Rapport stage IBS final

La ligation se fait à 22°C pendant 30 minutes puis 5 minutes à 70°C pour
inactiver l’enzyme.
Chaque condition a une fonction bien particulière. Nous pourrons ainsi vérifier
notre ligation une fois la transformation faite et la mise en boite des clones
effectuée.
1. Le tube n°1 est le premier contrôle, c’est le contrôle positif de la
transformation. A priori, nous devrions obtenir des colonies puisque le
vecteur pETDuet est circulaire.
2. Ce tube est un premier témoin négatif, en effet il ne possède que le
vecteur pETDuet digéré sans ligase ni insert, il ne peut donc pas se
recirculariser. On ne devrait donc pas obtenir de colonies.
3. Ce tube est un second témoin négatif car il contient le plasmide digéré et
la ligase. Les deux sites de restriction n’étant pas complémentaires, la
ligation ne devrait pas avoir lieu et donc aucun transformant ne devrait
être obtenu. Ce tube permet de vérifier s’il y a bien eu digestion, auquel
cas les deux extrémités du vecteur sont non complémentaires et ne
peuvent se rabouter. Nous ne devrions pas obtenir de colonies après
transformation.
4. Ce tube comportant à la fois le vecteur et l’insert digérés par les mêmes
enzymes ainsi que la ligase, pETDuet devrait pouvoir se recirculariser en
intégrant l’insert.
5. Le tube n°5 est le même que le 4 mais avec des rapports insert/plasmide
différents.
4. Transformation :
Grâce cette étape, on souhaite réintégrer les vecteurs recircularisés dans des
cellules compétentes. Pour ce faire, on ajoute aux 10 µl des tubes de ligation :
50 µl de cellules compétentes (rendues compétentes par traitement au
CaCl2) DH5-α dans lesquelles doivent entrer les vecteurs.
30 min dans la glaceles vecteurs se fixent aux phospholipides de la
paroi.
45 secondes à 42°C la température augmente la fluidité des
phospholipides membranaires, les vecteurs entrent dans les cellules
2 minutes dans la glace.
400 µl de SOC (milieu nutritif qui fait repartir les cellules compétentes,
restaure le métabolisme et la croissance des bactéries et permet
l’expression du gène qui code pour la protéine qui dégradera
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