iTRAQ - Inserm

Fractionnement, LC-Maldi, iTraq
Amélioration de la Couverture Protéomique des
Milieux très Complexes
Catherine Guette
Centre Régional de Lutte Contre
le Cancer Paul Papin
Centre INSERM Régional
de Recherche sur le Cancer U892

2D-DIGE (électrophorèse 2D différentielle)
iTRAQ
Deux techniques de
protéomique quantitative
100
50
0
111.2 114.4 117.6 120.8
Mass (m/z)

Oxaliplatine : un sel de platine de
NH 3 +
NH 3 +
Pt
Cl
Cl
3 ème génération
NH 3 +
NH 3 +
Cisplatine Carboplatine
Pt
C
C
CO
CO
NH 2
NH 2
Pt
O
O
Oxaliplatine
• Seul sel de platine actif dans les cancers colorectaux métastasés
• Synergie avec le 5-FU, utilisation en première ligne thérapeutique
• Activité dans les cancers du sein et des ovaires
CO
CO

Toxicité de l’oxaliplatine
• Absence de toxicité rénale
cardiaque
auditive
• Faibles toxicités hématologique
digestive
• Toxicité limitante neurologique
De type neuropathies périphériques :
- Neurotoxicité aiguë
- Neurotoxicité chronique
AIGUE : transitoire et dose-dépendante (85 à 95% des
patients). Troubles sensitifs: Crampes, fourmillement
parfois laryngospasmes
CHRONIQUE : évolution progressive
Difficulté à marcher, écrire, se boutonner
Dans 20% des cas pas de régression après 8 mois d’arrêt

Protéomique quantitative
Modèle cellulaire :
neuroblastome SH-SY5Y
CTRL
Ox 5 µM
Ox 10 µM
4 réplicats biologiques
indépendants
Ox 50 µM, 24 h
DIGE-2D iTRAQ
Cy2, Cy3, Cy5
12,5%, pH 3-10, 18 cm
MALDI-TOF/TOF
4-plex et 8-plex
OFFGEL 24 fractions, nano-LC-C 18
MALDI-TOF/TOF

Cy2
Cy3
Cy5
std interne
éch. 1
éch. 2
DIGE-2D : principe
+
Mélange des extraits marqués Séparation Scan Analyse

2D-DIGE : Résultats
–pI

1592 protéines
82 protéines
∆ +/- 30 %
Analyse par DIGE-2D

Les approches

iTRAQ : Principe chimique
Ross, P. L. (2004) Mol. Cell. Proteomics 3: 1154-1169

Premiers essais avec le 8-plex
8-plex iTRAQ

Le réactif iTRAQ
114 31 Peptide A échantillon 1
115 30 Peptide A échantillon 2
116 29 Peptide A échantillon 3
117 28 Peptide A échantillon 4
Réactif spécifique de la fonction amine des extrémités
N-terminales des peptides et des chaînes latérales des
lysines

Marquage
Quantification
117
116
115
114
31
30
29
28
iTRAQ
114 31 Peptide A échantillon 1
115 30 Peptide A échantillon 2
115 30 Peptide A échantillon 2
116 29 Peptide A échantillon 3
116 29 Peptide A échantillon 3
116 29 Peptide A échantillon 3
117 28 Peptide A échantillon 4
117 28 Peptide A échantillon 4
117 28 Peptide A échantillon 4
117 28 Peptide A échantillon 4
Fragmentation par collision
Identification

Marquage iTRAQ
Échantillon 1 Échantillon 2 Échantillon 3 Échantillon 4
Digestat 1 Digestat 2
Réduction, alkylation, digestion
iTraq 114 iTraq 115 iTraq 116 iTraq 117
Digestat 114 Digestat 115 Digestat 116
Digestat 117
Mélange des peptides
Séparation 2D:
1ère dimension: SCX ou OFFGEL
2ème dimension : nanoLC sur C 18
Digestat 2 Digestat 2
Analyse MS/MS sur MALDI TOF/TOF

Couplage LC-MALDI MS/MS
SCX
1614 MS
8585 MS/MS
42 heures

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Les spectres MS et MS/MS
1176.5342(R12665,S1920)
Final - Shots 2000 - 2LC5; Label 1077
1459.5674(R14251,S833)
1532.6335(R14770,S434)
1767.6576(R15965,S175)
0
699.0 1361.8 2024.6 2687.4 3350.2 4013.0
Mass (m/z)
MS/MS
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
1410.4
114.1301
70.0783
112.1062
175.1482
MS
Final - Shots 2000 - 2LC5; Label 1077 Prec = 1176.5000
636.4142
0
9 256 503 750 997 1244
Mass (m/z)
713.4863
1020.7413
1022.6471
1002.6669
8.0E+4

Zoom sur la zone des étiquettes iTraq
100 114.1146 116.1154
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
110.0883
112.0933
108.0 111.2 114.4 117.6 120.8 124.0
Mass (m/z)
120.0905
4177.5

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Final - Shots 2000 - 2LC5; Run #4; Label 1076 Prec = 1533.0422
114.1038
116.1008
698.3973
272.1489( 948.4424
472.2503(
0
9.0 331.4 653.8 976.2 1298.6 1621.0
Mass (m/z)
QUANTIFICATION
Résultats
974.4841
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
1102.9
Final - Shots 2000 - 2LC5; Run #4; Label 1076 Prec = 1533.0422
112.0804(
114.1038
115.1052
IDENTIFICATION
117.1096
120.0793 129.1108(
0
110 115 120 125 130 135
Mass (m/z)
1102.9

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Final - Shots 2000 - 2LC5; Run #4; Label 1348 Prec = 1418.9219
117.1147
115.1078
145.1094
258.2011(
371.2890
569.4044
687.3405
0
9.0 307.2 605.4 903.6 1201.8 1500.0
Mass (m/z)
QUANTIFICATION
Résultats
833.3831
949.4618
100
90
80
70
60
50
40
30
20
8766.7
Final - Shots 2000 - 2LC5; Run #4; Label 1348 Prec = 1418.9219
112.0830
114.1084
115.1078
IDENTIFICATION
116.1122
117.1147
10
110.0714 119.0998
0
110.0 113.2 116.4 119.6 122.8 126.0
Mass (m/z)
8766.7

Poids
(µg)
Identification des protéines :
iTRAQ vs non-marqué
Marquage
iTRAQ
Fractionnement
(1ère dimension)
Nombre de
protéines
200 non
SCX 116 (159)
200
oui
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
SCX 310 (472)
K R
non-labeled
iTRAQ

Affinité protonique et iTRAQ
L’affinité protonique des amines
tertiaires est supérieure à celle des
amines primaires (50 kJ/mole)
Peptides nonmarqués
1273
Peptides
iTRAQ
7438
L’iTRAQ augmente l’affinité
protonique des peptides

Evaluation de la concentration des
protéines par calcul du PAI
PAI= nombre de peptides identifiés/nombre de peptides théoriques
Number of identified proteins
60
50
40
30
20
10
0
200 microg, µg, SCX, SCX, non-marqués non-labeled vs iTRAQ
PAI
1
PAI
label-free
iTRAQ

Nombre de protéines identifiées
Poids
(µg)
200
400
en fonction de la quantité
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Marquage
iTRAQ
oui
Fractionnement
(1ère dimension)
oui SCX
Nombre de
protéines
SCX 310
iTRAQ, SCX, 200microg vs 400 microg
429
1
PAI
(472)
(492)
200 µg
400 µg

Fractionnement en fonction du
pI des peptides

Poids
(µg)
400
Identification des protéines :
Marquage
iTRAQ
oui
400 oui
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
SCX vs OFFGEL
Fractionnement
(1ère dimension)
Nombre de
protéines
SCX 429 (492)
OFFGEL 739 (879)
1
PAI
SCX
OFFGEL

Efficacité de la séparation OFFGEL
Total identified peptides (%)
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
non-marqués
iTRAQ
1 2 3 4
Nombre de fractions contenant un peptide unique
Introduction d’un paramètre
supplémentaire, le pI, pour
valider l’identification des
protéines

Classification des protéines en
The human mammary epithelial cell proteome.
Liu et al Proteomics. 2005 (5):1263-73.
35
30
25
20
15
fonction du pI
Protéome humain
(NCBI human protein database)
10
Classification of total identified proteins (A, C) and the human proteome (B, D) based on physiochemical
5
properties. pI distributions were plotted for the total identifications (A) and all human proteins (B) using
0
predicted pI values extracted from 3,7
NCBI human protein database, over increments of 0.1 pH units. MW
distributions were plotted for the total Isoelectric identifications point (0.2 (C) unit andincrements) all human proteins (D) using 20 kDa
increments.

Classification des protéines en
fonction de la masse
The human mammary epithelial cell proteome.
Liu et al Proteomics. 2005 (5):1263-73.
Number of proteins
250
200
150
100
50
0
300

Conclusion
L’iTRAQ favorise l’ionisation des peptides en MALDI
Identification de 947 protéines (1111) à partir de 400 µg
Le fractionnement OFFGEL permet d’introduction d’un filtre
supplémentaire , le pI, pour la validation de l’identification des
protéines
E. Ernoult, E. Gamelin, C. Guette, Proteome Science, sous presse.

Nombre
d’expériences
Améliorations technologiques
et injections multiples
Quantité Marquage Séparation
1ère Dimension
103
104
152
245
1406
Séparation
2ème Dimension
3 400 µg iTRAQ OFFGEL nanoLC-C18
N° Nombre de
protéines
1 1449
2 1608
3 1637
Total 2791
244
89

iTRAQ
∆ +/- 30%
141
Comparaison
2D-DIGE / marquage iTRAQ
186 protéines
(6,6%)
45
37
82 protéines
(5,1%)
2D-DIGE
∆ +/- 30%

Le plasma sanguin humain
22 protéines ~ 99% poids total
Dynamique de concentration ~10 11

Traitement du plasma
Conservation des échantillons
Déplétion
Digestion
Marquage iTRAQ (4 ou 8 plasmas simultanément, soit 400 µg)
Fractionnement OFFGEL 24 fractions
Analyse LC-MS/MS
Multiple Affinity Removal Spin
Cartridge – Human 14
Proteominer
Résultats : identification des protéines et quantification

Quantity
(µg)
400
400
400
400
400
Score :
Résultats
Déplétion iTRAQ Fractionation Protein
number
no
no
7 prots
7 prots
14 prots
95%
no
no
no
yes
yes
2DLC
(SCX/C18)
OFF-GEL
(12 fractions)
OFF-GEL
(24 fractions)
OFF-GEL
(24 fractions)
OFF-GEL
(24 fractions)
148
127
Peptide
Number
2787
2852
140 7630
184 11 651
216 16 156

Quantité
(µg)
Comparaison
Immunoaffinité / banque de peptides
Déplétion iTRAQ Séparation Nombre
Protéines
400 MARS-14 oui OFFGEL
(24 fractions)
3 expériences
400 ProtéoM oui OFFGEL
(24 fractions)
3 expériences
Nombre
Peptides
326 26120
374
275 16987
367

…et la gamme de concentration

Equipe “Protéomique’’
Catherine Guette
Emilie Ernoult
Anthony Bourreau
Catherine Hameline
Muriel Bahut