3 6.24
S 2.28 0 4.22 1.67
T 1.46 0 4.21 4.2
V 7.31 0 5.17 2.49
X 1.35 0 1.64 2.14
Y 6.2 0 1.64 2.08
Z 12.4 0 2.88 1.5
79
Prokaryotic abundance
x 10 8 cell.g (dw) -1 sediment

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Bacterial and archaeal abundances
Sample preparation for storage was conducted in the lab, within 6 h after sample
collection. Triplicate 1 mL sediment samples taken from the top 5mm of the core were mixed
with 1 mL of formalin (3.7% final) and stored at -80°C until analysis. From formalin
preserved samples, prokaryotes were desorbed from sediment particles using a protocol
modified from Duhamel and Jacquet (2006). Tween 80 (0.5% final) and sodium
pyrophosphate (0.1% final) were mixed with the sample by gentle shaking (30 min, 720 rpm)
the suspension was then sonicated (ultrasonic bath, 20 min). Finally cellular fractions
containing prokaryotes were purified using a migration on Gentodenz density gradient
(1.310 g.mL -1 ) according to Amalfitano and Fazi (2008). Cellular fractions were preserved in
formalin (3.7% final) at -80°C until flow cytometry analysis in the Plateforme Cytométrie-
Imagerie (Observatoire Océanologique de Banyuls sur Mer, http://www.obs-banyuls.fr/pci/).
Extemporaneously, cellular fractions were diluted in filtered seawater (1:100 v/v) and were
stained during 10 min with SYBR® Green I (50 µl. mL -1 ; 25X, Molecular Probes, Invitrogen
Cergy Pontoise, France). Then a standard 0.97 µm fluorescent bead suspension was added as
internal reference to each sample before running, at low flow rate (10 µL.min -1 ), allowing a
single-cell analysis (Amalfitano and Fazi, 2008). Data were acquired by CellQuest software
(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ USA). Cytogram analysis provided
event numbers, identified as prokaryotic cell numbers, during the count time (1 min). Counts
were subsequently normalized to flow rate and to the mass of extracted sediment to calculate
a density as number of prokaryotic cells per gram of sediment.
Bacterial and archaeal fingerpinting
ARISA and T-RFLP were used for assessing bacterial and archaeal diversity patterns
respectively. ARISA is known to be more efficient than T-RFLP for the determination of
bacterial diversity (Danovaro et al., 2006), but cannot be applied to archaea, as most of them
are known to have no ITS region (Danovaro et al., 2009).
Sample preparation for storage was conducted in the lab, within 6 h after sample
collection. Triplicate1 mL sediment samples taken from the top 5mm of the core were mixed
with 2.5 mL of preservative buffer (100 mM Tris-HCl [pH 8.0], 100 mM Na EDTA [pH 8.0],
1.5 M NaCl and 1% [wt/vol] cetyltrimethylammonium bromide) (Zhou et al., 1996).
80

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
DNA was extracted from 700µL of preserved buffer samples, using a bead beating
method (FastPrep and lysis matrix E; 5.5 m∙s -1 ; 30 s twice, MP Biomedicals, Illkirch, France)
coupled to UltraClean® Soil DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc., Carlsbad, CA,
USA). For each sample the amount of DNA was determined by spectrofluorimetry (LS 55,
PerkinElmer, Courtaboeuf, France) using SYBR® Green I (Molecular Probes, Invitrogen,
Cergy Pontoise, France), and quantified using DNA standard 1mg∙mL -1 solutions of calf
thymus DNA (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France).
Sediment bacterial community diversity patterns were assessed using the PCR-based
whole-community fingerprinting approach ARISA of bacterial DNA (Fisher and Triplett,
1999). ARISA amplifies the Intergenic Transcribed Spacers (ITS) between the 16S and 23S
rRNA genes using a fluorescent primer and the ITS size represents the operational taxonomic
unit (OTU). Results are displayed as the amount of different PCR products of specific
fragment length (ITS size). For each sample, the ARISA amplification step was conducted in
triplicates. The amplification was run according to Ranjard et al. (2000) using universal
bacterial primers SDBact (5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT-3’ labelled at the 5’ end
with the phosphoramidite dye 5-FAM fluorochrome) (Normand et al., 1996) and LDBact
(5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3’) (Normand et al., 1996) (Molecular Probes Invitrogen
Cergy Pontoise, France) with the following conditions: (i) 94°C for 5 min; (ii) 35 cycles of
94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min, and then (iii) 72°C for 5 min. The 25 µL-
reaction mixtures contained 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.3 mg∙mL -1 of bovine serum
albumin (MP Biomedicals, Illkirch, France), 5% of DMSO, 0.2 mM of each dNTP, 0.1 µM of
each primer, 1U of Taq polymerase (Promega, Charbonnières-les-Bains, France) and 10 ng of
template DNA. ARISA amplified products were purified using a QIAquick PCR Purification
Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France) and quantified by spectrofluorimetry as for extracted
DNA.
Sediment archaeal community diversity patterns were assessed using another PCR-
based whole-community fingerprinting approach, the T-RFLP. T-RFLP amplifies partial 16S
ribosomal RNA genes (16S rDNA) using a fluorescent primer. The amplified products were
digested by restriction enzyme which generates T-RFs (Terminal - Restriction Fragments).
The T-RFs size represents the operational taxonomic unit (OTU). For each sample, the
T-RFLP amplification step was conducted in triplicates. The amplification was run according
to Gantner et al. (2011) with modifications and using archaeal primers 340F
(5′-CCCTAYGGGGYGCASCAG-3′ labelled at the 5’ end with the phosphoramidite dye
81

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
5-FAM fluorochrome) (Gantner et al. 2011) and 1000R (5′-GGCCATGCACYWCYTCTC-3′)
(Gantner et al. 2011) (Molecular Probes Invitrogen Cergy Pontoise, France) with the
following conditions: (i) 98°C for 2 min; (ii) 35 cycles of 95°C for 30 sec, 57°C for 30 sec,
72°C for 90 sec, and then (iii) 72°C for 7 min. The 25 µL-reaction mixtures contained
1 x PCR buffer, 2 mM MgCl2, 3.3 mg∙mL -1 of bovine serum albumin (MP Biomedicals,
Illkirch, France), 0.8 mM of each dNTP, 0.5 µM of each primer, 0.8U of Taq polymerase
(Promega, Charbonnières-les-Bains, France) and 100 ng of template DNA. About 50 ng of
16S rRNA gene amplicons from each of the three triplicate PCR were digested separately at
37°C for 4 h in a 20 µl reaction volume that contained 5 U of the restriction endonuclease
AluI (Promega, Charbonnières-les-Bains, France), selected as Luna et al. (2009) demonstrated
that it is highly efficient in assessing archaeal phylotype richness in benthic assemblages.
Restriction digestions were stopped by incubation at 65°C for 20 min, and samples were then
kept frozen at -20°C until analysis. Then, triplicates digested amplification products were
pooled together and purified using a QIAquick Nucleotide Removal Kit (QIAgen,
Courtaboeuf, France) and quantified by spectrofluorimetry as for extracted DNA.
Ten ng of bacterial ARISA or 1µL of archaeal T-RFLP purified products from each
sample were combined separately with 10 µL Hi Di formamide and an ARISA internal
LIZ1200 or T-RFLP LIZ600 standard (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France) before
being heat treated (95°C, 5 min) and cooled on ice. ARISA or T-RFLP runs were performed
on a 3730XL Capillary Genetic Analyser (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France),
using a 50 cm capillary and standard Genemapper protocol, which detects the relative
abundance of different sized labelled PCR products (Plateforme Genome-Transcriptome
Pierroton INRA, Bordeaux-Aquitaine,
www.pierroton.inra.fr/biogeco/site_pole_agro/genoseq.html). Results were read using the
ABI Peak scanner software provided by Applied Biosystems (Courtaboeuf, France) where
each profile of peaks in an electrophoregram defines bacterial or archaeal diversity
fingerprint. Fluorescence data (peak areas and peak sizes) were exported to Microsoft Excel
to allow the data analysis. Peak size values were rounded to the nearest whole number and
ARISA peaks with a size inferior to 200 bp and T-RFLP peaks with a size inferior to 35 bp
were considered as noise and excluded for analysis. Data were also transformed to abundance
matrix.
82

Statistical analyses
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
As bacterial and archaeal diversity analyses were performed on triplicate for each site,
the three fluorescence intensities of each OTU per site were averaged to construct a bacterial
and an archaeal OTU average relative abundance matrices. These 2 matrices were also laid
end to end to generate a prokaryotic relative abundance matrix.
From these matrices, Bray-Curtis similarities (BC) between sites were calculated from
Primer software (PRIMER-E Ltd, Lutton, UK) according the following equation
– – where OTUi,a is OTUi relative
abundance in sample A and OTUi,b is OTUi relative abundance in sample B. Similarities were
represented on non-multidimensional scaling (MDS) (Clarke and Warwick, 2001) On each
MDS chart, every prokaryotic community was represented as one plot and the relative
changes in community structure as the distances between the points. A stress value less than
0.2 indicates a good representation of the BC distances between samples.
Agglomerative hierarchical clustering based on Bray-Curtis similarity matrix was
performed using Primer software to generate dendrogram showing the similarity among
samples and allowing the determination of non a priori groups of sites.
Statistical differences between a priori groups were tested using ANalysis Of
SIMilarity (ANOSIM) a random permutation tests (Monte-Carlo test, 100,000 permutations)
performed from similarity matrix (Kropf et al., 2004).
An accumulation curve and the associated regression curve based on Michaelis-
Menten equation was also designed a posteriori from the relative abundance matrix of all
samples using Primer software.
To estimate the diversity-level of each site, the Simpson indexes (D) were calculated
as following: D = (SUM(NS/NT) 2 ) where NS represents the relative abundance of one OTU
and NT the total number of OTU of the site.
To compare differences between group in term of prokaryotic abundance, OTU
richness or environmental data, Mann-Whitney tests were used when the set of data were
unpaired and Wilcoxon when the set of data were paired. Tests were performed using the
macro-command Merlin on Microsoft Excel software.
83

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
SIMPER analysis was used to identify the OTU that contributed to the discrimination
of sites allowing cluster differentiation. The overall significance of the difference between
clusters is assessed by ANOSIM. The Bray-Curtis similarity measure is implicit to SIMPER.
BIOENV analyses were used to find the combination that ‘best explains’ the OTU
community patterns from a set of environmental parameters. BIOENV is based on the
multiple correlations of Bray-Curtis similarities of community data and Euclidean distances
of environmental data. The correlations reveal a combination of environmental variables that
is more correlated to community similarity matrix. The Spearman R correlation coefficient of
this test illustrates the strength of relationship. This analysis requires excluding strongly
correlated parameters (R > 0.95) and the normalization of environmental data. Therefore,
Spearman correlations among environmental parameters were tested using the macro-
command Merlin on Microsoft Excel software in order to validate the environmental
parameter selection prior to run the BIOENV analysis.
RESULTS
Significance of tests and correlation was considered at 5% level i.e. p value ≤ 0.05.
The set of 29 sites selected in the inner part of Arcachon Bay provided contrasted
subsets of physical and biogeochemical conditions regarding (Table 1): the emersion
frequency, null for subtidal sites and ranging from 5.7 % (GV) to 51.5 % (CH) for intertidal
sites ; median annual salinity ranging from 20.44 psu (PHI) to 32.98 psu (L) ; sediment
granulometry e.g. median particle grain size ranging from 12,6 (J in April) to 462.8 (B on
April) and the C:N ratio which is below detection limit for 7 sites and peak up to 30.5 (J in
April). In April when data were avalaible, in intertidal area, 6 sites (CH, GH, M, N, P and Q)
were colonized by Zostera noltii with densities ranging from 2.4 mg m -2 sediment at P to 25.1
mg m -2 sediment at Q.
No R-value of Spearman correlation higher than 0.95 was found among the selected
parameters; as a consequence all the parameters could be kept to implement the BIOENV
analyses.
Abundances of prokaryotic cells ranged from 1.6 (L) to 6.8 10 8 cell.g -1 (I) in April and
were significantly higher than September abundances which ranged from 1.0 (A) to 6.2 (R)
10 8 cell.g -1 (Wilcoxon, p < 4 10 -3 ) (Table 1). Neither significant difference of abundances was
84

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
observed among benthic macro-invertebrate habitats described in Blanchet (2004), nor
between bare and Zostera noltii colonized sediments (Mann-Whitney, p > 0.05).
Considering the whole set of samples collected in the 29 sites on the two sampling
occasions, a total of 739 prokaryotic OTU was found ranging from 200 to 1196 bp size and 33
to 649 bp size for bacteria and archaea, respectively. Among them, 440 bacterial and 258
archaeal OTU were detected in April and 356 bacterial and 244 archaeal OTU in September.
While most of the OTU (76%) were detected on both sampling occasion, significant
differences were found between April and September prokaryotic communities (ANOSIM,
R = 0.731, p < 0.001%). April and September community data were considered as temporal
duplicates and analyzed separately hereafter.
Accumulation curves, based on Michaelis-Menten regression, showed that a mean
sampling of 6 sites in triplicate permits to estimate more than 75 % of theoretical total OTU
richness of this ecosystem except for archaeal communities in April which required the
sampling of 8 sites (Figure 2).
Numbers of different OTU observed
450
375
300
225
150
75
Figure 2: OTU-accumulation curves
0 5 10 15 20 25 30 35
Numbers of replicate samples
Triangles and boxes with error bars represent the averages and SD of observed bacterial and archaeal OTU
respectively as the samples are accumulated. These averages were obtained from 100,000 permutations of 29
relative abundance matrices of OTU. Curves represent the curve regressions based on Michaelis-Menten
equation. Black and gray symbols represent April and September data respectively.
85

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
At site-scale, sediments harbored in April, a significant higher bacterial (S = 187 ± 27
OTU cm -3 ; D = 0.04 ± 0.01) than archaeal (S = 79 ± 18 OTU cm -3 ; D = 0.1 ± 0.09) OTU
richness (S) and Simpson diversity (D) (Wilcoxon test, p < 0.05); in September too, with S
values of 148 ± 25 and 98 ± 20 OTU cm -3 and D values of 0.04 ± 0.01 and 0.1 ± 0.07 for
bacterial and archaeal communities respectively (Wilcoxon test, p < 0.05).
So-called rare OTU occurring in less than 10% of the investigated sites have
represented 28 % of the 698 prokaryotic OTU in April and 26% of the 600 prokaryotic OTU
in September.
Co-occurrences of OTU were investigated by searching for correlation among 698
OTU in April (600, in September). Significant correlation (Spearman, R value > 0.9) were
only found for 432 out of 243253 possibilities (0,24%) in April and 521 out of 179700
(0,29%) in September indicating low levels of OTU co-occurrences on the two sampling
occasions.
Fourteen bacterial and 12 archaeal OTU occurred in all the sampling sites in April; 17
and 13 respectively in September. Among these OTU, 9 bacterial OTU (OTU# 266, 290, 320,
322, 352, 470, 482, 528 and 636) and 5 archaeal OTU (OTU # 99, 153, 197, 265 and 493)
occurred in April as in September.
Intra-site Bray Curtis similarity ranged from 35% at the site I in September to 82% at
the site PHI in September too, with a mean of 62 ± 13 %, for bacterial communities, and
ranged from 25 % at the site PHI in April to 92 % at the site GS in April with a mean of
68 ± 13 %, for archaeal communities. In April, no significant difference was observed
(Wilcoxon test, p > 0.5) between bacterial and archaeal communities intra-site BC similarities
while in September archaeal communities showed significantly higher (by a 1.2 fold) intra-
site BC similarities (Wilcoxon test, p = 2.4 10 -4 )
A priori analyses were performed to compare prokaryotic communities based on
bacterial and archaeal relative abundance matrices, set end to end.
Considering the 6 groups of sites defined based on benthic macro-invertebrate habitats
described in Blanchet (2004), significant differences in the prokaryotic communities were
recorded between groups in April (ANOSIM, R = 0.142, p = 0.042) and September
(ANOSIM, R = 0.272, p = 0.002). More precisely, significant differences were found between
intertidal and subtidal prokaryotic communities in April (ANOSIM, R = 0.2, p = 0.002) and
86

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
September (ANOSIM, R = 0.5, p = 4 10 -5 ) (Figure 3A). Simpson indexes were significantly
higher for the prokaryotic communities of intertidal sites than for the prokaryotic
communities of subtidal sites in April (D, 0.03 ± 0.01 vs 0.05 ± 0.03) and September (D, 0.02
± 0.00 vs 0.05 ± 0.03) (Mann-Whitney, p < 0.02).
In the 17 intertidal sites, bare and Zostera noltii colonized sediments did not harbored
significantly different prokaryotic communities (ANOSIM, p > 0.8) (Figure 3B). Consistenly,
no significant differences in the Simpson index value was found between the two intertidal
prokaryotic communities (D = 0.03 ± 0.01; Mann-Whitney, p > 0.2).
.
Bray-Curtis similarity (%)
100
75
50
25
87
Figure 3: Comparison of prokaryotic community
structures from parameters described by Blanchet
(2004) to structure the benthic macro-invertebrate
communities.
Light and dark gray histogram bars with error bars
corresponded to intra-group similarities of
prokaryotic communities; black histogram bars
with error bars correspond to intergroup
similarities of prokaryotic communities. Error bars
represent standard deviation. Asterisks indicate
statistical differences between intra-group and
intergroup similarities when intra-group
similarities were superior to inter-group
similarities.
A: Light gray: group of subtidal sites; dark gray:
group of intertidal sites.
B: Light gray: group of sites with Zostera noltii
colonized sediment; dark gray: group of sites with
bare sediment sites.
Non a priori analyses were performed to compare prokaryotic communities based on
bacterial and archaeal relative abundance matrices, set end to end.
In April, a MDS plot of the BC similiraties calculated between the 29 prokaryotic
communities allowed to distinguish two clusters of sites: cluster#1 included 10 sites (B, CS,
D, GS, GV, H, I, K, L, X) with a mean BC similarity of 50.9 % ; cluster#2 included 17 sites
(A, CH, CV, E, F, GH, J, N, O, P, PHI, Q, S, T, V, Y, Z) with an mean BC similarity of
56.9 %. Sites M and R were outliers; clusters exhibited a 45% BC similarity (Figure 4A). The
Simpson index was significantly lower in Group 1 (0.05 ± 0.03) than in Group 2 (D, 0.03 ±
0.01) (Mann-Whitney, p < 0.03) especially due to the very low diversity in site B (D = 0.11)
and CS (D = 0.8).
0
100
75
50
25
0
April September
April September
A
B

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Using Primer software a SIMPER analysis based on 698 OTU detected in April
indicated that 6 bacterial and 14 archaeal OTU showed inter site variations in their relative
abundances that explained 42% of the inter-group dissimilarity. Five bacterial and 8 archaeal
OTU were ubiquitous. Among these, only one bacterial (# 322) and two archaeal OTU (#265
and #385) showed higher abundance in Group 1 than in Group 2. For instance, the archaeal
OTU #265 exhibited a mean relative abundance of 29.3 % in Group 1 and 8.3 % in Group 2
and explained alone 10% of the inter-group dissimilarity.
In september, a MDS plot of the BC similiraties calculated between the 29 prokaryotic
communities allowed to distinguish two clusters of sites: cluster#3 included 10 sites (B, CS,
D, E, F, GS, H, I, J, K) with a mean BC similarity of 58.0 % ; cluster#4 included 18 sites (A,
CH, CV, GH, GV, L, M, N, O, P, PHI, Q, R S, T, V, Y, Z) with an mean BC similarity of
62.0 %. The site X was an outlier; clusters exhibited a 48.7% BC similarity (Figure 4B). The
Simpson index was significantly lower in Group 3 (0.05 ± 0.03) than in Group 4 (D, 0.02 ±
0.00) (Mann-Whitney, p < 0.01).
A SIMPER analysis based on 600 OTU detected in September indicated that 7
bacterial and 11 archaeal OTU showed inter site variations in their relative abundances that
explained 46% of the inter-group dissimilarity. Six of the bacterial OTU out of 7 and 7
archaeal OTU out of 11 were ubiquitously found in September. Among these, 3 bacterial
(#320, #322 and #636) and 5 archaeal OTU (#99, #153, #197, #265 and #493) occurred in
April. Like in April, the archaeal OTU #265 exhibited a mean relative abundance of 36.2 % in
Group 3 and 3.6% in Group 4, explaining a large part (16%) of the inter-group dissimilarity.
88

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
2D Stress: 0.17
2D Stress: 0.15
89
Figure 4: nMDS representation of
prokaryotic communities patterns
in April (A) and in September (B)
based of Bray-Curtis similarity
analyses and from all-OTU
relative abundance matrices.
Prokaryotic community of each
site was represented by a plot.
Gray diamonds represented sites
of the Group 1; black diamonds,
sites of the Group 2; gray circles,
sites of Group 3 and black circles,
sites of Group 4. Stress value
indicates the relevance of graphic
representation.
A BIOENV analysis was performed using Primer software to identify those of the
studied environmental parameters that explained the differences between groups.
In April, a combination of five of the studied environmental parameters partially
explained the prokaryotic community structure (R = 0.434, p < 2%): emersion frequency,
annual median salinity, median particle grain-size, C:N ratio and depth of oxic/reduce
interface. All environmental parameters but depth of the oxic/reduce interface exhibited
significantly different values between the previously identified clusters of sites (Mann-
Whitney test). The sites of cluster #1 were characterized by the highest values of median
annual salinity (31.1 ± 1.0 ‰), median particle grain size (233.7 ± 167.8 µm) and C:N ratio
(5.5 ± 5.7) (Figure 5).
A
B

Emersion frequency (%)
C:N ratio
60
50
40
30
20
10
0
20
15
10
5
0
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Group Group 1 Group 2
Group 1
Group 2
Sediment oxic/reduce
interphase (cm)
Figure 5: Comparison between groups of sites revealed in April, of environmental parameters shown by
BIOENV analyses as structuring prokaryotic community patterns. For each chart, cross indicates the mean; bar,
the median; the top of box, 75 th percentile; the bottom of box, 25 th percentile; top of tail, the highest value and
the bottom of tail, the lowest values. Asterisks in superscript indicate statistical differences between groups at
p = 0.05 level (Mann-Whitney).
In September, a combination of five of the studied environmental parameters partially
explained the prokaryotic community structure (R = 0.433, p < 2%): emersion frequency,
median water current velocity, Trask index, water content and pelite content. All
environmental parameters exhibited significantly different values between the previously
identified clusters of sites (Mann-Whitney p < 0.05). The sites of cluster #3 were
characterized by the highest values of emersion frequency (25.7 ± 1.4 %), median water
current velocity (0.2 ± 0.1 m.s -1 ) and the lowest values of water (0.3 ± 0.1) and pelite content
(0.3 ± 0.3 %) and Trask index (2.2 ± 0.9) (Figure 6).
Water salinity median
34
32
30
28
26
24
22
20
7
6
5
4
3
2
1
0
0
Group 11 Group 2 2
Group 1 Group 2 2
Group 1 Group 22
90
Particle grain-size median
(µm)
500
400
300
200
100

Emersion frequency (%)
Trask index
Emersion frequency (%)
Trask index
60
50
40
30
20
10
0
4
3
2
1
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
0
Group b Group c
Group 4
Group 3
0.50,5
0.40,4
0.30,3
0.20,2
0.10,1
Figure 6: Comparison between groups of sites revealed in September, of environmental parameters shown by
BIOENV analyses as structuring prokaryotic community patterns. For each chart, cross indicates the mean; bar,
the median; the top of box, 75 th percentile; the bottom of box, 25 th percentile; top of tail, the highest value and
the bottom of tail, the lowest values. Asterisks in superscript indicate statistical differences between groups at p
= 0.05 level (Mann-Whitney).
To account for potential bias due to the randomness of rare OTU, similar
complementary analyses were performed on matrices restricted to the subset of spatially
ubiquitous OTU: 14 out of 440 bacterial and 12 out of 258 archaeal OTU in April and 17 out
of 356 bacterial and 13 out of 244 archaeal OTU in September.
Water current velocity (m.s -1 )
Water content
Water content
Current speed median (m.s -1 )
0
0.8 0,8
0,6
0.6
0.4 0,4
0.2 0,2
Groupe 1 Groupe 2
Group 4
0 0
0
Group b 4 Group c
Group Groupe 1 4 Groupe 2
Group b4 Group c
Based on this dataset, April and September communities shared 8 out of 23 bacterial
and 5 out of 20 archaeal OTU. Accordingly, prokaryotic communities showed significant
differences in April and September (ANOSIM test, R = 0.948, p < 0.001%) (Figure 7). In
April, the structure of the ubiquitous prokaryotic communities was explained by a
combination of 5 environmental parameters (R= 0.474, p < 1%): emersion frequency, C:N
ratio and the depth of oxic/reduce interface and these already explained the structure of the
entire communities unlike longitude and SOC content. In September, emersion frequency,
median water current velocity, Trask index, water content and pelite content explained the
91
Group 3
% pelite
1.01
0.8 0,8
0.6 0,6
0.4 0,4
0.2 0,2
Group 3 Group 3 Group 3
Pelite (%)

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
structure of ubiquitous prokaryotic communities (R= 0.489; p < 1%) fitting with the results of
the analysis performed based on the whole prokaryotic communities.
Discussion
2D Stress: 0.13
2D Stress: 0.11
92
Figure 7: nMDS representation of prokaryotic
communities patterns in April (A) and in
September (B) based of Bray-Curtis similarity
analyses and from ubiquitous-OTU relative
abundance matrices. Prokaryotic community of
each site was represented by a plot. Gray
diamonds represented sites of the Group 1;
black diamonds, sites of the Group 2; gray
circles, sites of Group 3 and black circles, sites
of Group 4. Stress value indicates the
relevance of graphic representation
In this study, one goal was to enlarge the knowledge of prokaryotic diversity at
ecosystem-scale in the Arcachon Bay and that required handling a large number of samples.
With this aim capillary electrophoresis coupled fingerprinting methods such as ARISA
A
(Fisher and Triplett, 1999) and T-RFLP (Avaniss-Aghajani et al., 1994) are especially
adapted methodologies. Both are currently used for estimating richness and community
composition (Danovaro et al. 2009; Edlund et al., 2008) although the 16S – 23S intergenic
transcribed spacer (ITS) size polymorphism that is assessed by ARISA is claimed to be the
best fit to the bacterial species taxonomic level (Danovaro, 2005). In contrast archaeal
diversity can hardly be approached by ARISA as some archaeal ITS possess no ITS (Leuko et
al., 2007). For all this reasons bacterial and archaeal community structures were respectively
assessed by ARISA and T-RFLP in the present study. Merging ARISA and T-RFLP OTU in a
B

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
single matrix joined heterogeneous taxonomic proxies but intended to consider the entire
prokaryotic communities in one attempt. The quite low percent of correlated OTU suggested
an absence of redundancy of bacterial and archaeal taxa as a probable consequence of the
specificity of the amplification protocols. There is no simple relationship between the
occurrence of a bacterial or archaeal species and the number and types of retrieved OTU
(Klappenbach et al., 2000). Consistent with the observation of Hewson and Fuhrman (2007),
the quite low percent of correlated OTU (

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
higher diversity (D’ = 0.03) of prokaryotic community cluster #2 and #4 in April and
September respectively.
The bacterial OTU richness represented more than 148 OTU per cm 3 of surface
sediment in each site of the Arcachon Bay on the two sampling occasions. This is consistent
with the magnitude of OTU numbers reported elsewhere (e.g. Hewson and Fuhrman, 2007;
Borin et al., 2009). Archaeal OTU exhibited significantly lower OTU richness in sediment.
This could be related to their densities in the surface sediments where they were reported to
be less abundant than bacterial cells (Molari et al., 2012). Accumulation curves, based on
Michaelis-Menten equation showed that sampling 6 sites permitted to estimate 75 % of
theorical total OTU richness, suggesting low gamma diversity within the 180 km 2 of this
ecosystem. According to Whittaker's multiplicative law, gamma diversity is the product of
alpha and beta diversity (Jost, 2007). The low gamma diversity of Arcachon Bay can be
explained by the low beta diversity observed due to the presence of only two prokaryotic sub-
communities per sampling time.
The prokaryotic communities were composed by an important part of rare OTU
(>25%). These OTU and their role in microbial ecology is an actual and controversial subject
especially with the expansion of next generation massive sequencer (Gobet et al., 2010).
These OTU are randomly present and consequently can be considered as artefacts (Kunin et
al., 2010). In fact, our results showed that if the analysis of beta diversity was performed
based only on ubiquitous-OTU similarity matrix, the clustering pattern was the same that
from analyze of all-OTU similarity matrix. We also observed a high correlation between
ubiquitous-OTU similarity matrix and all-OTU similarity matrix, consistent with the SIMPER
test between groups that revealed the preponderant role of ubiquitous OTU in the clustering
discrimination. Moreover, the omission of rare OTU unveiled longitude as a factor controlling
the ubiquitous prokaryotic community spatial pattern. But others authors support the
importance of these rare OTU in microbial ecology defining them as the “rare biosphere”
(Galand, 2009; Pedros Alio, 2006; Sogin et al., 2006). Analyses of these sub-communities
revealed on the one hand the presence of ubiquitous OTU and the scarcity of group-dependent
OTU which questioned about the presence of true habitat dependent-OTU and consequently
to the selection of OTU by habitat. These results fitted to the cosmopolitan theory. On the
other hand, the ubiquitous OTU abundances showed variations between the two habitats
fitting to the niche assemble theory. Differences of environmental conditions could lead to a
shift in the communities with the predominant development of the most competitive OTU
94

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
within each habitat. Emersion percent, granulometric parameters and salinity were revealed as
structuring the prokaryotic communities of the Arcachon Bay sediment in April as in
September except for the salinity that appeared as a controlling factor only in April. This is
consistent with the increased of the Leyre river inputs during this spring rainfall period which,
by a higher contribution, could become both a significant source of allochtonous prokaryotes
as an osmotic selection factor via a decreasing of surrounding water salinity (Crump et al.,
2004; Prieur et al., 1987). This is especially true in the sediment of the site close to the Leyre
mouth that showed a continental particulate organic matter isotopic signatures (Dubois et al.
in press) and consequently could be one of the hypothesize explaining the low diversity of the
site B (D = 0.11).
In parallel of our study, identification and numeration of macroinvertebrate organisms
were realized in the same sites on the same sampling occasions (not presented data, Dubois et
al. pers. comm.). Bray-Curtis similarity matrices of macroinvertebrate and prokaryotic
communities appeared to be correlated one with the other (RELATE, R = 0.267 in April;
R = 0.41 in September; p < 0.02 %). These results highlighted the links between the two kinds
of communities. Sharing the same habitat both communities could present (i) direct
interactions as trophic relationship (e.g. worms ingesting the sediment and the associated
prokaryotes and excreting pseudo-feces and associated prokaryotic microflora) or symbiosis
interactions (commensalism, parasitism or mutualism) (Prieur, 1991) but also (ii) indirect
interactions via the modification of sediment habitat by bioturbation, that could lead to a
change in prokaryotic communities (Bertics and Ziebis, 2010). The interaction between
prokaryotic communities, the macrofauna biocenosis and the characteristics of their biotope
are extremely complex due to high diversified interactions among them, and the difficulty to
quantify an important number of abiotic and biotic parameters describing the habitat.
CONCLUSION
This study intended to describe the bacterial and archaeal community diversity in a
transient ecosystem and understand the environmental key parameters driving their patterns
using molecular approaches. Our results showed that Arcachon Bay sediment harbored a low
gamma diversity of prokaryotes, composed by two-third of bacteria and a third of archaea.
95

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
This low gamma diversity could be explained by the relative homogeneity of the
habitat due to sediment reworking by hydrodynamics. Consequently, only two prokaryotic
sub-communities were differentiated in April as in September by emersion frequency and
granulometric parameters. Despite their large distribution area and their high density covering
the intertidal sediment, Zostera noltii did not appear as a driver of prokaryotic communities;
their influence on microbial activity could be only localized around rhyzosphere at millimeter
scale. Finally, prokaryotic community patterns appeared to be partially controlled by the same
environmental parameters as benthic macrofauna organisms.
Acknowledgements
This work was performed within the scope of the scientific programs ORIQUART
(EC2CO-PNEC). G. Meisterhans is funded by a doctoral fellowship of the Region Aquitaine.
The authors are grateful to Franck Salin (INRA, Pierroton) for ARISA analysis, Claude
Courties (Université Pierre et Marie Curie, Banyuls sur Mer) for cytometry analysis. We also
thank the sailors Francis Prince and Laurent Letort, P. Lebleu, B. Gouilleux, A. Garcia, L.
Bourrasseau, H. Bouillard, R. Parra, F. Salvo and C. Portier for help in field sampling and
samples processing.
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Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
102

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
2. Dynamique spatiale inter-écosystème
2.1 Introduction
Nous constatons que même au sein d’un écosystème prétenduement stratifié
(e.g. gradients continentaux, tidaux) comme le Bassin d’Arcachon, les assemblages répondent
finalement à l’habitat au sens large et ne réagissent que très peu au gradient chimique. Qu’en
est-il à l’inverse si l’on compare des habitats similaires (sédiments vaso-sableux structurés par
des apports en matière organique continentale) au sein de différents hydrosystèmes.
Dans ce contexte, et au moyen d’une analyse de la structure des communautés
bactériennes des sédiments à différentes échelles spatiales horizontale ou verticale allant du
centimètre à la centaine de kilomètres, nous avons recherché des différences habitat-
dépendant à l’échelle intra-écosystème et/ou entre écosystèmes. Afin de dissocier plus
facilement le rôle des facteurs écologiques de celui de l’éloignement géographique, nous nous
sommes basés sur une comparaison de trois écosystèmes (le Bassin d’Arcachon, la Vasière
Ouest-Gironde, et l’estuaire de la Gironde).
2.2 Sites d’étude et méthodologies
2.2.1 Sites d’étude
Au cours de ces travaux, nous nous sommes intéressés à trois écosystèmes situés dans le
Golfe de Gascogne au sud-ouest de la France: le Bassin d’Arcachon décrit précédemment
(chapitre I, partie 6.2 et chapitre II partie 1), la vasière Ouest-Gironde (VOG) et l’estuaire de
la Gironde (4°20’ N, 0°45’W).
2.2.1.1 La Vasière Ouest-Gironde
La VOG est une couche sédimentaire de 290 x 10 6 tonnes de dépôts majoritairement vaso-
argileux (> 75% ; Lesueur, 1992), s’étendant sur 420 km 2 au niveau du plateau continental du
Golfe de Gascogne (Figure II.1). Son épaisseur moyenne de 4 m (Lesueur, 1992) résulte des
processus de sédimentation des apports terrigènes de l’estuaire de la Gironde estimé à
1.5 x 10 6 tonnes par an (Castaing and Jouanneau, 1987). Emportées par les courants, les
matières en suspension terrigènes viennent s’accumuler dans la zone septentrionnale de la
VOG. Puis environ 35% de la matière temporairement stockée (0.9 x 10 6 tonnes par an) est
remise en suspension et se dispersent sous l’action de courants advectifs selon un gradient
Nord-Est/ Sud-Ouest (Jouanneau et al., 1999). Il en résulte une différence de composition
103

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
sédimentaire avec d’Ouest en Est une diminution de la teneur en particules fines au profit de
la fraction sablo-vaseuse (Jouanneau et al., 1989). La teneur en carbone organique y est faible
(0,8%), et la fraction labile, qui n’excède pas 10% du carbone organique total, proviendrait
principalement de la biomasse en elle-même. En effet la part détritique sst rapidement
incorporée dans le matériel vivant, et ne s’accumulerait donc pas (Relexans et al., 1992).
Cependant un apport de matière fraîche (pic de chlorophylle a et de matière organique labile)
au niveau de la zone occidentale de la VOG traduit la présence d’un gradient spatial Nord-Est/
Sud-Ouest de labilité de la matière organique pouvant structurer les peuplements benthiques
(Relexans et al., 1992). Autres facteurs structurant les peuplements, les processus de
remaniement sédimentaire (bioturbation/ hydrodynamique) sont à l’origine d’une absence de
gradients physiques et chimiques verticaux sur plusieurs centimètres de profondeur ainsi que
de la présence de chlorophylle a au niveau de strates inférieures à 10 cm (Relexans et
al., 1992).
Stations Profondeur (m) Latitude N Longitude O
V1 35 45°46'035 1°40'274
V3 55 44°44'979 1°41'560
V4 67 45°35’808 1°51’918
Figure II.1 : La Vasière Ouest-Gironde (France):localisation des sites de prélevements V1,
V3 et V4.
104
Estuaire de la
Gironde

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
2.2.1.2 L’estuaire de la Gironde
L’estuaire de la Gironde est le plus vaste estuaire français (Figure II.2), et le principal
exutoire du Bassin Aquitain. Cet écosystème apparait comme un bon modèle d’étude des
estuaires turbides par sa forte concentration en matières en suspension, pouvant dépasser les
1 g.L -1 (Glangeaud, 1938), limitant ainsi la production primaire autochtone (Goosen et
al., 1999). Ce système apparait donc globalement hétérotrophe (Heip et al., 1995), la
dégradation de la matière organique (respiration hétérotrophe) y étant favorisée. Inversement,
les biomasses phytoplanctoniques y sont faibles en comparaison avec les autres estuaires
Nord Européens (Lemaire et al., 2002), le microphytobenthos contribuerait donc
majoritairement à la production primaire (Irigoien, 1997). La balance production primaire /
respiration hétérotrophe influe sur la disponibilité en O2 et par conséquent sur les maillons
trophiques supérieurs.
Phare
Richard
Figure II.2: Estuaire de la Gironde : positionnement des sites d’échantillonnage en fonction
des secteurs halins définis par Rince (1983).
105
Saint
Christoly
Lamarque

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
2.2.2 Echantillonnages
Vingt neufs sites ont été échantillonnés au niveau de Bassin d’Arcachon en Avril et
Septembre 2009 et présentés précédemment (chapitre II-1) (Tableau II.1).
Ecosystème
Bassin
d'Arcachon
Vasière Ouest-
Gironde
Estuaire de la
Gironde
Tableau II.1 : Nombre et répartition des échantillons au sein des trois écosystèmes
étudiés.
Trois stations de la Vasière Ouest Gironde (V1, V3 et V4) ont été échantillonnées en
juillet 2010 à bord du navire océanique le Côte de la Manche, au cours de la campagne
BIOMIN1 (Figure II.1). Les prélevements ont été réalisés le long d’un gradient spatial vertical
entre l’interface colonne d’eau/sédiment et 10 centimètres de profondeur (7 horizons: 0-10 ;
10-20 ; 20-30 ; 30-50 ; 50-70 et 70-100 mm) et le long d’un gradient spatial horizontal de
maturité de la matière organique.
Les sédiments ont été échantillonnés en mars 2010 et juin 2011, au niveau de l’horizon de
surface (0-5 mm) et au niveau d’un horizon plus profond (30-50 mm), sur trois sites soumis à
des intrusions halines (Figure II.2) :
Nombre de
stations
Nombre de
carottes
(i) le site « Lamarque » situé dans le haut estuaire, au niveau de la zone oligohaline
dont la salinité moyenne est comprise entre 0,5 et 5 PSU
(ii) le site « Saint Christoly », situé dans l’estuaire médian, au niveau de la zone
mésohaline dont la salinité moyenne est comprise entre 5 et 18 PSU
(iii) le site « Phare Richard », situé dans le bas estuaire, au niveau de la zone
polyhaline dont la salinité moyenne est comprise entre 18 et 30 PSU
106
Nombre
d'horizons
Nombre de
dates
29 3 1 2
3 3 7 1
3 3 2 1

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Sur chaque site, trois carottes ont été prélevées manuellement ou à l’aide de carottiers
multitubes (échelle décimétrique) et traitées uniformément (triplicats d’échantillonnage). Pour
chaque carotte, deux prélèvements de 1cm 3 de sédiments ont été réalisés dans chaque horizon,
préalablement homogénéisé puis conservés à -80°C soit dans un tampon de préservation de
l’ADN pour des analyses de la diversité bactérienne en ARISA soit dans du formol-EMNF
pour des analyses d’abondance bactérienne en cytométrie en flux (chapitre II.1).
2.2.3 Analyse des communautés bactériennes
Pour chaque échantillon de sédiment, une mesure de l’abondance bactérienne a été
réalisée par cytométrie en flux au sein de la plateforme Cytométrie-Imagerie de Banyuls sur
mer (France) après purification de la fraction cellulaire sur gradient de Gentodenz®
(chapitre II.1).
De même, une analyse de la diversité des communautés bactériennes a été réalisée en
collaboration avec la plateforme Genome-transcriptome de Pierroton (INRA de Bordeaux)
après extraction et purification de l’ADN total (Chapitre II.1).
2.2.4 Analyses statistiques
A partir des profils d’ARISA obtenus, un traitement de données a été réalisé (Chapitre
II.1), permettant de déterminer un optimal divisor (Osborne et al., 2006) à 1/1000.
(i.e. élimination des pics dont l’aire contribue pour moins de 1/1000 ème de l’aire totale de
l’ensemble des pics). Une procédure de binning selon Ramette (2009) via l’utilisation de
l’algorithme « interactive binner » (http://www.ecology-research.com) sous le logiciel R
(http://cran.r-project.org/) a également été appliquée. La valeur de fenêtre a été estimée à
2 ± 0.1 (WS : 2 ; Sh : 0.1). A partir de la matrice d’abondance relative obtenue, une matrice
de similarité de Bray-Curtis a été calculée via le logiciel Primer 6.0 (PRIMER-E Ltd). La
significativité et l’amplitude des différences de structure des communautés bactériennes de
groupes d’échantillons définis a priori ont été déterminées par ANOSIM sous le logiciel
Primer 6.0 (PRIMER-E Ltd).
Les significativités des différences d’abondances bactériennes et de richesse en OTU des
communautés bactériennes ont été déterminées (i) par ANOVA de Mann-Whitney lorsque 2
groupes d’échantillons non-appariés étaient comparés ou (ii) par ANOVA de Kruskall-Wallis
107

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
ou de Friedman lorsque 2 groupes d’échantillons indépendants ou appariés étaient comparés.
Ces tests ont été réalisés à l’aide de la macro-commande Merlin sur Excel 2007. Le seuil de
significativité retenu était de 0.05 ; une valeur inférieure à 0.01 indiquant une significativité
importante.
2.3 Résultats
2.3.1 Abondance et structure des communautés bactériennes du Bassin d’Arcachon
Les principaux résultats de l’analyse des communautés bactériennes du Bassin
d’Arcachon sont présentés au niveau du chapitre II.1.
L’analyse de la structure génétique des communautés bactériennes des sédiments de
surface a mis en évidence la présence de deux types de communautés bactériennes l’une
peuplant les sédiments intertidaux vaso-sableux hétérogènes, la seconde peuplant les
sédiments subtidaux sablo-vaseux homogènes.
d’abondance.
Ces deux communautés bactériennes ne présentent pas de différence significative
2.3.2 Abondance et structure des communautés bactériennes de la VOG
Pour les 63 échantillons confondus, l’analyse de la diversité génétique bactérienne
montre la présence de 295 OTU de taille variant de 200 à 1122 pb. Sur le site V1, 266 OTU
ont été observées dont 3 % présentaient, indépendamment de l’horizon, un caractère constant
(présentes dans tous les réplicats) et 24 % un caractère rare (c'est-à-dire présentes dans moins
de 10% des réplicats). Sur le site V3, 194 OTU ont été observées dont 14 % d’OTU
constantes et 64 % d’OTU rares. Sur le site V4, 224 OTU ont été observées dont 4 % d’OTU
constantes et 54% d’OTU rares. Parmi elles, 166 OTU soit 56 % étaient présentes sur les trois
sites échantillonnés dont seulement 2 OTU ubiquistes (OTU 308 et OTU 348) c'est-à-dire
présentes dans tous les réplicats de toutes les stations.
L’analyse des similarités de Bray-Curtis dont les différences sont représentées sur un
MDS (Figure II.3), met en évidence une différence significative (2way-ANOSIM, R = 0.36 ;
p < 0.01) de la structure des communautés bactériennes des trois sites avec une différence
plus marquée pour le site V1 (Tableau II.2). Aucune différence significative de la structure
108

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
des communautés bactériennes n’a été observée entre les horizons quelle que soit la station
(2way-ANOSIM, p>0.05).
Figure II.3 : Structure des communautés bactériennes de la VOG déterminée par ARISA :
comparaison des similarités de Bray-Curtis représentées sur un MDS.
Site
Valeur du R de
l'ANOSIM
V1 vs V3 0.37
V1 vs V4 0.39
V3 vs V4 0.41
Tableau II.2 : Valeur de R de l’ANOSIM (100000 permutations) basée sur la comparaison
des similarités de Bray-Curtis entre les sites V1, V3 et V4 de la VOG.
Les mesures ayant été réalisées en triplicat, pour chacun des 7 horizons par site, la
variabilité moyenne intra-site a pu être calculée à partir de la matrice de similarité de Bray-
Curtis. Cette variabilité est significativement plus faible à V1 (40 ± 16 %) qu’à V3 (59 ±
11 %) et V4 (60 ± 17 %) (Mann-Whitney, p < 0.05).
En parallèle l’abondance procaryotique a été mesurée par cytométrie en flux. La
comparaison inter-site des abondances d’un même horizon, n’a pas mis en évidence de
109
V1:
V3: +
V4: ×
2D Stress: 0,12
Stress : 0.12

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
différence d’abondance entre les 3 sites (Friedman, p > 0.05). En revanche, une diminution
significative de l’abondance, le long de la colonne sédimentaire a été observée, quelque soit le
site avec une abondance moyenne de 39.10 7 ± 16.10 7 cell.g -1 de sédiment à l’interface
eau/sédiment et de 9.10 7 ± 6.10 7 cell.g -1 sédiment au niveau de l’horizon 70-100 mm.
2.3.3 Abondance et structure des communautés bactériennes de l’estuaire de la Gironde
A partir des profils d’ARISA, une analyse de la diversité génétique bactérienne a été
réalisée pour les échantillons prélevés en mars 2010 et uniquement pour les sites Lamarque et
Phare Richard. En effet aucun amplificon n’a pu être obtenu par PCR pour les échantillons
des deux horizons du site Saint Christoly.
L’analyse des similarités de Bray-Curtis a mis en évidence une différence significative
(2way-ANOSIM, R = 0.463; p < 0.03) de la structure des communautés bactériennes des deux
sites avec une différence plus marquée pour l’horizon 30-50 mm [ANOSIM, R = 0.852,
p < 0.1, valeur non significative due au faible nombre de réplicats et par conséquent au
nombre de permutations possibles (10)]. Le site Phare Richard a montré une structure de
communautés bactériennes différente entre les horizons (ANOSIM, R= 0.63, p < 0.1),
contrairement au site Lamarque (ANOSIM, R= 0.037, p = 0.7).
Les abondances des procaryotes sur les 3 sites d’étude, ont été mesurées en mars 2010
et juin 2011. Les résultats sont présentés sous forme d’un histogramme (Figure II.4)
différenciant les abondances procaryotes en cell.g -1 de sédiment en fonction des sites
échantillonnées et des horizons étudiés.
Lorsque l’on considère l’horizon sédimentaire, aucune différence significative
d’abondance procaryote n’a été observée entre les deux dates échantillonnées, à l’exception
du site Phare Richard dont l’horizon 30-50 mm présentait une abondance procaryote plus
élevée en mars 2010 qu’en juin 2011 (0.68 ± 0.17 x 10 7 vs 0.20 ± 0.10 x 10 7 cell.g -1 de
sédiment ; Mann-Whitney, p > 0.05).
En mars 2010, seul le site Saint Christoly montre une variation spatiale verticale
d’abondance procaryote, présentant avec une abondance significativement plus élevée dans
l’horizon 0-5 mm que dans l’horizon 30-50 mm (Mann-Whitney, p < 0.05). Une variation
110

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
spatiale horizontale a été observée au niveau de l’horizon 30-50, le site Lamarque hébergeant
une plus forte abondance procaryote (1.2 ± 0.4 x 10 7 cell.g -1 de sédiment) que le site Phare
Richard (0.68 ± 0.17 x 10 7 cell.g -1 de sédiment). Ce site hébergeait une plus forte abondance
procaryote que le site Saint Christoly (0.070 ± 0.022 x 10 7 cell.g -1 de sédiment) (Mann-
Whitney, p < 0.05). En revanche aucune variation d’abondance procaryote, entre site, n’a été
observée pour l’horizon 0-5 mm (Kruskall-Wallis test, p > 0.05) avec une valeur d’abondance
procaryote moyenne de 1.5 ± 0.7 x 10 7 cell.g -1 de sédiment.
En juin 2011, les trois sites échantillonnés ont montré également une variation spatiale
verticale d’abondance procaryote, l’horizon 0-5 mm présentant une abondance
significativement plus élevée (1.3 ± 1.3 x 10 7 cell.g -1 de sédiment) que l’horizon 30-50 mm
(0.27 ± 0.37 x 10 7 cell.g -1 de sédiment). Aucune différence significative d’abondance
procaryote, n’a été observée entre le site le plus en amont (Lamarque) et celui le plus en aval
(Phare Richard), pour les deux horizons étudiés (Mann-Whitney, p > 0.05). En revanche, le
site médian, Saint Christoly, présentait des abondances procaryotes significativement plus
faibles que les deux autres sites (Mann-Whitney, p < 0.05) aussi bien pour l’horizon 0-5 mm
(0.49 ± 0.13 x 10 7 vs 1.7 ± 1.4 x 10 7 cell.g -1 de sédiment) que pour l’horizon 30-50 mm (0.064
± 0.023 x 10 7 vs 0.037 ± 0.042 x 10 7 cell.g -1 de sédiment) (Figure II.4).
111

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Figure II.4 : Abondance des procaryotes hétérotrophes en fonction des sites
échantillonnés et des horizons étudiés. La : Lamarque, St : Saint Christoly, Ri : Phare
Richard
2.3.4 Comparaison des trois écosystèmes
L’ensemble des jeux de données correspondant aux trois systèmes étudiés ont été mis en
commun afin de pouvoir analyser les patrons de diversité bactérienne le long d’un gradient de
distance géographique.
Ri
St
La
0,00E+00 1,00E+07 2,00E+07 3,00E+07 4,00E+07 5,00E+07
Ri
St
La
0,0E+00 1,0E+07 2,0E+07 3,0E+07 4,0E+07 5,0E+07
En préambule il faut noter que la disparité des jeux de données limite leurs interprétations.
Le nombre d’échantillons par écosystème est très différent entre les trois écosystèmes étudiés
(i.e. 174 échantillons pour le Bassin d’Arcachon vs 63 échantillons pour la VOG vs 18
échantillons pour l’estuaire de la Gironde). Aucun réplicat temporel n’a été réalisé, hormis
pour le Bassin d’Arcachon (duplicat). De plus, si des descripteurs communs ont été analysés,
les outils/méthodes utilisés pour les caractériser diffèrent entre les trois écosystèmes.
112
Juin 2011
Mars 2011
Abondance procaryotes (cell.g -1 de sédiment)
0-5mm
30-50mm

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
L’analyse des similarités de Bray-Curtis entre l’ensemble des communautés
bactériennes, dont les différences sont représentées par un MDS (Figure II.5), a mis en
évidence une différence significative (ANOSIM, R = 0.508 ; p < 0.01) de la structure des
communautés bactériennes des trois écosystèmes. Les comparaisons entre les écosystèmes
deux à deux ont montré une différence plus marquée (i.e. valeur du R de l’ANOSIM plus
grande) entre les communautés bactériennes de l’estuaire de la Gironde et celles des deux
autres écosystèmes (Estuaire de la Gironde vs VOG : ANOSIM, R = 0.833 ; p 0.05).
VOG
Bassin d’Arcachon
Estuaire de la Gironde
Figure II.5: MDS représentant les différences de structures des communautés bactériennes
des sédiments des trois écosystèmes étudiés, basé sur l’analyse des similarités de Bray-Curtis.
113
2D Stress: 0,22
Stress : 0.22

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Figure II.6 : Relation « distance-decay » appliquée aux communautés bactériennes du Bassin
d’Arcachon, de la VOG et de l’Estuaire de la Gironde
2.4 Discussion
Similarité de Bray-Curtis (%)
100
80
60
40
20
L’étude de ces trois écosystèmes nous a permis de comparer les patrons de diversité
des communautés bactériennes à diverses échelles géographiques.
L’analyse de 255 échantillons de sédiments provenant de 34 stations de trois
écosystèmes, pose d’abord la question de la dominance/rareté des OTU au sein des
communautés bactériennes.
0
Les communautés bactériennes des trois écosystèmes étudiés sont composées d’une
importante proportion d’OTU rares souvent supérieure à 50%. La présence systématique de
quelques OTU avec de fortes abondances relatives au sein de chaque site, contribue jusqu’à
46 % de l’abondance totale. Ces OTU peuvent être qualifiées d’OTU dominantes au sein de
leurs communautés respectives (Figure II.7).
Similarité de Bray-Curtis = -0,0935 distance géographique + 38
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Distance géographique (km)
114

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
Abondance relative au
sein d’un échantillon (%)
50
40
30
20
10
0
OTU
dominantes
1 10 100 1000 10000 100000
Nombre d’OTU
Figure II.7: Dominance ou rareté des OTU au sein des communautés bactériennes
Ce type de structure de communautés apparait comme classique et suit les modèles
structuraux observés aussi bien chez les macro-organismes (Grime, 1997) que chez les micro-
organismes (Hughes et al., 2001; Zhou et al., 2002). Cependant cette diversité d’espèces
(OTU) rares chez les micro-organismes est bien supérieure à celle observée chez les macro-
organismes amenant Sogin et al. (2006) à introduire la notion de « biosphère rare ». La
présence de ces OTU rares et leurs rôles potentiels sont très controversés. En effet Kunin et al.
(2010) considèrent ces OTU comme un artéfact car elles présentent un caractère aléatoire.
D’autres auteurs comme Galand (2009), Pedros Alio (2006) ou Sogin et al. (2006) soutiennent
l’hypothèse que ces OTU assureraient une fonction encore méconnue au sein des
écosystèmes. L’une de ces fonctions pourrait être liée à la capacité de résilience des
écosystèmes (Grime, 1997; Sogin et al., 2006). Cependant, si la « biosphère rare » peut
présenter un fort intérêt lorsque l’on s’intéresse à la diversité fonctionnelle d’une
communauté, l’approche « Multivariate Cutoff Level Analysis (MultiCoLA) de Gobet et al.
(2010) a montré qu’en éliminant 35-40% des OTU rares obtenus par pyroséquencage, les
patrons écologiques sont maintenus, montrant la robustesse des approches de diversité β à la
présence (ou non présence) de ces OTUs rares. Notre analyse par ARISA et T-RFLP de la
dynamique spatiale des communautés procaryotes du Bassin d’Arcachon, nous amène
également à la même conclusion. En effet l’analyse faite à partir des variations d’abondances
relatives des 10-20 OTU ubiquistes au sein de l’écosystème, génère des patrons identiques à
ceux obtenus à partir de l’analyse du jeu de données complet comportant 739 OTU.
115
VOG
Vasiere
Bassin d’Arcachon Bassin d'arcachon
Estuaire de la estuaire Gironde
OTU rares

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
L’ensemble de ces résultats amène donc à réfléchir sur l’utilité de techniques de séquençage
massif qui génèrent des jeux de données complexes à analyser, lorsque l’on s’intéresse
uniquement à la diversité β des communautés procaryotes.
A l’échelle locale, les paramètres influant sur la dynamique spatiale horizontale des
communautés bactériennes apparaissent semblables pour les trois écosystèmes étudiés.
La qualité de la matière organique est l’un de ces paramètres. En effet l’étude des
similarités entre les communautés bactériennes des trois sites de la VOG montre que le site
V1 se distingue fortement des sites V3 et V4. Les flux benthiques totaux mesurés en parallèle
montrent une décroissance de V1 à V4 indiquant une dégradation de la matière organique
provenant des rejets continentaux de la Gironde (Deflandre, 2011). Il en résulterait une
diminution de la labilité de la matière organique disponible à la dégradation sur les sites V4 et
V3 par rapport à V1. De plus la mesure du rapport chlorophylle a / (chlorophylle a +
phéophytine a), descripteur de la qualité de la matière organique végétale, montre la présence
de matière végétale plus labile à la station V1 qu’aux deux autres stations (Deflandre, 2011).
La qualité de la matière organique disponible à l’assimilation par les bactéries pourrait alors
être un facteur structurant les communautés bactériennes. La qualité de la matière organique
(i.e. rapport C/N) est également l’un des facteurs structurant mis en évidence par l’analyse
BIOENV au niveau du Bassin d’Arcachon en avril 2009.
La granulométrie semble également jouer un rôle structurant au sein de ces
écosystèmes. En effet, l’analyse BIOENV met également en évidence au niveau du Bassin
d’Arcachon, la structuration des communautés procaryotes par la granulométrie sédimentaire,
à travers l’indice de Trask qui traduit l’hétérogénéité de taille des particules, la médiane
granulométrique mais aussi le pourcentage en pélite. Au niveau de la VOG et en particulier au
site V1, la variabilité intrasite de la granulométrie (e.g. couche de sable de 0.5 mm d’épaisseur
à la surface de certaines carottes de V1) (Deflandre, 2011) pourrait également expliquer la
variabilité des communautés bactériennes qui y est observée. En effet les propriétés
granulométriques des particules sédimentaires sont souvent décrites comme structurant les
communautés bactériennes en milieu terrestre (Kotani-Tanoi et al., 2007) comme en milieu
benthique (Jackson and Weeks, 2008).
Un autre facteur structurant commun entre le Bassin d’Arcachon et la VOG, est la
présence d’oxygène. Ce facteur explique partiellement la différence entre les deux sous-
communautés procaryotes à Arcachon (limite oxique/réduit) et pourrait expliquer la forte
116

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
variabilité intra-site observée sur le site V1 de la VOG. En effet, la distribution de l’O2 montre
elle-aussi une forte variabilité sur le site V1 (Deflandre, 2011). La corrélation entre la
composition des communautés bacteriennes et la stratification des composés redox est
d’ailleurs largement démontrée aussi bien dans les sédiments marins que dans les sols
(Pett-Ridge 2005 ; Edlund et al., 2008).
D’autre part, il semblerait y avoir un lien fort entre la structure des communautés
procaryotes et celle de la macrofaune benthique et cela pour les trois écosystèmes étudiés.
D’un côté, nous avons montré au niveau du Bassin d’Arcachon une importante corrélation
entre les matrices de ressemblance des deux types de communautés. D’un autre côté,
l’estimation de l’importance des structures biologiques à l’aide d’un profileur d’images
sédimentaires (SPI) qui permet de déterminer un indice BHQ (Benthic Habitat Quality index
(Nilsson et Rosenberg, 1997) pour chaque site (Deflandre, 2011) et l’analyse des
communautés bactériennes discriminent l’une comme l’autre le site V1 des sites V3 et V4.
L’activité de bioturbation pourrait influer sur les communautés bactériennes en modifiant par
exemple la structure de l’habitat sédimentaire (e.g. granulométrie) (Bertics and Ziebis, 2009).
Les sites V3 et V4 montrent également une forte homogénéneité spatiale verticale qui
s’expliquerait par la présence d’une abondante faune benthique dont la présence de plusieurs
espèces bioturbatrices comme Labidoplax digitata et Callianassa subterranea sur le site V4
(Deflandre et al., 2011). Ces espèces bioturbatrices pourraient engendrer un remaniement
sédimentaire conduisant à la fois à un brassage des espèces bactériennes en introduisant les
espèces des couches supérieures vers les couches inférieures mais également à un brassage
des composés chimiques (Bertics and Ziebis, 2009). Enfin au niveau de l’estuaire de la
Gironde, les résultats mettent en évidence un lien étroit entre la respiration et l’abondance des
procaryotes hétérotrophes à travers une équation corrélant l’activité de respiration à
l’abondance des procaryotes de subsurface et à l’abondance de la macrofaune benthique
(Delmares, 2011).
A l’échelle locale, chaque système présenterait ses spécificités : structure des habitats
définie par (i) la structure des communautés de macro-invertébrés (Bassin d’Arcachon), (ii) le
gradient de matière organique (Vasière Ouest-Gironde) ou (iii) gradient halin (estuaire de la
Gironde). Pour les communautés bactériennes des sédiments, des facteurs environnementaux
attendus (qualité de la matière organique, O2, macrofaune) conditionnent les assemblages.
Cependant ce type d’approche où les facteurs sont confondants, ne permet pas de conclure sur
117

Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
le rôle structurant de chaque facteur, mais met plutôt en évidence de manière générale une
sélection des espèces (OTU) par l’environnement à l’échelle locale.
Le but de cette comparaison des trois écosystèmes était également de s’intéresser à la
structuration des communautés bactériennes à l’échelle globale.
Si la distribution des bactéries a longtemps été soutenue par la théorie de la
distribution cosmopolite, les récentes études basées sur des approches moléculaires révèlent
une distribution biogéographique. L’étude de Cho et Tiedje (2000) est l’une des premières à
mettre en évidence des patrons « distance-decay» en comparant des sites sur quatre continents
par des approches d’empreinte moléculaire (BOX-PCR). Franklin and Mills (2003) ont
montré cette même relation à plus faible échelle (2,5 cm à 11 m) tandis que Hillebrand et al.
(2001) se sont attachés à montrer cette relation chez des eucaryotes unicellulaires à une
échelle de 1 to 1000 km. Mettre en évidence une dynamique biogéographique des
communautés procaryotes n’est pas évident puisqu’il est difficile de s’affranchir des facteurs
environnementaux autres que la distance géographique. C’est une des limites actuelles
majeures des études (Green and Bohannan, 2006). Nous nous sommes donc intéressés aux
patrons de diversité des bactéries du sédiment de trois écosystèmes présentant des
similitudes : trois écotones présentant une accumulation de matière particulaire fine et dont les
apports océaniques ont la même origine, le Golfe de Gascogne. Notre approche par ARISA
met en évidence une diminution de la similarité entre les communautés avec l’éloignement
géographique des écosystèmes. Cependant bien que les deux sites de l’estuaire soient distants
de plus de 60 km, ils montrent une similarité inter-site équivalente à la similarité intra-site. De
même, au sein du Bassin d’Arcachon, la distance géographique entre les sites n’est pas un
facteur explicatif de la structure des communautés, montrant alors, qu’au sein d’un système
les facteurs environnementaux domineraient sur la distance géographique dans les processus
régissant les assemblages bactériens. Une étude identique sur les sédiments prélevés entre Los
Angeles et l’île Santa Catalana (environ 35 km) avait abouti à des conclusions identiques
(Hewson et al., 2007). L’hypothèse de Baas-Becking « everything is everywhere, but, the
environment selects » serait donc valable à cette échelle.
118

2.5 Réferences
Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
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Chapitre II: Communautés procaryotes des sédiments
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CHAPITRE III:
Diversité des procaryotes à l’échelle d’un
organisme benthique : cas des bivalves
fouisseurs
121

122

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Ce chapitre porte sur le déterminisme de la structure des communautés bactériennes
associées à deux espèces de bivalves fouisseurs (la coque Cerastoderma edule et la palourde
Ruditapes philippinarum). La structure de ces communautés a été analysée par une technique
d’empreinte moléculaire, l’ARISA.
La dynamique des communautés bactériennes associées à un hôte vivant est plus
complexe que celle d’un habitat inerte comme le sédiment du fait du caractère « vivant » de
cet hôte. En effet, les communautés bactériennes associées aux bivalves (CBAB) résultent à la
fois de processus de transmission latérale par balnéation et filtration dans un habitat septique
mais également de processus de transmission verticale et/ou horizontale c'est-à-dire
directement entre hôtes. Les processus de transmission latérale impliquent que les CBAB sont
potentiellement influencées par la dynamique spatiale et temporelle des communautés
bactériennes de l’habitat des bivalves (eau et sédiment). Les processus de transmission
verticale et/ou horizontale impliquent, eux, une co-évolution possible entre les CBAB et leur
hôte. Ces modes de transmission peuvent suggérer un déterminisme des CBAB par l’habitat
de l’hôte et par l’hôte lui-même (Figure III.A). Ce sont ces hypothèses qui ont été
investiguées au cours de ce chapitre.
Dans une première partie (Chapitre III.1) les CBAB ont été caractérisées à l’échelle
d’un bivalve entier (la coque Cerastoderma edule), en lien avec son niveau d’infestation par
un parasite trématode digène Bucephalus minimus. Cette caractérisation a été conduite sur des
individus appartenant à une cohorte sur une durée de 10 mois. Comme pour l’habitat
sédimentaire (Chapitre III), les CBAB étaient caractérisées par un nombre important d’OTU
présentant un caractère aléatoire et peu abondant. De plus, aucune dynamique temporelle ni
aucun effet de l’infestation parasitaire sur les CBAB à l’échelle de l’individu n’a été constaté.
Il a été émis l’hypothèse que la forte similarité entre les communautés bactériennes
d’individus physiologiquement différents pourrait être due à la dominance des communautés
issues du tube digestif. Il nous est alors apparu important, pour les prochaines études, de non
plus considérer les CBAB à l’échelle de l’individu entier mais à l’échelle plus fine de
l’organe.
Dans une deuxième partie (Chapitre III.2), notre intérêt s’est donc porté sur les CBAB
d’un second modèle de bivalve marin, la palourde Ruditapes philippinarum, à l’échelle de
trois organes: les branchies et le tube digestif considérés comme les sites primaires d’infection
bactérienne car étant le plus en contact avec le milieu extérieur, et un pool d’organes internes
123

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
(dénommé reste) séparé de la contamination bactérienne du milieu extérieur par des barrières
physiques et immunitaires. Afin d’investiguer la part du déterminisme d’habitat de celle du
déterminisme d’hôte sur la structure des communautés bactériennes, notre étude s’est basée
sur la comparaison des communautés bactériennes d’individus appartenant à deux lots de
palourdes présentant un état physiologique différent et provenant d’habitats contrastés. La
structure des communautés bactériennes a été caractérisée d’une part sur des individus de
l’habitat naturel et d’autre part sur des individus ayant subi une expérience de transplantation
croisée afin de mieux différencier la part des deux types de déterminisme. Les résultats de
cette étude ont mis en évidence l’influence majoritaire de l’habitat sur les CBAB du tube
digestif et des branchies alors que la structure des CBAB des tissus internes plus constante,
suggérerait un déterminisme d’hôte. De plus la modification de l’état de santé par le
changement d’habitat apparait également comme un facteur structurant les CBAB de
l’ensemble des organes étudiés.
Pour valider l’hypothèse d’un déterminisme d’hôte sur les CBAB des organes internes,
la dernière partie de ce chapitre (Chapitre III.1) s’est intéressée à comparer les CBAB de deux
espèces de bivalves fouisseurs vivant en sympatrie. Les CBAB de ces deux bivalves ont été
analysées en distinguant d’une part les branchies et le tube digestif liés au milieu extérieur, de
plusieurs organes internes et en particulier l’hémolymphe qui en tant que support de la
capacité immunitaire peut être considérée comme le compartiment le plus interne et le plus
contrôlé de l’hôte. D’autre part un intérêt particulier a été porté aux CBAB les plus
étroitement associées à leur hôte. Pour cela des individus des deux espèces ont subi une étape
de dépuration de 21 jours afin d’éliminer la flore transitoire la moins étroitement associée aux
bivalves. La comparaison des CBAB des deux hôtes bivalves a révélé une spécificité d’hôte
de l’ensemble des CBAB des organes étudiés excepté celles du tube digestif dont le
déterminisme d’habitat resterait le plus contributif. L’expérience de dépuration a mis en
évidence que la majorité des CBAB associées au tube digestif était composée de populations
transitoires faiblement associées alors que les CBAB des branchies présentaient une forte
proportion de populations plus étroitement associées.
Finalement l’ensemble de ces études a permis de mettre en évidence deux
compartiments modèles pour l’étude des CBAB, le tube digestif majoritairement lié à l’habitat
et l’hémolymphe majoritairement liée à l’hôte. Le choix de ces deux modèles apparait donc
pertinent pour de futures études sur les CBAB et en particulier pour une vision fonctionnelle
de leur structure.
124

Etat de santé de l’hôte
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Partie 1: Diversité
bactérienne à l’échelle
d’un individu
Espèce de l’hôte
Partie 3: Diversité bactérienne à
l’échelle de l’organe :
déterminisme d’espèce
CBAB des organes
internes
Transmission verticale et
horizontale
CBAB d’un bivalve
Organes
Partie 2: Diversité bactérienne à
l’échelle d’un organe :
déterminisme d’hôte ou d’habitat
Figure III.A: Communautés bactériennes associées aux bivalves : mise en évidence d’un
déterminisme d’hôte ou d’habitat
125
Habitat de l’hôte
Transmission latérale
CBAB pour communautés bactériennes associées aux bivalves
Partie 2: Diversité
bactérienne à l’échelle
de l’ organe :
déterminisme d’hôte ou
d’habitat
CBAB du tube digestif
des branchies

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
126

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
1. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un individu
Dynamics of Bacterial Communities in Cockles (Cerastoderma edule) with Respect to
Trematode Parasite (Bucephalus minimus) Infestation.
Author names: Guillaume Meisterhans 1 , Natalie Raymond 1 , Solène Lebreton 1 , Franck
Salin 2 , Line Bourasseau 1 , Xavier de Montaudouin 1 , Frédéric Garabetian 1 , Florence
Jude-Lemeilleur 1
Affiliations and Addresses:
G. Meisterhans 1 (g.meisterhans@epoc.u-bordeaux1.fr),
N. Raymond 1 (n.raymond@epoc.u-bordeaux1.fr)
S. Lebreton 1
L. Bourasseau 1 (l.bourasseau@epoc.u-bordeaux1.fr)
X. de Montaudouin 1 (x.de-montaudouin@epoc.u-bordeaux1.fr)
F. Garabetian 1 (f.garabetian@epoc.u-bordeaux1.fr)
F. Jude-Lemeilleur 1 ( f.jude@epoc.u-bordeaux1.fr)
F. Salin 2 (franck.salin@pierroton.inra.fr)
1 Université de Bordeaux UMR 5805 EPOC Bordeaux F-33000 France.
2 Plateforme Génôme-transcriptôme de Pierroton UMR BIOGECO 1202 INRA - Université
Bordeaux 2
Original manuscript submitted to Microbial Ecology on the 5 th November, 2010.
Revised manuscript submitted to Microbial Ecology on the 20 th January, 2011
Accepted manuscript to Microbial Ecology on the 31 St January, 2011
Correspondence to : F. Jude-Lemeilleur, Université de Bordeaux UMR 5805 EPOC, station
marine d’Arcachon, 2 rue du Pr Jolyet F-33120 Arcachon, France. Phone: +33556223911;
Fax : +33556835104 ; E-mail : f.jude@epoc.u-bordeaux1.fr
Short title: cockle bacterial communities
127

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
128

Abstract:
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
The bacterial communities associated with the cockle (Cerastoderma edule) were investigated
at the individual level through a 10 month monitoring programme. Temporal changes and
those changes associated with a common parasite of the cockle, Bucephalus minimus were
investigated by monthly sampling of individuals, selected based on their shell length (cohort
monitoring). Cockle bacterial community abundance (CBCA) and diversity (CBCD) were
estimated by epifluorescence microscopy counts and ARISA (Automated Ribosomal
Intergenic Spacer Analysis) respectively. CBCA showed a temporal pattern peaking at 30 x
10 6 cells per gram of cockle flesh and intervalval liquid in October and a significant 1.8 fold
increase linked with B. minimus occurrence. CBCD was characterized by 112 ± 26 ITS
(Intergenic Transcribed Spacer) per individual and showed a relative homology between
individuals (52 ± 6 % , Jaccard similarity) in spite of more than 30% of rare ITS. Consistent
with an undisturbed evolution of the condition index of the studied cohort individuals as an
estimate of their physiological state, neither temporal nor parasite induced change in CBCA
have been related to marked changes in CBCD.
129

Introduction
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Many types of close associations between marine invertebrates and microorganisms
have been described [27]. Some microorganisms are reported to colonize the host tissues as
intracellular endosymbionts [8] or endoparasites [2, 4] which can be acquired by vertical
transmission from parent to offspring [9] or by bathing in a septic environment including
horizontal transmission by contemporary hosts [31, 42]. Other associations between marine
invertebrates and microorganisms occur in the digestive tract of the animals [39]. The gut
microflora includes mutualistic resident bacteria, commensal or benign parasitic transient
bacteria and, lysed and absorbed bacteria [27]; the latter represent preys in a trophic
interaction sensu stricto. However literature dealing with the diversity and community
dynamics of microorganisms in their host related to the dynamics of host populations remains
scarce.
Choosing the cockle (Cerastoderma edule, L.), a common European bivalve of many
coastal ecosystems, as an example and considering that during their life individuals grow,
mature, progressively change their trophic sources [49], harbour different trematode parasites
[16] and face varied climatic situations [19], we can hypothesize that bacterial communities
associated with cockles will also undergo variation in structure, and abundance.
The cockle represents a good biological model due to its economic value [20] and its
ecological relevance for ecosystem functioning (e.g. bioturbation) [26]. Also, previous studies
reported the occurrence of food borne pathogens and fecal indicator bacteria [38] and the
infection by mycoplasma-like bacteria [3] or rickettsia-like bacteria [7], or by numerous
trematode species suggesting contrasted patterns of interaction among these different
organisms [5, 44]. These studies questioned the link between bacteria, macroparasite
occurrence and individual cockle fitness.
To address this issue, our study aimed (i) to characterize the structure (density,
molecular fingerprints) of cockle bacterial communities (CBC) at the individual scale
including methodological settings needed for bacterial genotyping in such a matrix (ii) to
assess the CBC dynamics in cockle individuals of a given cohort during 10 months; (iii) to
estimate whether the occurrence of a trematode parasite in cockles may impair bacterial
communities in terms of diversity and abundance. Bucephalus minimus was selected because
130

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
this species uses the cockle as a first intermediate host [13]. It means that the parasite
reproduces asexually in the cockle, invades most of its tissues and that strong metabolic
disturbance are expected. We monitored on a monthly basis the abundance (epifluorescence
microscopy counts) and the genetic diversity (semi-nested ARISA fingerprinting) of bacterial
communities associated with one individual cockle (CBC).
Materials and Methods
Sampling sites
Cockles were sampled in the National Reserve of Banc d’Arguin situated in Arcachon
Bay, a macrotidal lagoon along the French Atlantic coast (44°40’N, 1°10’W). At Banc
d’Arguin, the habitat consists of moderately sheltered intertidal sand flats (median grain size
= 350 µm). The water salinity and temperature ranges are 34 - 35 psu, and 9.5 - 21.0°C
respectively. The benthic community biomass is dominated by cockles with abundance
reaching 100 to 200 ind∙m -2 [17]. This population is characterized by high demographic
fluctuations, fast individual growth and a relatively short lifespan [24].
Cockle characterization
Cockles from the May 2006’s cohort were sampled monthly at low tide from January
to October 2007. This age-class was identified by cohort analysis. Individuals were
selectively sampled using the shell length. At each occasion, a minimum of one hundred
buried cockles were collected by hand, measured to 1-mm precision with a calliper, and
stored at 4°C during transport to the laboratory. Cockles located at the sediment surface were
discarded due to poor condition as Blanchet et al. [5] suggested that this abnormal position
was a prelude to cockles’ death [16]. Prior to analyses, samples were stored at -20°C less than
6 months. After thawing, cockles were washed with tap water, and opened under sterile
conditions according to the French standards for bacteriological analyses of marine bivalves
(AFNOR NF V 08-600 of October 2000). Individual shell mass and flesh and intervalval
liquid (FIL) mass were weighed to 0.1 g precision. The wet FIL mass was converted to dry
FIL mass using the following equation: dry FIL mass = 0.1259 x wet FIL mass
(de Montaudouin, personal data). Condition index was measured as the ratio of the dry FIL
mass (in mg) to the shell dry mass (in g) [51].
131

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
B. minimus occurrence
In order to note presence/absence of B. minimus (Bm+ versus Bm-) the foot of cockles
was cut, squeezed between two sterile glass slides, and observed under a stereomicroscope
(NIKON SMZ1500, HR plan Apo 1) [14]. The prevalence was defined as the percentage of
parasitized cockles [6]. Then, FIL were shredded (blade OMNI TH) and stored in sterile
flasks, at -20°C, for less than 2 years, until bacterial counts and diversity analyses were
carried out.
Bacterial counts
Samples (shredded FIL) were thawed into a preservative buffer (Tris-HCl, 300 mM
pH8; 0.1 M NaCl; 20 mM EDTA). Analyses were performed, for each month, on each FIL of
between 2 and 5 Bm+ found and from each FIL of 3 Bm- cockles. An aliquot of 50 µL of
each sample was labelled with a mixture containing two volumes of SYBR® Green I (25X,
Molecular Probes, Invitrogen Cergy Pontoise, France) for one volume of propidium iodide
(60µM, Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise, France). This mixture is a
modification of LIVE/DEAD® BacLight TM Bacterial Viability kit that is usually used to
differentiate live from dead bacteria. It was applied to allow a better discrimination between
bacteria and tissues of cockles. After fixation for 15 min at room temperature in darkness,
samples were filtered onto 0.2-µm GTBP-pore-size, 25-mm diameter Isopore membrane
filters (Millipore, Molsheim, France) under low vacuum pressure (200 mm Hg). The filters
were removed from the filtering tower and mounted in non fluorescent immersion oil between
a glass slide and cover slip, and stored at 4°C until counting with an epifluorescence
microscope (Olympus BH2-RFCA, excitation filter BP490, magnification 1000) was carried
out. Cockle bacterial community abundance (CBCA) was calculated using the following
formula [CBCA=(FAxTN)/(SFxVxF)], with CBCA as number of cellular units per mL of
sample; FA: effective Filtration Area of the membrane filter (here FA = 201 mm 2 ); TN: Total
Number of cellular units (here TN ranged between 150 to 250); SF: Surface of microscopic
Field (0.02 mm 2 ); V: filtered Volume (mL) and F: number of observation Fields investigated
(here F = 50 minimum). The potential dilution of the FIL was taken into account for
calculation of CBCA. The results were expressed as cell units per g of FIL.
132

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Cockle bacterial community structure analysis by ARISA
Changes in the cockle bacterial community diversity (CBCD) were assessed using the
PCR-based whole-community fingerprinting approach ARISA (Automated Ribosomal
Intergenic Spacer Analysis) of bacterial DNA [21]. ARISA amplifies the Intergenic
Transcribed Spacers (ITS) between the 16S and 23S rRNA genes using a fluorescent primer
and the ITS size represents the operational taxonomic unit (OTU). Results are displayed as
the amount of different PCR products of specific fragment length (ITS size). For each cockle,
DNA was extracted from 6 replicates of 25 mg of FIL, using a bead beating method (FastPrep
and lysis matrix A; 6 m∙s -1 ; 40 s, MP Biomedicals, Illkirch, France) coupled to QIAamp DNA
Mini Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France). For each cockle, the pooled amount of DNA
extracted from 150 mg (6 x 25 mg) of cockle FIL was determined by spectrofluorimetry
(LS 55, PerkinElmer, Courtaboeuf, France) using SYBR® Green I (Molecular Probes,
Invitrogen, Cergy Pontoise, France), and quantified using DNA standard 1mg∙mL -1 solutions
of calf thymus DNA (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France). The same amount of
extracted DNA (10 ng) was used for each ARISA amplification assay. For each sample, the
first ARISA amplification step was conducted in triplicates. The amplification was run
according to Ranjard et al. [47] using universal bacterial primers SDBact (5’-TGC GGC TGG
ATC CCC TCC TT-3’ labelled at the 5’ end with the phosphoramidite dye 5-FAM
fluorochrome) [41] and LDBact (5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3’) [41] (Molecular
Probes Invitrogen Cergy Pontoise, France) with the following conditions: (i) 94°C for 5 min;
(ii) 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min, and then (iii) 72°C for 5
min. The 25 µL-reaction mixtures contained 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.3 mg∙mL -1 of
bovine serum albumin (MP Biomedicals, Illkirch, France), 5% of DMSO, 0.2 mM of each
dNTP, 0.1 µM of each primer, 1U of Taq polymerase (Promega, Charbonnières-les-Bains,
France) and 20 ng of template DNA. A second PCR amplification was performed on 1 µL of
the pooled first step PCR amplicons using the same forward primer (SDBact) and the reverse
primer ITSReub (5’-GCC AAG GCA TCC ACC-3’) [34] (Invitrogen, Cergy Pontoise,
France) recommended in [35]. Nested (or semi-nested) ARISA, a two successive PCR
amplification of the ITS, was shown to enhance the detection threshold of natural microbial
communities originating from complex matrices that possibly contain PCR inhibitors such as
humic acids [35]. The amplification conditions were: held at 95°C for 5 min, 35 cycles of
95°C for 30 s, 61°C for 30 s, and 72°C for 90 s and a final extension of 72°C for 10 min.
Single-stage (i.e. first ARISA amplification step) and semi-nested PCR products were
133

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
purified using a QIAquick PCR Purification Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France) and
quantified by spectrofluorimetry as for extracted DNA. Two ng of purified products from
each sample were combined with 10 µL Hi Di formamide and an internal LIZ1200 standard
(Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France) before being heat treated (95°C, 5 min) and
then cooled on ice. ARISA was performed on a 3730XL Capillary Genetic Analyser (Applied
Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France), using a 50 cm capillary and standard Genemapper
protocol, which detects the relative abundance of different sized PCR products labelled with
the fluorescent primers (Plateforme Genome-Transcriptome Pierroton INRA, Bordeaux-
Aquitaine, www.pierroton.inra.fr/biogeco/site_pole_agro/genoseq.html). Results were read
using the ABI Peak scanner software provided by Applied Biosystems (Courtaboeuf, France)
where each profile of peaks in an electrophoregram defines bacterial diversity fingerprint.
Fluorescence data (peak areas and peak sizes) were exported to Microsoft Excel to allow the
data analysis. Peak size values were rounded to the nearest whole number and peaks with a
size inferior to 200 bp were considered as noise and excluded for analysis [35]. According to
Osborne et al. [43] an optimal divisor (2500) was determined to eliminate the background
fluorescence (data not shown). Moreover according to Ramette [46] data were binned
(i.e. electrophoretic profiles alignement) using the interactive and automatic binning
algorithms [their respective manuals and examples are available online (http://www.ecology-
research.com)] implemented in the free, R programming language [The R Foundation for
Statistical Computing (http://cran.r-project.org/)]. From Peakscanner output table, a custom R
binning scripts [46] was applied (WS: 2; Sh: 0.1). All peaks with relative fluorescence
intensity value inferior to 0,004 (1/optimal divisor) were not included in further analyses since
they consisted of background peaks. Therefore, to consider a maximum of peaks while
excluding background noise, only fragments with relative fluorescence intensity above a
threshold of 0.4% and ranging between 200 and 1200 bp were considered as a true peak. Each
true peak displayed represented one ITS and the peak area represented the relative abundance
of the ITS present. Data were also transformed to abundance matrix. Similarity between
profiles (presence/absence) was computed using Primer (PRIMER-E Ltd, Lutton, UK), from
the Jaccard similarity index [J = 100 x c / (a + b - c)] where a is the number of ITS found only
in sample A, b the number of ITS found only in sample B and c the number of ITS shared
between samples A and B. Similarity between profiles (relative fluorescence) was computed
from the Bray-Curtis similarity index [BC = 100 x (1 - sum (d-e))] where d is ITS relative
abundance in sample D and e ITS relative abundance in sample E. A rarefaction curve based
134

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
on Michaelis-Menten equation was designed a posteriori from the presence /absence matrix
of all samples using Primer (PRIMER-E Ltd, Lutton, UK).
Statistical analyses
Mann-Whitney and Kruskall-Wallis tests were used to compare CBCA and CBCD
similarity indexes (Jaccard and Bray-Curtis) between different sampling times or parasitic
states. Statistical differences between groups were tested using ANalysis Of SIMilarity
(ANOSIM) a random permutation tests (Monte-Carlo test, 100,000 permutations) performed
from similarity matrix [32]. Comparison of the ARISA profiles (presence/absence matrix)
obtained after single-stage and semi-nested PCR was analysed by non-multidimensional
scaling (MDS) [10]. On each MDS chart every bacterial community was represented as one
plot and the relative changes in community structure as the distances between the points. The
two MDS were superimposed and symetric procrustes rotation rotates one MDS to maximize
similarity, with the other MDS minimizing the sum of squared differences between the plots.
Statistical differences between presence/absence matrixes obtained by each method were
tested by 1,001 permutation tests. All tests and correlations were considered significant
statistically at p value ≤ 0.05.
Results
Cockle sampling set
A total of 46 cockles was analysed between January and October 2007, including 16
cockles whose tissues where found to be parasitized by B. minimus (Bm+ cockle) (Table 1).
Cockles were labelled using the sampling month number and a distinctive letter for each
individual. Shell lengths ranged from 23 1 mm in January 2007 for 8-month old cockles to
34 1 mm in October 2007 for 17-month old cockles. As a consequence of the sampling
strategy (2006’s cohort cockles were selected), no variation of the shell length was expected
within the set of cockles analysed monthly. Individual FIL mass ranged from 1.12 to 5.79 g
and varied monthly (p = 0.002, Kruskall-Wallis based on Bm- individuals). On June, July,
August and September 2007, when the number of collected Bm+ individuals was sufficient,
no differences in the cockles FIL mass were found between Bm+ and Bm- individuals
(p > 0.05, Mann-Whitney). The condition index increased from 32 4 ‰ in January 2007 to
82 14 ‰ in June (p = 0.006, Kruskall-Wallis) with no significant difference found between
135

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
May and June. From July to October the monthly mean condition index reached a plateau
around 87 5 ‰. From June to October, no significant difference in condition index was
found between Bm- and Bm+ individuals (p = 1.00, Mann-Whitney) (Fig.1.a).
.
Individual Date Shell length FIL mass
mm g
Bucephalus
minimus
136
DNA extraction
yield
µg DNA g -1 [FIL]
1a 04/01/2007 26 1,58 - 2,98
1b 04/01/2007 23 1,12 - 0,88
1c 04/01/2007 23 1,23 - 76,9
2a 01/02/2007 26 1,80 - 2,73
2b 01/02/2007 24 1,66 - 2,07
2c 01/02/2007 26 1,75 - 0,32
3a 08/03/2007 26 1,73 - na
3b 08/03/2007 25 1,55 - na
3c 08/03/2007 24 1,32 - na
4a 05/04/2007 26 2,12 - 16,1
4b 05/04/2007 27 2,28 na
4c 05/04/2007 26 2,04 - 1,06
5a 03/05/2007 27 2,18 - na
5b 03/05/2007 28 2,84 - na
5c 03/05/2007 28 2,54 - na
6a 05/06/2007 29 1,88 - 6,93
6b 05/06/2007 29 3,36 - 0,84
6c 05/06/2007 29 2,54 - 0,56
6d 05/06/2007 29 3,39 + 0,58
6e 05/06/2007 29 5,11 + 1,21
7a 04/07/2007 32 4,96 - 0,78
7b 04/07/2007 32 3,94 - 0,96
7c 04/07/2007 32 5,42 - 0,45
7d 04/07/2007 32 3,25 + 0,40
7e 04/07/2007 32 4,41 + 0,50
7f 04/07/2007 32 4,00 + 0,36
7g 04/07/2007 32 5,03 + 0,56
8a 03/08/2007 33 3,08 - 2,92
8b 03/08/2007 33 4,63 - 0,88
8c 03/08/2007 33 5,38 - 0,84
8d 03/08/2007 33 3,39 + 0,46
8e 03/08/2007 33 3,02 + 0,42
8f 03/08/2007 33 3,97 + 1,11
9a 10/09/2007 33 3,53 - 1,09
9b 10/09/2007 33 4,27 - 1,88
9c 10/09/2007 33 5,79 - 0,82
9d 10/09/2007 33 4,54 + 1,61
9e 10/09/2007 33 4,44 + 0,83
9f 10/09/2007 33 2,60 + 2,00
9g 10/09/2007 33 4,85 + 0,36
9h 10/09/2007 33 4,66 + 1,32
10a 09/10/2007 34 4,46 - 0,58
10b 09/10/2007 34 4,34 - 0,65
10c 09/10/2007 34 4,08 - 0,63
10d 09/10/2007 34 2,96 + 0,57
10e 09/10/2007 34 5,39 + 0,59
Table 1. Description of the
individual 2006’s cockle
cohort sampled at Banc
d’Arguin (Arcachon Bay) in
2007. Detection in cockle
tissues of Bucephalus
minimus is noted “+”; no
detection is noted “-”; na, not
available; FIL, Flesh and
Intervalval Liquid.

ARISA settings
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
DNA extraction yields exhibited a high heterogeneity varying between 0.32 and
16.1 µg∙g -1 [FIL]. One sampled cockle, individual “1c”, displaying a totally out of range value
(76.9 µg∙g -1 [FIL]), was excluded for further analyses.
To analyse the CBCD, the ARISA were based on semi-nested PCR amplification of a
fraction of the former amplicon. Indeed after a single-stage PCR, 21 samples out of 38 did not
display an interpretable ARISA profile (no peak detected). For the remaining 17 individuals,
the extent of amplification yields obtained by single-stage PCR varied from 0.73 to 237 ng∙ng -
1 [DNA template], mean SE = 27 8 ng∙ng -1 [DNA template] (Fig. 2). Semi-nested PCR
amplification yields varied from 349 to 1,683 ng∙ng -1 [DNA template],
mean = 817 45 ng∙ng -1 [DNA template]. One individual, cockle 9c, displaying a very low
semi-nested PCR amplification yield (43 ng∙ng -1 [DNA template]), was excluded for further
analyses. No correlation was found between single-stage PCR and semi-nested PCR
amplification yields (p = 0.56, Spearman correlation). The CBCD profiles recovered from the
two amplification strategies were compared using a procrustean rotation of the two non metric
multidimensional scaling corresponding to either the samples amplified by single-stage or
those amplified by semi-nested PCR (Fig. 3). Similar within-cluster plotting patterns were
found between the two nMDS (p < 0.22, Procrustes correlation) indicating that semi-nested
PCR amplification did not change the respective CBCD profiles obtained by single-stage PCR
amplification. CBCD was consequently analysed by semi-nested-PCR ARISA on 37 cockles.
Semi-nested PCR amplifiation yield
(ng ng -1 [DNA template] )
2000
1500
1000
500
0
0 50 100 150 200 250
Single-stage PCR amplification yield
(ng ng -1 [DNA template])
137
Fig. 2. Comparison of DNA
amplification yields
between semi-nested PCR
and single-stage PCR
amplification of cockle
bacterial communities using
Ranjard et al. [47] and
Lear and Lewis [35]
amplification protocol for
ARISA.

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Fig.3. Comparison of bacterial community profiles obtained by two different approaches (single-stage PCR and
semi-nested PCR) on cockles sampled from January 2007 to October 2007 in Banc d’Arguin (Arcachon Bay).
Plot is derived from nonmetric multi-dimensional scaling of ARISA using a Jaccard distance matrix similarity
(ITS presence/absence matrix) (black box: single-stage PCR method, white box: semi-nested PCR method).
Comparison was only realized on the bacterial communities of 17 cockle individuals which display an
interpretable ARISA profile with single-stage PCR.
Cockle bacterial community abundance (CBCA)
The CBCA was measured on sampled Bm- cockle individuals from January to
October 2007 (Fig. 1.b). During this period values of individual CBCA ranged from 1 x 10 6 to
30 x 10 6 cells∙g -1 [FIL] corresponding to 2 x 10 6 and 162 x 10 6 bacterial cells per individual,
respectively.
8e
8f
7d
7g
7g
2a 2a
9d 9d
8c 8c
7a 7a
8d 9a1a
8a 8a10d
8d
10d 9b
9b
10e
7dSn 7d
9a
1a
During the first 5 months of the monitoring (January to May 2007), monthly Bm-
CBCA were not significantly different (p = 0.34, Kruskall-Wallis), with an average of
1.9 0.3 x 10 6 cells∙g -1 [FIL]. A marked and significant increase in the CBCA was observed
between May and June, with a mean value of 12 1 x 10 6 cells∙g -1 [FIL] in June (p = 0.02,
4a
1b
138
7aSn 7a
8aSn 8a
2aSn 2a
8cSn 8c
7gSn 7g
9b
9bSn8dSn
8d
9dSn
9d
9a 9aSn 1aSn
1a
10dSn 10d
8eSn 8e
8fSn 8f
10eSn 10e
1bSn 1b
4aSn 4a

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Mann-Whitney). From August to October 2007, the monthly mean CBCA significantly
increased (p = 0.03, Kruskall-Wallis), peaking at 30 x 10 6 cells∙g -1 [FIL] in October.
Bm+ cockles were detected from June 2007 when the mean shell length was 29 mm
(Table1). The temporal pattern of Bm+ CBCA was comparable to the pattern described for
Bm- individuals; maximal values occurred in October, mean = 40 x 10 6 cells∙g -1 [FIL].
No significant difference in CBCA was found between Bm+ and Bm- individuals in
June and July (p > 0.05, Mann-Whitney). Conversely, the cockle bacterial community
abundance was 1.8 higher in Bm+ individuals than in Bm- individuals in August, September
and October (p < 0.05, Mann-Whitney).
(a)
(b)
Condition index (‰)
Bacterial abundance
cell * 106 g-1 [FIL]
140
105
70
35
0
50
40
30
20
10
0
a
a(3)
b
a(3)
b
Bm- Bm+
c
a(3) a(3) a(3)
c
c,d
d
b(3) b(2)
Jan-07 Feb-07 Mar-07 Apr-07 May-07 Jun-07 Jul-07 Aug-07 Sep-07 Oct-07
c,d
b(3)
139
d
b(4)
c,d
b(3)
c,d
d(3)
c,d
c(3)
d
d(5)
c,d
d(3)
c,d
d(2)
Fig.1. Monthly mean
condition index (a) and
bacterial community
abundances (b) of non
parasitized (Bm-) or
parasitized (Bm+) cockles
sampled from January 2007
to October 2007 in Banc
d’Arguin (Arcachon Bay).
Number of replicates is
between brackets. Error
bars represent standard
deviations (absence of error
bars is due to a lack of
replicates). Similar letters
in superscript indicate no
statistical differences
among months at p=0.05
level (Mann-Whitney).

ITS size
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
(a)
Jan-07
Feb-07
Apr-07
Jun-07
Jul-07
Aug-07
Sep-07
Oct-07
(b)
251 273
273 227
375 251
227 295
295 259
257 253
351 257
200 401
201 275
777 433
385 385
259 375
253 200
369 431
433 285
431 407
235 225
291 293
279 383
307 201
341 369
333 351
401 777
347 569
389 365
387 367
349 377
407 235
437 231
327 333
225 279
275 291
301 555
293 233
429 343
353 329
583 341
285 583
807 209
377 211
233 307
379 389
243 579
775 379
365 489
357 241
569 249
343 271
579 281
383 501
207 207
231 217
283 327
331 429
501 399
513 483
339 491
ITS size
Jun-07
Jul-07
140
Aug-07
Sep-07
oct-07
Fig.4. Frequency of
bacterial ITS detected from
individual cockles sampled
from January 2007 to
October 2007 in the
Arcachon Bay, with a
relative abundance higher
than 1%.(a)Bm- individuals
(b) Bm+ individuals.
ITS monthly frequency is
represented by a shade of
grey where the color
symbolizes the ITS
frequency: white: not
detected; light grey: 1 to 33
%; dark grey: 34 to 66 %;
black: 67 to 100 % of
analysed individuals. Open
black boxes underline the
presence of ITS only found
in Bm- or Bm+ individuals

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Cockle bacterial community diversity (CBCD)
A total of 284 ITS, ranging from 200 to 909 bp in size, was detected by semi-nested
PCR ARISA analysis of the bacterial community of 37 cockles. Among the detected ITS, 41
(14% of all ITS) were detected only in Bm- cockle set, 15 (5% of all ITS) were detected only
in Bm+ cockle set whereas 228 ITS were shared by the two sets.
Regarding temporal patterns in Bm- and Bm+ respectively, (i) 3 ITS (ITS# 227 ,251,
273) have been detected every month in every tested cockle; (ii) 77 ITS out of 269 (Bm-) and
91 ITS out of 243 (Bm+) have been detected every month and, (iii) 66 of these ITS were
found in both Bm- and Bm+ cockles. Third of the detected ITS (93 out of 284) occurred in
less than 10 % of individuals sampled during the monitoring. A focus on the 108 ITS
contributing to more than 1% of total abundance was realized (Fig.4.). Regarding their
temporal pattern in Bm- and Bm+ respectively, 9 ITS and 8 ITS have been detected every
time ; among these ITS 5 were indistinctly found in Bm- and Bm+ cockles. Half of the
detected ITS (51 out of 108) were only detected once or twice during the 10-month monthly
monitoring. These ITS were moreover characterized by a rare occurrence being generally
found in only 1 of the 3 replicate individuals.
The high proportion of rare ITS (detected by the 2 discrimination methods) resulted in
a low mean level (mostly < 50%) of Jaccard and Bray-Curtis similarities of CBC between
individuals. CBC similarities of Bm- individuals collected at different times (e.g. two
consecutive months Jaccard similarity = 49 ± 10 %, Fig. 5.a; Bray-Curtis similarity =
46 ± 14 %, Fig. 5.b) were not significantly lower than similarities recorded between
individuals collected on the same date (Jaccard similarity = 52 ± 8 %, Fig. 5.a; Bray-Curtis
similarity = 53 ± 14 %, Fig. 5.b) (p > 0.1, Mann-Whitney). As a consequence, no temporal
pattern could be evidenced using presence / absence data and Jaccard index or peak relative
intensity data and Bray-Curtis index. Moreover, comparison of CBCD among months when
CBCA was low (January, February, April) to the ones when CBCA was significantly higher
(June, July, August, September, October), using ANOSIM, showed no significant difference
(p> 0.05). Consistently unlinked with the CBCA no significant difference in the CBCD was
found among months from May to October.
141

(a)
(b)
Jaccards similarity (%)
Bray-Curtis similarity (%)
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
Within the same month
Between two consecutive sampling times
1 2 3 4 5 6 7 8
Jan-07 Feb-07 Apr-07 Jun-07 Jul-07 Aug-07 Sep-07 Oct-07
142
Fig. 5. Temporal dynamics of
bacterial communities in individual
cockles, sampled in Banc d’Arguin
(Arcachon Bay) from January 2007
to October 2007, where no
Bucephalus minimus was detected.
Histogram bars with error bars
corresponded to similarities of
cockle bacterial communities within
a month; black points with error
bars correspond to similarities of
cockle bacterial communities
between two months. Error bars
represent standard deviation
(absence of error bars is due to a
lack of replicates). (a): Similarity
based on presence / absence of the
ITS; (b): Similarity based on the
relative abundance of ITS (peak
relative fluorescence)
Regarding the CBCD of Bm- and Bm+ individuals, no significant difference was
found in the number of ITS per individual between Bm+ and Bm- cockles (p = 0.8, Mann-
Whitney), mean = 112 ± 26 ITS per individual. Amongst the 15 ITS out of 243 that were
detected only in the Bm+ individuals, most of them had an occurrence lower than 25%.
Globally rare ITS primarily accounted for differences in CBCD between Bm- and Bm+
individuals. Based on presence / absence of the ITS, Jaccard similarities between CBCD of
Bm- (Jaccard = 50 ± 10 %) or Bm+ individuals (Jaccard = 50 ± 8 %,) were not significantly
different from similarities calculated between individuals belonging to the same set (p > 0.05,
Mann-Whitney) (Fig. 6.a). Bray-Curtis similarities based on peak relative intensity showed
comparable results (Fig. 6.b). Similarities between CBCD of Bm- on one side (Bray-Curtis =
48 ± 14 %) and Bm+ on the other side (Bray-Curtis = 33 ± 15 %) were not significantly
different of similarities between Bm- and Bm+ cockles (Bray-Curtis = 38 ± 15 %) (p > 0.05,
Mann-Whitney) (Fig. 6.b). Comparison of CBCD among Bm- and Bm+ groups ANOSIM
showed no significant difference between Bm- and Bm+ clusters (p = 0.46).

(a)
Jaccards similarity (%)
(b)
Bray-Curtis similarity (%)
Discussion
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
Bm-
Bm+
Between Bm- and Bm+
Jun-07 Jul-07 Aug-07 Sep-07 Oct-07
143
Fig. 6. Comparison of similarities
between bacterial communities in
cockles sampled in the Banc
d’Arguin (Arcachon Bay) from June
2007 to October 2007 according to
their parasitic state. Histogram bars
with error bars (error bars
represent SD) correspond to
similarities of cockle bacterial
communities between individuals
sampled on the same month.
Absence of error bars is due to a
lack of replicates. (a): Similarity
based on presence / absence of the
ITS; (b): Similarity based on the
relative abundance of ITS (peak
relative fluorescence)
In this study we applied structural descriptors of bacterial communities to characterize
the dynamics of the communities associated with cockles at the individual scale. This sought
to document the link between bacteria, parasite occurrence and cockle age.
To characterize cockle bacterial community diversity, a fingerprinting method
(ARISA) was used. This culture independent approach assesses the genetic structure of a
bacterial community based on 16S - 23S ITS size [21]. Since bacterial species have various
numbers and types of ribosomic operon, there is no simple relationship between the
occurrence of a bacterial species and the number and types of retrieved ITS [29]. It is
nevertheless assumed that the ITS richness and composition realistically reflect the bacterial
taxonomic diversity [23]. An attempt to assess the cultivable diversity of the same samples
provided only 17 colonial morphotypes on marine agar (data not shown). Eight out of 17
could be closely related to members of the genus Bacillus, i.e. an endospore former,

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
suggesting that sample storage (no preservative such as glycerol added) affected the cultivable
fraction. On the other hand, the 2-year long storage of cockle FIL samples at -20°C was
unlikely to have affected the sample DNA quality [48]. Neither comparison between
molecular and cultivable diversities nor phylogenetic assignment of the recovered ITS was
therefore possible. Apart from ITS ascribing, ARISA fingerprinting is intrinsically adapted to
assess β diversity (sensu Forney et al. [22]) i.e. pairwise comparisons of the composition
(Jaccard similarity based on presence/absence of the ITS) or of the relative abundance (Bray
Curtis similarity based on the relative fluorescence of the peaks) of bacterial communities.
From the measured bacterial abundances (maximum 40 x 10 6 cells∙g -1 [FIL]) and taking an
average individual bacterial mass of 9.5 x 10 -13 g∙cell -1 [40] it could be estimated that bacterial
biomasses have represented less than 0,1% of the biological material from which DNA was
extracted, the remaining 99,9% being cockle tissues. Hence low quantities of bacterial DNA,
and thus a low proportion of target DNA, were to be recovered in our samples. This could
explain why single-stage PCR did not amplify enough DNA in numerous samples.
Conversely, semi-nested PCR, known to enhance the sensitivity [35], proved not to distort the
CBC diversity pattern and was therefore successfully adopted.
The cockle population of Banc d’Arguin has been monitored monthly since 1999 and
is representative of the species on its geographic distribution area [19]. More precisely, the
studied 2006 cohort exhibited common temporal patterns of growth as attested by (i) Von
Bertalanffy’s growth model parameters: L∞ = 36.75 mm, k = 1.33 yr -1 [25] and (ii)
comparison of measured condition index (mean = 78 ± 24‰ , min = 30‰, max = 122‰) to
the values mentioned in de Montaudouin et al. [15] (mean = 58‰, min = 49‰, max = 73‰).
The patterns of CBC structure reported in the present study should thus be considered to
represent typical features even for parasitized individuals. The maximum B. minimus
prevalence recorded during this survey (5%) agreed with previous observations [16]
suggesting that the studied set of individual cockles experienced the usual parasitic infection
pressure.
On average during the 10-month survey, B. minimus-free cockles presented a
14 ± 2 x 10 6 cells∙g -1 [FIL] bacterial load composed of a quite stable ITS number of 112 ± 26
ITS per individual. Given the typical range between culture-dependent and culture-
independent numerations of bacteria [11] our data agreed with bacterial densities up to
10 5 MPN∙g -1 [FIL] reported in Blanchet et al. [5]. Comparable operational taxonomic unit
(OTU) richness was reported for lobster gut [39]. The inter-individual variability of CBCD
144

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
attested by Jaccard or Bray Curtis similarities averaging 53 ± 7% and 53± 12% respectively
indicated a relative homology between bacterial communities of individuals sampled within a
given month. This result was expected because cohort individuals were sampled on the same
sampling site, were recruited on the same period (same age) and have thus experienced
similar environmental conditions such as, for instance, being submitted to the same bacterial
contamination events. Despite ITS binning, rare ITS (= ITS recorded in less than 10% of the
studied cases) have represented 33% of the 284 detected ITS. The rare ITS marginally
contributed to the ITS richness; hence the CBCD was satisfactorily described. That no
distinctive temporal pattern could be evidenced even when higher bacterial abundances were
found in cockles during the summer period suggested a relative stability of the bacterial taxa
harboured by cockles (CBCD). Changes in cockles’ bacterial load (CBCA) during the
summer period could be due to an increase in gut microflora caused by (i) enhanced seawater
bacterioplankton densities during the productive period [1] or (ii) enhanced filtration rates
linked to individual growth [12] or (iii) the reproductive life cycle affecting the FIL mass
during the spawning period [12]. The gut microflora hypothesis is emphasized by the
probable importance of gut bacterial numbers (e.g. 90% of the cultivable heterotrophic
bacteria are in oyster gut, [33]). Considering the different organs (e.g. gut, gills, muscle)
separately would allow this hypothesis to be tested in further studies.
The cockle size is an important factor contributing to B. minimus infestation as B.
minimus is known to parasitize cockles having reached at least a 16 mm shell length [16]. In
the present study, B. minimus was first detected later than expected (in June) when cockles
were 13 month old and had a shell length of 29 mm. The fact that parasitized and not
parasitized cockles exhibited comparable condition indexes suggested that parasitized
individuals were not affected physiologically [36]. However, the parasite flesh can represent
more than 25% of the total flesh of the host-parasite system [18] and a similar condition
index between parasitized and non-parasitized cockles can signify a deficit of host flesh in
parasitized individuals. The only indication of an interaction between CBC and B. minimus
infestation was the enhanced CBCA recorded in cockles parasitized by B. minimus during the
summer period. It might indicate a secondary bacterial infection linked to bacterial invasive
development in damaged cockle tissues (gonads, gills and digestive gland). Another
indication of secondary infection is the change in the individual bacterial community
composition as observed for coral by Sunagawa et al. [50] and Peirera de Castro et al. [45].
Lysis of the tissues due to the primary infestation may lead to development of new niches
145

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
(organic matter release, sites to be colonized) for saprophytic bacteria. These niches could be
settled by exogenous and/or commensal opportunistic bacteria leading to changes in bacterial
community composition. In the present study no change in CBCD between Bm- and Bm+
individuals could be evidenced by comparing Jaccard and Bray-Curtis similarity indexes.
Given that no difference was found in the physiological state of the cockles (condition index)
with respect to the parasitic state, the CBCA increase still needs to be explained. It could be
hypothesized that sampled individuals were in an early stage of the secondary infection,
when major changes in CBCD have not occurred yet.
A rarefaction curve based on Michaelis-Menten equation was designed a posteriori
from the CBC presence /absence matrix of all samples (Fig.7). According to Magurran [37]
this curve tentatively documented the maximum ITS richness (Smax) and the sampling
strategy (optimal number of replicates for an exhaustive diversity analysis). For Smax the best
fit of the Michaelis-Menten equation indicated a 283 ITS per cockle value. The Smax value is
probably an overestimation of the actual CBCD at the individual scale although it is likely to
be an underestimate at the population scale. On the other hand, taxa-area relationships were
shown for bacteria being mainly supported by the habitat heterogeneity [30]. Cockle tissues
and particularly the gut could be possibly seen as diversified habitats for bacterial settlement.
Accordingly, high bacterial diversity was reported in oyster gut, gills and gonads [28].
Moreover, comparable orders of magnitude (hundreds of OTUs) were reported in lobsters
[39] and in corals [45]. For the sampling strategy, the a posteriori test indicated that working
on three replicates allowed only 62% of the theoretical total CBCD to be taken into account.
That may explain the high rate of rare ITS. According to our estimation 16 replicates would
be required to base analyses from 90% of theoretical total CBCD. This is a challenge in such
a field experiment since collecting 16 parasitized cockles could require collecting hundreds
of cockles where cockle densities range from 100 to 200 ind∙m -2 . Further studies should
obviously consider a trade-off in the number of replicate individuals per condition for a more
accurate analysis of the cockle bacterial community dynamics.
146

Number of different ITS observed
300
250
200
150
100
50
Conclusion
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Mean number of observed ITS Michaelis-Menten curve
0 10 20 30 40
Number of replicate samples
147
Fig. 7. Rarefaction curve
Black points with error bars
represent the averages and SD of
observed ITS as the samples are
accumulated. This average was
obtained from 100,000 permutations
of 37 presence/absence matrices of
ITS. Gray curve represents the
curve regression based on
Michaelis-Menten equation
(Number of ITS = (283 x number of
replicates) / (1.8 + number of
replicates).
This study investigated the dynamics of the symbiotic bacterial communities during
cockle growth or infestation by B. minimus. Some ITS (93 out of 284) occurred in less than
10 % of individuals sampled during the monitoring but bacterial community compositions of
cockle individuals that had been submitted to the same bacterial contamination events were
similar at a 52 ± 6 % level (mean Jaccard similarity). Further studies should consider the
number of replicate individuals per condition and may take advantage of considering
separately the different organs (e.g. gut, gills, muscle) for a more accurate analysis of the
cockle bacterial community dynamics. In the present case study however, typical cockle
growth patterns and parasite prevalence were observed. Apart from transient changes in
cockle bacterial loads during summer, marked changes in the bacterial community
composition were not linked to changes in individual physiological state (attested by
condition index) during the 10-month cohort monitoring. Likewise, apart from enhancement
of parasitized cockle bacterial loads during summer, B. minimus infestation of cockles did
not affect the individual physiological state and bacterial community composition. These data
suggested that bacterial community composition, in contrast with community abundances,
could be consistently linked to cockle fitness descriptors highlighting the need to consider
bacterial diversity when studying their association with marine invertebrates.

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Acknowledgements
This study is part of the project “Multistress” (Coordinator: Dr X de Montaudouin) funded
by ANR (Agence Nationale pour la Recherche, France). G Meisterhans is funded by a
doctoral fellowship of the Region Aquitaine. The authors thank SEPANSO for authorizing
sampling in the National Reserve of Banc d’Arguin and Dr SC Culloty for editing the
English writing of the manuscript.
148

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Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
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Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
152

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organe : déterminisme d’hôte ou
d’habitat
2.1 Introduction
Depuis des millions d’années, les invertébrés marins vivent en symbiose avec une flore
bactérienne abondante, diversifiée et spécifique c'est-à-dire différente de celle de l’habitat
environnant (Frischer et al., 2000; Rohwer et al., 2002 ; Gerce et al., 2011). Cette spécificité
est liée en particulier au fait que l’habitat de cette microflore est un organisme vivant
(Hansson et al., 2009). Une partie de cette microflore est acquise par transmission latérale
c'est-à-dire via l’environnement à travers des mécanismes actifs de filtration ou
d’enfouissement et des mécanismes passifs par simple balnéation dans un environnement
septique (Dubilier et al., 2008 ; Bright and Bulgheresi, 2010). De ce fait, cette microflore est
composée en partie de populations transitoires liées d’une part aux fluctuations de cet
environnement (Tanaka et al., 2004 ; Serais et al., 2010) mais également à celles de l’état de
santé de l’hôte et en particulier de l’efficacité de ses barrières comme l’intégrité de ses
branchies (Dame, 1996) ou l’efficacité de son système immunitaire (Pruzzo et al., 2005 ;
Antunes et al., 2010). Cette partie de la microflore est composée de bactéries allochtones (i.e.
non spécifiques à l’hôte) (Romero et al., 2002), nommée dans le tube digestif, flore de transit
par Harris (1993). Une autre part de cette microflore est acquise par transmission verticale
c'est-à-dire par une transmission parentale via l’incorporation des bactéries à la surface ou au
sein des gamètes ou par transmission horizontale par acquisition entre hôtes contemporains
indépendamment des mécanismes de reproduction. Cette microflore plus étroitement associée
présenterait une longue histoire évolutive commune avec ses hôtes, qui résulterait de
pressions de sélections communes (Taylor et al., 2007; Zurel et al., 2011). Elle peut
également présenter une dynamique influencée par des paramètres environnementaux comme
la température (Schöttner et al., 2009), ou par l’état de santé de l’hôte (Hansson et al., 2009).
Cette flore est qualifiée de résidente au niveau du tube digestif (Harris, 1993), et plus
généralement de flore autochtone (Romero et al., 2002).
153

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
L’objectif de cette partie a été d’évaluer les déterminismes d’hôte et d’habitat des
communautés bactériennes associées au bivalve (CBAB) au sein des différents organes de
l’hôte plus ou moins en contact avec l’habitat.
Pour répondre à cette question, nous nous sommes intéressés aux communautés
bactériennes d’un modèle d’invertébré marin, la palourde japonaise Ruditapes philippinarum.
Ce bivalve filtreur-fouisseur, originaire d’Asie, est de nos jours, une espèce commune et
dominante des lagunes et estuaires depuis son introduction à travers le monde au début des
années 1930 (Jensen et al., 2004) et présente un fort intérêt économique en tant que seconde
espèce la plus exploitée au monde avec 3 millions de tonnes produites par an (FAO, 2007).
Notre intérêt s’est porté sur trois types d’organes : d’un côté les branchies et le tube
digestif considérés comme les sites primaires d’infection bactérienne car étant le plus en
contact avec le milieu extérieur (Prieur et al., 1990) et de l’autre, le reste des tissus regroupant
les organes plus internes (glande digestive, pied, manteau, gonade, cœur, hémolymphe)
séparés du milieu extérieur par des barrières physiques et immunitaires et donc
potentiellement moins en contact direct avec l’habitat environnant.
Afin d’appréhender l’influence de l’état physiologique du bivalve sur les CBAB, deux lots
de palourdes aux caractéristiques physiologiques différentes ont été étudiés. Ces deux lots
provenaient de deux sites aux caractéristiques contrastées afin de pouvoir également
s’interroger sur l’influence de l’habitat sur les CBAB. L’analyse a porté d’une part sur deux
lots de palourdes échantillonnées dans leur habitat naturel et d’autre part sur des lots ayant
subi une expérience de transplantation croisée (i.e. changement d’habitat). Les
caractéristiques intrinsèques (longueur de coquille, indice de condition, paramètres
hémocytaires …) des individus des différents lots ont été déterminées et une caractérisation
des CBAB a été réalisée au travers d’une mesure de l’abondance bactérienne par PCR
quantitative sur l’ADNr 16S bactérien et d’une analyse de la structure des communautés
bactériennes par empreinte moléculaire (i.e. ARISA) sur l’intergene ribosomique16S-23S.
En parallèle, une analyse de la structure des communautés bactériennes du biotope
(sédiment) a été réalisée selon la même approche ARISA. L’abondance bactérienne a été
mesurée par cytométrie en flux.
154

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2.2 Matériel et méthodes
2.2.1 Les sites d’échantillonnage
Les échantillons analysés (palourdes et sédiments) ont été prélevés au niveau de deux
sites de la zone intertidale du Bassin d'Arcachon, le site A et le site B (Figure III.1).
Figure III.1 : Localisation des deux sites d’échantillonnage (site A et site B) dans le
Bassin d’Arcachon (France)
Le site A est localisé au niveau du Banc d’Arguin, un banc de sable localisé à l’entrée
du Bassin d’Arcachon et préalablement décrit dans Meisterhans et al. (2011). Il se situe dans
les eaux néritiques externes (ENE) (Bouchet, 1968), c'est-à-dire majoritairement sous
influence des eaux océaniques (salinité : 34-35 PSU ; température : 9,5-21°C). Les palourdes
sont enfouies dans un sédiment nu, de nature sablo-vaseuse (médiane granulométrique :
360µm), peu riche en matière organique (1%). En période d’immersion les bivalves sont
recouverts d’une masse d’eau hébergeant des communautés phytoplanctoniques
principalement composées de cyanobactéries (Données SOMLIT : Service d’Observation en
Milieu LIToral, Responsable B. Sautour). Le site B (Station 11) est situé dans les eaux
néritiques internes (ENI) (Bouchet, 1968). Ce site, sous influence continentale reçoit des
apports d’eau douce provenant de la Leyre et par conséquent est soumis à des périodes de
155

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
dessalure (salinité : 22-32 PSU ; température : 1-25°C). Les bivalves sont enfouis dans un
sédiment de nature vaso-sableuse (médiane granulométrique : 96 µm), plus riche en matière
organique (5,44%) et recouvert d’un herbier à Zostera noltii (61%). En période d’immersion
les bivalves sont recouverts d’une masse d’eau hébergeant des communautés
phytoplanctoniques différentes de celles du site A et principalement composées de pico et
nano-eucaryotes, de cryptophycées et de procaryotes hétérotrophes (Données SOMLIT).
Les deux lots de palourdes proviennent donc de deux habitats contrastés tant par les
caractéristiques physiques et chimiques des sédiments et de la colonne d’eau de ces habitats
que par la composition des communautés planctoniques présentes.
2.2.2 Dispositif expérimental
2.2.2.1 Etude de deux lots de palourdes dans leur habitat naturel
Une étude des individus des deux lots a été réalisée in situ. Sur chacun des deux sites,
seize individus de taille adulte (30-50 mm) ont été prélevés en avril 2010 et en novembre
2010 c'est-à-dire à deux périodes différentes du cycle biologique des palourdes (avant/après
ponte).
- 6 individus à des fins de mesure de l’abondance bactérienne par qPCR et de la
diversité bactérienne par ARISA mais également pour des mesures des paramètres
hémocytaires [concentration totale en hémocytes (THC) ; taux de phagocytose]
- 5 individus pour une mesure des longueurs coquillères et des indices de condition
- 5 individus pour des mesures de la concentration en ATP, du niveau d’activité des
acides malonedialdéhydes (MDA), et de leur signature isotopique (δ 13 C et δ 15 N).
Les 10 derniers individus ont permis de décrire l’état physiologique de la population sur
chacun des deux sites.
2.2.2.2 Transplantation croisée
En parallèle, sur chacun des deux sites, 181 palourdes ont été prélevées en avril 2010.
De manière à différencier les deux lots, un marquage a été réalisé sur les coquilles des
156

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
palourdes à l’aide de vernis selon un code couleur. Les individus de chaque lot ont ensuite
subi une étape de dépuration pendant 6,5 jours afin d’homogénéiser leurs communautés
bactériennes transitoires liées à la transmission latérale par balnéation dans un bassin à flux
continu d’environ 25m 2 d’eau déposée (Société CODIMER, Gujan Mestras, France)
(Furfari, 1966). Puis ils ont été soit réimplantés sur leur site d’origine soit transplantés sur le
second site (Figure III.2). Sur chaque site (A et B) et pour chacun des lots, 3 cages contenant
chacune 55 individus ont été disposées afin de retrouver les individus dépurés parmi la
population autochtone.
Réimplantation sur
le site A
Lot A/A
Figure III.2: Plan expérimental simplifié de l’expérience de transplantation croisée
A la fin de la période de dépuration (T’0) et 6 mois (T’6) après la
réimplantation/transplantation, 16 individus (5, 5 et 6 individus par cage) par lot ont été
échantillonnés permettant les mêmes séries de mesures que celles réalisées lors de l’étude des
deux lots de palourdes dans leur habitat naturel.
Les individus vivants restant à T’6 ont été dénombrés afin de calculer un taux de
survie des individus.
Lot A
Transplantation sur
le site B
Dépuration (6,5 jours)
Réimplantation sur
le site B
157
Lot B
Transplantation sur le
site A
Lot A/B Lot B/B Lot B/A
Avril
T’0
T’6
Mesure de l’abondance et de la
diversité bactériennes

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2.2.2.3 Echantillonnage de carottes de sédiment
Une mesure de la diversité bactérienne des sédiments a également été réalisée. Pour
cela, début avril, fin avril, début juin, fin juillet, et début novembre 2010, six carottes de
sédiment ont également été prélevées afin d’analyser les communautés procaryotes à
l’interface eau-sédiment (0-0,5 cm). Trois carottes ont permis de mesurer l’abondance
procaryote par cytométrie en flux ; les trois autres ont permis une analyse de la diversité
bactérienne par ARISA.
2.2.3 Traitement et analyses des échantillons:
2.2.3.1 Echantillons de palourdes
2.2.3.1.1 mesures des indices de condition
A chaque temps de prélèvement, les longueurs coquillères et les indices de condition
(IC) ont été mesurés sur 5 individus par lots afin d’estimer le taux de remplissage moyen d’un
individu pour chaque lot. Les longueurs, largeurs et hauteurs coquillères ont été mesurées au
centimètre près, à l’aide d’un pied à coulisse. Le poids de l’individu entier a été également
mesuré. Les individus ont ensuite été ouverts, leur chair égouttée, pesée afin de déterminer le
poids frais de chair. Les chairs ont ensuite été placées 48 h dans une étuve (60°C) dans des
coupelles d’aluminium, préalablement pesées et numérotées, afin de déterminer le poids sec
de chair. Les coquilles séches ont été également pesées. L’ensemble de ces pesées a été réalisé
au moyen d’une balance de précision (ABT 100-5M ; Kern and Sohn, Balingen-Frommern,
Allemagne) avec une incertitude de 0,001g. A partir des mesures réalisées un IC a été calculé
selon la formule définie par Walne and Mann (1975):
IC (‰) = poids sec de chair (mg) / poids sec de coquille (g)
158

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2.2.3.1.2 mesure du fractionnement isotopique
Une analyse des isotopes stables a été réalisée afin de comparer le régime alimentaire
et le niveau trophique des palourdes appartenant aux 2 lots. Sur chaque individu, les muscles
adducteurs postérieurs ont été prélevés afin de connaitre le fractionnement isotopique en δ 13 C
et δ 15 N.
Les prélèvements de muscles ont été placés dans des piluliers préalablement nettoyés
dans un bain d’acide (HCl 1,2N) (Kennedy et al., 2005), rincés trois fois à l’eau MilliQ
(Millipore Corporation), séchés dans une étuve à 60°C et enfin calcinés pendant 4h dans un
four à 450°C. Les échantillons ont été conservés à -20°C jusqu’à analyse. Avant analyse, les
échantillons ont été lyophilisés au minimum 4h puis réduits en poudre avant d’être remis au
sec et à l’abri de la lumière dans les piluliers. Le δ 13 C et de δ 15 N ont été directement mesurés
sur la poudre obtenue.
Les valeurs de δ 13 C et de δ 15 N ont été mesurées à partir de 0,5 à 0,7 mg d’échantillon
(préalablement pesé dans des nacelles en étain) à l’aide d’un analyseur élémentaire (EA;
NC2500, CarloErba®) couplé à un spectromètre de masse de rapport isotopique (IRMS;
Isoprime, GV Instruments®) selon le protocole décrit par Dang et al. (2009). La dérive
journalière du spectromètre de masse a été corrigée à l’aide de standards (caséine et glycine).
Les valeurs absolues ont été corrigées grâce à un standard certifié (acétanilide).
2.2.3.1.3 mesures des paramètres hémocytaires
Sur chaque individu destiné à l’analyse de l’abondance et de la diversité des
communautés bactériennes 0,5 à 1 mL d’hémolymphe a été prélevé à travers la charnière du
bivalve préalablement nettoyée à l’alcool, dans le muscle adducteur postérieur à l’aide d’une
seringue de 2 mL équipée d’une aiguille stérile (Terumo 25G, Louvain, Belgique). Le
prélèvement a été immédiatement observé au microscope (grossissement x40 ; NIKON
SMZ1500, HR plan Apo) pour vérifier la pureté du prélèvement (i.e.présence d’hémocytes
uniquement). L’hémolymphe a ensuite été filtrée sur une maille de 80µm afin d’éliminer les
particules de grandes tailles pouvant entrainer ultérieurement une obstruction du capillaire du
cytomètre en flux, transférée dans un microtube stérile et conservée dans la glace avant d’être
159

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
aliquotée pour des mesures de concentration en hémocytes totaux ou THC (Total Hemocyte
Count) et des taux de phagocytose.
D’une part, afin de réaliser le dosage des hémocytes totaux, 50µL d’hémolymphe ont
été dilués volume à volume dans de l’eau de mer naturelle filtrée (filtre 0,7µm de diamètre) et
stérilisée (autoclave 121°C, 20 min) (EMNF), puis fixés par ajout d’un volume de formol-
EMNF (formol 37% filtré sur 0,22 µm et dilué au 1/5 ème dans de l’EMNF) et enfin conservés
moins d’une semaine, dans le noir et à 4°C jusqu’à l’analyse en cytométrie.
D’autre part, afin de déterminer le taux de phagocytose, 20 µL d’une solution de billes
fluorescentes (Fluoresbrite TM plain YG-2.0 µm microsphères 2.5% solids-latex.
Polysciences, Inc, Warrington, PA 18976 ; diluée au 1/50 ème ) ont été ajoutés à un aliquot de
100 µL d’hémolymphe. L’ensemble a été incubé 2 heures dans un bain marie à 18°C afin de
permettre aux hémocytes actifs de phagocyter les billes. Les échantillons ont ensuite été fixés
et conservés selon le même protocole que pour les THC.
Le THC et le pourcentage d’hémocytes ayant phagocyté au moins trois billes
(pourcentage de phagocytose) par échantillon ont ensuite été déterminés par Christophe
Lambert (IR CNRS, UMR 6539 LEMAR, Brest) en cytométrie en flux (Facscalibur, Becton
Dickinson; 30 sec ; débit high)
2.2.3.1.4 analyses de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes des
palourdes
Après le prélèvement de l’hémolymphe, le bivalve a été ouvert. Les branchies (Br) ont
été prélevées à l’aide de pinces et ciseaux stériles ; le tube digestif (TD) a été extrait sous
loupe binoculaire (SMZ1500 ; Nikon, Champigny sur Marne, France) et le reste des tissus
(Re) (i.e. glande digestive, pied, manteau, cœur …) a été poolé.
Chaque organe a ensuite été pesé à 0,01 mg près. Puis chaque organe a été broyé à
l’aide d’un homogénéisateur de tissus (blade OMNI TH) dans un volume de tampon de
broyage (100mM Tris-HCl [pH 8.0], 100mM Na EDTA [pH 8.0]) spécifique pour chaque
organe (3 mL pour la branchie, 1 mL pour le tube digestif, 30 mL pour le reste des tissus).
160

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Après homogénéisation, 400µL de broyat ont été prélevés et additionnés d’1mL de
tampon permettant la préservation de l’ADN (100mM Tris-HCl [pH 8.0], 100mM Na EDTA
[pH 8.0], 1.5M NaCl and 1% [wt/vol] cetyltrimethylammonium bromide) (Zhou et al, 1996)
puis congelés à -80°C jusqu’à l’extraction de l’ADN.
2.2.3.1.4.1 extraction/purification et dosage de l’ADN total
A partir des échantillons conservés à -80°C, l’ADN total a été extrait et purifié selon le
protocole décrit précédemment dans Meisterhans et al. (2011) (Chapitre III, partie 1). Ce
protocole combine l’utilisation d’une méthode de lyse mécanique des cellules par « bead
beating » (FastPrep et lysis matrix A; 6 m∙s -1 ; 40 s, MP Biomedicals, Illkirch, France) et d’une
méthode de lyse chimique couplée à une purification sur colonne de silice grâce à un kit
d’extraction / purification (QIAamp DNA Mini Kit ; QIAgen, Courtaboeuf, France). Les
extractions et purifications de l’ADN total des échantillons de palourde ont été réalisées à
partir d’un volume de chair broyée équivalent à 5 mg de tissu (poids frais) quelque soit
l’organe. L’ADN extrait et purifié a été élué dans de l’eau ultra pure (Sigma Aldrich, St.
Quentin Fallavier, France). L’ADN extrait a été dosé par spectrofluorimétrie (LS 55,
PerkinElmer, Courtaboeuf, France) via l’utilisation de SYBR® Green I (Molecular Probes,
Invitrogen, Cergy Pontoise, France), et d’une solution standard d’ADN (calf thymus DNA
1mg∙mL -1 ; Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, France) selon le protocole décrit dans
Meisterhans et al. (2011) (Chapitre III, partie 1). L’ADN extrait et dosé a ensuite été conservé
à -80°C jusqu’à l’analyse de l’abondance et de la diversité bactériennes.
2.2.3.1.4.2 diversité des communautés bactériennes par ARISA
La diversité des communautés bactériennes des palourdes a été analysée par ARISA.
Pour chaque échantillon, trois amplifications indépendantes ont été réalisées à partir de la
même quantité d’ADN (10 ng). Des amorces bactériennes universelles (Ranjard et al., 2000)
ont été utilisées, SDBact : (5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT-3’), marquée à l’extrémité
5’ avec le fluorochrome 5-FAM phosphoramidite) et LDBact (5’-CCG GGT TTC CCC ATT
CGG-3’) (Molecular Probes, Invitrogen) selon le protocole décrit dans Meisterhans et al.
161

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
(2011) (Chapitre III, partie 1). Les amplicons ont été purifiés via l’utilisation du kit QIAquick
purification (QIAgen, Courtaboeuf, France). L’ARISA a été réalisée à partir de 2 ng
d’amplicon purifié et d’un standard interne (LIZ1200 ; Applied Biosystems) sur un 3730XL
Capillary Genetic Analyser (Applied Biosystems Ltd.) en collaboration avec la Plateforme
Genome-Transcriptome de Pierroton (INRA, Bordeaux-Aquitaine).
2.2.3.1.4.3 abondance des communautés bactériennes
A partir des extraits d’ADN totaux purifiés et dosés, le nombre de copies d’opérons
ribosomiques 16S dans chaque échantillon a été estimé par PCR quantitative en temps réel,
selon la méthode de Lopez-Gutierrez et al. (2004). Le couple d’amorces bactériennes 341f
(5’-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’) et 515r (5’-ATT CCG CGG CTG GCA-3’) a été
utilisé. Pour chaque échantillon, trois amplifications indépendantes ont été réalisées sur
Mx3000P QPCR System (Stratagene) en utilisant le kit « Brillant SYBR® Green QPCR
Master Mix » (Agilent Technologies) selon les conditions recommandées par le fabriquant
(protocole « Mx3000P Instrument » du manuel d’utilisation): 95 °C pendant 10 min ;
45 cycles à (a) 95 °C pendant 30 sec, (b) 50 °C pendant 30 sec et (c) 72 °C pendant 30 sec ;
1 cycle à (a) 95 °C pendant 1 min, (b) 65 °C pendant 30 sec et (c) 95 °C pendant 30 sec. Trois
courbes étalons par run ont été réalisées, simultanément à l’amplification des échantillons, à
l’aide d’un plasmide contenant une copie de l’opéron ribosomique 16S d’Escherichia coli
(plasmide pGEM®-T, Promega, Charbonnières-les-Bains, France).
2.2.3.2 Echantillons de sédiments
Des mesures d’abondance procaryote et de diversité bactérienne ont également été
réalisées au niveau des sédiments de chaque site. Pour chaque carotte, la couche de sédiment
comprise entre 0 et 0,5 cm de profondeur (interface eau-sédiment) a été prélevée puis
homogénéisée à l’aide d’une spatule dans une coupelle stérile. Un échantillon de 1cm 3 de
sédiments homogénéisés a été prélevé à l’aide d’une seringue de 2 mL tronquée (TERUMO).
Les échantillons destinés à une mesure de l’abondance bactérienne par cytométrie en flux ont
été conservés dans un 1mL de formol 7,4%-EMNF. Les échantillons destinés à une mesure de
162

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
la diversité des communautés bactériennes par ARISA ont été conservés dans un 2,5 mL de
tampon de préservation de l’ADN comme décrit dans Meisterhans et al. in prep (Chapitre II,
partie 1). L’ensemble des échantillons a été conservé à -80°C jusqu’à analyse.
2.2.3.2.1 analyse de l’abondance et de la diversité des communautés bactériennes des
sédiments
2.2.3.2.1.1 extraction/purification et dosage d’ADN total
La même démarche que celle utilisée pour les échantillons de palourdes a été utilisée
pour extraire, purifier et doser l’ADN total des sédiments. L’extraction et la purification de
l’ADN à partir d’une matrice sédimentaire requièrent toutefois l’utilisation de kits adaptés.
L’extraction/purification a donc été réalisée sur un volume équivalent à 200 µL de sédiment à
partir des kits FastPrep Lysing Matrix E (FastPrep System, MP biomedicals) et UltraClean®
Soil DNA Isolation kit (MOBIO Laboratories Inc.). L’ADN extrait et purifié a été dosé par
spectrofluorimétrie comme décrit précédemment puis conservé à -80°C.
2.2.3.2.1.2 abondance des communautés bactériennes
A partir des échantillons conservés dans du formol-EMNF, stockés à - 80 °C, la fraction
organique contenant les procaryotes a été purifiée par migration forcée sur un gradient de
concentration (Gentodenz®) puis les procaryotes ont été dénombrés par cytométrie en flux
(run de 1 min à faible débit) (Plateforme Cytométrie-Imagerie du Laboratoire Arago,
Banyuls/Mer) selon le protocole décrit dans Meisterhans et al. in prep (Chapitre II, partie 1).
2.2.3.2.1.3 diversité des communautés bactériennes par ARISA
A partir des échantillons conservés dans du tampon de préservation de l’ADN, stockés
à - 80 °C, une mesure de la diversité des communautés bactériennes a été réalisée par ARISA
selon le même protocole que celui décrit précédemment pour les échantillons de palourdes.
163

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2.2.4 Traitement de données et analyse statistique
Afin d’analyser les données de diversité β mesurée par ARISA, un traitement de
données issues des arisogrammes a été réalisé in silico. Ce traitement plus amplement détaillé
dans Meisterhans et al. (2011) (Chapitre III, partie 1), consiste, d’abord en l’élimination du
bruit de fond au moyen du calcul d’un optimal divisor (Osborne et al., 2006). Cet optimal
divisor a été estimé à 1/750 pour les arisogrammes des échantillons de palourdes
(i.e. élimination des pics dont l’aire contribue pour moins de 1/750 ème de l’aire totale de
l’ensemble des pics) et à 1/1000 pour les arisogrammes des échantillons de sédiments. Ce
traitement est suivi par une procédure de binning selon Ramette (2009) via l’utilisation de
l’algorithme « interactive binner » (http://www.ecology-research.com) sous le logiciel R
(http://cran.r-project.org/). Le binning permet un alignement des arisogrammes par la
détermination d’une valeur de fenêtre. Cette valeur de fenêtre a été estimée à 2 ± 0,1 (WS : 2 ;
Sh : 0,1).
A partir de la matrice d’abondance relative obtenue, une matrice de similarité de
Bray-Curtis a été calculée via le logiciel Primer 6.0 (PRIMER-E Ltd).
La significativité et l’amplitude des différences de structure des communautés
bactériennes de groupes d’échantillons définis a priori ont été déterminées par ANOSIM sous
le logiciel Primer V06 (PRIMER-E Ltd). La significativité des différences des données
quantitatives (abondances bactériennes/procaryotes des palourdes et des sédiments, richesse et
evenness des communautés bactériennes, caractéristiques physiologiques des palourdes) a été
déterminée par des ANOVA non paramétriques (ANOVA de Mann-Whitney ou de Wilcoxon
pour comparer 2 groupes d’échantillons indépendants ou appariés; ANOVA de Kruskall-
Wallis ou de Friedman pour comparer plus de 2 groupes d’échantillons indépendants ou
appariés). Ces tests ont été réalisés à l’aide de la macro-commande Merlin sur Excel 2007. Le
seuil de significativité retenu a été de 0,05 ; une valeur inférieure à 0,01 indiquant une
significativité importante.
164

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2.3 Résultats
2.3.1 Deux habitats contrastés : diversité β des communautés procaryotes des
sédiments
A partir des prélèvements sédimentaires de l’horizon 0-0,5 cm réalisés d’avril à
novembre 2010 (3x5 échantillons), les abondances en procaryotes mesurées par cytométrie en
flux et les structures des communautés bactériennes déterminées par ARISA ont été
comparées entre les deux sites A et B.
Au cours de ce suivi, aucune différence d’abondance en procaryotes n’a été observée
entre les deux sites (Mann-Whitney, p > 0,05), chaque site hébergeant en moyenne
7,1 ± 5,4 10 7 cell.g -1 de sédiment sec.
En revanche, les communautés bactériennes des deux sites présentaient,
indépendamment du temps, de fortes différences de structure (1way-ANOSIM, R = 0,847,
p < 0,01) (Figure III.3) bien que plus faibles en novembre qu’en avril (similarité de Bray-
Curtis : 12,36 vs 33,39).
Près de la moitié (48,4 %) de la dissimilarité entre les deux types de communautés
bactériennes a pu être expliquée par les différences de contribution de quelques OTU entre les
deux sites. Les abondances relatives des OTU #344, #510, #432, #502 et #383 étaient plus
importantes sur le site A que sur le site B alors que les abondances relatives des OTU #266,
#258, #278, #276 et #320 étaient plus fortes sur le site B que sur le site A.
165

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Figure III : MDS, basé sur l’analyse des similarités de Bray-Curtis, représentant les patrons
des communautés bactériennes du sédiment à l’interface eau-sédiment des deux habitats
(carrés noirs : site A, carrés blancs : site B). La valeur de stress indique la bonne qualité de
la représentation de la matrice de similarité en 2 dimensions.
2.3.2 Deux lots de palourdes différenciés: description des caractéristiques des individus
Les mesures d’ATP et de MDA n’ayant pas été réalisées à ce jour, aucun résultat ne
sera présenté dans ce chapitre.
2.3.2.1 Indices de condition
Les résultats prennent en compte les données en avril et en novembre.
Les coquilles des individus prélevés sur le site A étaient significativement plus
longues que celles des individus prélevés sur le site B (44,4 ± 0,8 mm vs 29,0 ± 0,9 mm ;
Mann-Whitney p < 0,01) (Figure III.4). De même, les indices de condition des individus du
lot A étaient significativement plus élevés que ceux du lot B (62,4 ± 4,4 ‰ vs 37,6 ± 3,7 ‰ ;
Mann-Whitney, p < 0,01) (Figure III.4).
166
2D Stress: 0,11
Stress: 0,11

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Figure III.4 : Indices de condition (histogrammes) et longueurs coquillères (carrés) des
individus prélevés sur le site A (noir) et sur le site B (blanc). Les écarts types sont représentés
sous forme de traits noirs.
2.3.2.2 Fractionnement isotopique
Les individus des deux lots de palourdes présentaient un fractionnement isotopique en
δ 13 C significativement différents (-17,2 ± 0,1 ‰ vs -18,5 ± 0,1 ‰ ; Mann-Whitney, p < 0,01)
mais le même fractionnement isotopique en δ 15 N (8,3 ± 0,4 ‰ ; Mann-Whitney, p > 0,05)
(Figure III.5).
δ15N (‰ )
Indice de condition (‰)
9,2
8,8
8,4
8,0
100
80
60
40
20
7,6
-16,0
0
Avril T0 Novembre T6
-17,0
Figure III.5 : Fractionnement isotopique (δ 13 C et δ 53 N) des muscles adducteurs
postérieurs des individus du lot A (losanges noirs) et du lot B (losanges blancs).
167
-18,0
δ13C (‰)
50
40
30
20
10
0
-19,0
Longueur coquillère (mm)
-20,0

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2.3.2.3 Paramètres hémocytaires
En avril, la concentration en hémocytes totaux (THC) circulant dans l’hémolymphe
(1,7± 1,2 10 5 cell.mL -1 d’hémolymphe) ainsi que le taux de phagocytose (50,2 ± 9,9 % de
cellules actives) étaient identiques pour les deux lots d’individus (Mann-Whitney, p > 0,05).
En revanche, en novembre, les individus du lot A présentaient une THC 20 fois supérieure à
celle des individus du lot B (Mann-Whitney, p < 0,01), mais un taux de phagocytose 0,7 fois
inférieure (Mann-Whitney, p < 0,01).
2.3.3 Caractérisation des communautés bactériennes des palourdes
L’abondance bactérienne a été estimée par PCR quantitative en temps réel en avril et en
novembre sur 6 individus par lot et sur 3 organes (Br, TD et Re) par individu. Cette
abondance a été exprimée en nombre de copies d’ADNr 16S par gramme de tissu.
2.3.3.1 Etude des individus dans leur habitat naturel
2.3.3.1.1 comparaison entre les 2 lots de palourdes
Quelque soit le temps d’échantillonage considéré, aucune différence significative
d’abondance bactérienne par individu n’a été observée entre les deux lots de palourdes
(Mann-Whitney, p > 0,05) avec en moyenne 2,4 ± 1,6 .10 9 copies d’ADNr 16S. ind -1 .
Cependant, le poids frais moyen de tissu des individus du lot A était environ 4 fois supérieur à
celui des individus du lot B (5,7 ± 1,8 g vs 1,1 ± 0,2 g ; Mann-Whitney, p < 0,01). De ce fait,
la concentration en bactéries (exprimée par gramme de tissu) était donc 4 fois supérieure pour
les individus du lot B par rapport à ceux du lot A.
Si en avril, l’analyse des similarités de Bray-Curtis a fait apparaitre une différence entre
les communautés bactériennes du lot A et celles du lot B (2way-ANOSIM, R= 0,347,
p < 0,01), aucune différence n’a été observée en novembre (2way-ANOSIM, p > 0,05). Plus
précisément, seule une différence significative entre les deux lots de palourdes a été observée
en avril pour les communautés bactériennes des branchies (1way-ANOSIM, R = 0,647,
168

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
p < 0,01) et du tube digestif (1way-ANOSIM, R = 0,385, p < 0,01) ; celles du reste ne
présentant pas de différence (1way-ANOSIM, p > 0,05).
En revanche, seules les communautés bactériennes associées au reste présentaient une
différence significative de richesse taxonomique en avril entre les deux lots de palourdes
(lot A : 70 ± 5 OTU vs lot B : 50 ± 11 OTU ; Mann-Whitney, p < 0,01).
Aucune différence de l’indice de Simpson n’est observée entre les communautés
bactériennes des deux lots palourdes quelque soit l’organe et le temps (Kruskall-Wallis,
p > 0,05).
2.3.3.1.2 comparaison des communautés bactériennes entre organes
Aucune différence significative d’abondance bactérienne n’a été observée entre les
trois organes des individus du lot A (Friedman, p = 0,47) avec une abondance moyenne de 1,6
± 2,9.10 10 copies d’ADNr 16S. g -1 de tissu. En revanche, les individus du lot B présentaient
une abondance bactérienne significativement plus élevée au niveau des branchies
(2,3 ± 2,4.10 11 copies d’ADNr 16S. g -1 de tissu) par rapport aux deux autres organes
(4,8 ± 4,5.10 10 copies d’ADNr 16S. g -1 de tissu) (Wilcoxon, p < 0,05).
L’analyse des similarités de Bray-Curtis, tenant compte des deux temps
d’échantillonnage (avril et novembre), a mis en évidence une différence entre les
communautés bactériennes des trois organes. Cette différence était plus marquée pour les
individus du lot A (2way-ANOSIM, R = 0,317, p < 0,01) que pour ceux du lot B (2way-
ANOSIM, R = 0,122, p 0,05). Seules les communautés bactériennes du lot A ont montré des
différences « evenness » entre organes (Friedman, p < 0,05). En effet, l’indice de Simpson
indiquait une diversité plus faible des communautés bactériennes associées au tube digestif
(0,10 ± 0,07) par rapport à celles des branchies (0,08 ± 0,03) et du reste (0,06 ± 0,02). En
revanche, les communautés bactériennes du lot B avaient un indice de Simpson constant entre
organe (0,10 ± 0,07 ; Friedman, p > 0,05).
2.3.3.1.3 comparaison des communautés bactériennes entre palourdes et sédiment
Les communautés bactériennes associées aux organes des palourdes étaient
significativement différentes des communautés bactériennes du sédiment de leur habitat
respectif (2way-ANOSIM, R = 0,827 p < 0,01) avec une dissimilarité de Bray-Curtis de
169

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
81,4 %. (Figure III.6). Cette différence était plus importante pour les communautés associées
au reste (2way-ANOSIM, R = 0,821 p < 0,01) que pour celles du tube digestif (2way-
ANOSIM, R = 0,781, p < 0,01) et des branchies (2way-ANOSIM, R = 0,774, p < 0,01).
Les communautés bactériennes des sédiments se caractérisaient par une richesse
taxonomique très supérieure à celle des palourdes (89 ± 19 OTU vs 53 ±16 OTU ; Mann-
Whitney, p < 0,01) alors que ces deux types de communautés ont une « evenness » identique
(indice de Simpson = 0,09 ± 0,05 ; Mann-Whitney, p >0,05). Cette comparaison a été
effectuée à partir des résultats obtenus après une amplification sur la même quantité de
matrice ADN.
Figure III.6 : MDS, basé sur l’analyse des similarités de Bray-Curtis, représentant les
patrons de diversité des communautés bactériennes du sédiment (carrés) et des palourdes
(triangles) indépendamment du site. La valeur de stress indique la bonne qualité de la
représentation de la matrice de similarité en deux dimensions.
2.3.3.2 Expérience de transplantation croisée
2.3.3.2.1 dépuration
Après 6,5 jours de dépuration par balnéation dans une eau déposée, aucune
modification significative (comparée à l’état initial en avril) de la longueur coquillère (lot A :
45,2 ± 2,2 mm ; lot B 29,4 ± 3,4 mm), de l’indice de condition (lot A : 65,3 ± 17,3 ‰; lot B :
25,8 ± 4,1 ‰;), de la THC (1,12 ± 0,9 10 5 cell.mL -1 d’hémolymphe) ni du pourcentage de
170
2D Stress: 0,14
Stress : 0,14
matrice
palourde
sediment

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
phagocytose (63 ± 12 % de cellules actives), n’a été observée pour le lot A comme pour le lot
B (Mann-Whitney, p > 0,05) (Tableau III.1).
De même, aucune diminution significative de l’abondance bactérienne n’a été
observée et cela quelque soit le lot de palourdes. Les individus du lot B présentaient donc une
abondance bactérienne par gramme de tissu environ 4 fois supérieure à celle des individus du
lot A.
D’autre part, la comparaison des similarités de Bray-Curtis a montré une réduction des
différences entre les communautés bactériennes des individus des deux lots (2way-ANOSIM,
R = 0,141, p < 0,05). Plus précisément, après dépuration seules les communautés bactériennes
associées aux branchies conservent une différence entre les 2 lots de palourdes (1way-
ANOSIM, R = 0,263, p < 0,05). Les communautés du tube digestif ne présentaient plus de
différence entre les 2 lots (ANOSIM, p > 0,05), et celles associées au reste conservaient leur
similarité (ANOSIM, p > 0,05). Cette réduction des différences inter-lot s’est traduit
également par une augmentation significative des similarités de Bray-Curtis des communautés
bactériennes associées au reste (T0 : 43 ± 11% vs T’0: 69 ± 9 %).
Aucune différence de richesse taxonomique ni d’« evenness » n’a été observée à
l’échelle de l’organe entre les individus des deux lots (Mann-Whitney, p > 0,05).
2.3.3.2.2 réimplantation/transplantation
2.3.3.2.2.1 comparaison des caractéristiques physiologiques des individus appartenant aux
différents lots de palourdes
Après 6 mois, le taux de survie des individus du lot A réimplantés sur le site A (lot
A/A) a été estimé à 100% alors que seulement 43% des individus du lot B réimplantés sur le
site B (lot B/B) ont survécu. Les individus du lot A transplantés sur le site B (lot A/B) avaient
un taux de survie moindre comparé à celui du lot A/A (95 % vs 100%). Au contraire, les
individus du lot B transplantés sur le site A (lot B/A) présentaient un taux de survie plus
important que celui des individus du lot B/B (63% vs 43 %).
171

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Les individus des deux lots n’ont montré aucune croissance comme le prouve
l’absence de différence significative des longueurs coquillères entre T’0 et T’6 (Mann-
Whitney, p > 0,05). Les individus du lot A/A ont perdu en masse par rapport aux individus à
T’0 (Mann-Whitney, p < 0,05) alors que les individus du lot B/B ne présentaient quand à eux
aucune variation de leurs indices de conditions par rapport aux individus à T’0 (Mann-
Whitney, p > 0,05). Les individus du lot A/B avaient un indice de condition significativement
plus faible que celui des palourdes de même origine (lot A/A) (Mann-Whitney, p < 0,01) mais
non différent de celui des individus partageant le même habitat (lot B/B) (Mann-Whitney,
p > 0,05). En revanche les individus du lot B/A avaient un indice de condition
significativement plus élevé que celui des palourdes de même origine (lot B/B) (Mann-
Whitney, p < 0,01) mais non différent de celui des individus partageant le même habitat (lot
A/A) (Mann-Whitney, p > 0,05). L’ensemble des valeurs d’indices de condition est présenté
dans le tableau III.1.
Longueur
(mm)
Indice de
condition (‰)
THC
(cell.mL -1 )
Taux de
phagocytose
(%)
T'0
T'6
T'0
T'6
T'0
T'6
T'0
T'6
Lot A/A Lot B/B Lot A/B Lot B/A
Moyenne 45,2 29,4 45,2 29,4
Ecart type 2,2 3,4 2,2 3,4
Moyenne 42,4 28,4 42,8 29,4
Ecart type 4,0 2,1 4,1 1,3
Moyenne 65,3 25,8 65,3 25,8
Ecart type 17,3 4,1 17,3 4,1
Moyenne 61 29 34 62
Ecart type 8 3 13 9
Moyenne 88204 135507 88204 135507
Ecart type 87355 101074 87355 101074
Moyenne 1005595 163262 183143 837905
Ecart type 696532 149889 131205 564317
Moyenne 64 62 64 62
Ecart type 12 11 12 11
Moyenne 29 43 55 27
Ecart type 11 14 12 7
Tableau III.1 : caractéristiques physiologiques des individus des lots réimplantés (A/A et B/B)
et des lots transplantés (A/B et B/A).
Les individus du lot A/A présentaient une THC 6 fois supérieure à celle des individus
du lot B/B (Mann-Whitney, p < 0,01), mais le taux de phagocytose etait identique entre les
deux lots de palourdes réimplantés (Mann-Whitney, p > 0,05). Les THC et les pourcentages
de phagocytoses des individus transplantés étaient significativement différentes de ceux des
172

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
individus de même origine et identiques à ceux des individus partageant le même habitat
(Mann-Whitney) (Tableau III.1).
2.3.3.2.2.2 comparaison des communautés bactériennes des individus transplantés (A/B et
B/A) avec celles des individus réimplantés (A/A et B/B)
Seules les communautés bactériennes associées aux branchies ont montré des
différences d’abondances. En effet les abondances bactériennes au niveau de cet organe
étaient identiques pour les lots A/B et B/B (3,6 ± 3,1 10 10 copies.d’ADNr 16S g -1 de tissu,
Mann-Whitney, p > 0,05) alors qu’elles diffèraient de celles du lot A/A (4,3 ± 6,2 10 9
copies.d’ADNr 16S g -1 de tissu, Mann-Whitney, p < 0,05). De même, ces abondances étaient
identiques pour les lots B/A et A/A (5,9 ± 6,6 10 9 copies d’ADNr 16S. g -1 de tissu Mann-
Whitney, p > 0,05) alors qu’elles diffèraient de celles du lot B/B (2,8 ± 2,0 10 10 copies
d’ADNr 16S. g -1 de tissu Mann-Whitney, p < 0,05). Pour les autres organes, aucune
différence d’abondance des communautés bactériennes n’a été observée entre les lots (tube
digestif : 1,4 ± 1,9 10 10 copies d’ADNr 16S. g -1 de tissu ; reste: 2,2 ± 3,2 10 10 copies d’ADNr
16S. g -1 de tissu ; Mann-Whitney, p > 0,05) (Figure III.7).
Abondance bactérienne
(nombre de copie d’ADNr 16S. g-1 de tissu)
1,20E+11 1.2 1011 8,00E+10 0.8 1011 4,00E+10 0.4 1011 0,00E+00
Lot A/A Lot A/B Lot B/A Lot B/B
Figure III.7 : Abondances bactériennes associées aux organes d’individus
appartenant aux lots de palourdes réimplantés (lot A/A et lot B/B) ou transplantés (lot A/B et
B/A). Branchies: histogramme noir, tube digestif: histogramme gris et reste des organes:
histogramme blanc. Les barres fines représentent les écarts-types.
173

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
A l’échelle de l’individu, l’analyse des similarités de Bray-Curtis a montré en premier
lieu une différence significative entre les communautés bactériennes des lots de palourdes
réimplantées dans leur habitat d’origine (A/A et B/B) et celles des palourdes transplantées
dans un autre habitat (A/B et B/A) (2way-ANOSIM, R = 0,28 p < 0,01) (Figure III.8). La
différence est expliquée à plus de 12 % par la contribution de l’OTU 286 qui présentait une
abondance relative au niveau des branchies et des restes plus importante chez les individus
des lots transplantés (A/B et B/A) que chez ceux des lots réimplantés (A/A et B/B). Cette
même OTU 286 présentait une abondance relative plus importante au niveau du tube digestif
des individus des lots réimplantés (A/A et B/B).
Figure III.8 : MDS, basé sur l’analyse des similarités de Bray-Curtis, représentant les
patrons des communautés bactériennes des palourdes réimplantées sur leur site d’origine
(A/A et B/B) (symboles noirs) ou transplantées (A/B et B/A) (symboles blancs). La valeur de
stress indique la bonne qualité de la représentation de la matrice de similarité en deux
dimensions.
De manière plus détaillée, les communautés bactériennes associées aux branchies chez
les individus transplantés (A/B ou B/A) étaient significativement différentes de celles des
branchies de tous les individus réimplantés, qu’ils partagent le même habitat ou la même
origine (1way-ANOSIM ; Tableau III.2).
174
2D Stress: 0,16
Stress: 0,16

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Les communautés bactériennes associées au tube digestif chez les individus
transplantés du lot A/B étaient significativement différentes de celles associées au tube
digestif de tous les individus réimplantés, qu’ils partagent le même habitat ou la même origine
(1way-ANOSIM ; Tableau III.2). En revanche les communautés bactériennes associées au
tube digestif des individus transplantés du lot B/A étaient identiques uniquement à celles des
individus réimplantés d’origine différente mais partageant le même habitat (lot A/A ; 1way-
ANOSIM p > 0,05). Elles diffèraient donc de celles des individus réimplantés de même
origine mais ne partageant pas le même habitat (lot B/B ; 1way-ANOSIM, Tableau III.2).
Les communautés bactériennes associées au reste chez les individus transplantés du lot
A/B étaient significativement différentes de celles associées au reste de tous les individus
réimplantés, qu’ils partagent le même habitat ou la même origine (1-way ANOSIM ; Tableau
III.2). Celles associées au reste chez les individus transplantés du lot B/A étaient identiques
uniquement à celles des individus réimplantés de même origine mais ne partageant pas le
même habitat (lot B/B, 1way-ANOSIM, p > 0,05). Elles diffèraient donc de celles des
individus réimplantés d’origine différente mais partageant le même habitat (lot A/A ; 1way-
ANOSIM, Tableau III.2)
Branchies
Tube digestif
Reste
Tableau III.2 : Comparaison des communautés bactériennes entre lots transplantés (A/B et
B/A) et lots réimplantés (A/A et B/B): valeur des R des 1-way ANOSIM. Les différences non
significatives sont indiquées par la mention NS.
175
Lot A/B Lot B/A
Lot A/A 0,546 0,511
Lot B/B 0,357 0,376
Lot A/A 0,544 NS
Lot B/B 0,522 0,231
Lot A/A 0,651 0,501
Lot B/B NS NS

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2.4 Discussion
Cette étude a porté sur la caractérisation des communautés bactériennes associées à un
bivalve marin fouisseur, la palourde japonaise Ruditapes philippinarum. Nous nous sommes
plus particulièrement intéressés aux déterminismes de ces communautés à l’échelle de trois
organes. Les branchies et le tube digestif, organes en contact direct avec l’environnement,
sont susceptibles d’héberger une microflore largement acquise par transmission latérale
(déterminisme d’habitat). Le reste des organes plus internes et isolés de l’extérieur par des
barrières physiques et physiologiques sont eux plutôt susceptibles d’héberger une microflore
plus autochtone (déterminisme d’hôte).
Les palourdes échantillonnées sur le site A (lot A) affichent de meilleures
caractéristiques physiologiques. En effet leur capacité de croissance (longueur de coquille =
44,4 ± 0,8 mm) et leur taux de remplissage (IC= 62,4 ± 4,4 ‰) sont supérieurs à ceux des
palourdes échantillonnées sur le site B (lot B). Ces observations sont en accord avec celles
effectuées par Dang et al. (2009) et valident le choix de ces deux lots pour cette étude. La
signature isotopique en δ 13 C diffère également entre les deux lots d’individus. S’il ne peut être
exclu que cette différence soit partiellement liée à la physiologie des individus, elle
exprimerait majoritairement une différence de régime alimentaire (Dang et al., 2009). Ces
résultat sont en accord avec ceux du suivi mensuel des communautés pico- et nano-
planctoniques (sources nutritives des bivalves), réalisé dans le cadre du réseau national
d’observation en milieu littoral (SOMLIT). En effet, ce suivi réalisé depuis 2003, montre une
dominance des cyanobactéries au site A alors que le site B est plus riche en pico- et nano-
eucaryotes, en cryptophycées et en procaryotes hétérotrophes. D’autre part, nos résultats
montrent une différence de structure des communautés bactériennes entre les sédiments des
deux sites (1way-ANOSIM, R = 0,847, p < 0,01) bien que les abondances procaryotes soient
similaires (7,1 ± 5,4 10 7 cell.g -1 de sédiment sec). Ces résultats valident nos choix de sites
d’étude contrastés et de lots de palourdes différenciés. Les individus du lot A issus du site A
peuvent être considérés, par leur caractéristiques physiologiques, comme des individus de
référence présentant un « bon état de santé ».
Nous nous sommes dans un premier temps interrogés sur la notion de communautés
bactériennes spécifiques à la palourde par rapport à son environnement. Il est en effet connu
que certains invertébrés marins comme les éponges ou les moules hébergent une flore
bactérienne spécifique différente de celle de l’habitat environnant (Frischer et al., 2000; Gerce
176

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
et al., 2011). Cette spécificité serait liée au caractère vivant de l’organisme. Il a en effet été
montré qu’un organisme corallien mort ne présente pas la même flore associée qu’un
organisme corallien vivant (Hansson et al., 2009). Comme les éponges, les coraux et les
moules, les palourdes hébergent des communautés bactériennes qui se distinguent de celles de
leur environnement ou du moins des communautés bactériennes de l’horizon sédimentaire 0-
0,5cm (2way-ANOSIM, R = 0,827 p < 0,01) qui constituent la source nutritive principale de
ces bivalves (Pieri, 1895 ; Le Treut, 1986). Les organes en contact direct avec
l’environnement sont susceptibles d’héberger via la transmission latérale, une proportion de
bactéries allochtones transitoires plus importante que les organes internes. Les branchies
constituent l’une des premières barrières physiques et fonctionnelles réalisant un tri des
particules provenant de l’environnement avant passage dans le tube digestif (Dame, 1996) et
sont par conséquent les plus en contact avec l’habitat. Le tube digestif accumule, quand à lui,
une flore bactérienne déjà pré-triée (Harris, 1993 ; Dame, 1996). Les organes internes (i.e. le
reste dans notre étude) sont irrigués par un système circulant d’hémolymphe dont la capacité à
éliminer de manière sélective certaines populations bactériennes à travers des mécanismes de
phagocytose a été mis en évidence chez d’autres especes de bivalves comme Anodonta
cygnea ou Mytilus galloprovincialis (Pruzzo et al., 2005 ; Antunes et al., 2010). Nos résultats
montrent un gradient de dissimilarité des communautés bactériennes associées aux organes en
fonction du lien plus ou moins étroit de ces organes avec l’habitat. Les communautés
bactériennes associées au reste sont en effet plus dissemblables des communautés du sédiment
(2way-ANOSIM, R = 0,821 p < 0,01) que celles du tube digestif (2way-ANOSIM, R = 0,781,
p < 0,01) et des branchies (2way-ANOSIM, R = 0,774, p < 0,01). La présence d’une structure
de communautés bactériennes associées à la palourde différente de celle des communautés
bactériennes du sédiment, renforcent l’idée de l’existence de communautés bactériennes
spécifiques à la palourde.
Nous nous sommes ensuite interrogés sur le déterminisme des communautés bactériennes
associées à la palourde. Pour cela les communautés bactériennes associées à un organe ont été
comparées entre individus appartenant à deux lots de palourdes physiologiquement différentes
et provenant de deux habitats contrastés.
Les communautés bactériennes associées aux organes internes étaient identiques en avril
et en novembre entre les deux lots de palourdes. Ces résultats suggèrent que ces communautés
bactériennes sont plus étroitement liées à l’espèce Ruditapes philippinarum et ce en dépit du
fait que les deux lots de palourdes étaient constitués d’individus physiologiquement différents
177

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
et provenant de deux habitats contrastés. D’après le modèle d’acquisition des communautés
bactériennes par les bivalves, les populations dominantes associées aux tissus internes seraient
alors acquises plus particulièrement par transmission verticale ou horizontale et pourraient
résulter d’une co-évolution (ou d’une pression de sélection) entre le bivalve et son microbiote
(Zurel et al., 2011). Selon Romero et al. (2001) on peut plus simplement parler de populations
autochtones car présentant un caractère permanent au sein du bivalve.
En avril, les communautés associées aux branchies et celles associées au tube digestif
diffèrent entre les individus des deux lots. Etant donné que les deux lots de palourdes étaient
constitués d’individus physiologiquement différents et provenant de deux habitats contrastés,
deux hypothèses peuvent être émises : (i) les communautés bactériennes associées aux
branchies et au tube digestif sont déterminées par l’habitat, (ii) et/ou par l’état physiologique
des individus hôtes. En novembre, ces mêmes communautés sont identiques entre les deux
lots de palourdes. A cette période, les conditions environnementales sont plus similaires entre
les deux habitats. En effet, les écarts de salinité de la colonne d’eau environnante sont réduits
par rapport à avril (données SOMLIT) du fait des débits plus faibles de la Leyre (affluent
majoritaire du Bassin d’Arcachon) (Bouchet, 1968). L’analyse des communautés bactériennes
des sédiments montrent également une plus forte similarité en novembre qu’en avril entre les
2 sites. Les communautés bactériennes des branchies et du tube digestif, apparaissaient donc
comme déterminées principalement par l’habitat et seraient majoritairement constituées de
populations bactériennes transitoires (ou flore de transit). Cependant, on ne peut exclure
l’influence de la physiologie du bivalve sur les communautés bactériennes associées à ces
deux organes, puisque les individus des deux lots de palourdes présents dans les deux habitats
contrastés étaient physiologiquement différents.
Afin de mettre en évidence la part du déterminisme d’habitat et du déterminisme d’hôte
sur les communautés bactériennes associées à la palourde, une expérience de transplantation
croisée entre les deux lots de palourdes et les deux habitats contrastés a été réalisée.
Au préalable, les palourdes ont subi une étape de dépuration de 6,5 jours. Dans cette
expérimentation, la dépuration a été utilisée dans le but d’éliminer les populations allochtones
bactériennes transitoires apportées par transmission latérale. Comme attendu, les populations
allochtones bactériennes transitoires originaires des sites A (pour le lot A) ou B (pour le lot B)
ont été remplacées par des populations allochtones bactériennes transitoires du bassin de
dépuration conduisant à une augmentation des similarités entre les communautés bactériennes
178

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
associées aux 2 lots de palourdes. Ce résultat est en accord avec ceux observés lors des
reparcages de bivalves à des fins sanitaires (d’une durée minimum de 2 jours) et dont le but
est d’éliminer des espèces bactériennes allochtones potentiellement pathogènes pour l’homme
accumulées lorsque l’habitat naturel présente de manière ponctuelle ou persistante une
mauvaise qualité sanitaire (Furfari, 1966). La littérature fait également état d’expériences de
dépuration plus longues. Caro et al. (2009) ont expérimenté une étape de dépuration sur une
période de 4 mois. Leur but était d’éliminer toutes les bactéries faiblement associées aux
branchies du bivalve Codakia orbicularis afin d’avoir accès aux bactéries les plus étroitement
liées à leur hôte.
Après l’étape de dépuration, les communautés bactériennes associées au tube digestif des
deux lots de palourdes étaient devenues semblables. Celles des branchies présentaient une
différence moindre par rapport à avant l’étape de dépuration validant le procédé par
balnéation dans une eau déposée. La faible différence restante pourrait être dû à un temps de
dépuration trop court Cependant, Serais et al. (2010) ont montré qu’une durée de 5 jours était
suffisante pour éliminer une contamination par Escherichia coli. On ne peut donc exclure que
les conditions de balnéation non optimale dans les bassins de dépuration aient induit une
diminution du taux de filtration ralentissant l’élimination des bactéries allochtones. Le
changement de qualité nutritive ou de turbidité du milieu sont des causes connues de
variations des processus de ventilation branchiale (Le Treut, 1986). Finalement, les résultats
observées à la suite de cette étape de dépuration renforcent l’hypothèse que les communautés
bactériennes associées aux branchies et au tube digestif sont majoritairement déterminées par
l’habitat.
A la fin de l’expérience (T’6) les communautés bactériennes des individus transplantés et
celles des individus réimplantés mais de même origine diffèrent, suggérant que le changement
d’habitat entraine une modification des communautés bactériennes. Les branchies et le tube
digestif apparaissent comme les organes les plus sensibles aux changements d’habitat puisque
les communautés bactériennes des lots A/B et B/A diffèrent de celles des lots réimplantés de
références. Ces résultats confortent l’hypothèse que les branchies et le tube digestif sont des
sites primaires d’infection bactérienne allochtone. La structure des communautés des organes
internes (i.e. le reste) n’évolue pas lorsque les individus sont réimplantés sur leur site
d’origine ou transplantés sur l’autre site, sauf pour les individus du lot A/B transplantés sur un
site moins favorable (indice de condition et taux de survie plus faible sur le site B). Ces
résultats suggèrent donc que la structure des communautés bactériennes associées aux organes
179

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
internes est majoritairement liée à l’état physiologique des hôtes. En effet la transplantation
des individus du lot A/B dans un environnement moins favorable a pu provoquer une
détérioration de l’état de santé des individus, accompagnée par une diminution plus ou moins
importante des barrières physiques et/ou physiologiques.
2.5 Conclusion
A travers la comparaison des communautés bactériennes de deux lots de palourdes
différenciées et provenant d’habitats contrastés, cette étude met en évidence une structure
différente des communautés bactériennes à l’échelle de l’organe. Les communautés
bactériennes associées au tube digestif qui est l’un des organes les plus en contact avec
l’habitat et impliqués dans la fonction trophique apparaissent majoritairement déterminées par
l’habitat alors que celles associées aux organes plus internes semblent majoritairement être
déterminées par la position taxonomique de l’hôte. Les communautés bactériennes associées
aux organes internes pourraient alors être le résultat d’un contrôle de l’hôte ou celui d’une co-
évolution entre l’hôte et sa microflore due à des pressions de sélections communes. Les
communautés bactériennes associées aux branchies présentent un déterminisme qui semble
plus complexe, ces communautés étant à la fois influencées par l’habitat et par l’hôte. Le
changement d’habitat du bivalve entraine une modification de sa condition physiologique
mais également une modification de la structure des communautés bactériennes des organes y
compris des organes internes suggérant que l’état physiologique interviendrait dans le
maintien des communautés bactériennes autochtones de la palourde. L’hypothèse d’un
déterminisme d’hôte devrait pouvoir être confirmée en comparant les communautés
bactériennes associées à deux espèces de bivalves vivant en sympatrie et présentant la même
écologie (e.g. la coque Cerastoderma edule et la palourde Ruditapes philippinarum). Un
intérêt plus particulier pourrait alors être porté sur les populations bactériennes autochtones,
véritable microflore associée aux bivalves. L’étude de sa position exacte dans les tissus (ecto-
ou endosymbiontique) par FISH par exemple pourrait permettre de mieux caractériser la
nature de l’intéraction bactéries-bivalves. La caractérisation de la composition taxonomique
de cette microflore associée par une approche de (méta)génomique ainsi que l’étude de ses
capacités métaboliques permettrait en accédant à l’auto-écologie des populations
bactériennes, de mieux comprendre les fonctions qu’elles assurent (e.g. épuratrice,
immunitaire voire probiotique).
180

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2.6 Références
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Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
184

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
3. Diversité des procaryotes à l’échelle d’un organe : déterminisme d’espèce
Evidence for specific tissue-dependent bivalve-associated bacteria in cockles
(Cerastoderma edule) and clams (Ruditapes philippinarum)
Ika Paul-Pont 1,3 , Guillaume Meisterhans 1,2, , Natalie Raymond 1,2, , Line Bourrasseau 1,2, , Xavier de
Montaudouin 1,2, , Frédéric Garabetian 1,2, , Florence Jude-Lemeilleur 1,2, *
1 Univ. Bordeaux, EPOC, UMR 5805, F-33120 Arcachon, France
2 CNRS, EPOC, UMR 5805, F-33120 Arcachon, France.
3 Farm Animal and Veterinary Public Health, Faculty of Veterinary Science, The University of
Sydney, 425 Werombi Road, Camden NSW 2570, Australia 2
Soumis le 30 Janvier 2012 à FEMS Microbiology Ecology ; Manuscript ID: FEMSEC-12-01-0053
Key words: microbiota; bivalve; bacterial association; bacterial abundance; bacterial diversity;
starvation
Running title: Specific tissue-dependent bivalve-associated bacteria
* Corresponding author
Address :Station Marine d’Arcachon, 2 rue du Pr Jolyet, F-33120 Arcachon, France
Phone : +33556223911 ; Fax : +33556835104 ; e-mail : f.jude@epoc.u-bordeaux1.fr
185

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
186

Abstract
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Research on the structure of microbial communities in marine bivalves presents some
specific challenges as bivalves accumulate large numbers of microorganisms due to their lifestyle as
siphon feeders and/or burrowing animals. In the present study, bacterial community abundance
(BCA) and diversity (BCD) were estimated by epifluorescence microscopy and Automated
Ribosomal Intergenic Spacer Analysis in cockles (Cerastoderma edule) and clams (Ruditapes
philippinarum) before and after a 21-day starvation experiment to assess the shift from transient to
resident host-associated bacterial communities within bivalve tissues. The gut of bivalves
expectedly harboured the highest bacterial concentration whereas the lowest value was found in
hemolymph, consistent with its role in innate immunity. Sympatric cockle and clam individuals
exhibited significant differences in BCD in all tissues suggesting species-level control of bacterial
communities in individuals experiencing the same contamination from the environment (2 way-
ANOSIM: R=0.739 p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
188

Introduction
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Marine bivalves host numerous bacteria and are able to survive in highly septic surroundings
depending on the efficiency of their immune system (Antunes et al., 2010). Three main pathways
for microflora acquisition by marine bivalves are described (Bright & Bulgheresi, 2010). In vertical
transmission, bacteria shift from parents to offspring, through the incorporation of bacteria within or
on gametes. In horizontal transmission, bacterial acquisition is independent of host reproduction and
bacteria are taken up through spread between contemporary hosts. Lateral transmission concerns
microflora being acquired directly from the environment, through the burrowing and filtration
activities of bivalves (Dubilier et al., 2008). Interactions between microflora and their host can be
diverse, from simple opportunistic interaction to parasitic or symbiotic relationships, and can
influence bivalve fitness. While endosymbiosis (Kim et al., 1995; Caro et al., 2009) or intimate
association with tissues (Romero et al., 2002) have been reported, little is known about the overall
dynamics of the bacterial communities in bivalves. For instance, literature remains scarce on the
diversity and the nature of bacterial communities in bivalves. Some studies suggested that specific
bacterial assemblages interact with oysters (Hernández-Zárate, 2006; La Valley et al., 2009) and
freshwater mussels (Frischer et al., 2000). On the other hand, the sanitary aspects of microbial
contamination of shellfish (resources survey data, fish farming purification processes) suggest that
bivalve-associated bacteria may be highly influenced by the bivalves’ environment, through lateral
transmission. In French national sanitary surveys (e.g. French microbiological monitoring network
for shellfish growing areas – REMI; http://envlit.ifremer.fr/surveillance/microbiologie_sanitaire) the
whole shell content is analysed as ground flesh and intervalval liquid (FIL). Most of the fecal
indicator bacteria that are found in shellfish inhabiting a contaminated area can easily be eliminated
after a short period of purification in an adequate tank because they belong to the fraction of the
bivalve-associated bacterial community that may simply be passing through the animal along with
water and food, i.e. they are transient microorganisms acquired incidentally as a consequence of
siphoning activity. If so it could be hypothesized that they are mainly associated with the gills and
the gut. This particular case and a previous study on endosymbionts (Kim et al., 1995) ask the
question: is there tissue-dependence of bivalve-associated bacteria (BAB)? In a previous study,
Meisterhans et al. (2011) suggested to consider the different organs (e.g: gut, gills, muscle)
separately as the important gut microflora may hide a specific microflora associated with other
organs.
189

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
To address this question, bacterial communities were assessed in different bivalve tissues
using molecular approaches. The cockle Cerastoderma edule and the clam Ruditapes philippinarum
were selected for their ecological relevance. In European coastal zones, the latter is an introduced
species while the former is a native species. Individuals of both species can live in sympatry,
burrowing in the sediment and feeding on the suspended particles that accumulate at the water-
sediment interface. Sympatric individuals exhibiting the same lifestyle are subjected to the same
lateral transmission events allowing comparison of the influence of this mechanism on the BAB.
Finally, to unveil the resident microflora that may have been masked by the transient microflora
acquired through feeding, a set of animals was analysed after 21 days starvation. The analyses were
also performed at individual scale in several functional tissues: hemolymph, gills, gut, mantle and
remaining tissues (including foot, gonad, heart, muscle and digestive gland) to identify tissue-
dependent associations.
Materials and Methods
Sampling sites
Fifty cockles (36.0 ± 2.5 mm shell length, mean ± SD) and fifty Manila clams (46.4 ± 2.4
mm shell length, mean ± SD) were collected at Banc d’Arguin, a moderately sheltered inter-tidal
sand flat (median grain size = 350 µm), in Arcachon Bay (France, 44°40’N 1°10’W). The water
salinity and sediment temperature annually range from 31 – 35 psu and 0°C to 30°C, respectively
(Dang et al. 2010). The benthic community in sand is dominated by cockles with adult abundance
reaching 200 ind.m -2 while Manila clams are generally scarcer (

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
was set to 15°C (± 0.7°C, mean ± SD) and the photoperiod 12:12 using a timer and artificial light
sources.
At the beginning (T0) and at the end (Tf) of the starvation experiment, five cockles and five
clams were randomly sampled for analysis. Hemolymph (He) was withdrawn from the adductor
muscle of each individual with a 25-gauge needle attached to a 1-mL sterile syringe (TERUMO).
Each sample was observed under a stereomicroscope to verify the absence of disseminated
neoplasia in relation to its strong negative impact on host physiology (Carballal et al., 2001).
Bivalve foot was dissected and squeezed between two glass slides under a microscope (Nikon
Eclipse E400) to check for the absence of the deleterious and proliferating parasitic trematode
Bucephalus minimus. Gills (Gi), mantle (Ma), gut (Gu) and remaining tissues (Re) (including foot,
gonad, heart, muscle, digestive gland) were dissected, weighed and shredded with a homogenizer
(blade OMNI TH) in NaCl (30 g.L -1 ; final dilution 1/10). Each sample was dispensed as aliquots in
formol (3.7%) – NaCl (30 g.L -1 ) for bacterial counts and in a preservative buffer (100 mM Tris-HCl
[pH 8.0], 100 mM Na EDTA [pH 8.0], 1.5 M NaCl and 1% [wt/vol] cetyltrimethylammonium
bromide) (Zhou et al., 1996) for diversity analyses.
Total bacterial count
An aliquot of 50 µL of each sample was used to determine the total bacterial count by using
an epifluorescence microscope (Olympus BH2-RFCA, excitation filter BP490, magnification 1000)
according to the protocol described by Meisterhans et al. (2011). Results were expressed as cell
units per g of flesh (fresh weight).
Bivalve bacterial community structure analysis by ARISA
Changes in the bivalve bacterial community diversity (BCD) were assessed using the PCR-
based whole-community fingerprinting approach ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer
Analysis) of bacterial DNA (Fisher & Triplett, 1999). ARISA amplifies the Intergenic Transcribed
Spacer (ITS) between the 16S and 23S rRNA genes using a fluorescent primer and the ITS size
represents the operational taxonomic unit (OTU). Results are displayed as the amount of different
PCR products of specific fragment length (ITS size). Even though several biases have been
associated with the use of molecular based techniques such as ARISA in the analysis of bacterial
communities, these biases can be assumed to affect all samples equally, if the samples have a
common source and are similarly treated (Ramirez-Saad et al., 2003). DNA was extracted from
subsamples of 25 mg of tissue, using a bead beating method (FastPrep and lysis matrix A; 6 m∙s -1 ;
191

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
40 s, MP Biomedicals, Illkirch, France) coupled to QIAamp DNA Mini Kit (QIAgen, Courtaboeuf,
France). The amount of extracted DNA was determined by spectrofluorimetry (LS 55, PerkinElmer,
Courtaboeuf, France) using SYBR® Green I (Molecular Probes, Invitrogen, Cergy Pontoise,
France), and quantified using DNA standard 1 mg mL -1 solutions of calf thymus DNA (Sigma
Aldrich, St. Quentin Fallavier, France). The same amount of extracted DNA (10 ng) was used for
each ARISA amplification assay. For each sample, the ARISA amplification step was conducted in
triplicate. The amplification was run according to Ranjard et al. (2000) using universal bacterial
primers SDBact (5’-TGC GGC TGG ATC CCC TCC TT- labelled at the end with the
phosphoramidite dye 5-FAM fluorochrome) and LDBact (5’-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-)
(Normand et al., 1996) (Molecular Probes Invitrogen Cergy Pontoise, France) with the following
conditions: (i) 94°C for 5 min; (ii) 35 cycles of 94°C for 1 min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min, and
then (iii) 72°C for 5 min. The 25 µL-reaction mixtures contained 1 x PCR buffer, 1.5 mM MgCl2,
0.3 mg mL -1 of bovine serum albumin (MP Biomedicals, Illkirch, France), 5% of DMSO, 0.2 mM
of each dNTP, 0.1 µM of each primer, 1U of Taq polymerase (Promega, Charbonnières-les-Bains,
France) and 20 ng of template DNA. PCR products were purified using a QIAquick PCR
Purification Kit (QIAgen, Courtaboeuf, France) and quantified by spectrofluorimetry as described
before. Two ng of purified product from each sample were combined with 10 µL Hi Di formamide
and an internal LIZ1200 standard (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France) before being heat
treated (95°C, 5 min) and then cooled on ice. ARISA was performed on a 3730XL Capillary
Genetic Analyser (Applied Biosystems Ltd, Courtaboeuf, France), using a capillary and standard
Genemapper protocol, which detects the relative abundance of different sized PCR products
labelled with the fluorescent primers (Plateforme Genome-Transcriptome Pierroton INRA,
Bordeaux-Aquitaine, www.pierroton.inra.fr/biogeco/site_pole_agro/genoseq.html). Results were
read using the ABI Peak scanner software provided by Applied Biosystems (Courtaboeuf, France)
where each profile of peaks in an electrophoregram defines the bacterial diversity fingerprint.
Fluorescence data (peak areas and peak sizes) were exported to Microsoft Excel to allow data
analysis. Peak size values were rounded to the nearest whole number and peaks with a size inferior
to 200 bp were considered as noise and excluded from analysis (Lear & Lewis, 2009). According to
Osborne et al. (2006), an optimal divisor (500) was determined to eliminate the background
fluorescence (data not shown). Moreover, according to Ramette (2009) data were binned (i.e.
electrophoretic profiles alignement) using the interactive and automatic binning algorithms [their
respective manuals and examples are available online (http://www.ecology-research.com)]
implemented in the free, R programming language [The R Foundation for Statistical Computing
192

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
(http://cran.r-project.org/)]. From Peak scanner output table, a custom R binning script (Ramette,
2009) was applied (WS: 2; Sh: 0.1). All peaks with relative fluorescence intensity value inferior to
0.002 (1/optimal divisor) were not included in further analyses since they consisted of background
peaks. Therefore, to consider a maximum of peaks while excluding background noise, only
fragments with relative fluorescence intensity above a threshold of 0.2% and ranging between 200
and 1500 bp were considered as a true peak. Each true peak displayed represented one ITS and the
peak area represented the relative abundance of the ITS present. Data were also transformed to
abundance matrix. From this matrix, Bray-Curtis similarities (BC) between samples were calculated
from Primer software (PRIMER-E Ltd, Lutton, UK) according the following equation
– – where OTUi,a is OTUi relative abundance
in sample A and OTUi,b is OTUi relative abundance in sample B. Similarities were represented on
non-multidimensional scaling (MDS) (Clarke & Warwick, 2001). On each MDS chart, every
bacterial community was represented as one plot and the relative changes in community structure as
the distances between the points.
Statistical analyses
A Mann–Whitney test and when possible an Analysis of Variance (ANOVA) were
performed to compare BCA between different sampling times and bivalve species. Comparison of
BCA among tissues within each species was assessed using the Friedman test for related samples.
Statistical differences in BCD between groups (species, time, tissues) were tested using ANalysis
Of SIMilarity (1 way-ANOSIM or 2 way-ANOSIM) a random permutation tests (Monte-Carlo test,
100,000 permutations) performed from Bray-Curtis similarity matrixes (Clarke & Warwick, 2001;
Kropf et al., 2004). All tests and correlations were considered statistically significant at p value
≤ 0.05.
193

Results
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
1. Initial bacterial community structure in bivalves
a. Bacterial community abundance (BCA)
Clams were significantly bigger than cockles (4.8 ± 0.3 g vs. 2.9 ± 0.1 g, respectively) but no
significant difference was observed in terms of total bacterial concentration (cell g -1 ) and bacterial
content (cell matrix -1 ) between both bivalves at whole individual scale (Table 1). Bacterial
concentrations in cockles and clams respectively reached 3.1 10 10 ± 0.6 10 10 and 3.2 10 10 ± 0.3 10 10
cells g -1 before the starvation experiment. Only slight differences in bacterial concentration
appeared between bivalve species, namely the hemolymph, the gut and the remaining tissues of
clams showed significantly higher bacterial concentrations than in cockles (Table 1). Despite these
differences, cockles and clams displayed the same bacterial distribution between tissues. The gut
harboured the highest bacterial concentration (1.7 10 11 ± 0.1 10 11 and 2.6 10 11 ± 0.3 10 11 cells g -1 in
cockles and clams, respectively) followed by mantle, gills and remaining tissues holding similar
bacterial concentrations (1.4 – 4.2 10 10 cells g -1 ), whereas the lowest value was found in hemolymph
(7.3 10 6 ± 0.4 10 6 and 9.7 10 6 ± 0.7 10 6 cells g -1 in cockles and clams, respectively) (Table 1). BCA
were also expressed in cells matrix -1 in order to assess the distribution of the bacterial community
between bivalve tissues according to their relative weights and functions (Table 1). In cockles, the
relative bacterial content (cells matrix -1 ) showed a similar trend to that observed for bacterial
concentration (cells g -1 ). More than 50% of the total bacterial content was found in the gut despite
its relatively low weight, whereas the remaining tissue (Re) harbored only 30% of the total bacterial
content, followed by the mantle (9%) and gills (5%) (Table 1). The bacterial content in hemolymph
represented less than 0.01% of the total bacterial load in cockles. In clams only 15% of the total
bacterial content was found in the gut whereas the remaining tissue and the mantle held more than
77% of the total bacterial load. The bacterial content in hemolymph of clams represented less than
0.01% of the total bacterial load, similar to what was observed in cockles (Table 1).
194

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Table 1. Mean value (± standard error, SE, n=5) of tissue weight (g, fresh weight), bacterial concentration (cell g -1 , fw)
and content (cell matrix -1 ) in cockles and clams before the starvation experiment. A one way ANOVA was performed to
assess difference between bivalve species. NS: no significant difference.
Tissue weight (g) Bacterial concentration (cell g -1 ) Bacterial content (cell matrix -1 )
Cockle Clam p value Cockle Clam p value Cockle Clam p value
Mean 1.01 0.8
7.3E+06 9.7E+06
7.8E+06 7.7E+06
Hemolymph
NS
p=0.011
SE 0.01 0.11 3.8E+05 6.5E+05 3.6E+05 1.2E+06
Mantle
Gills
Gut
Remaining
tissues
Whole
individual
Mean 0.33 1.32
2.5E+10 2.1E+10
8.5E+09 1.9E+11
p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
b. bacterial communities’diversity (BCD)
cockles
A total of 309 ITS, ranging from 200 to 1245 bp in size, was detected by ARISA analysis of
the bacterial community of tissues of five cockles before the starvation experiment, with a mean
value of 156 ± 12 ITS per individual (mean ± SE) (Table 2). Among the detected ITS, 179 (58%)
were rare, being generally found in less than 20% of the studied samples (i.e. in one bivalve out of
five analyzed) whereas only 15 ITS (5%) were considered as constant in cockles (i.e. in at least four
bivalves out of five analyzed) (Table 3). The high proportion of rare ITS resulted in a low mean
level (Mean ± standard deviation (SD): 20.6 ± 13.6%; Min-Max range: 0-83.2%) of Bray-Curtis
similarities of cockle bacterial community among individuals. One third of the detected ITS
(97 ITS) was tissue specific and 13% (41 ITS) were ubiquitously found in cockle tissues. In
addition, most tissue-specific ITS were characterized as rare since more than 86% of them were
only recorded in one of the five sampled cockles. Comparison of BCD among cockle tissues was
performed by the 1 way-ANOSIM test and revealed significant differences (R=0.43; p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Table 2. Mean value (± standard error, SE, n=5) of ITS detected in cockle and clam tissue before the starvation
experiment.
Gills Hemolymph Mantle Remaining tissues Gut Whole individual
Cockle Clam Cockle Clam Cockle Clam Cockle Clam Cockle Clam Cockle Clam
Mean 39 34 55 60 63 55 57 63 46 69 156 188
SE 7 7 8 10 12 5 6 6 10 12 12 8
Total 128 120 152 206 185 198 178 190 139 182 309 364
Table 3. Constancy of the ITS detected in cockle and clam tissues before the starvation experiment (T0). Rare = ITS
detected only in 1 of the 5 sampled individuals, Occasional = 2 / 5, Common = 3 / 5, Constant = 4-5 / 5.
Cockle
Clam
ITS-T0
rare occasionnal common constant Total
Hemolymph 88 28 21 15 152
Gills 91 20 9 8 128
Mantle 106 41 28 10 185
Gut 79 37 18 5 139
Remaining tissues 107 48 14 9 178
Whole individual 179 71 44 15 309
Hemolymph 135 56 9 6 206
Gills 86 22 6 6 120
Mantle 147 32 13 6 198
Gut 89 51 17 25 182
Remaining tissues 107 55 15 13 190
Whole individual 213 86 54 11 364
197

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Cockles vs. clams
Two different ANOSIM tests were performed to compare BCD between both sympatric
bivalves. The first ANOSIM was performed at whole individual scale with all tissues pooled,
whereas the second one was done on each tissue considered individually between both species.
Despite the 275 ITS (69% of all ITS) shared by both bivalve species before the starvation
experiment, ANOSIM results showed highly significant difference of total BCD between both
bivalves at whole individual scale (2 way-ANOSIM: R=0.56 ; p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
2. Bacterial community structure after starvation experiment
a. Bacterial abundance
Cockles
No significant effect of the 21-day starvation was demonstrated on the total body weight of
cockles, despite the fact that the weights of the hemolymph and digestive tube of starved cockles
were significantly lower than those of cockles before the experiment (Table 4, Mann-Whitney test,
p>0.05). To avoid any dilution effect of weight on bacterial concentration in cockle tissues, results
were expressed as bacterial count (cells matrix -1 ) instead of bacterial concentration (cells g of
tissue -1 ) to compare the BCA in bivalves before and after the starvation experiment. At whole
individual scale, there was a significant reduction in cockle bacterial content after the starvation
experiment (9.15 10 10 ± 1.88 10 10 vs. 1.74 10 10 ± 2.56 10 9 cells ind -1 , for initial and starved cockles,
respectively). This decrease in bacterial content was significant in most tissues, except gills in
which no significant difference appeared before and after the starvation (Mann-Whitney, p=0.06)
(Table 4).
Despite the decrease of tissue weight and bacterial content, the relative weight of each tissue
was similar to what was observed before the starvation experiment as well as the relative bacterial
concentration among each tissue at the end of the experiment. Namely, the gut harboured the
highest bacterial concentration (7.74 10 10 ± 4.9 10 9 cells g -1 ) followed by mantle, gills and
remaining tissues holding similar bacterial concentrations (5.62 – 7.26 10 9 cells g -1 ), whereas the
lowest value was found in the hemolymph (4.48 10 6 ± 3.66 10 5 cells g -1 ) (Friedman test, p

Hemolymph
Mantle
Gills
Gut
Remaining
tissues
Whole
individual
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Table 4. Mean value (± standard error, SE, n=5) of tissue weight (g, fresh weight), bacterial concentration (cell g -1 , fw)
and content (cell matrix -1 ) in cockles before (T0) and after (Tf) the starvation experiment. A Mann-Whitney test was
performed to assess difference in function of sampling time. NS: no significant difference.
Tissue weight (g)
Bacterial concentration
(cell g -1 )
200
Bacterial content
(cell matrix -1 )
T0 Tf p value T0 Tf T0 Tf p value
Mean 1.01 0.91
7.3E+06 4.5E+06 7.8E+06 4.1E+06
p=0.028
SE 0.01 0.05 3.8E+05 3.7E+05 3.6E+05 5.0E+05
Mean 0.33 0.37
2.5E+10 6.7E+09 8.5E+09 2.5E+09
NS
SE 0.03 0.02 2.5E+09 1.9E+08 1.2E+09 8.4E+07
Mean 0.28 0.30
1.4E+10 5.6E+09 4.2E+09 1.6E+09
NS
SE 0.05 0.04 1.2E+09 9.6E+08 1.0E+09 1.8E+08
Mean 0.27 0.06
1.7E+11 7.7E+10 4.7E+10 4.8E+09
p=0.047
SE 0.12 0.01 1.4E+10 4.1E+09 2.1E+10 9.0E+08
Mean 1.03 1.12
3.0E+10 7.3E+09 3.1E+10 8.5E+09
NS
SE 0.09 0.11 2.2E+09 1.0E+09 3.2E+09 1.8E+09
Mean 2.93 2.77
3.1E+10 6.16E+09 9.1E+10 1.7E+10
NS
SE 0.14 0.11 5.9E+09 6.8E+08 1.9E+10 2.6E+09
p=0.012
NS
p=0.012
p=0.012
p=0.012
p=0.007

Clams
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
No difference of total body weight was revealed after the starvation experiment, and a
similar result was found even at the tissue level (Mann-Whitney test, p>0.05, Table 5). However,
final bacterial contents of starved clams were significantly lower than those of the initial clams, at
whole individual scale (3.80 10 11 ± 0.21 10 11 vs. 9.67 10 10 ± 1.43 10 10 bacteria ind -1 for initial and
starved clams, respectively) and in most organs except gills (Table 5). The relative weights of each
organ were also similar to what was observed before the starvation experiment. No significant
difference of bacterial concentration among tissues was revealed at the end of the starvation
experiment, except for the hemolymph, displaying the lowest bacterial concentration (Friedman test,
p

Hemolymph
Mantle
Gills
Gut
Remaining
tissues
Whole
individual
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Table 5. Mean value (± standard error, SE, n=5) of tissue weight (g, fresh weight), bacterial concentration (cell g -1 , fw)
and content (cell matrix -1 ) in clams before (T0) and after (Tf) the starvation experiment. A one-way ANOVA (when
possible) and a Mann - Whitney test were performed to assess difference in function of sampling time. NS: no
significant difference.
Tissue weight (g)
Bacterial concentration
(cell g -1 )
202
Bacterial content
(cell matrix -1 )
T0 Tf p value T0 Tf T0 Tf p value
Mean 0.80 1.00
9.7E+06 1.1E+08 7.7E+06 1.1E+08
NS
SE 0.11 0.02 6.5E+05 1.9E+07 1.2E+06 2.3E+07
Mean 1.32 1.32
2.1E+10 9.6E+09 1.9E+11 1.3E+10
NS
SE 0.13 0.11 3.1E+09 2.6E+09 1.8E+10 4.3E+09
Mean 0.49 0.59
2.5E+10 4.8E+10 1.2E+10 2.6E+10
NS
SE 0.04 0.07 4.7E+09 1.1E+10 3.4E+09 3.8E+09
Mean 0.09 0.09
2.6E+11 1.3E+11 2.3E+10 8.1E+09
NS
SE 0.01 0.01 2.5E+10 9.4E+10 3.0E+09 4.2E+09
Mean 2.12 2.32
4.2E+10 1.8E+10 8.8E+10 4.2E+10
NS
SE 0.15 0.17 4.4E+09 6.6E+09 6.5E+09 1.5E+10
Mean 4.83 5.48
3.2E+10 1.8E+10 3.8E+11 9.7E+10
NS
SE 0.32 0.33 2.7E+09 2.9E+09 2.1E+11 1.4E+10
p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
b. Bacterial diversity
Cockles
A total of 298 ITS, ranging from 199 to 1277 bp in size, was detected by ARISA analysis of
the bacterial community of tissues of five cockles at the end of the starvation experiment (Table 6-
7) with a mean value of 147 ± 11 ITS per individual. Among the detected ITS, 193 (65%) were rare
being generally found in less than 20% of the studied samples, whereas only 5 ITS (less than 2% of
the studied sample) were shared by almost all individuals (Table 6). Comparison of bacterial profile
among individuals led to a low value of Bray-Curtis similarity index (Mean: 15 ± 7%; Min-Max
range: 1-66%). Comparison of BCD among cockle tissues was performed by the ANOSIM test and
revealed significant differences (1 way-ANOSIM: R=0.60; p0.05). In terms of ITS tissue specificity,
37% of the detected ITS (111 ITS) were tissue specific and most of them (78%) were rare, i.e. only
recorded in one of the five analyzed cockles. On contrary, 6% (19 ITS) of the detected ITS were
ubiquitously found in all tissues of cockles.
At the whole individual scale no significant difference was found in terms of average
number of ITS exhibited per individual between T0 and Tf (156 ± 12 vs. 147 ± 11 ITS per
individual (mean ± SE) at T0 and Tf, respectively, ANOVA test p=0.608, Table 7). Whatever the
tissue, a significant difference of BCD was observed between T0 and Tf (2 way-ANOSIM: R=0.33;
p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Tf. In this case, the focus was only set up on the proportion of new common / constant Tf-ITS (i.e.
ITS detected in at least three of the five cockles analyzed at Tf). A range from 2 to 7 ITS
corresponding to new common / constant ITS was then revealed at Tf, leading to a proportion
comprised between 13 and 33% of the total common / constant ITS detected at the end of the
experiment. Finally, an ANOSIM test was performed on the common / constant ITS revealed at Tf
and highlighted strong differences of bacterial profile among cockles tissues (R=0.65; p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Table 6. Constancy of the ITS detected in clam and cockle tissues after the starvation experiment (Tf). Rare = ITS
detected in 1 individual / 5, Occasional = 2 / 5, Common = 3 / 5, Constant = 4-5 / 5.
Cockle
Clam
ITS-Tf
rare occasionnal common constant Total
Hemolymph 120 41 14 7 182
Gills 81 17 11 9 118
Mantle 69 42 16 7 134
Gut 66 19 7 6 98
Remaining tissues 92 26 6 8 132
Whole individual 193 67 33 5 298
Hemolymph 113 27 12 5 157
Gills 96 33 14 6 149
Mantle 115 34 9 6 164
Gut 113 40 11 8 172
Remaining tissues 97 25 4 6 132
Whole individual 244 60 34 8 346
Table 7. Mean value (± standard error, SE, n=5) of ITS detected in cockle and clam tissue after the starvation
experiment.
Gills Hemolymph Mantle
205
Remaining
tissues Gut Whole individual
Cockles Clams Cockles Clams Cockles Clams Cockles Clams Cockles Clams Cockles Clams
Mean 37 46 55 45 46 47 40 37 30 52 239 227
ES 10 7 4 6 5 8 7 4 4 8 18 12

Cockle
Clam
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Table 8. ITS richness in bivalve tissues as well as at whole individual scale during the starvation experiment. Total ITS
richness corresponds to all detected ITS in cockles and clams during the experiment pooled over all times. Remaining
ITS corresponds to ITS commonly found in bivalves at T0 and Tf (= [ITS-T0 + ITS-Tf] – [Total ITS richness]). The
new ITS corresponds to ITS absent at T0 but present at Tf (= [ITS-Tf – Remaining ITS]).
Total ITS
richness
Before
starvation (T0)
206
After
starvation (Tf)
Remaining ITS
after starvation
Hemolymph 248 152 182 86 96
Gills 181 128 118 65 53
Mantle 226 185 134 93 41
Gut 188 139 98 49 49
Remaining tissues 230 178 132 80 52
Whole individual 366 309 298 241 57
Hemolymph 279 206 157 84 73
Gills 215 120 149 54 95
Mantle 277 198 164 85 79
Gut 253 182 172 101 71
Remaining tissues 256 190 132 66 66
Whole individual 427 364 345 282 63
New ITS revealed
after starvation
Table 9. Percentage of remaining ITS at the end of the starvation experiment among the proportion of
common/constant ITS initially present (T0-ITS).
Clam Cockle
n % n %
Hemolymph 4 27 7 19
Gills 6 50 10 59
Mantle 3 16 7 18
Gut 4 10 4 17
Remaining tissues 4 14 4 17

Clams
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
ARISA analysis performed on clams revealed a total of 346 ITS, ranging from 207 to 1427
bp in size. Among the detected ITS, 244 were rare (Table 6) leading to a high proportion (70%) on
contrary to the constant ITS (n=8) which represented only 2% of the total detected ITS. This high
proportion of rare ITS resulted in a low mean level of Bray-Curtis similarities in regard with clams
bacterial community among individuals (Mean: 22 ± 6%; Min-Max range: 1-84%). Comparison of
BCD among clam tissues was performed by the ANOSIM test and revealed slight differences
(1 way-ANOSIM: R=0.23; p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
Table 10. Percentage of new existing common/constant ITS at the end of the starvation experiment.
Cockles vs. clams
Clam Cockle
n % n %
Hemolymph 4 24 7 33
Gills 6 30 5 25
Mantle 7 47 3 13
Gut 2 11 3 23
Remaining tissues 0 0 2 14
After the starvation experiment, 243 ITS (60% of all ITS) were shared by cockles and clams
(instead of 275 ITS shared at T0). An ANOSIM was performed to assess the difference of BCD
between the two sympatric bivalves. Results showed significant differences of total BCD between
both bivalves at whole individual scale (2 way-ANOSIM: R=0.74 p0.30; p0.65;
p

Discussion
Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
209
Figure 3.
Comparison of bacterial
community patterns of two
sympatric bivalve species, the
cockle Cerastoderma edule
(black boxes) and the clam
Ruditapes philippinarum (black
circles) after starvation
experiment. MDS representation
is based on Bray-Curtis similarity
analyses. Stress value indicates
the relevance of graphic
representation.
To our knowledge this is the first attempt to study bacterial structure (abundance and
diversity) in fluids and tissues of the two marine bivalves Cerastoderma edule and Ruditapes
philippinarum. A previous study was performed to assess BCA (bacterial community abundance)
and BCD (bacterial community diversity) in cockles C.edule at the whole individual scale, i.e. in the
total flesh and intervalval liquid (FIL), through a 10 month monitoring program (Meisterhans et al.,
2011). Results showed significantly lower BCA values (1-30 10 6 cells g -1 ) than those reported in the
present study for the same species sampled at the same site (1.9-4.6 10 10 cells g -1 ). Although the use
of similar techniques for total bacterial count could allow a direct comparison between both studies,
the main difference concerned the level of observation: total FIL vs. tissue levels. It could be easily
hypothesized that a significant part of the BCA may have been lost, hidden or diluted due to the
bacterial counting protocol (tissue shredded in a buffer before being filtered on a 0.2 µm membrane
filter) when analyses have been directly performed on the total FIL. Such results suggested that a
Str

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
more accurate analysis of the BCA could be obtained by separately considering the different tissues.
Meisterhans et al. (2011) also analyzed the BCD with a similar fingerprint method (ARISA) and
demonstrated a lower bacterial diversity, with only 284 ITS detected among the 37 sampled cockles.
Even if the same hypothesis (i.e. a lower access to the cockle bacterial communities when analyzing
BCD at the whole individual scale instead of at separate tissue levels) might be relevant to explain
discrepancies with the present work, no direct comparison between studies can be made. Indeed, the
nature of PCR methods (semi-nested vs. single stage) as well as threshold parameters used to
analyze the ARISA data (optimal divisor and binning values) differed between studies and prevent
any direct comparison of absolute ITS value. Notwithstanding, some similar features were revealed
such as the high proportion of rare ITS, even when focusing on the more contributing ITS, leading
to low Bray-Curtis similarities among cockles sampled at the same time (Meisterhans et al., 2011).
They also demonstrated that these rare ITS primarily accounted for the difference in BCD among
different batches of sampled cockles. In the present study, rare ITS also accounted for differences in
BCD among bivalve species and among tissues within each species as was revealed by the results of
Bray-Curtis similarity mean values (higher when Bray-Curtis analysis was performed only on
common / constant ITS). A strong gap has been revealed in the cockle inter-individual variability of
BCD between both studies, attested by higher Bray-Curtis similarity values calculated from data of
the study of Meisterhans et al. (2011). Such results may suggest that (i) a greater BCD was assessed
by separately considering the different tissues; (ii) tissues could possibly be seen as diversified
habitats for bacterial settlement leading to strong differences between bacterial communities from
one tissue to another.
1. Tissue-dependent bacterial communities?
Evidence for tissue-associated microbial communities in invertebrates has been mostly
related to sponge and terrestrial worm species (Egert et al., 2004 ; Gerce et al., 2011). The present
study strongly supported the existence of tissue-dependent bacterial communities in bivalves as has
been suggested already for some oyster and mussel species (Frischer et al., 1999 ; La Valley et al.,
2009). The main differences in bacterial communities were revealed in gut, hemolymph and gills of
bivalves. The gut of both bivalve species harbored the highest bacterial concentrations (cells g -1 ),
due to its direct relation with the septic environment during feeding (Prieur et al., 1990). Some
previous studies also reported the highest bacterial content (cell matrix -1 ) to be in the gut of marine
bivalves (Al Jebouri & Trollope, 1981; Kueh & Chan, 1985) as was observed for cockles in the
210

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
present study. In contrast, the gut of clams exhibited a relatively low total bacterial content, despite
a high bacterial concentration, probably due to the low weight of this tissue in comparison with
mantle or remaining tissues (Table 1). This tissue also presented a low ITS richness in comparison
with the other tissues (Table 2) in spite of it having the highest bacterial concentration in both
bivalve species. This result may be due to the dominance of specific bacterial species in the gut of
bivalves which might hide other bacterial species that are present in lower abundance. Indeed, two
major sources of error that have been identified for molecular-based techniques concern (i) the
probability for different species to display the same ribosome types or “ribotypes” that are
considered as a unique band/peak, and (ii) a poor detection sensitivity of rare organisms (La Valley
et al., 2009). In contrast, the hemolymph of cockles and clams displayed a high ITS richness
associated with the lowest bacterial concentrations/contents; this could be strongly related to the
role of hemolymph in the innate immunity of bivalves. The main line of invertebrate defense
involves the hemolymph components, i.e., circulating hemocytes and soluble factors, which are able
to trigger a wide range of defense mechanisms for bacterial elimination (Prieur et al., 1990).
Antunes et al. (2010) demonstrated the ability of the freshwater bivalve Anodonta cygnea to filter
and eliminate selectively some bacterial species (namely Escherichia coli and enterococci, present
in the surrounding water) through an active phagocytotic process conducted by hemocytes. The low
bacterial concentration found in bivalve hemolymph could be related to a higher selective pressure
than in the gut, whereas the high ITS richness might be due to (i) a better balance in the abundance
of bacterial species able to survive in this particular tissue, which leads to the detection of most
species via molecular-based techniques; (ii) a possible infiltration of bacteria from connective
tissues to the hemolymph as bivalves present a semi opened circulatory system. Hemolymph is
pumped by the heart to the arteries which deliver the hemolymph directly to the conjunctive tissues
around the organs allowing exchange of oxygen but also microbiota between hemolymph and
tissues. Several studies have already demonstrated the presence of bacteria in hemolymph of healthy
and sick organisms (Silverman et al., 1995; Antunes et al., 2000; Vaughn et al., 2008). As a
consequence, persistence of some bacterial species in hemolymph without causing disease or
mortality might be due to particular interactions between hemocytes and soluble hemolymph
components (Pruzzo et al., 2005). The gill constitutes one of the first barriers to foreign particles
and microorganisms due to its direct contact with the surrounding environment, and its role in water
filtration for respiratory and nutritional purposes (Paul-Pont et al., 2010). In the present study, gills
of both bivalve species presented the lowest ITS richness, and their ITS diversity differed markedly
from all other tissues (ANOSIM analyses). These results suggest that gills play an important role as
211

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
a selective barrier as they are able to select/eliminate specific bacteria. Particularly, some selective
processes in the uptake of bacteria by bivalves have been already demonstrated (Olafsen et al.,
1993), as well as close relations between bacteria and gills in the cockle Cerastoderma edule
(Carballal et al., 2001) and the cupped Pacific oyster Crassostrea gigas (Hernández-Zárate &
Olmos Soto, 2006). Finally, the existence of tissue-dependent bacterial communities was borne out
by the percentage of tissue-specific ITS, about 30% in both species, and the low proportion of
ubiquitous ITS (8 and 13% for cockles and clams, respectively). The different tissues of bivalves
may represent a wide range of habitats exhibiting different physico-chemical conditions and
biological selective pressures due to their functions and/or relation with the surrounding
environment. Consequently, these microenvironments may allow proliferation of bacterial species
that specialize in these environments, thus inhibiting a part of the transient bacterial species
inadvertently ingested during respiratory and feeding activities (La Valley et al., 2009).
2. Host-dependent bacterial communities?
The finding of similar total bacterial counts and bacterial concentrations harbored by both
bivalve species as well as the significant proportion of shared ITS (69%) at the beginning of the
experiment illustrated the importance of environmental transmission from the surrounding water
column/sediment in both bivalve species living in the same environment. However, the ANOSIM
test performed to assess whether the initial BCD was homogeneous between the two species showed
a difference in total BCD between species at whole individual scale (2 way-ANOSIM: R=0.56 ;
p

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
community of this tissue and the ambient environment, i.e. water, sediment, etc. (Prieur et al., 1990;
Egert et al., 2004). Cockles and clams seemed to be able to control, at least partly, their own
bacterial communities, as suggested by the differences of BCD between both bivalves. Such an
assertion entails that some intimate bacterial association may occur between bivalve tissues and
specific bacteria.
3. Close interactions between bacteria and bivalve tissues?
A 21-day starvation experiment was undertaken to investigate the dynamics of the bacterial
communities hosted by two sympatric bivalve species. The depuration process is defined as a
particular case of the feeding mechanism controlled by filtration efficiency, the pumping rate and
intestinal transit, which themselves are influenced by environmental conditions such as temperature,
salinity or the type of bacteria involved (Prieur et al., 1990). Such sources of variation create
difficulty when comparing results from different depuration experiments. Furthermore, few data
about total bivalve bacterial fauna before and/or after a depuration experiment are available in the
literature, since most studies have been designed from a public health standpoint, with a narrow
focus on pathogenic bacteria (Prieur et al., 1990; La Valley et al., 2009). At whole individual scale,
almost a one log decrease in total bacterial count was observed in both bivalve species after the
starvation experiment. In terms of relative BCA among tissues, the depuration was mainly revealed
by the strong decrease observed in the gut of starved bivalves: from 50% to 30% for cockles, and
from 15% to 9% for clams. As no food was added during the 21-day experiment, we could
hypothesize that bacteria present in the gut were lysed as a nutritional resource for the starved
bivalve (Harris, 1993; Caro et al., 2009). Part of the bacterial population was probably eliminated in
faeces and pseudofaeces. The depuration experiment led to significant decreases of bacterial
concentration and content at whole individual scale as well as for each organ, except the gills of
both bivalve species (Table 4-5). This result is in contradiction with the study of Caro et al. (2009)
which demonstrated a loss of one third of the gill-associated bacterial population each month during
a long-term starvation experiment. However, the study only involved the endosymbiotic population
of Codakia orbicularis in gills, and not the total bacterial population harbored by gills. As particular
attention was undertaken to minimize water contamination during the experiment (sterilized
synthetic seawater, plastic grid to eliminate faeces and pseudofaeces, renewal of the water every
two days), the lack of any BCA decrease in gills after the depuration experiment still needed to be
explained. This result may suggest intimate association of bacterial communities with gills of
bivalves. Such an hypothesis needs to be confirmed by the analysis of BCD dynamics in gills
213

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
throughout a starvation experiment. Another hypothesis could be related to a diminution of filtration
activity under stress conditions (starvation) leading to a lower depuration rate. Further experiments
would need to be undertaken to specifically assess this question.
The starvation experiment led to a decrease of ITS richness at whole individual scale as well
as at tissue level (Table 8). This decrease was associated with marked differences in microbial
assemblages over time, as suggested by the significant results of ANOSIM tests performed for each
bivalve species. These results indicated that an important part of the bacterial population associated
with bivalves might correspond to weakly-associated bacteria that were easily eliminated during
starvation. More interestingly, the 21-day starvation experiment has highlighted the existence of
persistent ITS in both species, ranging from 36 to 59%, according to the tissue analyzed, with a
maximal value of 82% at whole individual scale (Table 8). Due to the high proportion of rare ITS
(i.e. ITS detected only in one of the five bivalves analyzed at each time point), their randomness and
consequently their low pertinence from an ecological point of view, a focus was the proportion of
remaining ITS among the common / constant ITS. Then, the proportion of remaining ITS after the
starvation experiment did not exceed 27% except for gill tissue in which the remaining common /
constant ITS reached 50% in clams and about 60% in cockles (Table 9). Such results suggested that
these ITS may correspond to bacteria more strongly associated with bivalve tissues, potentially
being able to develop a symbiotic association, or at least close interaction, with bivalves,
highlighting the concept of a core microbiota (Roeselers et al., 2011). The highest proportion of
remaining common / constant ITS was found in gills of both bivalve species, which was in
agreement with previous studies (Carballal et al., 2001; Hernández-Zárate & Olmos Soto, 2006).
The existence of gill endosymbionts hosted in specialized cells called ‘bacteriocytes’ in several
bivalves species such as Codakia orbicularis (Frenkiel & Moueza, 1995), Myrtea spinifera,
Thyasira flexuosa (Brissac et al., 2011), Calyptogena soyoae (Kim et al., 1995) and a hydrothermal
vent mussel (Distel et al., 1995) constituted additional evidence of the particular interaction existing
between some bacteria species and the gills of molluscs. In the present study, the lowest percentages
of the remaining common / constant ITS were found in the gut of both bivalves, and only concerned
4 ITS (Table 9). This low proportion may indicate that intestinal microbes in bivalves are food
items (i.e. lysed/absorbed bacteria) rather than symbionts helping the digestion processes. Besides,
the rather simple tubular morphology of the bivalve gut, lacking ‘fermentation chambers’
characteristic of the intestinal tract of organism harboring digestive symbionts, may also partly
explain the dominance of trophic/transient bacteria (Egert et al., 2004). New ITS have been revealed
by the starvation experiment, ranging from 18 to 64% of the Tf-detected ITS and from 0 to 47% of
214

Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
the common / constant Tf-detected ITS (Table 8, 10). The late detection of these particular ITS
might be due to their relative abundance being too low to be detected with the threshold we chose
before conducting the starvation experiment. The elimination of a large part of the microflora due to
the depuration may have enhanced the proliferation and the settlement of non-dominant bacterial
species by decreasing the spatial/food competition within the tissues, leading to their detection via
molecular-based techniques.
Overall, further investigations on the proportion of bacterial species being able to develop
close association with bivalve tissues using standard microbiology (e.g. culture, staining, enzymatic
assays) as well as molecular based techniques (16S RNA gene sequencing, SSH, FISH) would be
needed to understand the nature and role of such microbiota in bivalves intimate ecology.
Hemolymph and gills should be considered in further experiments on the particular bacterial-tissue
associations highlighted in the present work, as these relations may play fundamental roles in
bivalve physiology.
Acknowledgements
This work was carried out with the financial support of the project REPAMEP Liteau 3
(Manila clam response to environmental stress combining metals, toxic blooms and pathogens)
(Coordinator: X de Montaudouin). The authors are grateful to sailors Francis Prince and Laurent
Letort for their valuable help in the field, the SEPANSO for authorizing sampling in the National
Reserve of Banc d’Arguin and Franck Salin (INRA, Pierroton) for ARISA analysis and
Pr. R.J. Whittington for editing the English writing of the manuscript.
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Chapitre III : Communautés bactériennes associées aux bivalves
218

CHAPITRE IV :
Conclusion générale
219

220

Chapitre IV : Conclusion générale
Ce travail a porté sur la caractérisation de la structure génétique des communautés
bactériennes et archéennes de différents habitats (sédiments littoraux, bivalves fouisseurs), à
diverses échelles (échelle centimétrique à kilométrique pour les communautés du sédiment ;
échelle de l’individu ou de l’organe pour les communautés associées aux bivalves) par une
approche d’empreintes moléculaires.
Nos résultats sur les sédiments de trois écosystèmes (Bassin d’Arcachon, Vasière
Ouest Gironde, Estuaire de la Gironde) ainsi que sur deux espèces de bivalves fouisseurs
(Cerastoderma edule et Ruditapes philippinarum), mettent en évidence l’existence d’OTU
procaryotes dites rares, par analogie avec les espèces rares des inventaires réalisés pour
caractériser les communautés des macro-organismes. Au sein des communautés bactériennes
et archéennes caractérisées, la dominance des OTU rares est observée de manière récurrente.
L’importance et le rôle de ces OTU rares sont très controversés. Ces OTU peuvent en effet
être considérées soit comme un artéfact (Kunin et al., 2010) soit comme le support d’une
fonction méconnue au sein des écosystèmes (Galand, 2009). Ne disposant d’aucune
information directe sur les propriétés fonctionnelles des communautés que nous avons
étudiées, il nous est difficile de trancher. Pourtant, nos résultats montrent que les patrons de
diversité sont identiques que les analyses soient réalisées à partir de la matrice des similarités
faite sur l’ensemble des OTU ou sur les OTU ubiquistes seulement. Ce résultats est observé
ainsi bien pour l’analyse des communautés procaryotes des sédiments benthiques que pour
celle des communautés bactériennes associées aux bivalves fouisseurs (non présentéé dans ce
manuscrit). Ces résultats confirment les résultats de Gobet et al. (2010) sur les communautés
bactériennes des sédiments et mettent en évidence le faible pouvoir discriminant des OTU
rares pour définir la diversité β. Si les OTU rares peuvent être négligées lorsque l’on compare
la structure génétique de plusieurs communautés, il peut en être autrement lorsque l’on
s’interroge sur la diversité des communautés au sens large. En effet la dominance ou la rareté
d’un taxon n’est pas le seul critère pour juger de l’importance écologique de ce taxon au sein
d’une communauté. Les taxons dominants présentent évidemment une dynamique particulière
mais les espèces clés de voûte ne sont pas forcément les taxons les plus représentés au sein
d’une communauté.
Notre principal objectif était de s’interroger sur les processus d’assemblage des
communautés procaryotes de deux grands types d’habitats, l’habitat sédimentaire et un habitat
vivant, les bivalves filtreurs fouisseurs.
221

Chapitre IV : Conclusion générale
Pour les sédiments, notre analyse des communautés bactériennes de trois écosystèmes
situés en zone de transition (au sens de la définition qu’en donne la DCE 2000/60) a mis en
évidence un effet de la distance géographique sur la similarité des structures génétiques des
communautés bactériennes. Ces résultats pourraient s’inscrire dans la logique d’une
hypothèse biogéographique de la distribution spatiale des taxons microbiens. En revanche à
l’échelle intra-écosystème, il est observé, notament dans le Bassin d’Arcachon où une étude
plus complète a été réalisée, un effet structurant des paramètres physiques et chimiques (en
particulier le pourcentage d’émersion et la nature des particules sédimentaires) qui domine sur
celui de la distance géographique dans les processus régissant les assemblages bactériens. Ce
résultat est en accord avec l’hypothèse de Baas-Becking (1918) « everything is everywhere
but the environment selects » (de Wit and Bouvier, 2006). Ces deux paramètres structurant les
communautés bactériennes sont également les principaux facteurs structurant les
communautés de macro-invertébrés de cet écosystème comme montré par Blanchet (2004),
par Blanchet et al. (2005) et également par Dubois et al. (pers. comm.) lors d’une étude
réalisée en parallèle de la nôtre. Ces résultats, ainsi que la corrélation observée entre la
matrice de similarités des communautés procaryotes et celle des communautés de macro-
invertébrés de Dubois et al., suggère que ces deux types de communautés peuvent être liées.
Dans le Bassin d’Arcachon, un effort d’échantillonnage important (29 sites) a permis
de mettre en évidence deux grands types de sous-communautés procaryotes dans les
sédiments de surface de l’écosystème. L’hétérogénéité spatiale à l’échelle hectométrique des
communautés procaryotes est donc faible et surtout partiellement découplée, contre toute
attente, des gradients physiques et chimiques (vitesses de courants, températures, salinités de
l’eau…) et biologiques (gradient de densité d’herbier, de composition de la matière
organique, présence d’assemblages contrastés de macro-invertébrés, …) structurant ces
habitats. Ce résultat est cohérent avec la distribution homogène de la composition de la
matière organique sédimentaire observée au sein de cet écosystème par Dubois et al. (2011).
Par conséquent, il est possible d’avancer que cet écosystème de transition n’est pas la simple
image d’un milieu stratifié par l’affrontement entre les masses d’eaux continentales et marines
mais présente bien un caractère spécifique se matérialisant par la présence d’une matière
organique d’origine autochtone (Dubois et al., 2011) et par l’absence d’une dynamique des
structures génétiques des communautés procaryotes liée à leur position géographique. Cette
étude met en évidence que, pour un même effort d’échantillonnage, la multiplicité des
222

Chapitre IV : Conclusion générale
réplicats intrasites présente un intérêt plus important que la multiplicité des sites pour
l’analyse de la diversité procaryote au sein de cet écosystème.
Cependant, nos travaux ont été réalisés à une échelle d’analyse centimétrique c'est-à-
dire intégrant et moyennant l’ensemble des processus ayant lieu sur les 0,5 premiers
centimètres des sédiments de surface. Une diversité à l’échelle micrométrique existante serait
alors masquée par notre approche à plus large échelle, comme nous le suggérons pour
expliquer l’absence d’une mise en évidence de communautés procaryotes spécifiquement
associées à la présence de Zostera noltii. En effet les herbiers sont connus pour relarguer du
carbone organique dissous dans les premiers micromètres autour des rhizomes. Ce relargage
est décrit comme modifiant la composition taxonomique et l’activité des communautés
procaryotes de la rhizosphère (O'Donohue et al., 1991; Welsh et al., 1996 ; Larkum et al.,
2006). Par exemple, la fixation de l’azote par les communautés microbiennes est accrue au
niveau de la rhizosphère, tout comme les taux de réduction de l’acétylène et des sulfates
(Welsh et al., 1997; Nielsen et al., 2001, Larkum et al., 2006). Il existe donc des interactions
étroites entre les communautés bactériennes de la rhizosphère et l’herbier. De futures études
pourraient alors compléter ces connaissances par une approche à plus fine échelle, milli- voire
micro-métrique. Par exemple l’analyse de la structure génétique des communautés
procaryotes le long d’un gradient de distance aux structures biologiques, pourrait mettre en
évidence une dynamique des communautés en fonction de la distance aux rhizomes. Cette
question est partiellement traitée dans le cadre du programme ANR IZOFLUX (Responsable,
P. Anschutz) dont l’objectif est de caractériser les relations entre flux biogéochimiques et les
processus benthiques dans les sédiments colonisés par les herbiers de Zostera noltii. Ce
programme s’intéresse plus particulièrement à quantifier les processus microbiens conduisant
à la production de N2 (e.g. dénitrification, anammox) à différentes échelles allant de la racine
à l’écosystème. Coupler ces mesures de flux d’activités procaryotes à une mesure de la
structure des communautés procaryotes par empreinte moléculaire et à une analyse de la
composition de ces communautés permettraient d’appréhender le « qui fait quoi ? » au sein de
ces communautés. En effet, l’approche par empreinte moléculaire seule ne procure pas
d’information sur les fonctions assurées par les taxons mis en évidence. A l’instar des travaux
réalisés en milieux terrestres (Bressan et al., 2009) identifier les populations bactériennes qui
bénéficient des exsudats racinaires et déterminer l’impact de cette source de carbone sur la
structure et les fonctions des communautés bactériennes du sédiment via l’utilisation de
223

Chapitre IV : Conclusion générale
traceurs isotopiques (e.g. culture de plante sous 13 CO2) permettraient également de mieux
percevoir les interactions procaryotes-herbier.
Ces travaux nous donnent une vision des patrons spatiaux horizontaux de la structure
génétique des communautés procaryotes du Bassin d’Arcachon. S’intéresser conjointement
aux patrons spatiaux verticaux, le long de la colonne sédimentaire, permettrait de suivre la
dynamique des communautés procaryotes en lien avec les processus de diagenèse précoce. Ce
travail nécessiterait alors une approche alliant microbiologistes et biogéochimistes. En effet
nous avons vu que pour expliquer la dynamique des communautés procaryotes, une large base
de données descriptive de l’habitat était requise. Parmi ces données la quantification des flux
d’accepteurs d’électrons présente un intérêt particulier puisque ces flux traduisent l’activité
procaryote au sein des sédiments. La mise en relation entre les flux d’accepteurs d’électrons et
la diversité des communautés procaryotes pourraient alors être une première étape dans la
connaissance des interactions biodiversité-fonctionnement au sein de cet écosystème. Ces flux
peuvent être modifiés par la présence d’organismes ingénieurs de l’écosystème, capables de
remanier le sédiment (brassage des particules sédimentaires) ou encore de créer des structures
biologiques (creusement des galeries ou terriers) (Matisoff 1995 ; Rhoads, 1974). Ces
phénomènes, appelés bioturbation, sont décrits comme stimulant l’activité de minéralisation
de la matière organique par les procaryotes (Hansen and Kristensen, 1998; Lohrer et al., 2004;
Kogure and Wada, 2005). En particulier, la bioturbation entraine une introduction d’oxygène
vers les couches plus profondes du sédiment, modifiant les limites entre zones oxique et
anoxique dans le sédiment et pouvant entrainer localement une inhibition de la respiration
anaérobie. Les phénomèmes de bioturbation apparaissent donc comme des facteurs importants
de structuration des communautés procaryotes. Il semble donc important de s’attacher à
comprendre les liens entre la diversité taxonomique et fonctionnelle des procaryotes et celle
des organismes bioturbateurs. Y a-t-il un lien entre le niveau de complexité des communautés
procaryotes et des communautés de bioturbateurs ? Cette réflexion pourra passer par la
comparaison de l’effet de différents organismes bioturbateurs sur la diversité des procaryotes
du sédiment ou encore sur la mise en évidence d’une dynamique des communautés
procaryotes le long des structures biologiques comme les terriers de macro-invertébrés par
exemple.
Les futurs travaux devront donc approfondir les informations disponibles via (i)
l’identification des souches dont l’auto-écologie pourra nous renseigner sur les potentialités
fonctionnelles de l’assemblage, (ii) la quantification du niveau d’expression de certains gènes
224

Chapitre IV : Conclusion générale
fonctionnels à l’échelle communautaire ou encore (iii) le suivi de la dynamique temporelle
des deux sous communautés procaryotes mises en évidence. L’enjeu est de pouvoir acquérir
ces informations à l’échelle écosystémique ce qui disqualifie certaines approches trop
fastidieuses. L’acquisition de ces informations pourrait permettre de mieux comprendre le lien
entre la diversité procaryote et le fonctionnement de l’écosystème et d’apporter un
suppplément d’information aussi bien pour les modèles de gestion et de conservation de
l’écosystème que dans le suivi à moyen et long terme de l’évolution de l’environnement
comme celui mis en place dans le cadre du Service d’Observation en Milieu LITtoral.
La seconde partie de nos travaux a porté sur les facteurs structurant les assemblages
des communautés bactériennes associées aux bivalves fouisseurs. L’habitat et l’état de santé
du bivalve ont plus particulièrement été regardés comme les facteurs de contrôle les plus
évidents de la structure génétique des communautés bactériennes du bivalve. Selon l’organe
considéré et sa fonction, en contact avec le milieu extérieur, les facteurs structurant les
communautés bactériennes qui lui sont associées diffèrent. Si les communautés bactériennes
du tube digestif et des branchies, organes les plus en contact avec le milieu extérieur et
considérés comme des sites primaires d’infection bactérienne, sont majoritairement liées à
l’habitat, celles des organes les plus internes comme le muscle, le pied ou l’hémolymphe
semblent majoritairement liées à l’appartenance du bivalve à un taxon ainsi qu’à l’état de
santé de celui-ci. Les communautés bactériennes du tube digestif d’un bivalve apparaissent
donc comme de bons modèles pour décrire la dynamique de l’environnement dans lequel vit
le bivalve, mais ils ne sont que peu le reflet des communautés bactériennes propres aux
bivalves (i.e. flores symbiotiques, résidentes ou autochtones). En ce qui concerne les
branchies, le déterminisme des communautés bactériennes qui leur sont associées semble plus
complexe. C’est justement dans les branchies qu’ont été décrites les symbioses les plus
étroites (bactériocytes branchiaux abritant des bactéries sulfo-oxydantes endosymbiotiques)
chez certains bivalves (Lucinidae). Au contraire, les communautés bactériennes des organes
plus internes comme l’hémolymphe apparaissent comme de bons modèles pour de futures
études sur la dynamique des communautés bactériennes étroitement associées aux bivalves.
Si cette étude a permis de mettre en évidence un déterminisme des communautés
bactériennes différent en fonction des organes de l’hôte, elle ne génère, compte tenu de la
méthodologie mise en place, aucune information sur le rôle fonctionnel de ces bactéries au
225

Chapitre IV : Conclusion générale
sein de l’hôte. Mettre en évidence le rôle fonctionnel de ces communautés bactériennes au
sein de l’hôte est l’un des futurs enjeux scientifiques dans la caractérisation des mécanismes
d’interactions bactéries-bivalves. Il permettrait en particulier de préciser le lien entre les
communautés bactériennes et l’état de santé de l’hôte. Par exemple, les bivalves hébergent-ils
des taxons bactériens apparentés aux bactéries probiotiques décrites chez d’autres invertébrés
marins ? Certaines bactéries impliquées dans les processus liés au cycle de l’azote ont montré
un rôle épurateur chez d’autres mollusques marins, les coraux, participant ainsi à la bonne
fitness de ces organismes. Existe-t-il de tels taxons au sein des communautés bactériennes des
bivalves ? La réponse à ces questions requiert une étude de la composition de ces populations
bactériennes et de leur auto-écologie. Une première approche par séquençage de l’ADNr 16S
de souches pures isolées sur milieu de culture (réalisée en parallèle de ces travaux et non
présentée dans ce manuscrit) et visant à déterminer la composition des communautés
bactériennes associées aux bivalves met en évidence la dominance des γ-Protéobactéries,
α-Protéobactéries, Actinobactéries, Bactéroïdes et Firmicutes. Déterminer les capacités de ces
souches à métaboliser divers substrats à travers par exemple des systèmes comme le système
BIOLOG Ecoplate© qui permet de suivre la croissance bactérienne à partir d’une trentaine de
sources de carbone différentes, permettrait d’avoir une première vision de leur diversité
fonctionnelle. De même, déterminer leur potentielle capacité à produire des substances
antimicrobiennes serait un premier pas dans la mise en évidence d’un rôle probiotique des
communautés bactériennes associées aux bivalves. De manière plus générale, une
caractérisation de la composition et de la diversité fonctionnelle de la microflore associée aux
bivalves, incluant les communautés archéennes non prises en compte dans nos travaux,
apporterait une vision plus large et plus complète de la diversité des communautés
procaryotes associées aux bivalves et de leur rôle fonctionnel. Cette caractérisation
permettrait de révéler la présence d’éventuels taxons hôte-spécifiques, non présents dans
l’habitat de l’hôte. Une telle étude sur la composition bactérienne des éponges a d’ailleurs été
menée par Fieseler et al. (2004) et a permis de découvrir un nouveau phylum bactérien baptisé
« Poribacteria ». La connaissance des capacités métaboliques et de l’activité des
communautés procaryotes associées aux bivalves dans les processus liés au cycle de l’azote
présente également un fort intérêt à la fois dans la compréhension des interactions
procaryotes-bivalves mais également dans celles avec l’habitat. En effet d’une part il est
connu que chez les éponges, certains symbiontes bactériens jouent un rôle important dans la
transformation de l’azote secrété par l’éponge et ses autres symbiontes (Hoffmann et
al., 2009). D’autre part, il est également connu que la présence de bivalves dans
226

Chapitre IV : Conclusion générale
l’environnement stimule les activités bactériennes de nitrification, dénitrification ou de
production d’ammonium dans l’environnement (Henriksen et al., 1983). Outre le rôle de
l’activité de bioturbation du bivalve dans la stimulation des activités procaryotes de
l’environnement, l’hypothèse d’une influence des communautés procaryotes associées aux
bivalves sur celles de l’environnement pourrait également être envisagée. Une première étape
d’identification de ce lien serait la caractérisation des activités liées au cycle de l’azote des
procaryotes associées aux bivalves via par exemple une adaptation de la méthode de 15 N
stable isotope pairing développée pour les sédiments par Dalsgaard et al. (2003).
L’analyse de la composition taxonomique et de la diversité fonctionnelle est donc une
des voies de recherche qui pourrait permettre d’améliorer la connaissance des interactions
entre la flore de l’hôte et la flore de l’habitat. Ces connaissances devront également être
élargies à d’autres modèles d’invertébrés marins qui permettront à la fois de généraliser les
résultats obtenus sur des modèles de bivalves fouisseurs mais également d’affiner la
caractérisation des déterminismes des communautés bactériennes associées. En effet, pour
deux espèces de bivalves au même mode de vie (fouisseurs) les communautés bactériennes du
tube digestif et des branchies sont majoritairement déterminées par l’habitat, mais quelle est la
part de l’effet du mode de nutrition dans ce déterminisme. L’étude des communautés
procaryotes de deux espèces sympatriques mais au mode de vie différent (e.g. bivalves
filtreurs non fouisseurs et sessiles comme l’huître ou la moule vs bivalves filtreurs-fouisseurs
comme la coque ou la palourde) pourraient permettre de répondre à cette question. De même,
comparer les communautés procaryotes associées à un organe interne entre hôtes peuplant des
habitats différents, le long de l’aire de répartition géographique de cet hôte, permettrait de
mieux envisager la part de l’environnement et de la spécificité d’hôte dans la constitution de
la microflore associée.
Finalement, la caractérisation de la structure génétique des communautés procaryotes
par empreinte moléculaire apparait comme une étape préliminaire mais indispensable dans
l’analyse de la diversité des communautés. Elle permet en effet de discriminer un ou plusieurs
types d’assemblages procaryotes au sein d’habitats complexes rendant ainsi possible l’analyse
de la composition en espèces par des techniques basées sur de la métagénomique non
applicables pour des études à large effort d’échantillonnage. Si au sein de communautés
faiblement diversifiées et à faible taux de réarrangement, il est possible de reconstituer des
génomes entiers d’espèces à partir des fragments d’ADN séquencés, cela reste encore un
challenge lorsque les communautés sont complexes. Cependant, une haute résolution de
227

Chapitre IV : Conclusion générale
séquencage génère une complexité dans les jeux de données nécessitant d’adapter les
traitements de données et de faire évoluer les outils mathématiques et algorithmiques
permettant l’analyse des séquences d’acides nucléiques. Les futures approches nécessiteront
donc d’allier à la fois compétences en écologie microbienne et en bio-informatique pour
caractériser les dynamiques des structures génétiques taxonomiques et fonctionnelles des
communautés procaryotes.
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230

R E S U M E
Les structures des communautés procaryotes (diversité β) ont été caractérisées au sein
de deux compartiments du benthos en milieu littoral: les sédiments et les bivalves fouisseurs.
Dans les sédiments de surface, les communautés bactériennes et archéennes ont été
ciblées par ARISA (Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) et T-RFLP (Terminal-
Restriction Fragment Length Polymorphism) sur le gène codant pour l’ARN 16S
respectivement. Sur 29 sites des zones intertidale et subtidale du Bassin d’Arcachon, les
communautés procaryotes présentaient des patrons de distribution spatiale corrélés à ceux de
la macrofaune benthique mais représentaient une faible diversité cumulée par habitat.
L’extension à des écosystèmes proches (Vasière Ouest Gironde, Estuaire de la Gironde) a mis
en évidence une forte proportion d’OTU (Operational Taxonomic Unit) rares et une
diminution de la similarité entre les communautés avec l’éloignement géographique des
écosystèmes.
Chez les bivalves, les communautés bactériennes ont été caractérisées successivement
à l’échelle de l’individu, de l’organe isolé et de l’espèce. Le suivi d’une cohorte de coques n’a
pas montré d’influence de la présence du parasite Bucephalus minimus sur la structure de ces
communautés à l’échelle de l’individu. En revanche, prises à l’échelle de l’organe en
comparant la coque à la palourde, les communautés bactériennes associées aux bivalves se
sont différenciées en fonction des organes (e.g branchies, tube digestif, reste des tissus), de
l’habitat et/ou de l’espèce.
Mots clés: bactéries, archées, Ruditapes philippinarum, Cerastoderma edule, écosystème de
transition, CE-fingerprinting, interactions bactéries-bivalve.
ABSTRACT
The structures of prokaryotic communities (β diversity) were characterized in
sediments and burrowing bivalves.
In the sediments, the bacterial and archaeal communities were analyzed by ARISA
(Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) and 16S RNA gene T-RFLP (Terminal-
Restriction Fragment Length Polymorphism) respectively. In 29 subtidal and intertidal sites of
the Arcachon Bay, the spatial patterns of prokaryotic and benthic macrofaunal communities
were correlated whereas prokaryotic community species exhibited a low cumulated diversity
per habitat. Extending to neighboring ecosystems (West-Gironde mud patch, Gironde estuary)
revealed the occurrence of a high proportion of rare OTU (Operational Taxonomic Unit) and
a decrease of community similarities with geographic distance among ecosystems.
For the bivalves, the whole individual, the organ-scale and the species-scale were
successively considered. A cockle cohort monitoring indicated no influence of the parasite
Bucephalus minimus occurrence on bacterial community structure at the individual-scale.
Comparing cockle and clam at the organ level demonstrated that bivalve associated bacterial
communities could differ among organs (e.g. gills, digestive gut, others tissues), among
habitats and/or between species.
Keywords: bacteria, archaea, Ruditapes philippinarum, Cerastoderma edule, Transient
ecosystem, CE-fingerprinting, Bacteria-bivalve interactions.
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