Ludovic BERTHELOT Étude de phases lipidiques par RMN du 31P ...

DEA de biophysique moléculaire
Universités Paris VI, Paris VII, Paris XIII, Orléans
École Centrale
rapport de stage présenté par
Ludovic BERTHELOT
Étude de phases lipidiques par RMN du 31 P.
Recouplage de l'anisotropie du
déplacement chimique.
Travail effectué sous la direction du Pr. Philippe DEVAUX
UPR 9052
Laboratoire de physico-chimie moléculaire des membranes biologiques
année scolaire 1998-1999

Remerciements
A
u vu du déroulement de ce stage, il est difficile d'éviter de faire deux fois plus de
remerciements qu'à l'habitude. Même si le laboratoire de rattachement était l'IBPC (Institut
de Biologie Physico-Chimique, 13 rue P&M Curie, 75005), une grande partie des recherches s'est en
effet déroulée dans le laboratoire de RMN de l'ENS (École Normale Supérieure, 24 rue Lhomond,
75005), qui abrite le spectromètre de l'IBPC.
Mes premiers remerciements iront au Pr. Philippe Devaux, qui a dirigé ces recherches en me
communiquant son enthousiasme tout en me ménageant une relative autonomie, ainsi qu'à Dror
Warschawski, qui m'a encadré pendant ces cinq mois avec autant de disponibilité que d'efficacité.
Je n'oublierai pas non plus d'associer à ces remerciements le Pr. Geoffrey Bodenhausen, pour la
qualité de ses conseils autant que l'intérêt de ses séminaires.
Mon passé de chimiste n'aurait pas été aussi bien mis à profit sans la patience et la gentillesse de
Paulette Hervé. Quant à ma conversion à la biologie expérimentale, c'est à Sophie Cribier que je la
dois, pour ses conseils en matière de préparation sanguine.
Enfin, que Patricia Sépulcri, Mounir Traïkia, Mohamed Triba, Laurent Catoire, Fabien Ferrage,
Jean Pierre Duneau, Michaël Deschamps, et quelques autres que j'oublie de citer, soient remerciés
d'avoir fait régner au sein des deux labos une ambiance autant studieuse que chaleureuse, mais
toujours source d'émulation, et qui fait que l'on peut dire de ce stage que c'est une expérience réussie.

Table des matières
Introduction 1
Chapitre 1 : Éléments théoriques
I. Les lipides
A. Qu'est-ce qu'un lipide? 2
B. Les phospholipides 2
C. Le polymorphisme lipidique 4
D. La membrane biologique : exemple des érythrocytes 5
II. La RMN du 31 P appliquée aux lipides
A. Pertinence de l'étude par RMN 6
B. Rappels de RMN 6
C. La RMN en bande large du 31 P dans les phospholipides
1. Les interactions dominantes 7
2. CSA et profil de raies 8
D. L'effet de la rotation
1. Moyennage du CSA 11
2. Impulsions de 180° synchronisées avec la rotation 12
E. Le recouplage de l'anisotropie du déplacement chimique
1. Utilité de la technique de recouplage dans l’étude des lipides 14
2. La méthode de Tycko 14
Chapitre 2 : Matériels et méthodes
I. Préparation des échantillons
A. Les préparations de lipides hydratés 17
B. Les fantômes de globules rouges 17
II. Utilisation de l’appareil de RMN
A. Description du matériel 18
B. Mise en œuvre des spectres de RMN 21
Chapitre 3 : Résultats et discussion
I. Mise au point sur un lipide, la DMPC 20
II. Les résultats sur le mélange ternaire 22
III. Discussion des résultats précédents 25
IV. Une extension à un système biologique : les fantômes de globules rouges 25
Conclusions et perspectives 27
Références 28
Annexe 1 29

Introduction
P
armi les différentes molécules ou macromolécules du vivant, protéines solubles et acides nucléiques
sont très étudiés, et, à ce titre, de mieux en mieux décrits structurellement. Au contraire, les lipides
–mais il en va de même des sucres, par exemple– sont encore sources de nombreuses interrogations. Si leur
rôle cellulaire ne fait aucun doute, si la description d’une membrane cellulaire en terme de bicouche lipidique
est acceptée, on ne s’explique toujours pas leur si grande diversité, pas plus que des processus comme la
fusion membranaire. Par ailleurs, les protéines membranaires, autres molécules essentielles à la membrane,
ont des interactions avec les lipides qui sont encore méconnues : il est simplificateur de dire que les lipides
auraient un rôle purement structural, alors que les protéines n’auraient qu’un rôle fonctionnel au sein de la
cellule.
Une classe importante de lipides est celle des phospholipides, qui possèdent tous un groupe phosphate. La
résonance magnétique nucléaire (RMN) du phosphore-31 ( 31 P) est une méthode de choix dans la
reconnaissance des phases de phospholipides, et plus généralement dans l’étude des systèmes membranaires.
Elle est complémentaire de diverses autres techniques, comme la diffraction des rayons-X ou la résonance
paramagnétique électronique (RPE). En solution organique, on peut ainsi différencier chaque phospholipide
selon le déplacement chimique du 31 P, noyau de spin ½, d’abondance naturelle 100%, ainsi que de sensibilité
assez élevée. De nombreuses revues sur la RMN du 31 P dans l’étude des membranes ont été réalisées. On
pourra par exemple se référer à la présentation de Yeagle (Yeagle, 1993) dans l’Encyclopédie de la RMN.
Comme on le détaillera par la suite, le spectre statique du phosphore-31 d’un phospholipide a une allure
caractéristique de sa phase. On parle de spectre large bande, car le pic d’absorption associé s’étend sur
plusieurs dizaines de ppm. L’asymétrie de ce spectre est alors le reflet de l’interaction dominante en RMN du
31 P, l’anisotropie du déplacement chimique. Mais dès que l’on a affaire à un mélange de lipides, la
reconnaissance du profil du spectre est compliquée par la superposition de chacun des profils des lipides.
C’est pour séparer ces profils selon les lipides présents dans le mélange –un spectre pour un lipide et non
plus une superposition de spectres pour le mélange de lipides– que la notion de recouplage est utile. Comme
on le verra, les spectres obtenus par recouplage de l’anisotropie du déplacement chimique ont deux
dimensions, une selon laquelle on sépare les lipides présents selon leur tête polaire, une autre selon laquelle
on peut lire le profil large bande typique de la phase lipidique.
Le but de ce stage a donc consisté en la mise au point d’une nouvelle technique d’étude de système
membranaire. Ce rapport qui en rend compte doit donc tout d’abord présenter les bases théoriques
nécessaires à la compréhension de la technique développée. Après une brève présentation des lipides et du
polymorphisme lipidique, on s’attardera sur la RMN du 31 P, qu’il s’agisse de spectres large bande ou haute
résolution par la technique de rotation à l’angle magique, dans le but de préciser l’intérêt et le
fonctionnement de la technique du recouplage. Avant de présenter les résultats obtenus et de les discuter, on
décrira préalablement les protocoles expérimentaux propres aux échantillons de lipides utilisés, ainsi que les
appareils requis pour la spectroscopie de RMN.
1

Chapitre 1
Éléments théoriques
D
ans ce chapitre, nous détaillerons les bases théoriques des expériences que nous avons réalisées.
Après une présentation du monde des phospholipides, nous nous attarderons surtout sur la
spécificité de la RMN du 31 P dans ces lipides, afin de parvenir à expliquer la méthode de recouplage de
l’anisotropie du déplacement chimique.
I. Les lipides
A. Qu’est-ce qu’un lipide ?
Les lipides sont de petites molécules insolubles et amphiphiles. A ce titre, ils possèdent une tête
hydrophile et une queue hydrophobe, qui leur permettent de s’auto-assembler en structures en couches voire
en bicouches. Cette structure en bicouche est la base des membranes cellulaires. Ainsi, une caractéristique
commune à tous les lipides est leur rôle fonctionnel au sein des cellules, qui est d’abord un rôle de
compartimentation et d'échange entre l'intérieur et l'extérieur.
Si les lipides sont aussi divers, c’est du fait de la grande variété qui existe dans la tête polaire et la queue
hydrophobe de la molécule. L’annexe 1 présente un tableau récapitulatif des principaux types de lipides
membranaires. On y voit surtout deux grandes classes, une pour laquelle la queue hydrophobe est composée
d’un squelette carboné cyclique, dans le cas des stérols et plus particulièrement du cholestérol, une autre
pour laquelle il s’agit au contraire de deux chaînes aliphatiques comportant de 12 à 20 carbones environ. Les
deux chaînes d’acides gras, identiques ou non, sont, chez les glycérides, fixées sur une molécule de glycérol,
elle même reliée à une tête polaire qui peut être un sucre (cas des glycérolipides) ou un phosphate substitué
(cas des phospholipides). Les sphingolipides sont construits sur une unité de base sphingosine, substituée par
une chaîne aliphatique et possédant une tête polaire phosphate ou oligosaccharide.
Les détails ne seront pas abordés ici. On pourra par exemple se référer au chapitre 1 du Phospholipids
Handbook, par Gregor Cevc (1993), notamment pour la nomenclature.
B. Les phospholipides
Il s’agit surtout d’introduire leur nomenclature, qui servira par la suite.
Une famille importante de lipides est celle des phospholipides. Par ce terme, on désigne ici d’une manière
abusive ce qu’il serait plus convenable d’appeler les diacylphosphoglycérides, qui ne sont qu’un des
membres de la famille des phospholipides, mais l’un des principaux. Ces lipides sont les principaux
2

constituants naturels des membranes cellulaires. Ils constituent plus de 80% des lipides dans les membranes
mitochondriale ou plasmique, et plus de 90% dans les membranes nucléaires a .
Chimiquement, dans un phospholipide, une molécule de glycérol est estérifiée en position 1 et 2 par deux
chaînes d’acides gras saturées ou non. La position 3 est substituée par un groupement phosphate, auquel est
reliée une tête polaire noté X sur la figure 1.1. La configuration naturelle de l’atome de carbone 2 est (R), ce
que désigne généralement le symbole sn (pour stereospecific numbering).
HO
1
CH 2
OH
2
3
H
CH 2
OH
(a)
R
O
R'
O
O
O
O
(b)
O
P O
_
O
X
figure 1.1 : (a) molécule de sn-glycérol (le carbone prochiral 2 est en configuration (R))
(b) : structure de base d’un diacylglycérophospholipide. X est la tête polaire et
R et R’ sont les chaînes aliphatiques.
La nomenclature des phospholipides fait intervenir la tête polaire X. Le tableau 1.2 détaille les principales
têtes polaires des phospholipides.
tête polaire X nom commun symbole
-H acide phosphatidique PA
-CH 2 CH 2 N + (CH 3 ) 3
choline
+
-CH 2 CH 2 NH 3
éthanolamine
-CH 2 CH(COO - +
)NH 3
sérine
-CH 2 -CHOH-CH 2 OH
glycérol
phosphatidylcholine
phosphatidyléthanolamine
phosphatidylsérine
phosphatidylglycérol
PC
PE
PS
PG
OH
OH
OH
OH
OH
phosphatidylinositol
PI
inositol
tableau 1.2 : nomenclature des principaux phospholipides en fonction de leur tête polaire.
a Les lipides restant sont principalement des cardiolipides dans la membrane mitochondriale, et des sphingolipides dans
la membrane plasmique.
3

Enfin, les chaînes d’acides gras (notée R et R’ sur la figure 1.2) interviennent aussi dans les propriétés
physiques des phospholipides. Les principales chaînes sont répertoriées dans le tableau 1.3.
nom commun nom systématique Symbole b
lauroyl dodécanoyl 12:0
myristoyl tétradécanoyl 14:0
palmitoyl hexadécanoyl 16:0
stéaroyl octadécanoyl 18:0
oléoyl octadéc-9-(Z)-énoyl 18:1cÄ 9
linoléoyl octadéca-9,12-(Z),(Z)-diénoyl 18:2ccÄ 9,12
tableau 1.3 : nomenclature des chaînes d’acides gras R et R’.
Au vu des tableaux 1.2 et 1.3, on peut désormais préciser la désignation des phospholipides qui sera faite
par la suite. On parlera principalement de la DMPC et de la DOPE, qui sont respectivement la 1,2-
DiMyristoyl-sn-glycéro-3-PhosphatidylCholine (X=choline, R=R’=14:0) et la 1,2-DiOléoyl-sn-glycéro-3-
PhosphatidylÉthanolamine (X=éthanolamine, R=R’=18:1cÄ 9 ).
C. Le polymorphisme lipidique
Les molécules amphiphiles que sont les lipides ont une grande propension à s’organiser selon des
assemblages réguliers et ordonnés à deux ou trois dimensions. Au delà d’une concentration très faible en
solution aqueuse, les lipides vont s’associer pour mettre leurs têtes polaires en contact avec l’eau, et en isoler
leurs chaînes hydrophobes. Une des structures possibles est la bicouche, qui peut se refermer sur elle même
pour former une vésicule. Mais d’autres formes existent, comme la micelle (pour des détergents), la micelle
inverse ou des formes intermédiaires que sont les phases hexagonales ou cubiques. On passe d’une phase à
l’autre par des variations des conditions du milieu : température, pourcentage d’hydratation, pH, force
ionique, présence d’agents extérieurs comme des protéines ou du cholestérol.
La figure 1.4 illustre les deux principales phases que l’on rencontrera par la suite : la phase hexagonale
inverse, dite H II , et la phase lamellaire (bicouche).
figure 1.4 : représentation schématique des phases hexagonale inverse (à gauche) et lamellaire (à droite) (d’après
Gregor Cevc, Phospholipids Handbook , chapitre 2)
b Le premier chiffre est le nombre total de carbones de la chaîne, le deuxième est le nombre total d’insaturations Ä ; en
exposant, les positions de ces insaturations dans la chaîne ; c et t pour des configurations cis ou trans de la double
liaison (cis est la configuration naturelle)
4

La phase H II fait apparaître un agencement hexagonal de “cylindres micellaires inverses”. Il existe aussi
une phase hexagonale (non inverse, dite H I ), où les cylindres micellaires ne sont pas inverses (i.e. les lipides
tournent alors leurs têtes hydrophiles vers l'extérieur du cylindre).
La simple notion de bicouche est plus complexe que ne peut le faire apparaître la figure 1.4. Au sein de la
phase lamellaire, on fait encore la distinction entre phase cristal-liquide (ou fluide, dite L á ), et phase gel (dite
L â ) à plus basse température. La différence entre les deux est surtout due à la flexibilité des chaînes
hydrophobes, beaucoup plus grande au sein de la phase fluide, comme l’illustre la figure 1.5, issue de
simulations par dynamique moléculaire (Heller et al., 1993). La diffusion latérale est également bien plus
importante dans la phase fluide.
figure 1.5 : simulation de la dynamique de 5 molécules de POPC dans des membranes modèles
(a) : en phase L â ; (b) : en phase L á ; (d’après Heller et al., 1993)
D. La membrane biologique : exemple des érythrocytes
La membrane externe des globules rouges (érythrocytes) est l'exemple le mieux décrit de membrane
cellulaire. Composée en masse pour moitié de protéines membranaires, pour moitié de lipides, cette
membrane peut être facilement étudiée parce qu'on peut l'isoler du reste de la cellule de globule rouge. Par
un procédé de lyse osmotique, le globule éclate et une simple centrifugation permet d'éliminer l'hémoglobine
qu'il renferme. On obtient alors des stromas, ou fantômes percés (en anglais ghosts), constitués uniquement
des membranes lipidiques et de leurs protéines intrinsèques, ainsi que du cytosquelette. Les détails
concernant la biophysique des membranes de globule rouge peuvent par exemple être trouvés dans l'ouvrage
de E. Shechter (1993). Pour mémoire on reportera simplement dans le tableau 1.6 la composition lipidique
moyenne de ces membranes.
cholestérol 25
phospholipides totaux 56
dont PC 23
PE 20
PS 11
PI 2
sphingomyéline SM 18
autres 1
tableau 1.6 : pourcentage de la quantité totale de lipides dans l'érythrocyte humain.
5

II. La RMN du 31 P appliquée aux lipides
A. Pertinence de l’étude par RMN
Pour étudier et comprendre la membrane biologique, les méthodes d’étude sont multiples, et permettent
chacune de sonder des propriétés différentes. Après de premières études de phases lipidiques par diffraction
de rayons X (Luzzatti, 1962), d’autres techniques ont été appliquées aux membranes ou aux modèles
lipidiques, qui avaient toutes pour but d’étudier une gamme de mouvements propres : ainsi, des méthodes de
spectroscopie infra-rouge ou Raman peuvent sonder des mouvements très rapides (10 7 à 10 11 Hz), alors que
les méthodes de RPE sondent des mouvements plus lents (10 3 à 10 9 Hz). Des informations structurales
peuvent également être obtenues par cryo-microscopie électronique, ou par microscopie à force atomique.
Le but n’est pas dans cette présentation de comparer toutes ces méthodes en les développant, mais de
situer la RMN parmi elles. En effet, elle a un rôle bien particulier, parce qu’il s’agit d’une méthode qui peut
couvrir une vaste gamme de mouvements. Sa nature même lui permet de s’intéresser à un grand nombre de
noyaux différents, de spin non nul : 1 H, 2 H, 13 C, 15 N ou 31 P principalement. Leurs propriétés spectroscopiques
sont telles que les fréquences de mouvements accessibles vont de 10 -1 à 10 10 Hz.
Nous avons choisi ici de mener une étude par RMN du 31 P. C’est, avec 1 H, le seul de ces isotopes
abondant à l’état naturel. Son rapport gyromagnétique est 2,5 fois plus faible que celui du proton, ce qui fait
de lui un noyau tout de même assez sensible c . Mais surtout, les spectres du 31 P sont dominés par une
interaction, le déplacement chimique, qui, du fait des propriétés électroniques propres au noyau de
phosphore, est fortement anisotrope (i.e. n’a pas la même valeur suivant trois directions privilégiées de
l’espace). Cette anisotropie du déplacement chimique a des conséquences importantes sur le profil du spectre
31 P, qui est caractéristique de la phase où se trouve le phospholipide.
Enfin, une membrane biologique est un objet mi-fluide, mi-solide, en fait un solide mou voire un cristalliquide.
On entre alors dans le domaine de la RMN solide, avec son formalisme propre et surtout sa grande
variété d’expériences possibles. La rotation à l’angle magique et les techniques de recouplage sont alors des
méthodes de choix dans l’étude de ces membranes.
C’est principalement ces deux aspects, anisotropie du déplacement chimique et effet de la rotation, que
l’on va tenter d’illustrer dans les paragraphes suivants.
B. Rappels de RMN
On s’appuie sur les bases de RMN acquises en DEA. On suppose acquises quelques notions de mécanique
quantique, notamment la notion d’Hamiltonien H, dont les fonctions propres sont les fonctions d’onde ψ du
système pour la valeur propre E (l’énergie), selon l’équation de Schrödinger Hψ=Εψ. Des précisions
théoriques peuvent être trouvées dans de nombreux ouvrages. Citons notamment celui de K. Schmidt-Rohr et
H. W. Spiess (1994), qui nous a guidé tout au long de ce stage.
c 13 C, avec un ã 4 fois plus faible que 1 H, est encore moins sensible ; de plus, son abondance naturelle n’est que de 1%.
15 N et 2 H ont des ã respectivement 10 fois et 6,5 fois plus faibles que 1 H, et nécessitent tous deux un enrichissement
du lipide.
6

La RMN est une technique spectroscopique qui utilise les propriétés physiques de la matière placée dans
un champ magnétique non nul. Une description correcte en est faite au niveau quantique, et montre que, pour
des noyaux atomiques possédant un moment magnétique (donc de spin non nul), le champ magnétique, que
l’on notera par la suite B d 0 , lève la dégénérescence des niveaux énergétiques. Cet effet Zeeman se traduit par
un Hamiltonien : H Z
= −γ B 0
I z
, où I z est l’opérateur de spin en projection sur l’axe z, par définition
confondu avec l’axe du champ B o . e
Toutes les autres interactions que peut subir le noyau considéré se traduisent par un Hamiltonien qui est
une perturbation au premier ordre de l’Hamiltonien Zeeman. Ce sont ces interactions qui sont intéressantes,
car elles expliquent la forme des raies d’absorption, leur déplacement, leur dédoublement ou leur
élargissement. Elles se traduisent localement par des fluctuations du champ magnétique ressenti par le
noyau.
Faisons brièvement un inventaire des Hamiltoniens que l’on doit considérer pour notre système. Les
expériences étant menées sur le 31 P, on ne s’intéresse qu’aux spins ½.
• déplacement chimique : sous l’influence du champ B 0 , le nuage électronique génère un champ local
autour du noyau de 31 P. Dans un cas isotrope (RMN liquide), ce champ local est proportionnel à B 0 , avec
une constante de proportionnalité σ de l’ordre de 10 -6 (c’est la constante d’écran). Ici il faut multiplier B 0
non plus par un scalaire, mais par un tenseur de rang 2, i.e. par une matrice 3x3, notée $σ , le tenseur
d’anisotropie du déplacement chimique. Alors on a H CS
= γ I $σB0 f .
• interaction dipolaire : lorsque deux noyaux i et j sont couplés par une interaction dipolaire, leur
Hamiltonien d’interaction se note : H D
= I D $ I ; D $ est le tenseur d’interaction dipolaire.
i
j
• interaction scalaire : de même lorsque deux noyaux i et j sont couplés scalairement, on a un tenseur
d’interaction scalaire J $ , et un Hamiltonien : H S
= I J $ I .
• interaction quadrupolaire : elle n’apparaît que pour des noyaux de spins plus grands que 1, donc on
la mentionnera sans la développer par la suite.
C. La RMN en bande large du 31 P dans les phospholipides
1. Les interactions dominantes
Toutes les interactions précédentes ne sont plus à considérer lorsque l’on s’intéresse au 31 P dans les
phospholipides.
• couplages homonucléaires : il n’y a qu’un 31 P par phospholipide, donc il n’y a pas de couplage scalaire
homonucléaire 31 P- 31 P. Il pourrait y avoir un couplage dipolaire 31 P- 31 P, mais la diffusion latérale rapide (10 5 -
10 9 Hz) des lipides au sein de la membrane empêche ce couplage d’être efficace (Warschawski, 1995).
i
j
d On note les vecteurs en gras.
e On remarquera que les Hamiltoniens seront dans la suite donnés à un facteur h près, i.e ils sont associés à une
pulsation ω = E / h et non plus à une énergie.
f CS pour Chemical Shift
7

• couplages hétéronucléaires : les couplages hétéronucléaires significatifs ne se font qu’entre 31 P et 1 H,
car les autres noyaux présents ( 13 C voire 15 N) ont une abondance négligeable dans des lipides non marqués.
Le couplage scalaire proton-phosphore est de l’ordre d’une dizaine de Hz. On verra que cette valeur est trop
faible pour être appréciable sur un spectre.
Le seul couplage à prendre en compte est donc le couplage dipolaire hétéronucléaire 31 P- 1 H. La constante
de couplage associée reportée dans la littérature (Dufourc, 1986) varie de 1 à 5 kHz selon la liberté de
mouvement de la tête polaire contenant le groupe phosphate. Cette constante est bien sûr indépendante du
champ B 0 .
• anisotropie du déplacement chimique (en anglais CSA pour Chemical Shift Anisotropy) : c’est
l’interaction prédominante, qui explique les profils des spectres statiques. On verra dans le paragraphe
suivant que cette anisotropie a une valeur typique de moins de 200 ppm, soit, sur un spectromètre 400 MHz g ,
un écart en fréquence d’en général une dizaine de kHz, et 30 kHz maximum. Ainsi le couplage dipolaire 31 P-
1 H, même plus faible, n’est pas vraiment négligeable y compris à haut champ. On peut annuler ses effets par
un simple découplage du proton, consistant en une irradiation simultanée en large bande (Cullis & de Kruyff,
1976). Dans la pratique, on constate toutefois qu’il n’y a pas d’incidence flagrante sur la forme du spectre
statique avec ou sans découplage, si ce n’est des épaulements moins marqués, et par conséquent on négligera
dans la suite le couplage dipolaire hétéronucléaire, pour se concentrer principalement sur le CSA et ses effets.
2. CSA et profil de raie
Le développement suivant peut être passé pour en arriver au résultat final. Des précisions pourront être
trouvées dans l'ouvrage de Schmidt-Rohr et Spiess (1994), ainsi que dans la thèse de E. Dufourc (1986). Sur
ce point, ces deux ouvrages reprennent les résultats initialement exposés par Seelig (Seelig, 1978). Le but est
ici d'expliquer la forme des spectres statiques en 31 P pour les principales phases lipidiques.
Dans un repère lié au groupement phosphate, et appelé le système d'axes principaux (abrégé PAS en anglais, pour
Principal Axis System) la partie symétrique du tenseur d'anisotropie du déplacement chimique peut être diagonalisée:
$σ
PAS
⎛σ
xx
0 0 ⎞
⎜
⎟
= ⎜ 0 σ
yy
0 ⎟
⎜
⎝ 0 0 σ
⎟
⎠
Le fait que les 3 termes diagonaux soient différents traduit l'anisotropie de cette interaction, qui dépend de l'orientation ;
typiquement on donne: σ xx =-80ppm, σ yy =-25ppm et σ zz =+110ppm (Seelig, 1978).
Posons B 0 =B 0 k ; k est le vecteur unitaire orienté selon l'axe du champ. Soit ω = − 0
γ B 0
la pulsation de Larmor.
L'Hamiltonien de déplacement chimique s'écrit: H CS
= ω CS
I z
t
La pulsation de précession due au déplacement chimique peut s'exprimer par: ω = −ω 0
kσ$ k ; c'est donc une
forme bilinéaire symétrique. De ce fait, on ne tient compte dans son calcul que de $σ PAS , la partie symétrique de $σ , qui
est diagonale dans le système d'axes principaux. La partie antisymétrique du tenseur donne, quant à elle, une
contribution nulle.
zz
CS
g 400 MHz est la fréquence de résonance du proton. Cela correspond à un champ de 9,4 T environ, et à une fréquence de
résonance en phosphore de 162 MHz (γ Η /γ P 2,5).
8

Si l'on se place dans le repère PAS, k peut être exprimé au moyen de ses coordonnées polaires (θ, φ), et on a:
2 2 2
[ (cosφsin θ) (sinφsin θ) (cos θ)
]
ω = ω σ + σ + σ
CS 0 xx yy zz
(ω CS dépend de θ et φ donc dépend bien de l'orientation de chaque molécule)
1
On fait alors intervenir la partie isotrope du tenseur, définie par 1/3 de sa trace: σiso = σ
xx
+ σ
yy
+ σzz
3 ( ) ,
et on la soustrait aux valeurs principales pour définir: σ = σ − σ iso
(α=x, y ou z)
α
Le résultat du calcul est une expression de la pulsation associée au CSA, en fonction des angles θ et φ. Elle fait
intervenir deux paramètres:
η σ σ y
−
x
= est le paramètre d'asymétrie
σz
δ = −ω 0
σ z
est le paramètre d'anisotropie.
De simples relations trigonométriques conduisent au résultat suivant (Schmidt-Rohr & Spiess, 1994):
αα
ω
CS
δ
= ωiso
+ [ θ − − η θ φ ]
2 3 2 1 2
cos sin cos( 2 ) (1)
Mais on travaille avec des objets dont la symétrie n'est pas quelconque: en effet, la rotation rapide des
phospholipides autour d'un axe normal à la bicouche entraîne une symétrie axiale du tenseur de CSA dans un repère B
lié à la bicouche (i.e. η=0). Dans ce repère B, ce tenseur s'écrit :
σ$
B =
⎛σ
⎞
⊥
0 0
⎜
⎟
⎜ 0 σ
⊥
0 ⎟
⎜
⎝ 0 0 σ
⎟
⎠
La direction de référence est ici n, la normale à la bicouche qui est aussi l'axe moyenné du phospholipide.
Les deux tenseurs diagonaux $σ PAS et $σ B peuvent être reliés au moyen d'un changement de bases faisant intervenir des
matrices de transformation d'angles d'Euler. Par conservation de la trace lors d'un changement de base, on a notamment:
σ = 1
iso
σ +
3 ( 2
⊥
σ/ /)
.
En développant ce changement de bases, l'expression précédente de ω CS (équation (1)) peut être finalement transformée
en un dernier résultat (Seelig, 1978), ne faisant plus intervenir que l'angle β entre les directions n et k.
2
⎡ 2 3cos
β − 1 ⎤
ω
CS
( β) = −ω 0 ⎢1
− σiso
− ∆σ(
) ⎥
⎣ 3 2 ⎦
∆σ est l'anisotropie du déplacement chimique, définie par ∆σ = σ //
− σ ⊥
.
On note ω = −ω ( − σ ) la pulsation isotrope, qui correspondrait au cas de la RMN liquide, et
iso
0 1
iso
/ /
∆ω = 2 CSA
ω ∆σ
3 0 le facteur d'anisotropie (qui est égal à δ). Alors on a simplement:
β −
ω
CS
= ωiso + ∆ ω
CSA( cos 2
3 1
)
2
(2)
Le résultat précédent fait apparaître une relation simple entre la pulsation de précession associée au CSA,
et l'angle β entre l'axe moyen du lipide (qui est aussi la normale à la bicouche) et l'axe du champ B 0 . On va
voir que ce résultat permet facilement de déduire l'allure du spectre large bande en 31 P d'un phospholipide,
selon la phase dans laquelle il se trouve. La figure 1.7 illustre les différents profils de raies théoriques
associés aux principales phases.
9

figure 1.7 : forme des spectres 31 P statiques pour des phospholipides dans différentes phases; une fréquence nulle
correspond à un déplacement chimique isotrope
(adapté d'après Dufourc, 1986)
Plaçons nous tout d'abord dans le cas d'une phase lamellaire. L'expression analytique des spectres (a) et
(b) de la figure 1.7 se déduit simplement de l'équation (2). Il faut pour cela comprendre que les normales n à
la bicouche sont distribuées dans l'espace d'une manière isotrope. En effet, ces bicouches forment des
vésicules multilamellaires, de forme sphérique. On doit alors calculer la probabilité dP pour un
phospholipide donné d'avoir un axe moyen incliné d'un angle β à dβ près par rapport à l'axe du champ.
1
On trouve facilement (Seelig, 1978) que : dP = d = p d
2 sin β β ( ω ) ω (c'est le calcul de l'angle solide
pour un cône de demi-angle au sommet β). p(ω), qui est la fonction de probabilité associée à la pulsation de
d(cos β)
résonance ω, vaut donc : p( ω)
= 1 . En tirant cosβ de l'équation (2), et en dérivant, on peut
2 dω
montrer que : p( ω)
=
1
6 3∆ω
CSA
ω
⊥
− ω
ω − ω
⊥
iso
. Cette fonction de probabilité est proportionnelle à la
hauteur du pic de pulsation ω. En convoluant cette fonction par une fonction lorentzienne (pour rendre
compte de la largeur de raie), on obtient un profil tel que celui du spectre 1.7 (a). Ce spectre présente une
singularité pour ω
= ω ⊥
. Il est fortement dissymétrique, et on dira de lui qu'il possède “un pic à droite”.
On peut par ailleurs remarquer sur la figure 1.7 que le spectre statique d'une phase lamellaire fluide L α ,
s'il présente la même asymétrie que celui d'une phase gel L β , puisqu'il s'agit également d'une phase
10

lamellaire, en diffère cependant sensiblement par la largeur : le spectre (b) est ainsi plus étroit que le spectre
(a). Des arguments que nous ne reporterons pas ici montrent que dans la phase fluide, l'ajout d'un
mouvement d'oscillations au mouvement de rotation entraîne une diminution des valeurs propres du tenseur
du CSA. Ainsi, l'anisotropie du déplacement chimique ∆σ est plus faible en phase fluide, et le spectre est plus
fin.
Considérons maintenant le cas d'une phase hexagonale. Les lipides y sont arrangés en monocouches
assemblées en forme de cylindres. Ces lipides diffusent rapidement autour de l'axe du cylindre, si bien que le
système cylindrique présente désormais une symétrie axiale. Les directions des axes des cylindres sont
isotropes. Pour un lipide dans un cylindre donné, on peut définir deux valeurs propres du tenseur
d'anisotropie: l'une, σ H / /
, correspond au cas où le cylindre a un axe colinéaire à B 0 ; l'autre, σ H ⊥
, au cas où
l'axe est normal à B 0 . Des considérations de symétrie permettent de démontrer que, en comparant à une phase
B
lamellaire fluide pour laquelle les valeurs propres sont notées σ / /
et σ ⊥ B , on a: σ
H
/ /
B
≈ σ ⊥
et
H 1 B B
σ⊥
≈ 2 ( σ⊥
+ σ
/ /
) . Le calcul complet est notamment présenté par Seelig (Seelig, 1978). Dans la phase
hexagonale, l'anisotropie apparente du déplacement chimique devient donc : ∆σ
= σ − σ ⊥
= −
∆σ
H H H 1 B
//
2 .
En clair, le spectre statique 31 P d'un lipide en phase hexagonale (1.7(c)) est inversé par rapport à celui d'une
phase lamellaire, et présente un CSA environ deux fois plus faible de celui d'un phase lamellaire fluide
(1.7(b)).
D. L’effet de la rotation
On n'a jusqu'à présent parlé que des spectres dits “statiques”, c'est à dire enregistrés pour un échantillon
immobile au cours du temps. Supposons maintenant que cet échantillon soit contenu dans un rotor tournant
autour de lui même, et dont la direction fasse avec la verticale du champ un angle bien déterminé h . Alors
expérimentalement on constate que, pour des vitesses de rotation suffisantes, le spectre du 31 P n'a plus
l'asymétrie si particulière du paragraphe précédent, mais est au contraire un spectre à haute résolution,
composé simplement d'une raie fine, comme pour le spectre 1.7(d).
Cette technique de RMN solide, appelée la rotation à l'angle magique (en anglais MAS pour Magic Angle
Spinning) permet de moyenner l'anisotropie du déplacement chimique à zéro. C'est une méthode artificielle
qui produit le même résultat que celui obtenu pour des micelles, et également de très petites vésicules, où le
CSA est moyenné “mécaniquement” du fait de leur faible temps de corrélation de rotation (τ c
surtout de la rapide diffusion de lipides à la surface.
1. Moyennage du CSA
≈ 1 ms ), et
Une explication simple de ce moyennage peut se faire ainsi : sous l'effet de la rotation du rotor autour de
lui même, toutes les molécules acquièrent une symétrie cylindrique, ou plutôt peuvent être remplacées par
une pseudo-molécule de symétrie cylindrique. Tous ces cylindres sont coaxiaux et leur axe commun fait un
angle, noté α, avec la verticale du champ; cette direction est également celle du rotor, et α est l'angle
h un schéma expérimental sera présenté au chapitre 2.
11

d'inclinaison du rotor par rapport à la verticale. Alors, la pulsation de résonance associée au 31 P de chaque
α
molécule est donnée, d'après l'expression (2) par: ω
CS
( α) ωiso ωCSA( cos 2
3 − 1
= + ∆
) . Le facteur
2
d'anisotropie ∆ω CSA
dépend de chaque molécule, car il “garde la trace” de la projection sur la pseudo-
2
molécule. Néanmoins, pour un angle α = α m
tel que 3cos α m
− 1 = 0 , on se débarrasse de cette
contribution, et ω
CS
= ω . On n'a plus alors qu'une raie fine, centrée sur le pic isotrope (comme si on était
iso
en RMN liquide, cf figure 1.7(d)). On dit que l'on a moyenné à zéro l'anisotropie du déplacement chimique.
1
L'angle α m
= arccos( ) ≈ 54°
44'
est appelé l'angle magique.
3
On ne rentrera pas dans la théorie du MAS, qui fait intervenir la mécanique quantique, et notamment la
théorie de l'Hamiltonien moyen, développée par Haeberlen (Haeberlen, 1968) puis Maricq et Waugh
(Maricq & Waugh, 1979).
On peut cependant comprendre aisément que pour chaque molécule, la pulsation de résonance du CSA
soit désormais dépendante du temps, et même périodique (de période la durée de révolution du rotor). Le
calcul de cette pulsation, reporté dans la suite, dérive de celui présenté au §C.2.
t
On a pu montrer (§C.2.) que la pulsation de résonance associée au CSA se calculait par :ω
CS
= −ω 0
kσ$ k . Dans
un repère fixe par rapport au rotor (qui tourne à la pulsation ω r ), le vecteur k a pour coordonnées :
⎡sinα
⎤ ⎡ ⎤
m
cos ω
rt
cos ωrt
⎢
⎥ 2 ⎢ ⎥
k = ⎢sinαm
sin ω
rt
⎥ = ⎢sin
ωrt
⎥ , tandis que le tenseur de l'anisotropie du déplacement chimique est
3
⎣
⎢ cosα
⎦
⎥ ⎢ 1 ⎥
m ⎣ 2 ⎦
( ij )
$σ = σ
1≤i,j
≤3 (il n'a pas de raison d'être diagonal dans le repère du rotor).
En développant le produit matriciel dans ce repère fixe par rapport au rotor, on fait apparaître
σ = ( iso
σ + σ + σ ) /
11 22 33
3 , et l'expression finale de ω CS en fonction du temps peut se mettre sous la forme :
ω ( t) = ω + C cos ω t + C cos 2ω t + S sin ω t + S sin 2 ω t (3)
CS iso 1 r 2 r 1 r 2
r
Les valeurs des coefficients C et S qui dépendent des σ ij sont reportées dans la littérature (Schmidt-Rohr & Spiess,
1994, p103). L'important est ici de faire apparaître la dépendance temporelle de la pulsation de résonance, qui est
périodique. Pour une vitesse de rotation grande devant la fréquence des interactions considérées, on peut moyenner
cette expression. Alors ω
CS
( t) = ω .
iso
2. Impulsions de 180° synchronisées avec la rotation
Supposons que notre échantillon tourne dans un rotor incliné à l'angle magique à une fréquence suffisante
pour moyenner les interactions inhomogènes comme le CSA. Alors la pulsation de précession associée à ce
CSA, calculée au paragraphe précédent, peut être schématiquement représentée par le schéma 1.8(a). On
comprend bien qu'en valeur moyenne ω
CS
( t) = ω .
iso
12

figure 1.8 : représentation schématique de la variation temporelle de ω CS −ω iso (a) en rotation à l'angle magique, à la
pulsation de rotation ω r =2π/t r ; (b) idem mais en appliquant 4 impulsions 180° synchronisées avec la rotation; la ligne
pointillée symbolise une valeur moyenne non nulle (adapté de Griffin, 1998).
Une technique utilisée pour réintroduire les interactions précédemment moyennées à zéro consiste à
appliquer à l'échantillon, durant sa rotation, une série d'impulsions radiofréquence 180° i . Cette technique,
initialement développée par Alla (Alla et al., 1978), a ensuite été réutilisée dans le but de construire des
spectres 2D de recouplage. La figure 1.9 permet de comprendre pourquoi on peut dire d’une impulsion 180°
qu’elle inverse le sens de précession de l'aimantation.
figure 1.9 : effet d’une impulsion 180° sur une aimantation qui précesse sous son déplacement chimique
(on ne considère pas la relaxation)
Par conséquent une impulsion 180° réintroduit le CSA qui avait été auparavant moyenné par le MAS. Le
CSA est ainsi recouplé. Pour plusieurs impulsions 180° par période, la valeur moyenne de cette interaction
est non nulle, comme le montre la figure 1.8 (b).
i
on rappelle qu'en RMN impulsionnelle, une impulsion 180° fait tourner l'aimantation d'un angle 180° dans le
référentiel tournant (i.e. elle la change en son opposée si elle est orthogonale à sa direction). Elle a une durée
τ = π / γ B 1
, pour un champ radiofréquence d'intensité Β 1 .
13

E. Le recouplage de l’anisotropie du déplacement chimique
1. Utilité de la technique de recouplage dans l’étude des lipides
Les paragraphes précédents ont tenté de mettre en évidence l’intérêt de la RMN du 31 P dans l’étude des
phospholipides, notamment dans les attributions de phases, ou dans les mesures de paramètres d’ordre. Mais,
comme cela apparaîtra dans la partie expérimentale, les quantifications de phases sont délicates dans le cas
de mélanges. Par ailleurs, la rotation à l’angle magique, en produisant des raies fines et de grande résolution,
est capable de “séparer” les lipides selon la valeur de leur déplacement chimique isotrope. Il est donc naturel
de tenter de leur appliquer les techniques dites de recouplage.
2. La méthode de Tycko
Parmi toutes les méthodes de recouplage (du CSA ou de l’interaction dipolaire) qui existent, la méthode
développée par Robert Tycko (Tycko et al., 1989) joue un rôle particulier, parce qu’en théorie, la dimension
indirecte du spectre (celle qui correspond à l’incrémentation de t 1 ) reproduit l’allure du spectre que l’on
obtiendrait pour un échantillon statique. Certaines méthodes donnent un profil non intuitif sur cette
dimension, qu’il faut ensuite simuler in silico pour en déduire les paramètres intéressants comme les
éléments du tenseur d’anisotropie j . Nous nous proposons d’expliquer comment la séquence d’impulsions
180° appliquées durant un tour de rotor permet de recoupler le CSA et d’obtenir un profil de raie identique à
un spectre statique, à un facteur d’échelle près. Pour cela, les résultats exposés au cours des paragraphes
précédents vont être utiles. Une description de cette technique se trouve dans l’article original de Tycko,
mais aussi dans l’ouvrage de Schmidt-Rohr et Spiess (Schmidt-Rohr & Spiess, 1994, pp 195-198).
Développée à l’origine sur un noyau de 13 C dans un sucre, cette méthode n’avait auparavant jamais été
appliquée au 31 P même dans les phospholipides, bien que le CSA soit pour eux d’une grande importance.
Tout au long de l’expérience, l’échantillon tourne à une fréquence élevée, de l’ordre de 5kHz, et il est
incliné à l’angle magique par rapport à la verticale . Sous l’effet de ce MAS, et d’après l’équation (3), la
pulsation de précession ω CS a pour expression (à la constante ω iso près, que l’on ne mentionnera plus par la
suite) : ω ( t) = C cos ω t + C cos 2ω t + S sin ω t + S sin 2 ω t . La valeur moyenne de ω CS sur une
CS 1 r 2 r 1 r 2
r
période de rotation est nulle, i.e. ω CS
( t) = 0. L’idée de base de la séquence décrite est d’appliquer un
nombre pair d’impulsions de 180° synchronisées avec la rotation, comme le détaille le paragraphe D.2, afin
de rendre cette valeur moyenne non nulle et proportionnelle au cas statique. Or si l’échantillon ne tournait
stat
pas, on aurait ω r =0, et donc ω CS
= C + C
1 2 .
Introduisons une fonction p(t), de module 1 et qui change de signe à chaque impulsion 180°. La
figure 1.10 détaille l’allure de cette fonction pour 4 impulsions 180°, dont la durée τ est supposée négligeable
devant t r .
j
C’est le cas des séquences de Bax (Bax, 1983, 2 impulsions 180° par rotation) ou de Yarim-Agaev (Yarim-Agaev,
1982, 6 impulsions 180° par rotation)
14

figure 1.10 : la fonction p(t) associée à une séquence d’impulsions de recouplage ;
les impulsions sont de 180°, et ont une durée τ supposée négligeable devant t r .
stat
.La proportionnalité imposée entre ω CS
( t) et ω CS
se traduit mathématiquement par la formule :
1 tr
stat
p t t dt
t
∫ ( ) ω
0
CS
( ) = χ ω
CS
(4)
r
En effet, la figure 1.9 montre comment une impulsion 180° fait changer de signe la fonction ω CS ; c’est ce
que traduit la fonction p(t). χ est le facteur d’échelle anisotrope.
L’équation (4) est en particulier satisfaite lorsque p(t) est une fonction paire, et que l’on a l’égalité
1
1
tr
t
2
0
r ∫0
∫
2 r
p( t)cos( ω t) dt = p( t)cos( 2ω
t)
dt . La fonction sinus étant impaire, la première condition annule
r
les termes en facteur des coefficients S ; une conséquence est que les impulsions sont symétriques par
rapport à une demi-révolution du rotor (cf. figure 1.10). Par ailleurs, la deuxième condition sur les termes en
facteur des coefficients C impose que ces intégrales valent 1 2
χt r
.
Or chacune de ces intégrales se calcule aisément sur l’intervalle [τ i , τ i+1 ], où la fonction p(t) et constante
et vaut ±1. Ainsi pour k valant 1 ou 2, et pour 2N impulsions 180° par période de rotation :
1
N
2 tr
τ 1
1
2 t
2
∫0 ∫0
∫ ∑
r n=
1
r
n
p( t)cos( k ωrt) dt = cos( k ω
rt) dt + ... + cos( k ωrt) dt = ( −1) sin( k ω
r
τn)
τ N
kω
N
n
1
et finalement la condition sur les intégrales se ramène à : ∑ ( −1) [sin( ω
r
τn) − sin( 2ω r
τ
n)]
= 0 (5)
2
Le résultat de ce calcul est une expression qui lie les inconnues τ i à ω r . Nous venons d’établir une
condition sur les délais entre les impulsions de 180° telle que, si elle est vérifiée, la valeur moyenne de la
pulsation de précession due au déplacement chimique soit proportionnelle à la pulsation statique. La
constante de proportionnalité est χ
180° par tour de rotor pour satisfaire cette équation. Il y a en particulier des solutions simples pour 4 et 6
15
n=
1
1 t r
= ∫ p ( t ) cos( ω t dt
t 0
r ) . En fait, on a oublié de faire intervenir le
r
déplacement isotrope ω iso , et le même calcul que précédemment démontrerait que le facteur d’échelle
isotrope est ξ =
1
t
r
∫
t r
p ( t ) dt .
0
stat
Alors ω ( t) = ξ ω + χ ω
(6)
CS iso CS
Il ne reste plus alors qu’à calculer les valeurs numériques qui vérifient l’équation (5). Dans son article,
R. Tycko dresse un tableau des résultats. Il y est notamment expliqué qu’il faut au minimum 4 impulsions

impulsions, dont l’une d’elle est très simple puisqu’elle n’utilise que 4 impulsions et donne un ξ=0. C’est
cette solution qui est généralement la plus employée, dans l’article original (Tycko et al., 1989) et y compris
par la suite (Gross et al., 1997). Ainsi pour ω
r
τ1 = 70. 9°
et ω
r
τ2 = 160. 9°
, on a les valeurs de ξ=0 et
surtout χ=0,393 (soit des durées typiques de τ 1 =39µs et τ 2 =89µs pour une fréquence de rotation de 5000Hz).
On est désormais en mesure de comprendre la séquence d’impulsions (le pulse program) nécessaire à
mettre en œuvre pour réaliser nos expériences de recouplage du CSA. Il s’agit bien sûr d’une séquence 2D,
avec un temps d’évolution t 1 selon la dimension indirecte, et un temps d’acquisition t 2 selon la dimension
directe. Cette séquence est illustrée sur la figure 1.11, et correspond à χ=0,393.
figure 1.11 : séquence d’impulsions du recouplage du CSA par la méthode de Tycko (Tycko et al., 1989), correspondant
à χ=0,393 et ξ=0 ; les phases sont les suivantes :
Φ 1 =Φ 2 =Φ 4 =(+x,-x,-x,+x,+y,-y,-y,+y) ; Φ 3 =(+y,-y,-y,+y,-x,+x,+x,-x,-y,+y,+y,-y,+x,-x,-x,+x)
En particulier, une des différences avec la séquence originale est que notre séquence ne nécessite pas de
transfert de polarisation par polarisation croisée pour amener l’aimantation transversale sur le 31 P. C’est une
conséquence de l’abondance naturelle du 31 P, ainsi que de son assez grand rapport gyromagnétique, qui
permettent de débuter directement la séquence par une impulsion de 90° sur le phosphore (à l’inverse de
Tycko en 13 C). Par ailleurs, le cyclage de phases, détaillé dans la légende de la figure 1.11, ne sera pas
expliqué ici. Nous mentionnerons simplement que son effet principal sur la dimension indirecte (recouplée,
donc large bande) est de rejeter aux deux extrémités du spectres les artefacts expérimentaux, ainsi que de
diminuer la sensibilité aux imperfections des impulsions qui ne seraient pas exactement de 180°, et nous
renverrons pour cela à l’article originel.
Enfin, on notera que l’on ne découple pas en 1 H pendant la période d’évolution t 1 . Cela a inévitablement
pour conséquence de recoupler également le couplage dipolaire proton-phosphore, donc la coupe obtenue
selon la dimension indirecte ne sera pas purement due au CSA recouplé. Mais il a été vu que le couplage
hétéronucléaire dipolaire était faible ; de plus, il y aurait des interférences entre les impulsions 31 P et 1 H, ce
qui rendrait le recouplage inefficace. Par contre le canal proton est systématiquement découplé du canal
phosphore durant t 2 , par l’application d’une onde continue.
Tout ceci doit nous permettre en théorie d’obtenir des spectres 2D où l’on sépare sur une dimension les
lipides selon leur spectre haute résolution, et où l’on lit leur spectre recouplé du CSA, i.e. leur spectre
statique multiplié par un facteur d’échelle, sur l’autre dimension. Ces spectres seront présentés et commentés
au chapitre 3, après avoir auparavant présenter les méthodes expérimentales et le matériel employé.
16

Chapitre 2
Matériels et méthodes
C
e chapitre a deux buts : (i) détailler les protocoles expérimentaux utilisés, principalement dans la
préparation des mélanges de lipides et dans l'obtention de fantômes blancs de globules rouges et
(ii) de décrire les appareils et les procédures de traitement du signal requis pour la réalisation de spectres
RMN du 31 P, qu'il s'agisse de spectres statiques, de spectres haute résolution ou de spectres 2D recouplés.
I. Préparation des échantillons
A. Les préparations de lipides hydratés
Tous les lipides utilisés sont commerciaux, et de marque Sigma. Les solvants utilisés (chloroforme,
méthanol et éthanol) sont de marque Sigma, d'une pureté pour analyse. L'eau lourde (D 2 O), fournie par le
CEA à Saclay, a une pureté de 99,8%.
Les expériences ont été menées sur plusieurs échantillons de lipides. Les premières mises au point
expérimentales se sont faites sur des lipides uniques. Nous avons ainsi commencé par réaliser des
échantillons de DMPC puis de DOPE. Pour ce faire, 100mg de phospholipides sont mélangés à 100µL de
D 2 O. Le mélange est homogénéisé par vortex, et la dissolution des lipides est assurée par alternance de 3
cycles de congélation à –10°C – décongélation à +60°C. On forme ainsi des vésicules multilamellaires
hydratées à 50%. Après centrifugation (10min à 10.000g), le culot ( 120µL d'une “pâte blanche”) est transféré
dans un rotor MAS.
Afin de modéliser un mélange biologique simple de lipides, nous avons également réalisé un mélange
ternaire, contenant proportionnellement environ 30% de DOPC, 40% de DOPE et 30% de cholestérol en
moles. L'homogénéité du mélange est assurée en dissolvant en tout 150mg de lipides dans 20mL de solvants
organiques (mélange chloroforme-méthanol 10:1). Après 3 cycles d'évaporation rotative sous vide puis
redissolution dans 10mL de solvant, 100mg de poudre (contenant les 3 lipides) sont prélevés et dissous dans
100µL d’un tampon 150mM KCl, 10mM Tris, 0,2mM EDTA, pH=7,2. La préparation des vésicules est alors
identique à celle précédemment exposée.
B. Les fantômes de globules rouges
Les échantillons de stromas sont préparés à partir d'un culot de globules rouges humains distribués par les
Établissements de Transfusion Sanguine de l'Assistance Publique/Hôpitaux de Paris. Il s’agissait d'un produit
âgé de trois jours au moment de la préparation, et non utilisable en transfusion pour cause de volume
insuffisant. La préparation de fantômes requiert deux tampons : un tampon de lavage A (145mM NaCl, 5mM
KCl, 5mM HEPES, 0,5mM MgSO 4 , pH=7,4) et un tampon d'hémolyse B (5mM HEPES, 1mM EDTA,
pH=8). Un maximum d'étapes sont effectuées à 4°C, donc en chambre froide ou dans la glace. 40mL de
globules rouges sont prélevés et lavés deux fois avec le tampon A. La centrifugation dure 15min à 25.000g.
17

On procède ensuite à la lyse osmotique en versant la fraction lavée dans 40 volumes du tampon B. On laisse
le mélange en agitation durant deux heures, avant de centrifuger le tout à 26.000g pendant 20min à 4°C. On
lave le culot de la sorte quatre autres fois, dans un volume de tampon B à chaque fois. Après la première
centrifugation, il faut enlever le “red button” rouge foncé (sous le culot), qui contient des protéases. On
récupère finalement un liquide blanc visqueux, constitué des membranes percées séparées de l'hémoglobine :
c'est le stroma. Pour concentrer l'échantillon en vue d'améliorer la qualité des spectres, il convient de lui faire
subir une ultra-centrifugation à 100.000g pendant 10min à 4°C. On peut alors remplir le rotor avec un
volume de 120µL environ.
II. Utilisation de l’appareil de RMN
A. Description du matériel
Le spectromètre utilisé est un spectromètre de marque Bruker, modèle DMX 400 WB. Il s'agit d'un
spectromètre à large trou, dont la fréquence de résonance en proton est 400,13 MHz (et en 31 P : 161,9 MHz).
Son champ statique a une valeur de 9,4T. La sonde qui l'équipe est une sonde-MAS 4mm à 2 canaux, un
canal proton et un canal accordable “large bande”, de marque Bruker. Le rotor en zirconium a un diamètre
de 4mm, une hauteur de 1cm et est fermé par un bouchon à ailettes en Kel-F. Son volume est de 120µL. Sa
rotation à l'angle magique est assurée au moyen d'une unité pneumatique qui délivre deux flux d'air, comme
l'illustre la figure 2.1.
figure 2.1 : schéma de principe d'une sonde MAS; sur une sonde Bruker, le “drive” arrive en haut car c'est le bouchon
qui possède des pales.
La vitesse de rotation est contrôlée par stroboscopie, et est constante à moins de 1% près sur une durée de
plus de 10 heures. La température de l'échantillon est maintenue constante au moyen d'une résistance
chauffante qui règle la température du gaz de lévitation (“bearing”).
L'ensemble du spectromètre est piloté par une station Indy Silicon Graphics, reliée à une console Bruker
Avance 400.
18

B. Mise en œuvre des spectres de RMN
Le matériel décrit précédemment permet de réaliser les différents types de spectres du 31 P mis en œuvre
expérimentalement : spectres haute résolution en MAS, spectres statiques et surtout spectres 2D recouplés.
Avec les caractéristiques propres au matériel, les durées des impulsions 90° sont typiquement de 4,5 à
5,5µs pour 31 P, et de 9 à 10µs pour 1 H. Pour les spectres découplés sur le canal proton pendant l’acquisition,
cela assure un découplage de 25kHz environ.
La réalisation de spectres statiques (sans faire tourner le rotor) se fait paradoxalement au moyen de la
sonde MAS (qui possède un meilleur facteur de qualité qu'une sonde liquide), mais, comme il n'est pas
possible de réguler la température si l'on n'envoie pas d'air, il faut pour cela démonter la sonde pour y
bloquer le rotor au moyen d'un papier de Parafilm. On peut alors souffler de l'air chaud sans faire tourner le
rotor. De plus, il faut adapter pour ces spectres statiques une séquence d’impulsions avec écho en 31 P. La
décroissance du FID étant très rapide, on “récupère” les premiers points en refocalisant l’aimantation au
moyen d’une impulsion de 180°. Il faut pour cela étalonner au préalable la durée de cette impulsion. Le canal
proton est découplé pendant l’acquisition.
Les spectres 2D recouplés sont mis en œuvre avec des paramètres qui peuvent différer légèrement d’une
expérience à l’autre. Généralement les durées des expériences sont de 3 heures 30 avec 64 scans. Pour les
fantômes de globules rouges, il faut passer à 16 heures avec 256 scans.
19

Chapitre 3
Résultats et discussion
C
e chapitre a pour but d'exposer et de commenter une partie des résultats obtenus durant les cinq
mois de manipulations expérimentales, celle qui va à l'appui de la partie théorique développée au
chapitre 1. Pour une bonne compréhension du déroulement du stage, nous nous efforcerons de présenter ces
résultats dans un ordre chronologique, qui reflète le mieux la démarche suivie.
I. Mise au point sur un lipide, la DMPC
Afin de mettre en application les techniques développées précédemment, et notamment de tester
l’efficacité de la méthode de recouplage, il nous est tout d’abord apparu nécessaire de nous intéresser à un
cas simple et bien décrit dans la littérature. La DMPC est connue pour présenter une transition de phase à
23°C, entre une phase lamellaire gel (L β ) à basse température et une phase lamellaire fluide (L α ) à haute
température. On doit donc s’attendre à deux observations sur les spectres statiques du 31 P de la DMPC : ils
doivent avoir une asymétrie caractéristique (un “pic à droite”), et se rétrécir sensiblement lorsque l’on passe
au dessus de la température de transition (cf. chapitre 1, figure 1.7). Normalement, les mêmes observations
doivent être faites sur une coupe longitudinale (selon la dimension indirecte) d’un spectre 2D recouplé de
DMPC.
figure 3.1 : spectres statiques du 31 P de la DMPC (a) à 10°C, en phase gel ; (b) à 30°C , en phase fluide.
Les spectres sont réalisés avec un écho, et découplés du 1 H pendant l’acquisition.
La figure 3.1 reproduit les spectres statiques (sans rotation de l’échantillon) obtenus pour la DMPC à
10°C (a) et à 30°C (b). La différence d’anisotropie entre les deux phases est aisément quantifiable. Les CSA
des phases gel et fluide (les écartements des raies ∆σ) ont des valeurs expérimentales de 75 ppm et 55 ppm
respectivement, soit environ 12kHz et 9kHz. Le rétrécissement du spectre observé en chauffant est d’environ
25%, et l’asymétrie est nettement marquée dans les deux cas. Nous pouvions donc nous demander si la
20

otation à l’angle magique de l’échantillon, assortie de la séquence développée au chapitre 1, permettraient
d’obtenir des résultats comparables. Bien sûr, l’utilisation d’une telle méthode n’a ici qu’un intérêt formel,
puisque la DMPC est le seul lipide présent et qu’il n’y a pas de nécessité à faire apparaître une dimension
supplémentaire au spectre. Mais par ailleurs, la réalisation de ces spectres a été l’occasion d’optimiser leurs
nombreux paramètres.
La figure 3.2 représente le spectre de recouplage obtenu avec la séquence de Tycko adaptée, pour un
facteur d’échelle anisotrope de 0,393 (et un facteur d’échelle isotrope nul), à une vitesse de rotation de
figure 3.2 : spectre 2D de recouplage réalisé sur la DMPC à
10°C ; la vitesse de rotation est de 5kHz, et la séquence
correspond à χ=0,393
5000Hz. Le spectre est reproduit sans être recadré.
Les courbes de niveaux sont d’intensité croissante
vers le centre du spectre. L’axe des abscisses
(dimension directe, haute résolution à 5000Hz) est
gradué en ppm, alors que l’axe des ordonnées
(dimension indirecte recouplée) est gradué en Hz.
On voit ainsi que la fenêtre spectrale dans la
dimension indirecte est égale à la fréquence de
rotation en Hz a . La DMPC (ou plus simplement la
PC) a un déplacement chimique isotrope calibré
par référence à 0 ppm.
Ce spectre met notamment en évidence
l’efficacité de notre séquence dans la dimension
directe, toute l’intensité étant concentrée dans une
bande relativement fine. Par ailleurs, le cyclage de
phase a effectivement pour conséquence de rejeter
les artefacts à l’extérieur de la dimension
recouplée (ce sont les deux “pics” à
ω
/ 2π
= ± 2500Hz ).
De tels spectres ont été réalisés à différentes
températures (10°C et 30°C principalement). En
coupant le spectre 3.2 longitudinalement (i.e en
suivant l’axe de la bande fine et en passant par son maximum), on peut extraire les profils de raies recouplés
de la DMPC. La figure 3.3 (en page suivante) dresse la comparaison entre ces profils à 10°C (a), et à 30°C
(b), pour un facteur d’échelle anisotrope de 0,2 , et en tournant à 5kHz. L’axe est désormais gradué en ppm.
A nouveau deux points sont à discuter : l’asymétrie et la largeur des profils de raies. Il est clair que les
coupes dans la dimension recouplée ne présentent pas la forme canonique des spectres statiques. On
entrevoit ainsi déjà une faiblesse de la séquence choisie. Les raisons en sont multiples, au premier rang
desquelles se trouve la limitation intrinsèque de la résolution dans cette dimension.
a La séquence échantillonne un point toutes les 200µs (=2π/ω r ), et ce dwell time est l’inverse de la fenêtre spectrale.
21

Néanmoins on reconnaît dans les deux spectres proposés une asymétrie lamellaire, même si le pic à droite
est fortement “aplati”. Par ailleurs, comme pour les spectres statiques, le passage de 10°C à 30°C
s’accompagne d’un rétrécissement de 20% également, qui marque la transition gel-fluide. Enfin,
l’anisotropie du déplacement chimique peut être mesurée dans chacune des phases; on mesure
respectivement 14 ppm et 11 ppm pour les phases gel et fluide, qu’il faut diviser par le facteur d’échelle 0,2.
On arrive à des résultats (respectivement 70 et 55 ppm) très proches de ceux mesurés en statique, et
cohérents avec la littérature.
figure 3.3: coupes longitudinales d’un spectre de recouplage de la DMPC
(a) à 10°C, (b) à 30°C; ω r /2π=5kHz, χ=0,2
Mentionnons pour finir que la réalisation de ces premiers spectres de recouplage sur la DMPC, ainsi que
d’autres sur la DOPE, mais qui ne seront pas reportés ici, nous a permis d’optimiser des paramètres de
traitement des données, mais également des valeurs importantes comme la vitesse de rotation du MAS. Trop
rapide, on perd en résolution en ayant une trop grande fenêtre spectrale, et la durée τ des impulsions 180°
devient non négligeable devant τ r (Ishii & Terao, 1998). Trop lente, on ne peut plus loger le spectre dans la
fenêtre. Il est alors apparu optimal de tourner à une vitesse de 5kHz, qui est également la fréquence de
rotation employée par Tycko. Mais toute adaptation est envisageable, puique ω r et χ peuvent être modulés en
fonction du CSA donc de la molécule
II. Les résultats sur le mélange ternaire
Les expériences précédentes nous ont permis de faire déjà quelques remarques intéressantes concernant
notre séquence de recouplage. Mais elles n’ont jusqu’à présent pas démontré leur capacité à séparer les
phospholipides selon leur tête polaire. Par ailleurs, il n’a pas encore été observé de phase hexagonale, tant en
statique que sur un spectre recouplé.
Notre deuxième échantillon a donc été un mélange ternaire DOPC/DOPE/cholestérol, en pourcentage
d’environ 30/40/30 en moles. C’est l’un des seuls décrits dans la littérature comme possédant une
coexistence lamellaire-hexagonal à une température accessible au sein d’un spectromètre (Moran & Janes,
1998, Tilcock et al., 1982). Comme pour la PC seule, la première étude se fait en statique, afin d’observer la
transition de phase. Les résultats sont reportés sur la figure 3.4 par une évolution en température du profil de
raies.
Ces spectres sont en tous points comparables avec ceux de Janes (Moran & Janes, 1998), bien que notre
mélange ait une composition légèrement différente. Bien sûr pour un mélange, on pourrait établir un
22

diagramme binaire, ce qui explique que chaque phospholipide passe progressivement d’une phase lamellaire
fluide (a) à une symétrie hexagonale (d). On remarque qu’à une température de coexistence des phases, le
spectre ne peut pas aisément être décomposé en la somme de ses composantes. La PC ayant un plus grand
∆σ que la PE (Cevc, 1993) b , et leurs déplacements chimiques isotropes étant respectivement 0 et 0,6 ppm,
on peut attribuer les raies comme le montre la figure 3.4.
figure 3.4: évolution des spectres statiques du mélange ternaire avec la température;
le spectre (a) a été augmenté d’un facteur 2.
Avant de comparer ces résultats avec les coupes longitudinales effectuées sur un spectre de recouplage du
mélange ternaire, présentons l’un de ces spectres. La figure 3.5 en page suivante reproduit un grossissement
du spectre obtenu pour un facteur d’échelle de 0,393 , à 37°C. On y distingue nettement les deux bandes
séparées associées à la PC (0 ppm) et à la PE (0,6 ppm). Sur de tels spectres on peut extraire les coupes
longitudinales pour chacun des phospholipides, à différentes températures. Les évolutions en fonction de la
température sont retracées sur la figure 3.7. La dimension directe du spectre 3.5 est nettement résolue. La PC
et la PE ont des déplacements chimiques suffisament différents (0,6 ppm d’écart seulement) pour donner
naissance à deux bandes parallèles mais distinctes. Cela est confirmé par la coupe transversale de ces bandes,
reproduite en figure 3.6, et qui est superposable à un simple spectre MAS à 5000Hz. De plus, comme le
montrent les coupes 3.7, ces bandes ont bien l’asymétrie attendue en fonction de la phase lipidique. La PE
est plus proche des formes canoniques. Mais dans les deux cas, la symétrie hexagonale n’a pas un CSA
moitié plus faible que celui d’une phase lamellaire. Le rétrécissement est visible, mais pas quantitatif.
b c’est ce que met en évidence l’astérisque sur le spectre 3.4(a).
23

figure 3.5: gros plan d’un spectre de recouplage du
mélange ternaire DOPE/DOPC/cholestérol à 37°C;
ω r /2π=5kHz, χ=0,393
figure 3.6: superpositon d’un spectre MAS à 5000Hz
(a) et de la coupe transversale du spectre 3.5 selon la
dimension directe (b), pour le mélange ternaire à 37°C
figure 3.7: coupes longitudinales de spectres de recouplage du mélange ternaire; seule la température varie;
ω r /2π=5kHz ; χ=0,393
24

III. Discussion des résultats précédents
Ces quelques résultats nous suffiraient presque pour commenter les avantages et les limites de notre
technique de recouplage. Alors qu’un spectre statique comme le 3.4(c) ne permet pas de déduire la
proportion de lipide dans chaque phase pour un point au milieu du fuseau (sur le diagramme de phases), une
technique comme celle du recouplage sépare effectivement nos deux lipides en leur associant un profil de
raies cohérent. Il n’en reste pas moins que ce profil n’est pas (encore!) d’une précision suffisante pour
permettre d’attribuer des proportions à chaque lipide dans chaque phase. En théorie, le spectre 3.4(b) devrait
par exemple être la somme des deux spectres 3.7(b). Les explications à ces limitations sont multiples.
– D’abord, on a vu au chapitre 1 que l’on recouplait également l’interaction dipolaire hétéronucléaire. On
ne doit donc pas s’attendre à obtenir des spectres aussi asymétriques que des spectres statiques. Un
découplage continu durant la séquence s’est avéré infructueux, probablement en raison d’interférences avec
le recouplage. Il faudrait sans doute tenter de découpler par des impulsions de 180° centrées au milieu de la
séquence.
– De plus, les paramètres de l’expérience sont encore perfectibles. L’impulsion de 180°, notamment, n’est
pas idéale, au sens où elle n’est pas parfaitement carrée, pas parfaitement instantanée (τ ≈ 11 µ s non
négligeable devant τ = 200 µ s ) ou pas parfaitement reproductible. De même, les délais ne sont peut-être
r
pas assez précis ou reproductibles et la fréquence de rotation peut légèrement varier au cours de
l’expérience. Bref, on le voit, les causes techniques sont multiples pour justifier que l’expérience peut
encore être améliorée.
IV. Une extension à un système biologique : les fantômes de globules
rouges
Il s’est néanmoins avéré intéressant de tester cette expérience sur un échantillon biologique, en
l’occurrence des membranes d’érythrocytes isolées au sein de stromas. Si l’on ne doit vraisemblablement pas
s’attendre à identifier des phases lipidiques au moyen des coupes de leurs spectres de recouplage, la diversité
lipidique de la membrane naturelle et sa faible concentration dans notre échantillon posaient la question de la
résolution dans la dimension directe, et notamment du rapport signal/bruit. Il est à ce titre intéressant de noter
que, pour être interprétable, un spectre 2D de recouplage sur les stromas doit durer 16 heures au lieu de
3 heures 30 pour le mélange ternaire. Un gros plan de ce spectre, obtenu à une température de 30°C, et pour
un facteur d’échelle anisotrope de 0,393, est reproduit sur la figure 3.8. Comme on l’a souligné au chapitre 1,
tableau 1.6, la membrane des érythrocytes recèle de nombreux lipides possédant un atome de phosphore.
Outre les phospholipides “classiques”, on compte notamment la sphingomyéline (SM), dont le déplacement
chimique isotrope vaut 0,6 ppm (comme la PE) (Warschawski, 1995). Une première vue sur le spectre 3.8
nous indique déjà que la séquence de recouplage nous assure une résolution dans la direction directe
suffisante pour distinguer plusieurs bandes recouplées. La figure 3.9, qui représente la coupe transversale du
spectre 2D pour une fréquence de 0Hz, corrobore ce fait. Pour cela, on le superpose avec un simple spectre
MAS-haute résolution à 5000Hz, ramené au même bruit. Le petit pic dû à la PS, à 0,15 ppm, déjà
difficilement discernable sur un spectre haute résolution, est invisible en recouplage, tant sur une coupe que
25

sur la 2D. Le reste des spectres diffère peu.
L’attribution des bandes se fait donc telle
qu’elle est précisée sur le spectre 3.8: la PC à
0 ppm, la PE et la SM à 0.6 ppm.
Les coupes longitudinales associées sont
détaillées sur la figure 3.10. L’asymétrie y
est difficile à interpréter, surtout pour la PC,
qui semble osciller. Il s’agit de résultats
préliminaires récents, et des études plus
systématiques doivent être engagées. Il faut
néanmoins souligner le fait que notre
séquence de recouplage est capable de
séparer les lipides même en concentrations
biologiques.
figure 3.8 : gros plan du spectre de recouplage obtenu avec des
fantômes de globules rouges, à 30°C;
ω r /2π=5kHz, χ=0,393
figure 3.9 : superposition d’un spectre MAS à 5000Hz
(a) et de la coupe transversale (b) du spectre 3.7 selon
la dimension directe, pour des fantômes de globules
rouges à 30°C; les spectres sont ramenés au même bruit
figure 3.10 : coupes longitudinales du spectre de
recouplage 3.7, selon la dimension indirecte, (a) à
0,6 ppm, (b) à 0 ppm, pour des fantômes de globules
rouges à 30°C
26

Conclusions et perspectives
S
i ce mémoire peut paraître volumineux, c’est qu’il avait tout d’abord pour ambition de faire
comprendre une technique qui fait appel à de nombreux aspects de la RMN. Il fallait également
situer le problème dans son environnement biologique, celui de l’étude des membranes et plus
particulièrement des phases lipidiques.
La technique développée, le recouplage de l’anisotropie du déplacement chimique, déjà employée pour
des affinements de structures protéiques par exemple, peut ou pourra se révéler d’une grande utilité dans
l’étude des lipides. En principe elle permet de compléter les informations fournies par la simple RMN
statique en étant capable de séparer les phospholipides selon leur tête polaire dans une des dimensions d’un
spectre 2D, y compris sur des échantillons biologiques. Il a été vu que la deuxième dimension, censée
refléter la phase lipidique par un spectre proportionnel au spectre statique, montrait des problèmes de
résolution, particulièrement pour des échantillons complexes. On peut cependant raisonnablement croire que
des améliorations techniques de l’ordre de celles que nous avons menées durant ce stage seront à même de
régler certains de ces problèmes : on peut ajouter à la séquence un découplage pendant t 1 , on peut tenter de la
mettre en œuvre sur une sonde plus performante, ou avec des amplificateurs plus puissants.
Ce travail s’inscrit par ailleurs dans une problématique plus vaste que celle du polymorphisme. Le
recouplage pourrait s’avérer un outil intéressant pour mettre en évidence l’existence de zones rigides au sein
des membranes biologiques. La conception de la membrane en terme de “mosaïque fluide” due à Singer et
Nicholson (Singer & Nicholson, 1972) a ainsi récemment évoluée. On aurait désormais plutôt tendance à
l’interpréter en termes de “radeaux” (“rafts”) rigides, associant des sphingolipides et du cholestérol, et qui
“flotteraient” au sein de la bicouche fluide (Simons & Ikonen, 1997). Ces domaines rigides (Glaser, 1993) se
formeraient préférentiellement à proximité de protéines spécifiques (Denisov et al., 1998). S’ils impliquent
majoritairement un certain lipide, on peut espérer mettre en évidence sa rigidité sur des spectres tels que ceux
que nous avons réalisés. Il faut au préalable perfectionner cette méthode, voire envisager de la comparer à
une autre méthode de recouplage. Il est enfin intéressant de noter que les techniques de recouplage ne sont
pas limitées au CSA, pas plus qu’au 31 P. Lorsque c’est l’interaction dipolaire qui est recouplée, et parce que
cette interaction dépend de la distance internucléaire, le recouplage permet de mesurer des distances entre
résidus dans des protéines. Ainsi, les méthodes R 2 (Rotational Resonance) et REDOR (Rotational Echo
Double Resonance) sont des méthodes de choix dans le raffinement des structures protéiques (Warschawski
et al., 1998). Une méthode de recouplage a par ailleurs déjà été appliquée à des lipides, mais il s’agissait de
recoupler l’interaction dipolaire entre 1 H et 13 C (Gross et al., 1997).
27

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94
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editor, 5 : 3015-3022
28

Annexe 1
Les principaux lipides membranaires
♦ Phosphoglycérides
• diacylphosphoglycérides
• plasmalogènes
♦ Diacylglycéroglycérides
♦ Sphingolipides
• céramides
O
H 2
O C
O CH
O
O C O P O
H 2
_
O
H 2
O C
O CH
O
O C O P O
H 2
_
O
O
H 2
O C
O CH
X
X
O C O sucre
H 2
OH
OH
• sphingophospholipides*
(*sphingomyéline SM : X=choline)
• sphingoglycolipides
♦ Stérols
• cholestérol
NH
O
OH
O
O P O X
NH O _
O
OH
O sucre
NH
O
HO
Les têtes polaires X sont détaillées au chapitre 1, figure 1.2
29