Rapport stage IBS final

Protocole expérimental
1. Etape de PCR (amplification):
a. Polymerase chain reaction :
Cette étape de PCR d’amplification permet la création d’un nombre important
de copies d’une séquence d’ADN (10^9 copies).
Programme de PCR:
30'' 98°C dénaturation des brins d’ADN
10'' 98°C dénaturation des brins d’ADN
20'' 50°C 35 cycles hybridation ADN simple brin- amorces
10'' 72°C élongation d’ADN par la Taq-pol (élongation)
8' 72°C élongation par la Taq-pol
b. Gel de migration :
On coule un gel d'agarose et on dépose:
1 2 3
Marqueur
de taille
Echantillon
pour BET
Echantillon
à purifier
Cette étape doit permettre d’identifier, par
imprégnation au BET et révélation aux UV, les
fragments à purifier dans le n°2 et de couper la
bande d’agarose correspondante dans le n°3.
Le fragment d’ADN à purifier ne contient pas de BET ce qui évite la création de
mutations suite à la modification de l’ADN par le BET soumis aux UV.
La bande d’agarose est fondue à 50°C avec du tampon NT (200µl pour 100mg
de gel) puis :
• Mise sur colonne d’élution et centrifugation 11000g/min, élimination du
filtrat.
• Ajout de 700µl de tampon NT3 qui élimine les sels et les
macromolécules solubles (composé d’éthanol), centrifugation 1 minute,
élimination du filtrat et 2 ème centrifugation pendant 2 minutes.
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