PHYSICO-CHEMICAL ASPECTS OF THE ADHESION AND ... - EPFL

PHYSICO-CHEMICAL ASPECTS OF THE ADHESION AND
BlOFlLM FORMATION BY PSEUDOMONAS AERUGINOSA
ON UNMODlFlED AND MODlFlED PVC FROM
ENDOTRACHEAL TUBES
PRÉSENTÉE A LA FACULTÉ ENVIRONNEMENT NATUREL, ARCHITECTURAL ET CONSTRUIT
Institut des sciences et technologies de l'environnement
SECTION DES SCIENCES ET INGÉNIERIE DE L'ENVIRONNEMENT
ÉCOLE POLYTECHNIQUE FÉDÉRALE DE LAUSANNE
POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR ÈS SCIENCES
PAR
Karine TRIANDAFILLU
biologiste diplornée de l'université de Neuchâtel
et de nationalité française
acceptée sur proposition du juiy:
Prof. H. Harms, directeur de thèse
Prof. D. Haas. rapporteur
Prof. Ch. Holliger. rapporteur
Dr P. Landini, rapporteur
Lausanne, EPFL
2003

SUMMARY
Nosocornial (hospital acquired) pneumonia is a major medical complication in intubated
and mechanically ventilated patients. The bacterium Pseudomonns aerugir~osa is one of the
most prevalent nosocomial pathogen, responsible for 30 % of nosocomial infections, of which
47 % are ventilator-associated pneumonia (VAP). Prolonged intubation with an endotracheal
device is a major risk factor for VAP, where colonization of the upper respiratory tract by
P. neruginosa occurs in 90 % of patients, with a mortality reaching 40 % despite aggressive
antibiotic therapy. Therefore, a new strategy to prevent or at least to delay the occurrence of
VAP due to P. neruginosa is desirable. Successful bacterial colonization of the upper
respiratory tract involves the formation of biofilms on the surface of the intubation devices.
As it is generally accepted that biofilm formation is initiated by the crucial event of adhesion
of bacteria to a solid support. we investigated in this dissertation whether bacterial adhesion
could be reduced by surface modification of the polymer commonly used in endotracheal
devices, medical grade poly(viny1 chloride ) (PVC).
Initial bacterial adhesion can be considered for the most part in terms of colloidal
interaction forces goveined by physicochemical properties of the bacteria, the substratum
surface and the surrounding environment, as described in the extended DLVO theory.
Deviations from theory-based predictions arise from the fact that bacteria are not smooth
colloidal particles, but possess surface structural features like pili, flagella and
lipopolysaccharides (LPS), that may favour the subsequent molecular and irreversible
attachment of bacteria to a solid surface. Attempts to prevent the attachment of pathogens to
the endotracheal tubes first require a better insight of the biomaterial and bacteriai properties
involved in this process. The surface characteristics of a biomaterial can affect the affinity of
the bacteria for the polymer. In order to change the substrate accordingly, some
physicochemical properties of the bacteria must be known. We tested a wide range of P.
neruginosa strains, including the wildtype PAOI. specific mutants and clinical isolates from
tracheal secretions or the blood of patients presenting a VAP. It was demonstrated that the
surface of most P. aeruginosa strains was hydrophobic and negatively charged. Their overall
adhesion efficiency to untreated PVC pieces varied widely, which could be partly explained
by structural peculiarities of the surfaces of the strains. Generally, hydrophobic bacteria
adhere more than hydrophilic bacteria, and preferentially on hydrophobic supports.

Incidentally, several physicochemical surface modifications of the PVC substrate were
evaluated by in vitro assays for their potential to make the polyrner less attractive to bacteria.
The newly obtained biomaterials were characterized for their surface chernical composition,
wettability and roughness as parameters known to influence bacterial adhesion. First, an
oxygen plasma treatment yielding a hydrophilic surface was effective in reducing bacterial
adhesion by 70% as compared to native PVC. Secondly, the deposition of anti-microbial
silver ions as salt clusters on the PVC surface completely prevented the initial bacterial
adhesion due to specific bacterial toxic effects of silver. PEO (polyethylene oxide)-like
coatings and physisorption of ~luronics@ created non-fouling (protein resistant) surfaces but
did not affect P. aeruginosa adhesion.
Following the adhesion process, bacteria can proliferate to form mature, multi-layer
biofilms on colonized surfaces. Thus, the creation of anti-adhesive surfaces may not
necessarily lead to biofilm-resistant surfaces. The long-tem efficacy of the two most
prornising surface modifications, i.e. oxygen-plasma treated and silver-coated PVC, to reduce
or prevent biofilm development by P. aerugirzosa strains was therefore tested in a continuous
flow cultivation system. It was concluded that an observed significant reduction of bacterial
adhesion after hydrophilization of PVC was not sufficient to inhibit the formation of biofilm
on the intubation device. In contrast, the anti-rnicrobial properties of silver allowed to delay
the biofilm development on the biomaterial, but due to the progressive dissolution of the
silver deposits into the bulk medium, bacteria became able to adhere and proliferate on the
surface after a few hours. These experiments indicate the great potential of silver as an anti-
biofilm agent but at the same time illustrate the need to develop new surface treatment
methods in order to produce longer-lasting silver deposits on PVC surfaces.

III
VERSION ABBREGEE
Les pneumonies nosocomiales (acquises à l'hôpital) se sont révélées une complication
médicale majeure chez les patients intubés et ventilés mécaniquement. Pseudornoi~as
nen~gir~osn est un des plus important pathogènes bactériens présent en milieu hospitalier,
responsable de 30 % des infections, dont 47% sont des pneumonies "ventilatoires" (ventilator-
associated pneumonia, VAP). L'intubation prolongée avec un instrument endotrachéal
entraîne de grands risques de développer une VAP, puisqu'une colonisation du tractus
respiratoire supérieur par P. aeruginosa apparaît chez 90% des patients, avec une mortalité
atteignant 40% malgré une forte thérapie antibiotique. Par conséquent, il est nécessaire de
mettre au point une nouvelle stratégie permettant d'empêcher, ou du moins de réduire
l'apparition de VAP dues à P. aeruginosa. La colonisation bactérienne du tractus respiratoire
implique la formation de biofilms sur la surface du matériel d'intubation. Comme il est
généralement admis que la formation de biofilrns est initiée par l'adhésion de bactéries sur un
support solide, nous avons envisagé dans cette thèse que l'adhésion bactérienne puisse être
réduite par une modification de surface du polymère communément utilisé pour les tubes
endotrachéaux, le polychlorure de vinyl (PVC) de type médical.
L'adhésion bactérienne initiale peut être partiellement considérée en termes d'interactions
colloïdales gouvernées par les propriétés physico-chimiques de surface des bactéries, du
support et du milieu environnant, comme décrit dans la théorie DLVO. Les résultats déviant
des prédictions basées sur cette théorie sont dus au fait que les bactéries ne sont pas des
particules colloïdales lisses, mais possèdent des traits structuraux de surfaces comme les pili,
les flagelles et les lipopolysaccharides (LPS), qui peuvent favoriser l'attachement moléculaire
irréversible des bactéries à une surface solide. Une tentative d'empêcher l'adhésion de
pathogènes bactériens sur les tubes endotrachéaux nécessite d'abord une meilleure
connaissance des propriétés du biomatériau et des bactéries impliquées dans ce processus. Les
caractéristiques de surface d'un biomatériau peuvent affecter l'affinité des bactéries pour le
biomatériau en question. Afin de changer le substrat en conséquence, certaines propriétés
physico-chimiques des bactéries doivent aussi être déterminées. Nous avons testé un grand
nombre de souches de P. aeruginosa, incluant le type sauvage PAO1, des mutants spécifiques
et des isolats cliniques provenant de sécrétions trachéales ou du sang de patients présentant
une VAP. il a été montré que la surface de la plupart des souches était hydrophobe et

négativement chargée. Leur efficacité d'adhésion sur des coupons de PVC non traités est
apparue très variable, ce que nous avons tenté d'expliquer par certaines particularités
structurales de surface de ces souches. Généralement, les bactéries hydrophobes adhèrent
davantage que les bactéries hydrophiles, et préférentiellement sur des supports hydrophobes
eux aussi. De ce fait, plusieurs modifications de surfaces des substrats PVC ont été testées in
vitro afin d'évaluer leur potentiel de rendre le polymère moins attractif pour les bactéries. La
composition chimique, I'hydophobicité et la rugosité de surface de ces "nouveaux"
biomatériaux ont également été déterminées, puisque ce sont des paramètres reconnus pour
influencer I'adhésion bactérienne. Tout d'abord, un traitement par plasma oxygène a produit
une surface hydrophile réduisant I'adhésion des bactéries de 70% comparé au PVC natif.
Deuxièmement, l'incorporation sous forme d'agglomérats d'ions argent sur le PVC a permis
d'inhiber totalement I'adhésion bactérienne initiale grâce aux effets bactéricides de I'argent.
Le dépôt de poly-oxyde d'éthylène (PEO) et la physisoiption de ~luronics@ ont créé des
surfaces résistant à l'adsorption de protéines mais sans effet sur I'adhésion de P. neruginosa.
Suite au processus d'adhésion, les bactéries peuvent proliférer pour former d'épais
biofilms sur les surfaces colonisées. Ainsi, des surfaces anti-adhésives pour les bactéries ne
seront pas forcément des surfaces égaiement résistantes au développement de biofilms.
L'efficacité des deux modifications de surfaces les plus prometteuses (i.e. un PVC traité au
plasma oxygène et un PVC recouvert avec de I'argent) à réduire ou à empêcher le
développement de biofilms par P. aerugiitosa à long terme a donc été testé dans un système
de culture en flux continu. Nous avons conclu qu'une réduction significative de I'adhésion
bactérienne par une hydrophilisation du PVC n'était cependant pas suffisante pour inhiber la
colonisation subséquente du matériel d'intubation. En revanche, les propriétés
antirnicrobiennes de I'argent ont permis de retarder la formation de biofilms sur le
biomatériau. A cause d'une libération progressive d'ions argent dans le milieu environnant,
les bactéries se sont montrées capables d'adhérer et de proliférer sur la surface traitées après
quelques heures. Ces expériences démontrent le grand potentiel de I'argent en tant qu'agent
anti-biofilm mais illustrent en même temps le besoin de développer de nouvelles méthodes de
traitement de surface afin d'obtenir des dépôts d'argent qui restent plus longuement sur le
PVC des tubes endotrachéaux.

TABLE OF CONTENT
SUMMARY 1
VERSION ABREGEE 111
TABLE OF CONTENT V
CHAPTER 1
INTRODUCTION
1.1. Bacterial biofilms
1.1.1. Ubiquity of biofilms
1.1.2. A suwival issue for micro-organisrns
1.2. The clinical problem
1.2.1. Pseudo~nouas aenrginosa in the intensive care units
1.2.2. Colonization of endotracheal intubation devices and consequences
1.3. Phases of biofilm formation
1.3.1. Bacterial adhesion
1.3.2. Biofilm maturation and cell-to-ce11 communication
1.4. The anti-biofilm stategy
1.4.1. Control of biofilm development on medical devices
1.4.2. Biomaterial surface modifications and characterization
1.5. Outline of the dissertation
CHAPTER 2
ADHESION OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA STRAINS TO UNMODIFIED POLY-
(VINYL CHLORIDE) (PVC) FROM ENDOTRACHEAL INTUBATION DEVICES
2.1. Abstract 19
2.2. Introduction 20
2.3. Materials and Methods 21
19

2.3.1. Bacteria
2.3.2. Media and preparation of bacterial cultures
2.3.3. Physicochemical characterization of bacteria
2.3.4. Motility assay
2.3.5. Solid surfaces
2.3.6. Physicochemical characterization of solid surfaces
2.3.7. Calculation of interaction forces between bacteria and surfaces
2.3.8. Adhesion experiments
2.4, Results
2.4.1. Adhesion of P. aeruginosa strains to unmodified PVC
2.4.2. Bacteriai characteristics
2.4.3. Characteristics of PVC and flattened PVC
2.4.4. Calculation of Gibbs interaction energies of bacterid adhesion
2.5, Discussion
2.6. Conclusion
Acknowledgements
CHAPTER 3
OXYGEN PLASMA TREATMENT AND SILVER COATING OF ENDOTRACHEAL
TUBE PVC SURFACES TO REDUCE OR PREVENT INITIAL COLONIZATION BY
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
3.1. Abstract
3.2. Introduction
3.3. Materials and Methods
3.3.1. Bacteria, media, and culture conditions
3.3.2. Bacterial surface characterization
3.3.3. PVC surfaces
3.3.4. PVC surface modifications and characterization
3.3.5. Batch adhesion experiments
3.3.6. Extended DLVO calculations
3.4. Results
3.4.1. Chemicai characterization of strains
3.4.2. Characteristics of treated PVC surfaces
3.4.3. Effect of oxygen-plasma treatment of PVC pieces on adhesion of
selected P. aeruginosa strains
3.4.4. Effect of silver coating of PVC on adhesion of P. nerugiilosa strains
3.5. Discussion
3.6. Conclusion
Acknowledgements
CHAPTER 4
INFLUENCE OF VARIOUS PHYSICO-CHEMICAL SURFACE MODIFICATIONS
OF PVC ON PSEUDOMONAS AERUGINOSA ADHESION
4.1. Abstract
4.2. Introduction
4.3. Materials and Methods
4.3.1. Bacteria, media, and culture conditions
4.3.2. PVC surfaces

4.3.3. PVC surface modifications and charactenzation
4.3.4. Batch adhesion experiments
4.4. Results and Discussion
4.4.1. Influence of fluoropolymer (C&) plasma deposition and subsequent
protein coatings on bacterial adhesion
4.4.2. Influence of physisorption of ~luronics~ on bacterial adhesion
4.4.3. Influence of dextran, PEO-like, and Ag/PEO-like coatings on bacterial
adhesion
4.5. Conclusion
Acknowledgements
CHAPTER 5
IN VITRO BIOFILM FORMATION BY PSEUDOMONAS AERUGINOSA ON
UNMODmED AND CHEMICALLY MODIFIED PVC FROM ENDOTRACHEAL
TUBES UNDER CONTINUOUS FLOW
5.1. Abstract
5.2. Introduction
5.3. Matenals and Methods
5.3.1. Bacteria. media and culture conditions
5.3.2. PVC surfaces
5.3.3. PVC surface modifications
5.3.4. Biofilm growth experiments
5.3.5. Biofilms observation and analysis method
5.4. Results and Discussion
5.4.1. Biofilm formation on unmodified PVC surfaces
5.4.2. Biofilm formation on chemically treated PVC
5.5. Conclusion
Acknowledgements
CHAPTER 6
SUMMARY AND GENERAL CONCLUSIONS
6.1. Adhesion and biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa
6.2. Efficacy of physico-chemical treatments of PVC to reduce Pseudoinonas
aeruginosa colonization
6.3. Outlook and open questions
REFERENCES
LIST OF ABBREVIATIONS AND SYMBOLS
REMERCIEMENTS