Sébastien TERRAT - CNRS

Apport des nouvelles générations de
séquençage pour accéder à la diversité et
la richesse des communautés microbiennes
de sols issus d'échantillonnage de grande
ampleur
S. Terrat 1 , S. Dequiedt 1 , R. Christen 3 , D. Bachar 3 , M. Lelièvre 1 , T. Regnier 2 , V. Nowak 2 , P. Plassart 2 ,
P. Wincker 4 , P. Lemanceau 2 , P.A. Maron 1,2 , C. Mougel 1,2 et L. Ranjard 1,2
1 – UMR Agroécologie 1347 – Plateforme GenoSol, INRA – Dijon
2 – UMR Agroécologie 1347 – Pôle EcolDur, INRA – Dijon
3 – UMR CNRS 6543 – Laboratoire de Biologie Virtuelle, Nice
4 – CEA, Institut de Génomique (IG), Genoscope, Evry.

Caractéristiques des sols
Le sol est un environnement naturel assurant de multiples fonctions
Production d’aliments et
de biomasse
Source : A. Richer de Forges (CA 45)
Source : Infosol (INRA Orléans)
Source de matières
premières
Source : J. Moulin (CA 36)
Habitat et patrimoine
génétique
Source : Infosol (INRA Orléans)
Les microorganismes des sols sont très abondants, avec une forte
diversité
1g de sol
Bactéries
Champignons
10 6 - 10 9 individus
10 3 - 10 6 individus
10 3 - 10 6 espèces
Variable

Objectifs
Caractérisation des communautés microbiennes des sols via l’exploitation des
données issues du pyroséquençage d’amplicons 16S et 18S.
Inventaire exhaustif de la diversité microbienne tellurique,
Evaluer sa distribution temporelle et spatiale,
Mieux comprendre la régulation des communautés microbiennes du sol,
Relier cette diversité en fonctionnement biologique du sol et en services
écosystémiques.
(Ranjard et al., 2003, Ranjard et al., 2009, Dequiedt et al. 2011)

Inventaire de la diversité microbienne à l’échelle de la France
RMQS : Réseau de Mesure de la Qualité des Sols, mis en place en 2002 (INRA INFOSOL,
Orléans), grille d’échantillonnage des sols français : 16 km x 16km sur toute la France
2206 points.
ICP Forest niveau 1
1/3 sites agricoles
1/3 sites forestiers
1/3 sites prairies
Cartographie de la qualité des sols basée uniquement sur les paramètres physico-chimiques :
- texture, pH, Corg tot, Norg, Ca, Na, Mg, ETM, …

DNA
1
Métagenome
Abondance
Diversité
L’écologie moléculaire microbienne
RNA
2
Métatranscriptome
Fonctionnalité
Protein
3
Métaproteome
MétaTaxogénomique (16S/18S)
Substrats
Produits
4
Métabolome
Activité
Services
(Maron et al. 2007)

Le pyroséquençage
L’expansion des nouvelles générations de séquençage permet
maintenant d’acquérir un grand nombre de séquences.
GS-FLX 454 (Roche) Titanium :
• 1,000,000 reads (~400 bases)
• 400,000,000 bases en 10 heures
Limitation : production massive de données à traiter et à gérer.
Nécessité d’utiliser un pipeline d’analyse bioinformatique
optimisé et répondant à nos besoins.

Pipelines bioinformatique existants
PLUS MOINS
▲ Multiplateformes,
▲ MAJ (V 1.24.1),
▲ Nombreux outils dispo,
▲ Communauté active.
▲ Pas d’installation,
▲ Interface web conviviale,
▲ Outil de référence.
▲ MAJ (V 1.4.0),
▲ Analyse rapide,
▲ Production de
graphiques de qualité.
Développement pipeline dédié (16S/18S)
▼ Lignes de commande,
▼ Difficultés sur gros jeux
de données,
▼ Complexe à paramétrer.
▼ Volume des données,
▼ Peu évolutif,
▼ Téléchargements
fichiers à chaque étape.
▼ Confidentialité données.
▼ Linux ou Mac OS,
▼ Lignes de commande,
▼ Certains outils intégrés
engendreraient des
erreurs.
(Schloss, 2010 – Barriuso et al., 2011 – White et al., 2010)

Raw reads
(454, Illumina,
etc…)
Pipeline bioinformatique de traitement : vue globale
Prétraitement
Harmonisation
Taxonomie
Analyses
CLUSTERING 3.0% (INDICES DE DIVERSITE)
Sample Nb_seqs Nb_clusters Shannon var(Shannon) Evenness Simpson 1/Simpson
Zone A 1770 62 1.91 0.00139537 0.462716 0.25854 3.868
Zone A 2739 100 2.242 0.00104185 0.486905 0.206566 4.841
Témoin Zone B 5163 76 1.37 0.000603875 0.316427 0.496192 2.015
Zone B 20159 310 3.235 0.000142737 0.563985 0.0867775 11.524
Zone B 10274 183 2.489 0.00037131 0.477824 0.231748 4.315
Alignement
Données exploitables
Clustering Filtres
Statistiques

Séquences
brutes
Clustering basé sur l’alignement multiple INFERNAL
Clustering des données à K différences (PERL).
S’appuie sur des données organisées (diminution nombre d’étapes).
S’appuie sur les séquences les plus « vraies ».
Calcul de similarité entre 2 séquences (distance d’édition de Levenshtein).
Ignore les erreurs d’homopolymères.
(Terrat et al., 2012 - Shahbazkia & Christen, in preparation)
Prétraitement Alignement Clustering Filtres Taxonomie Analyses Statistiques

Séquences
brutes
Filtre des reads
Limitations :
Peu de recul sur taux d’erreur lié au pyroséquençage,
Existence des chimères, des single-singletons.
Clustering
(Terrat et al., 2012 - Shahbazkia & Christen, in preparation)
Prétraitement Alignement Clustering Filtres Taxonomie Analyses Statistiques

Séquences
brutes
Filtre des reads
(Terrat et al., 2012 - Shahbazkia & Christen, in preparation)
Prétraitement Alignement Clustering Filtres Taxonomie Analyses Statistiques

Séquences
brutes
Filtre des reads
Elimination des single-singletons
Assignation
taxonomique
Si OK : réinjection,
Sinon : élimination.
Elimination suffisante, trop stringente ?
Filtre supplémentaire pour chimères ?
(Terrat et al., 2012 - Shahbazkia & Christen, in preparation)
Prétraitement Alignement Clustering Filtres Taxonomie Analyses Statistiques

Séquences
brutes
Assignation taxonomique
Limitations :
Peu de recul sur qualité des bases disponibles,
Approches d’assignation différentes.
16S 18S
RDP
multiclassifier BLAST
???
BLAST
Couplage
résultats
Autres bases ?
Autres approches ?
Prétraitement Alignement Clustering Filtres Taxonomie Analyses Statistiques
???
Couplage
résultats

Développements techniques en cours
Mise au point d’une interface graphique multiplateforme :
• Interface graphique conviviale en cours de développement pour interagir
avec serveur de calcul dédié.
Développement d’une interface Web :
• Interface Web pour accéder au pipeline développé par la plateforme
GenoSol et pour nos différents collaborateurs.

Assignation taxonomique :
• Mise au point de bases épurées et d’une nouvelle approche
d’assignation appelée AffilGood.
Optimisation du pipeline :
Développements techniques en cours
Collaboration avec P. PEYRET et E. PEYRETAILLADE
Université d’Auvergne (ERT-CIDAM)
• Collaboration sur l’analyse de données et la mise au point ou
l’amélioration de programmes intégrés au pipeline.
Collaboration avec R. CHRISTEN
UMR CNRS 6543 – Laboratoire de Biologie Virtuelle

Influence des procédures d’extraction (standardisation) :
1 er paramètre à prendre en compte dans les inventaires taxonomiques
de la microflore tellurique.
Abondance relative (%)
MOBIO
5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5
GnS-GII
Développements techniques en cours
Partenariat scientifique avec P. WINCKER (initiation projet Taxomic-RMQS)
Institut de Génomique – Centre National de Séquençage – Genoscope
(A) 5 (B)
SY3
Abondance relative (%)
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5
GnS-GII
Gemmatimonadetes
Nitrospira
Crenarchaeota
Firmicutes
TM7
WS3
OP10
Sols sous culture : ; forêt à feuilles
caduques : ; forêt de conifères : ;
prairies : et vignes : . (A)
Comparaison de GnS-GII avec MOBIO,
et (B) de GnS-GII avec SY3.
(Terrat et al., 2012)

Lionel Ranjard
Remerciements
Pierre-Alain Maron
Christophe Mougel
Samuel Dequiedt
Mélanie Lelièvre
Fabien Morin
Philippe Lemanceau
Richard Christen Patrick Wincker

Merci de votre attention !

INRA de Dijon – UMR Agroécologie
Equipe rattachée au pôle EcolDur
Axe 1 : Distribution spatiale (temporelle) et régulation de la diversité
microbienne des sols
Axe 2 : Traduction de la diversité microbienne en fonctionnement
biologique (turnover des matières organiques des sols – cycle du C)
Carte de diversité
microbienne des
sols
Traduction
Carte d’aptitude
des sols à stocker
et déstocker du
Carbone
Programme Carbomic-RMQS

Appui logistique
Centre de Ressources Génétiques :
conservatoire de sols et ADNs de sites expérimentaux,
réseaux de surveillance et observatoire (RMQS, OREs, Réseau
PIC, Sites ateliers, sites de l’ADEME, ANDRA, OSV, LTO européens,…)
Plateforme Technique : caractérisation de la
diversité microbienne (qPCR, Fingerprint, Metaprotéomique,
Pyroséquençage,…)
Système d’Information Environnementale
(S.I.E.) : base de données (gestion et traçabilité, confrontation
données environnementales - microbiennes…) et outils
mathématiques adéquats (statistiques, géostatistiques, pipeline
bioinformatique,…)
Démarche qualité, veille technologique et formation
Mise à la disposition de la communauté scientifique
Référentiel de la caractérisation microbienne des sols

Diagramme Organisationnel de GenoSol