ETUDE DE RELATIONS STRUCTURE-ACTIVITE DE ... - EPFL

ETUDE DE RELATIONS STRUCTURE-ACTIVITE
DE PEPTIDES BlOACTlFS COMPRENANT
UNE PSEUDO-PROLINE
THÈSE No 2596 (2002)
PRÉSENTÉE À LA FACULTE DES SCIENCES DE BASE
ÉCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE LAUSANNE
POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR ÈS SCIENCES
DANS LE DOMAINE DE LA CHIMIE ET DU GÉNIE CHIMIQUE
PAR
Christophe BOISSARD
chimiste diplômé de l'université de Lausanne
de nationalité suisse et originaire de Monthey (VS)
acceptée sur proposition du jury:
Prof. M. Mutter, directeur de thèse
Prof. A. Beck-Sickinger, rapporteur
Prof. K. Johnsson, rapporteur
Prof. C. Soto, rapporteur
Lausanne, EPFL
2002

Résumé :
Parmi les 20 acides aminés encodés par les gènes, la proline joue un rôle important en raison
de son cycle. En particulier, l'existence du cycle pyrrolidine dans une chaîne polypeptidique et
l'absence du proton de la fonction amine empêche la proline d'adopter une structure
secondaire telle que hélice a ou feuillet B. En raison de la présence des deux groupes alkyles
sur son atome d'azote, l'énergie d'isomérisation cisltrans de la liaison amide qui la précède est
diminuée. Ce processus d'isomérisation joue un rôle clé pour le repliement des protéines et
pour la reconnaissance moléculaire. Dans le but d'augmenter ces propriétés particulières de la
proline, nous utilisons le concept des pseudo-prolines (Ypro) pour déterminer la conformation
bioactive de peptides.
Les pseudo-prolines sont synthétisées par condensation d'aldéhydes ou de cétones sur la
cystéine, la sérine ou la thréonine. L'insertion de deux substituants méthyle en position C2 de
la Ypro (Rl, R2 dans la figure 1) permet d'obtenir une liaison amide cis dans les dipeptides
Xaa-Ypro.
Figure 1 : réaction de synthèse des pseudo-prolines.
Ces caractéristiques des Ypro ont été utilisées pour introduire sélectivement une liaison amide
cis dans trois différents peptides bioactifs (Figure 2). Dans un premier exemple, la
conformation bioactive d'analogues de morphiceptine a été analysée en remplaçant la proline
par des pseudo-prolines possédant différents substituants en position C2. Le rapport Cisltrans
a été déterminé grâce à l'analyse RMN 2D. Nos analogues comprenant une liaison cis ont
démontré une affinité supérieure pour le récepteur p-opioïde par rapport au peptide ayant la
séquence native. Ceci indique que la conformation du peptide lié au récepteur est cis. Ce
résultat est très important pour l'optimisation de peptides "chef-de-file"
Une seconde application nous a permis d'introduire le concept Ypro dans des peptides appelés
"peptides destructeurs de feuillets B", qui jouent un rôle dans les maladies neurodégénératives
telles que la maladie d'Alzheimer ou l'encéphalopathie spongiforme bovine (ESB). Ce peptide
a une conformation hélicoïdale soluble, mais il peut spontanément former des filaments
insolubles constitués de feuillets P dans les synapses. L'utilisation des "peptides destructeurs
de feuillets B", qui contiennent une proline, permet de détruire ces agrégats. Cela nous
autorise à appliquer le concept Ypro à ce problème. Nous avons ainsi synthétisé divers
peptides comprenant une Ypro, grâce à une nouvelle méthode de synthèse en solution. L'effet
de ces analogues sur la formation de filaments a été analysée in vitro (en collaboration avec le

concernant la transition conformationelle et la réversibilité de la formation des filaments de
peptides ainyloides.
ro-Phe-Phe-Le
, Ile
Pro-Val-Ler Ile
Cyclolinopeptide A
O
( Peptide destructeur de feuillets P 1
Figure 2 : Structure des peptides bioactifs auxquels nous avons appliqué le concept Ypro.
Finalement, le peptide immunosuppresseur appelé cyclolinopeptide A (Figure 2) a été utilisé
comme support pour l'application du concept Ypro. L'incorporation de Ypro nous a permis de
rigidifier la structure de nos analogues pour l'étude de relations entre structure et activité de ce
peptide.
En conclusion, l'utilisation du concept Ypro pour déterminer les conformations bioactives de
peptides s'est avérée être un nouvel outil très puissant , qui permet l'étude de processus de
reconnaissance moléculaire.
IV

Abstract :
Arnong the 20 gene-encoded amino acids, proline plays a crucial role due to its cyclic nature.
In particular, the existence of a pyrrolidin ring in a polypeptide chain and the absence of a
hydrogen on the amine function eliminates the propensity of proline to adopt a regular
secondary structure such as a-helices or P-sheets. Due to the presence of two alkyl groups on
its nitrogen atom, the energy for cisltrans isomerisation of its preceding amide bond is
lowered. This isomerisation process plays a key role in protein folding and molecular
recognition. In order to enhance these particular properties of proline, we apply the concept of
pseudo-prolines (Ypro) to target bioactive conformations in peptides.
Pseudo-prolines are prepared by condensation of aldehydes or ketones with cysteine, serine or
threonine. The insertion of two methyl substituants in the C2 position of Ypro (RI, R2 in
figure 1) results in a cis amide bond in Xaa-Ypro building blocks.
Figure 1 : Synthesis of pseudo-prolines.
These features of Ypro were applied to selectively introduce a cis amide bond in three
different bioactive peptides (Figure 2). In a first example, the bioactive conformation of
morphiceptin analogues was targeted in replacing a proline residue by Ypro-systems carrying
different C2 substituents. The cisltrans ratio has been determined applying 2D-NMR
techniques. Most interestingly, the cis-containing analogues showed increased y-opioid
receptor binding capacity compared to the native peptide, pointing to a cis amide bond as
receptor-bound conformation. This result is of utmost relevance for further lead optimization.
In a second application, the Ypro concept was applied to peptides called "amyloid AB
peptides" playing a substancial role in degenerative diseases such as Alzheimer's disease or
BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy). This peptide has an helicoidal conformation
which is soluble but polymerises spontaneaously into fibrils existing of insoluble P-sheets in
the synaptic spaces. The use of "B-sheet breaking peptides" containing proline destabilizes
these aggregates, offering an interesting target for applying the Ypro concept. In synthesizing
a series of Ypro-containing peptides with a novel solution procedure, the effect upon fibril
formation has been studied in vitro (in collaboration with Dr. Soto et al., Serono). The results
available so far have let to new insights into a conformational transition and reversible fibril
formation in arnyloid peptides.

-
ro-Phe-Phe-Le
"\ , Ile
Pro-Val-Le~lle
Cyclolinopeptide A
QWNH
1 P-sheet breaking peptide)
Figure 2 : Structure of bioactive peptides for probing the Ypro concept.
Finally, the imrnunosuppressive cyclolinopeptide A (Figure 2) was used as a template for
probing the Ypro concept. The incorporation of Ypro-containing building block allowed for
the prepiiration of conformationally constrained analogues for structure-activity studies.
In conclusion, the application of the Ypro concept for targeting bioactive conformations of
peptides proves to be a powerful new tool in the study of molecular recognition processes.

Sommaire
1. Introduction générale : le concept pseudo-proline
1.1 Acides aminés
1.2 Les peptides et protéines
1.2.1 Synthèse naturelle des protéines
1.2.2 Structures secondaires des protéines
1.2.3 Structure tertiaire et quaternaire des protéines
1.3 Proline et isomères cis / trans
1.3.1 Description de la proline
1.3.2 Isomères cis 1 trans
1.4 Les pseudo-prolines
1.4.1 Définition et synthèse des pseudo-prolines
1.4.2 Stabilité des pseudo-prolines
1.4.3 Rôle et utilisation des pseudo-prolines
1.4.4 Comparaison proline / pseudo-prolines
1.5 Synthèse peptidique
1.5.1 Agents de couplage
1.5.2 Groupes protecteurs
1.5.3 Synthèse en solution et en phase solide
1.6 Buts de ce travail
1.7 Bibliographie
2. Les peptides opioïdes
2.1 Introduction
2.1.1 Histoire et classification des drogues

2.1.2 Origine de l'opium - la morphine, les peptides opioïdes 42
2.1.3 Activité biologique des peptides opioïdes 48
2.1.4 Les récépteurs opioïdes 5 1
2.1.5 Structure de morphiceptine et endomorphine-2 56
2.2 Buts de notre recherche 58
2.3 Stratégie de synthèse 59
2.4 Analyses RMN 62
2.4.1 Analyses 1D et 2D dans différents solvants 63
2.4.2 Détermination de la conformation cis ou trans de la liaison 67
Tyr1-Ser(YR" R2pro)2
2.5 Résultats des tests biologiques 70
2.6 Tests enzymatiques 71
2.6.1 Explication du test enzymatique 7 3
2.6.2 Résultats des tests enzymatiques 76
2.7 Conclusions 77
2.8 Partie expérimentale 79
2.8.1 ~moc-~~rSer(Y~". Mepro)-O~ 79
2.8.2 ~moc-~yr(all)ser(Y~. Hpro)-~~ 82
2.8.3 Synthèse des analogues d'endomorphine-2 84
2.8.4 Synthèse des analogues de morphiceptine 87
2.8.5 Synthèse de S~c-TyrSer(Y~".~"pro)~he-pNa 90
2.8.6 Tests d'affinité à la cyclophiline A 92
2.9 Bibliographie 93
3. Les peptides amyloides 95
3.1 Introduction 95
3.1.1 Généralités sur la maladie d'Alzheimer 95
3.1.2 Causes de la maladie d'Alzheimer - les amyloides 97
3.1.3 Structure des filaments arnyloides 100
3.1.4 Traitements actuels de la maladie 102
3.1.5 Peptides destructeurs de feuillets P 102

3.1.6 Conditions générales de changement de conformation 1 04
3.2 Buts de notre recherche 105
3.3 Stratégies de synthèse 106
3.4 Détermination du coefficient de partage (log P) 110
3.5 Analyses RMN 112
3.5.1 Détermination de la conformation de la liaison Leu1- 112
Xaa(YR'. ,pro)'
3.5.2 Conclusions des analyses RMN 119
3.6 Résultats des tests biologiques
3.7 Conclusions
3.8 Partie expérimentale
3.8.1 H-PhePheAsp(OBz1)-NH,
3.8.2 Synthèse des dipeptides avec une thiazolidine
3.8.3 AC-LC(Y~>~~~O)FFD-NH,
3.8.4 AC-LC(Y~". Mepro)FFD-NH7
3.8.5 Z-LeuSer(YMe7 Mepro)-OH
3.8.6 Ac-(ou Suc-)LS(YMe3 Mepro)FFD-NH,
3.8.7 ~moc-LeuSer(Y~".~'pro)-OH
3.8.8 Sar-LS(YMe* Mepro)FFD-NH,
3.8.9 Fmoc-LeuSer(YH1 Hpro)-OH
3.8.10 X-LS(YH,$ro)FFD-NH,
3.9 Bibliographie
4. Le cyclolinopeptide
4.1 Introduction au cyclolinopeptide 155
4.1.1 Découverte et premier rôle biologique du cyclolinopeptide 155
4.1.2 Mécanisme de cytoprotection du cyclolinopeptide 158
4.1.3 Activité biologique plus récente : immunosuppression 161
4.1.4 Nouvelle activité biologique : activité anti-HIV 163

4.1.5 Structure du cyclolinopeptide 165
4.2 Buts de notre recherche 169
4.3 Stratégies de synthèse 170
4.3.1 Synthèse en solution du peptide naturel 170
4.3.2 SPPS des dérivés du cyclolinopeptide 17 1
4.4 Résultats RMN 172
4.4.1 Analyse RMN des peptides linéaires 173
4.4.2 Analyse RMN des dérivés cycliques 179
4.5 Résultats biologiques 182
4.5.1 Tests d'affinité à la cyclophiline 183
4.5.2 Tests d'activité irnmunosuppressive (test IL-2) 185
4.6 Conclusions 187
4.7 Partie expérimentale 188
4.7.1 Synthèse Boc-LVPP-OH 188
4.7.2 Synthèse H-FFLII-OBzl 190
4.7.3 Synthèse cyclo (LVPPFFLII) (clp9cyc) 192
4.7.4 Synthèse des dipeptides contenant une pseudo-proline 196
4.7.5 Synthèse en phase solide (SPPS) des peptides cycliques 198
dérivés du cyclolinopeptide et contenant une pseudo-proline
4.7.6 Tests d'affinité à la cyclophiline A 206
4.8 Bibliographie 208
5. Conclusions générales