Utilisation des Microorganismes - Institut de biologie physico-chimique

Biotechnologie : Terminologie introduite en 1913 Karl Ereky (Ingénieur agricole Hongrois)
Il voulait développer la production agricole pour en faire une matière première pour la
production industrielle de molécules par les méthodologies BIOCHIMIQUES naissantes
Mise en œuvre de matériel biologique pour la production de biens et ou de services
Avantages des microorganismes :
Multiplication rapide -> bonne rentabilité des infrastructures
Se développent sur des nutriments renouvelables
Grande diversité métabolique : peuvent être utilisées pour produire beaucoup de molécules
Peuvent être adaptés à des objectifs productivistes : sélection, génie génétique, transgènèse
Peuvent produire des molécules étrangères (clonage)
Facile à cultiver, croissance rapide -> peu de risque de contamination
Facilité de purification des molécules produites
Production à température modérées (énergétiquement économe)

Historique
Méthodes ancestrale utilisées depuis le début de l’humanité pour la fabrication de fromages, de pain et de
boissons alcoolisées.
Pratiques empiriques « magiques » qui permettaient de conserver les aliments (fermentation, vinification…)
Des microorganismes alors complètement méconnus étaient à l’œuvre
Cette phase de proto-biotechnologie (empirique) a duré jusqu’au XIX siècle
C’est à dire, l’époque « pastorienne » de la découverte des microorganismes et de leur caractérisation
Quelques points de repères :
Sélection des espèces végétales et animales pratiquées des l’antiquité
Distillation XV ème siècle
Culture des champignons XVII Siècle
Préparation industrielle du sucre de betterave (XVIIéme siécle)
Préparation de molécules à capacités pharmacologiques (XVII éme siécle)
XVIII siècle essor de la chimie : Lavoisier (respiration, photosynthèse fermentations) Chaptal (vinification)
Berzelius (la catalyse), purification de la première « diastase » (amylase)
Pasteur : nature biologique de la fermentation et rôle des microorganismes; pasteurisation
1876; définition d’un enzyme : « ferment isolé d’un organisme vivant »
1883; Hause société Carlsberg : développement des cultures pures de levure
1888; création de l’Institut Pasteur
1912 découverte des vitamines -> production industrielle par des microorganismes
1913 Première préparation d’enzymes pour la lessive
1915 production de solvants par fermentation anaérobie (explosifs)

1940-45 purification des antibiotiques (Fleming 1929, penicillium utilisés comme agent antibactérien des 1870)
1963 commercialisation des premières lessives aux enzymes
1972-74 les premiers OGM (clonage d’exogènes dans E. coli, vecteurs bactériens : virus et plasmides
1980 Premiers OGM d’intérêt industriel (production insuline, hormones de croissance, interféron)
1980-81 Transgénèse végétale (Plasmide Ti d’Agrobacterium)
1987 Maïs transgénique
1994 Tomates transgéniques
etc…

Microorganismes
Organismes microscopiques souvent unicellulaires
Procaryotes (anuclées) : les bactéries et les archées (archae)
Exemple de procaryote : une bactérie fréquente du
tube digestif de l’Homme : Escherichia coli vue en
microscopie électronique,
(Photo F. Sauvager / Université Rennes).
Exemple de procaryote :
archéobactérie thermoacidophile
(milieu chaud et fortement acide)
Acidianus ambivalens
Les microorganismes utilisés en biotechnologies sont principalement des champignons et des bactéries

Eucaryotes (nuclées) : Champignons, algues, protozoaires
Exemple de protozoaire cilié : la paramécie utilise
des cils pour se déplacer et se nourrir
Exemple de levure : Saccharomyces cerevisae
Elle est utilisée dans la fabrication du pain, du vin
et de la bière
Exemple d’algues : l’euglène

Les bactéries sont classées selon :

Les bactéries peuvent aussi être classées selon :
G+C% : varie de 25 à 75%
Hybridation des acides nucléiques : Cinétique de réassociation des ADN dénaturés
provenant de 2 génomes(avant séquençage systématique des génomes complets)
donne une idée de % d’homologies entre génomes.

Analyse phylogénétique : établir une parenté entre les organismes et estimer leur temps de divergence
Arbres phylogénétiques : représentation shématique de la phylogénèse (Haekel 1866)

Séquençage des génomes

Etablissement d’arbre phylogénétiques basé sur des données de séquences.
Principe : L’apparition de mutations étant aléatoire et spontanée le nombre de mutations (différences
de séquence) qui séparent deux espèces mesure le temps qui s’est écoulé depuis leur apparition à partir
d’une espèce pré-existante unique.
Cette hypothèse revient à postuler l’existence d’une cellule vivante originale unique qu’on appelle LUCA
pour : Last Universal Common Ancestor)
On raisonne en « distance évolutive » : nombre de substitutions survenues dans les deux lignées depuis leur
divergence. Elle est, bien sur, fonction du temps.
Il faut choisir un gène universellement conservé : Système de transcription, de traduction
L’ARN 16S a été choisi
Ses avantages : Présent dans tous les organismes
Structure très conservée
Abondant et facile à purifier à partir de ribosomes

Principes de la méthode
Aligner plusieurs séquences du 16S ayant la même origine et dénombrer les différences.
1 CGUAGACCUGAC (12 mer)
X X X 3 différences entre les séquences; soit une distance évolutive de 3/12 = 0,25
2 CCUAGACGUGUC
Si on analyse plus de deux séquences (4 : A, B, C et D) on compare les séquences 2 à 2
A-B = 0,3; A-C = 0,44; A-D = 0,61
B-C = 0,31; B-D = 0,46
C-D = 0,43
Puis on tente de construire l’arbre le plus vraissemblable.
Par exemple
Ancètre commun
noeud
0,08
0,01
0,23
0,08 B
0,13
C
A
Branche
Feuille
0,29
D

Mitochondries
Chloroplastes
Last Universal Common Ancestor (LUCA) (3,5-4 milliards d’années)

(ascomycota)

Diversité du métabolisme bactérien
Les bactéries ont besoin d’ENERGIE pour se multiplier
Elles tirent leur énergie de l’environnement
Elles utilisent soit le potentiel chimique des molécules disponibles (chimiotrophes)
soit l’énergie lumineuse (phototrophes)
Elles se sont adaptées à des environnements très divers
Le potentiel chimique des molécules de l’environnement (SH2) est transféré à la cellule
grâce à des couples oxydo-réducteurs (exemple : A-AH2)
SH2 + A (oxydé) -> S (oxydé) + AH2 (réduit) + énergie
Chaque couple a un potentiel d’oxydo-)réduction qui détermine le sens de la réaction
Le couple qui a le potentiel le plus élevé est oxydant ; il sera réduit lors de la réaction.
red ox
Succinate / fumarate pot redox = +0,02 V
H2O / 1/2 O2 pot redox = 0,82 V
FADH2 / FAD pot redox = -0,20 V
H2 / H+ pot redox = 0
red ox red ox red ox red ox
FADH2 + Fumarate -> succinate + FAD succinate + 1/2 O2 -> H2O + fumarate

Les chaines d’oxydo réductions (transfert d’électrons) permettent à la cellule de récupérer l’énergie
S
AH2
B
CH2
N
Accepteur réduit
SH2
A
Récupération de l’énergie
BH2
Accepteur final
C NH2
(donneur d’électrons)
Couplage avec la machinerie de synthèse d’ATP
Le potentiel chimique diminue progressivement
Les bactéries utilisent l’énergie chimique d’un grand nombre de molécules minérales ou organiques
Le shéma ci-dessus montre que les bactéries ont également besoin d’un ACCEPTEUR final qui peut être
l’oxygène ou une molécule minérale (lithotrophe) ou organiques (organotrophe).
L’accepteur peut être intracellulaire (fermentation) ou extracellulaire (respiration). La respiration peut être
anaérobie si l’accepteur n’est pas l’oxygène (NO3 - /NO2 - ; SO4 2- /H2S; etc…)
Les bactéries ont également besoin de MATIÈRE pour se multiplier (synthèse de biomasse)
qu’elles peuvent puiser dans des molécules organiques (hétérotrophe) ou minérale (autotrophe)
La source d’énergie peut également être utilisée comme source de matière. C’est le cas des bactéries
Hétérotrophes qui oxydent des molécules organiques qui leur fournissent également carbone et azote.
Les bactéries chimiotrophes ont besoin de sources de carbone distinctes de leur source d’énergie (H2, H2S,
NH3 etc;…)
Les bactéries qui utilisent des sources d’énergie minérales à faible potentiel chimique ont en général un
métabolisme énergétique de type aérobie (rentabilité maximum de l’énergie interne)

Quelques exemples de sources d’énergie et d’accepteurs finaux des chaînes
d’oxydo-réduction
Bactéries chimiotrophes utilisant une source d’énergie « minérale » (non organique)
Bactéries utilisatrice hydrogène
H2 est donneur d’énergie, l’accepteur d’H est l’Oxygène, la source de carbone est le CO 2
H 2 + 2O 2 + CO 2 -> molécules organiques (biomasse) + H 2 O
Aquifex, Hydrogenobaculum…
Bactéries sulfureuses
Donneurs d’énergie : H 2 S, S, S 2 O 3- , l’accepteur de proton est O 2, elle libèrent de l’acide
sulfurique (SO 4
2-
), elle utilisent CO 2 comme source de carbone.
Beggiatoa, Thiotrix, Thiobacilles (très corrosives : maladie de la pierre)
Bactéries utilisant le Fer et le Manganèse
Fe 2+ + O 2 + H+ -> Fe 3+ + H 2 O
Sphaerotilus, Leptothrix, Thiobacillus
Sphaerotilus est utilisé pour épurer l’eau (elle est présente dans les boues actives des
épurateurs)
Gallionela prolifère dans les canalisations d’eau potable qu’elle peut boucher
Bactéries nitrifiantes utilisant les nitrates
Elle utilisent NH 3 ou les nitrites NO 2
-
commes source d’énergie et forment des nitrates
(NO 2
-3
) . L’accepteur d’hydrogène est toujours O 2 et la source de carbone est le CO 2 .
Certaines transforment NH 3 en NO 2
-
(nitrites)

Bactéries lithotrophes anaérobies (l’accepteur final d’H est extracellulaire et n’est pas l’O 2 :
respiration anaérobie)
Sources d’énergie : H 2 S, sulfures, thiosulfates…
Les accepteurs d’H sont principalement : les nitrates, les sulfates te les carbonates.
Nitrates : NO 3
-
-> NO 2
-
NO ou N 2
E. coli, Bacilli, Pseudomonas, peuvent avoir ce genre de métabolisme en anaérobie
Mais les vraies « bactéries dénitrifiantes » assurant la dénitrification complète sont peu nombreuses
: Thiobacillus denitrificans
Sulfates : Desulfovibrio réduit SO 4
2-
(accepteur d’H) en sulfures (S 2- ) puis en hydrogène sulfuré (H 2 S)
Source d’énergie : Carbone organique et aussi H 2 .
Carbonates : Bactéries méthanogènes. Methanobactérium, Methanobacillus, Methanococcus,
Methanosarcina…
Bactéries utilisant les molécules organiques comme sources d’énergie et de carbone et l’O 2
comme accepteur d’H 2 . Elles libèrent du CO 2 (Organotrophes aérobies)
Certaines comme Pseudomonas peuvent utiliser juqu’à 80 molécules différentes comme source
d’énergie alors que Diplococcus glycinophilus n’en utilise qu’une : le glycocolle.
Certaines bactéries (Acetomonas, Acetobactère…) n’oxydent pas complètement la molécule utilisée
comme source d’énergie. Elles libèrent de l’acide acétique et aussi de l’acide fumarique, de l’acide
citrique etc…

Un grand nombre de bactéries peuvent changer de métabolisme suivant leur environnement :
des lithotrophes anaérobies peuvent devenir organotrophes anaérobies en présence de certaines
molécules organiques
Certaines bactéries utilisent des molécules organiques intracellulaires comme accepteur d’H 2
Ce type de métabolisme anaérobie s’appelle fermentation.
Il y a plusieurs types de fermentation dans differents types de cellules : fermentation alcoolique ( Ethanol),
homolactique, mixte, hétérolactique, butyrique, acétobutyrique, propionique…

Toutes ces voies nécessitent
l’intervention d’un accepteur de
protons (NAD + /NADH+H + ) qui
réduit l’accepteur organique
final.

Métabolites Primaires et Secondaires
Métabolites primaires
Métabolites secondaires
Biomasse

Un exemple de métabolite primaire l’éthanol
L’alcool est produit par Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergiensis à partir de sucres
assimilables : le glucose, le fructose, le saccharose (Glu (alpha 1-4) Fru), le maltose (Glu
(alpha 1-4) Glu), le maltotriose (Glu (alpha 1-4) Glu (alpha 1-4) Glu).
S. c. produit 0,51 g d’éthanol à partir de 1g de glucose dans des conditions anaérobies.
90% du glucose est transformé en éthanol et 10% sert à faire de la biomasse.
L’alcool industriel : les biocarburants (voir cours Mme Buffard)
Alcool alimentaire : boissons alcoolisées
C’est une méthode très ancienne déjà pratiquée plusieurs siècles avant notre ère pour
conserver les aliments.
De nombreuses boissons sont fabriquées à partir de différents produits naturels
(essentiellement des produits agricoles) contenant des sucres ou des polysaccharides.

Le vin
La quasi totalité des vins sont obtenus à partir des raisins produits par les nombreuses variétés de
Vitis vitifera; on parle de cépages, il y en a environ 5000.
La nature d’un vin est fonction du cépage, de la nature du sol, des conditions climatiques et du mode
de vinification
La fermentation des fruits est un phénomène spontané du à la présence de levure « indigènes » à leur
surface
Le jus de raisin qui a une teneur très forte en sucre est un de ceux qui fermentent le plus facilement
La vinification consiste à contrôler le phénomène naturel. Les premiers exemples de domestication de la
vigne datent du IVème siècle avant JC en Grèce, Egypte, Rome et en Gaule. Elle s’est ensuite développée
dans les régions tempérées
Origine étymologique : le sanscrit Vêna qui désignait un liquide sucré en Inde. La racine a été conservée
dans de nombreuses langues. Le vin a ses divinités : Bacchus (Rome), Dionysos (Grèce).
La religion catholique a beaucoup oeuvrée au maintien de la culture de la vigne dans les monastères.
XIX siècle; le philloxera (insecte qui s’attaque au racines des plantes) a décimé les vignes européennes.
Les vignes actuelles sont des cépages européens gréffés sur des portes greffes américains (vitis ripana et
vitis rupestris).

Un des aspects de la vinification consiste à préparer un moût contenant les éléments nécessaires à la confection
du vin tout en évitant d’extraire les molécules à l’origine de qualités organoleptiques indésirables
Les différentes structures du grains de raisin (pellicules, pulpe, pépins) contiennent des éléments différents
Pépins : éléments phénoliques qui participent à la vinification des vins rouges et substances huileuses
indésirables
Pellicule : anthocyanes et composés volatiles responsables de la couleur et de l’odeur des raisins qui peuvent
être plus ou moins extraits lors de la préparation des moûts
La pulpe est composée de grosses cellules végétales entourées de parois cellulosiques qui constituent
75 à 85% du grain de raisin.
Le grain de raisin contient entre 150 et 250 g/l de sucres. Jusqu’à 300 g/l dans certains cépages tels que le
muscat. Les baies « concentrées par la croissance de moisissures (« pourritures ») peuvent dépasser cette
concentration
Le glucose et le fructose sont en quantité à peu prés équivalentes. Ils sont très largement majoritaires; on
trouve aussi un peu de saccharose de xylose, de rhamnose de maltose et de raffinose
La répartition des sucres dans la grain n’est pas homogène; ils sont plus abondants à proximité des pépins
Les principaux acides organiques du grain sont les acides tartrique, malique et citrique. Leur concentration
est plus importante vers la surface.

Azote et substances azotées : NH 4 , protéines et peptides
L’azote ammoniacal (NH 4 ) facilite beaucoup la croissance des levures lors de la fermentation
Substances odorantes. Principalement localisées dans la pellicules elles varient avec les cépages
qu’elles caractérisent
Certaines sont présentes dans le raisin (terpènes) alors que d’autres vont acquérir leur caractère odorant
à la suite de transformations qui se font au cours de la vinification
La vinification
Préparation du substrat
Le raisin est égrappé et écrasé (foulé). On peut garder qqs rafles qui fournissent des tanins. Il ne faut pas
écraser les pépins
Vins blancs / vins rouges
Le vin blanc est en général préparé à partir de raisin blanc mais on peut obtenir du vin blanc avec du raisin
Noir. Le vin rouge est toujours obtenu à partir de raisin noir.
Vins rouges : le raisin écrasé contenant encore des rafles, les pellicules et les pépins est incorporé directement
dans la cuve de fermentation
Vin blanc : le raisin est égrappé, foulé et légèrement pressé. Les rafles et les pépins sont enlevés et les grains
restant sont à nouveau pressés. Les pellicules et les pépins sont finalement séparés du moût par soutirage ou
centrifugation avant la fermentation.

La fermentation
La fermentation « en rouge » dure de 3 à 21 jours et se fait de 25 à 30°C. Il ne faut pas dépasser cette
température au dessus de laquelle on risque d’extraire des quantités excessives de tanins ou autres
molécules des pellicules et des pépins
La fermentation « en blanc » peut se faire jusqu’à 36 à 38°C (pas de risque d’extraction des molécules qui
pourraient développer de mauvaises odeurs)
Les moûts contiennent des bactéries dont il faut restreindre la croissance. Ceci est réalisé en ajoutant
du SO 2 qui a également l’avantage d’empêcher l’oxydation.
Les levures indigènes présentes à la surface du raison ne permettent pas d’obtenir plus de 4 à 5 degrés
d’alcool
Pratiquement la fermentation est déclenchée par l’addition de levures commerciales sélectionnées à raison
de 1 à 5 10 6 par ml. Ceci à plusieurs avantages : le premier est le contrôle et la reproductibilité de la
vinification. De plus, elle permet un démarrage rapide de la fermentation qui limite la croissance bactérienne
et l’oxydation grâce à un dégagement rapide de CO 2
Un peu d’oxygène est nécessaire au développement des levures (moût légèrement aéré lorsqu’il est
transféré dans la cuve de fermentation).
La forte concentration des moûts en acide (pH 3 à 3,9) les protège également contre le développement des
bactéries
La croissance des levures est également facilitée par l’addition de molécules telles que l’acide oléïque,
linoléique nécessaires à la synthèse des acides gras et des stérols de la membrane

Les levures ajoutées sont très caractérisées. Elles sont commercialisées sous forme de levures sèches
actives (LSA) par des « levuristes ». Des souches de levure différentes sont utilisées pour faire des vins
différents.
En plus de l’alcool et le CO 2 la fermentation des hexoses par la levure produit de nombreuses autres
molécules; par exemple : le glycérol, l’acide lactique, l’acétaldéhyde, l’acide succinique, et quelques
autres alcools. Le bilan global est:
180 g de glucose -> 83,6 g de CO 2 + 87,4 g d’éthanol + 8,1 g de molécules diverses + 1 g de levure
Le degré final d’alcool est fonction de la teneur en sucre : 1degré = 18g/l (vin rouge) et 17 g/l (blanc)
Les levures classiques ne tolèrent pas plus de 12 à 14 degrés d’alcool; elles ne se développent plus et
ne fermentent plus. On ne dépasse habituellement pas 14 à 15 degrés. Certaines levures sélectionnées
peuvent supporter 18 à 20° d’alcool.
Les acides aminés et les protéines du jus de raisin sont indispensables à la croissance de la levure
Certains vins sont le siège d’une deuxième fermentation malolactique qui transforme le diacide
acide malique (COOH- CH 2 -HCOH-COOH) en acide lactique (CH 3 - CH 2 -HCOH-COOH) monoacide.
Elle a lieu dans des vins acides vendangés précocement quand le raisin n’est pas complètement mur
(pH 3 à 3,5). Elle est en général amorcée par Leuconostoc oenos. Les bactéries lactiques dégradent
également l’acide citrique les vins rouges doivent en général subir une fermentation lactique
Quelques variantes.
Les Sauternes : On utilise des levures particulières qui utilisent préférentiellement le fructose. Les sucres
restant confère le goût spécifique à ces vins.
Vins rosés : Comme les vins rouges mais macération plus courte : 1 à 2 jours au lieu de 4 à 5 jours pour les
vins rouges. La macération peut durer jusqu’à 15 jours pour les vins colorés très taniques.

Champagne
Il était fabriqué dans des régions septentrionales ou le raisin est peu sucré et la fermentation lente
Le raisin est ramassé tôt et le pressage est léger : éclatement de façon à récupérer préférentiellement la pulpe la
plus riche en sucre (température lente)
Fermentation déclenchée par levures commerciales, pas de fermentation malolactique
Le vin est mis en bouteille, on rajoute du sucre et des levures et la fermentation se poursuit à 10°C pendant
4 mois en bouteilles
Il faut ensuite éliminer les levures : les bouteilles renversées, le goulot congelés et le bouchon retiré.
Les levures accumulées dans le goulot sont extraites, le volume est réajusté et les bouteilles rebouchées.
L’opération est réalisée au froid afin que le gaz carbonique produit au cours de la fermentation secondaire
ne s’échappe pas ; il reste soluble.
Dans la méthode originale on n’ajoutait pas de levure. Le vin était seulement mis en bouteille avant la fin de la
première fermentation
Les dernières étapes
Après fermentation le fin est filtré. Cette étape est précédée de la clarification afin de limiter les troubles et
dépôts qui sont un inconvénient commercial. Les troubles sont dus à la formation d’agrégats dus à l’oxydation
du fer la modification des protéines par les tanins à température élevée au cours de la fermentation
On peut décanter et transvaser le vin. On peut aider la floculation en ajoutant des « colles » chargées
positivement : sang de bœuf, caséine, gélatine, blanc d’œuf.
On rajoute parfois des enzymes (enzymes pectinolytiques, glucanases qui facilitent la filtration

On ajoute parfois des enzymes protéolytiques au début de la fermentation pour libérer des acides aminés qui
facilitent la croissance des levures
Le vieillissement
Les esters (réaction des acides avec les alcools) vont se former au cours du temps
Certains de ces esters, très odorants (et volatiles) sont indésirables
Les vins peuvent être conservés en bouteille ou en fût (toujours en chêne). Le bois cède ses tanins au vin,
la conservation en fût permet l’oxydation. Les grands vins sont vieillis en fûts ou ils acquièrent un fumet
« boisé »
L’oxydation est arrêtée lors de la mise en bouteille. Le goût des vins rouges évolue lentement en bouteille
probablement à cause de processus de réduction
Les vins blancs ne doivent pas s’oxyder : ils sont vieillis en bouteille.
Tentatives d’amélioration des procédés industriels de fabrique du vin
Sélection des souches pures de levure. Il est cependant parfois impossible de reproduire avec une levure
les propriétés des levures indigènes utilisées pour la vinification de certains vins
Tentatives d’amélioration génétiques; TRES règlementé (ne peuvent être utilisées comme donneur que des
gènes d’organismes normalement utilisés dans la fabrication du vin)
On essaye de modifier les levures afin de mieux contrôler l’acidité, d’améliorer le rendement alcoolique,
la floculation (production d’enzymes extracellulaires) ou les propriétés organoleptiques.
Exemples : levures capables de faire la fermentation malolactique (clonage d’enzymes bactériens), construction
de levure surproduisant du glycérol (auto clonage des génes de levure en multicopies)

La bière
Les matériaux végétaux utilisés ne sont pas directement utilisables par la levure. Ils contiennent des
polysaccharides qui doivent être transformés en sucres fermentescibles
Il s’agit essentiellement de l’amidon (polyglucose) contenu dans les graines de céréales : orge, seigne,
Millet, Sorgo mais aussi de pommes de terres et de betteraves.
La bière est essentiellement faite à partir d’orge. Mais elle peut également contenir d’autres céréales
(voir ci-dessous)
Le première étape consiste à dégrader l’amidon d’orge ou d’autres céréales à l’aide d’amylases. Les
amylases sont obtenues en faisant germer les graines
Le maltage
Le malt est de l’orge dont la germination a été arrêtée à un stade précoce. Il est préparé par un « malteur »
Après la récolte l’orge est conservé 2 mois en dormance avant d’être malté. La première étape est le
trempage : périodes de trempages de 10 heures entrecoupées d’étapes de passage à l’air libre. Elle est
réalisée à 10°C et dure 2 à 3 jours.
Les graines humidifiées (d° d’humidité passe de 10-12% à 44-50%) sont étalées dans des germoirs ; la
température est de 15°C. Il y a apparition d’une plantule et de radicelles (petite plante). Les graines sont
régulièrement remuées afin de favoriser l’oxygénation et d’empêcher l’entremêlement des radicelles.
La germination est arrêtée après environ une semaine pendant laquelle il y a eu synthèse d’!- et de
"-amylases ainsi que de glucanases, xylanases, peptidases, pectases… capables de dégrader la parroi de
la graine qui sera ainsi fragilisée.
C’est le « malt vert ». A ce stade la graine a perdu environ 5% de son amidon utilisé comme énergie et
source de nutriments pour le développement de la graine. Elle contient un excès d’amylase capable de
dégrader 2 fois la quantité d’amidon contenue dans la graine.
Le « touraillage » à pour but de stopper la germination. Le malte vert est déshydraté (dessiccation) dans
un four ventilé à 45° pendant une trentaine d’heures. Le d° d’humidité est ramené à environ 4%. Dans
ces conditions, les enzymes sont inactifs mais n’ont pas été dénaturés

Trempage

Germination

Tourraillage, coup de feu

Le malteur procède alors à un « coup de feu » (chauffage à 85°C-10°C) de 1 à 4 heures qui détermine l’état
final du malte; le malt pâle (coup de feu court) est utilisé pour les bières les plus courantes, le malt ambré
(coup de feu plus long et chaud) qui apporte couleur et arôme, et enfin le « malt torréfié » utilisé pour les bières
irlandaises.
Le malt est ensuite commercialisable (les radicelles sont utilisées pour l’alimentation des animaux). C’est un
produit inerte qui peut être stocké et transporté.
Le brassage
La première étape est la saccharification qui consiste à dégrader l’amidon du malt avec les enzymes
synthétisées au cours du maltage.
Les grains de malt sont concassés en présence d’eau chaude; on obtient la « maîche » à laquelle on peut
ajouter d’autres céréales non maltées (maïs, riz, blé*). Un des objectifs est de réduire les coûts.
Un exemple : une bière blanche contenant du blé (Hoegaardeen, Louvain, B). Elle contient 50 à 60
% d’orge malté, 25/50% de malt de froment, 10 à 50% de froment non malté et 0,1 à 5% d’avoine
ou de sarrasin.
En France, l’appellation bière implique que la maîche contient au moins 50% de malt d’orge.
Il y a plusieurs procédés d‘infusion (monopaliers, multipaliers, chauffage direct…) qui ont tous pour objectifs de
favoriser l’activité des différents enzymes contenu dans le malt.
L’infusion multipaliers décrites ci-dessous est très utilisée dans le nord de la France.
La maîche (malt concassé mélangé à de l’eau et porté à 45°C) est porté à des paliers successifs de 64°C puis
72°C par addition d’eau bouillante. Le volume d’origine est le plus faible possible afin que la maîche finale (le
brassin) ne soit pas trop diluée après ces opérations.
D’autres méthodes consistent à prélever une partie de la maîche qui est à 45°C, à la porter à ébullition et à la
rajouter au reste de la maîche afin d’obtenir une température de 64°C. On peut procéder de la même manière
pour atteindre le palier de température suivant. L’ébullition à l’avantage de gélatiner l’amidon qui n’est pas très
soluble : le brassin est un mélange très visqueux qu’il faut « brasser » pour l’homogénéiser.
Les différents paliers correspondent aux températures optimales de différents d’enzymes. Ie temps
d’incubation à ces températures laisse aux enzymes le temps d’agir sur les composants de la maîche avant
qu’une élévation de température ne les inactive.

Les différents paliers
Empâtage : 45-55°C, pH 3,8 à 5,9 pendant 10-30 minutes. Les protéases agissent, elle éliminent des
protéines indésirables et insolubles et fournissent des acides aminés. Une grande partie des protéines
responsable du trouble de la bière sont éliminées à cette étape
Saccharification : 55°C-65°C pH 5 à 5,5 pendant 30 à 60 minutes. Les !-amylases dégradent l’amidon.
L’amidon est un polymère linéaire (amylose) à structure branchée.
liaisons "1-6
liaisons "1-4
"-amylases
!-amylases
Les !-amylases attaquent les extrémités de l’amylose, elles libèrent des molécules de maltose
assimilables. Les "-amylases libèrent des dextrines
Le palier de saccharification favorise l’activité des !-amylases
Le palier suivant : 68-72°C pH 5,3, 5,7 pendant 30 à 90 minutes seule l’#"-amylase est encore active elle
libère des dextrines non fermentescibles. Cette étape favorise le corps de la bière.
Le dernier palier 80°C pendant 10 à 15 minutes inactive complètement les enzymes.
Le moût est ensuite filtré (percolation = filtration lente sous pression) : les déchets « dresches » sont
récupérés comme aliments pour le bétail
L’aromatisation par le houblon (inflorescences femelles) est faite à cette étape (2heures). Le houblon
donne une saveur amère due à la lupuline. Il était à l’origine ajouté pour ses propriétés antibiotiques
favorisant la conservation de la bière

Dresches

La fermentation
Le moût est ensemensé avec des levures (10 7 cellules/ml) qui proviennent en général d’une fermentation
précédente. Il y a plusieurs types de fermentations qui dépendent des levures utilisées
Fermentation basses. Elles sont réalisées à 5-14°C par saccharomyces uvarum (anciennement
carlsbergensis). La fermentation dure une dizaine de jours. Les levures sédimentent au fond de la cuve ou
elles peuvent être récupérées. Types de bières : lager (de lagern : stocker en allemand). Elles sont
conservées
Les fermentations hautes. Sont réalisées à 15-25°C par saccharomyces cerevisiae. Elles durent de 4 à 8
jours. Types de bière ale, stout (UK). Les levures remontent à la surface du moût pendant la fermentation.
Les degrès d’alcool sont supérieurs à ceux obtenus par la fermentation basse.
Fermentation spontanées : Brettanomyces bruxellencis, ou B. lambic. Ensemencement naturel du moût
par les levures indigènes. Procédé limité à une région de Belgique qui produit la bière Lambic.
A la fin de la fermentation 70% de l’amidon a été transformé en sucres fermentescibles qui ont été
complètement utilisés par la levure. Le reste est sous forme de dextrines.
La bière est finalement clarifiée (filtration) sur Kiesellgurh (diatomées fossiles) et mises en bouteilles. Elle
doit être conservée à l’abri de l’oxygène et des contaminations bactériennes. Quelques bières de grande
consommation sont pasteurisés pour faciliter la conservation
Certaines bières subissent des fermentations secondaires: bières de garde du nord de la France. Ce sont
le plus souvent des fermentations hautes (d° alcool élevé : 7-8) qui ne sont pas filtrées. La fermentation
continue en bouteille fermées (garde).

Garde (0°C)
Filtration

Amélioration des procédés
Levures surproductrices de !-glucanases (fabriquée mais non autorisée)
Levures produisant des amylases
-clonage de la glucoamylase de Saccharomyces dicistaticus (libère du glucose et coupe les
liaisons "1-6) dans S. uvarum
-clonage des gènes de la glucoamylase, de l’#"-amylase et de la pullulanase (glucanase
spécifique des liaisons "1-6; le pullulane est un polymère de glucoses reliés par des liaisons
"1-6)
Elimination se produits secondaires indésirables; le diacétyl ralenti le murissement de la
bière. Ceci est réalisé en faisant exprimer l’acétolactate carboxylase qui élimine
l’acétolactate utilisé pour former le diacétyl
- une protéine de blé la puro-indoline est ajoutée (10µg/ml) pour stabiliser la mousse. A
l’inverse les lipides déstabilisent la mousse.
Un autre exemple impliquant une distillation : le Whisky
La fabrication du whisky utilise également du malt comme source d’amidon et d’enzymes
Le procédé de préparation du malt est très proche de celui décrit pour la bière
Germination : humidification, graines étalées sur une épaisseur de 20-30cms et retournées
régulièrement pendant une semaine à 12 jours.
Touraillage : chauffage dans un four qui peut être chauffé à la tourbe (Ecosse Irelande). La présence de
tourbe dans le combustible modifie la saveur du malt
Le malt livré à la distillerie est dans un premier temps broyé sous forme de farine grossière appelée
Grist
Le Grist est ensuite réhydraté (1 volume de grist + 4 volume d’H 2 O). L’origine de l’eau est très
importante.

Comme pour la bière, la conversion de l’amidon en sucres fermentescibles est réalisée par paliers (3) entre 65
et 95°C. Les cuves font 25000 litres.
Le moût est ensuite séparé en drafts (déchets) recyclés pour l’alimentation du bétail. Cette opération est
appelée brassage car le mélange très visqueux doit être brassé pour l’homogénéiser et faciliter l’écoulement
du moût
Le moût est ensuite mis en cuve d’inox (autrefois en bois (pin ou mélèze) et la levure est ajoutée
On obtient un « bier » à 8 degrés d’alcool.
Le bier sera utilisé tel quel pour être distillé
Les distilleurs apportent une grande importance à la forme de l’alambic et au cuivre dont il est fait
Le whisky peut être distillé 2 à 3 fois
Le whisky est ensuite vieilli dans des futs de chêne, le plus souvent usagés, pendant au moins 3 ans. C’est le
temps minimum pour mériter l’appellation whisky.
Les fûts usagés peuvent conférer au whisky un goût particulier qui dépend de la nature de l’alcool qui y avait
été préparé. Par exemple du Sherry (Xeres). Ces grands futs (420-520 litres) parmi les plus chers sont d’abord
utilisés (loués) pour élever du Xeres avant d’être utilisés pour faire vieillir du Whisky. Les distilleries utilisent
également des fûts ayant contenu du madère, du porto, du sauterne, du bordeaux, du calvados du rhum…
pour enrichir la palette gustative des whiskys. Le vieillissement peut commencer dans des fûts ayant contenu
du Bourbon américain avant d’être transféré dans les fûts mentionnées plus haut.
Le vieillissement cause une évaporation (le chêne est poreux). La teneur en alcool à la sortie de l’alambic est
de 70%. Elle diminue avec le temps c’est la « part des anges »
Le whisky est ensuite embouteillé. Le whisky est stable en bouteille. Le titre est ajusté à 40% en alcool avec de
l’eau. Certains whisky titrent 43° ou 46° pour des problèmes de législation.
D’autres céréales sont employées pour faire du whisky : Pure malt = 100% malt d’orge; Le bourbon américain
contient du malt d’orge et du seigle. On peut y ajouter des pommes de terre, de la betterave ou de l’avoine.
Les whisky écossais et irlandais peuvent contenir du blé

Beaucoup d’acides aminés sont produits par voie fermentaire
Le glutamate (agent de sapidité), qqs acides aminés doivent être ajoutés aux aliments d’origine végétale
(lysine) ils sont essentiels pour l’homme
Préparation du glutamate.
Bactérie : Corynébactérium glutamicum
Milieu de culture (amidon ou extraits de betterave : on utilise la mélasse qui est un résidu des sucreries). Il
faut ajouter des sels d’ammonium car les acides aminés contiennent de l’azote. L’Urée peut être utilisée
Le pH est maintenu à 7-8 en ajoutant du NH 3 gazeux.
L’acide glutamique est secrété dans le milieu, l’étape limitante est la sécrétion. L’apport d’acides gras
favorise la production de Glu; peut être en modifiant les propriétés de la membrane. L’addition de
pénicilline (en quantité sublétale) qui perturbe la synthèse des enveloppes bactériennes favorise la
production de Glu; peut être en augmentant la porosité des membranes.
La souche industrielle est mutée dans le cycle de Krebs (ceto-glutarate deshydrogénase). Le cycle du
glyoxylate shunte le cycle. Cette mutation favorise la transformation de l’isocitrate en"cetoglutarate puis la
synthèse de glutamate.
Préparation de la lysine
C’est la même bactérie qui est utilisée mais elle est modifiée dans a voie métabolique qui aboutit à la
synthèse de lysine, methionine, thréonine et isoleucine.
La lysine est sécrétée on obtient jusqu’à 40g/l de lysine.

Les antibiotiques
On connaît environ 8000 antibiotiques et on en découvre plusieurs chaque année. Une cinquantaine sont
utilisés à des fins thérapeutiques
Les antibiotiques sont des métabolites secondaires dont la synthèse dérive de celle de métabolites
primaires (voir diapo)
La plupart sont synthétisés à partir de champignons (penicillium) ou de bactéries (bacilli, actynomycétes)
(voir tableau)
Les antibiotiques se répartissent en plusieurs catégories dépendantes de leur nature chimlque
Les plus populaires sont les !-lactams qui sont des dérivés d’acides aminé. La valine donne le cycle !-
lactam
Les principaux (pénicillines (la cystéine donne le cycle thiazolidine), céphalosporines, céphalines)
Ils agissent en inhibant la synthèse du peptidiglycane (ils empèchent la transpeptidation qui forme le
réseau du peptidoglycane)
Penicilline G (la première isolée) active contre la gram+. Nouvelles pénicillines actives contre le gram -
Le penicillium produit plusieurs penicillines naturelles (G, F, K, X) parmi lesquelles seule la penicilline G
est utilisable en thérapeutique. On peut influencer la synthèse des pénicillines en ajoutant dans le milieu
des molécules qui seront incorporées comme chaîne latérale (penicilllines G, V et 0 byosynthétiques voir
tableau). Les trois sont utilisables.
On produit également des penicillines semi-synthétiques à partir de l’acide 6-aminopenicillanique sur
lequel on greffe des radicaux (voir tableau)
Ils existe de nombreux autres !-lactams (tableau) et on en crée des nouveaux par voie chimique
(tableau)

Production de penicilline
La découverte 1929 Alexander Fleming : colonie de Staphylococcus aureus lysées par un moisissure
contaminant la boite d’agar. La penicilline est toujours l’antibiotique le plus facile à utiliser.
La souche originale est Pénicillium notatum. Elle produisait 1,2 mg/l (2 IU) de pénicilline. La recherche
d’autres souches à conduit la l’identification de Penicillium chrysogenum NRRL-1951 qui était plus
appropriée pour les cultures submergées. Elle produisait 120 IU/ml.
La recherche de variants a permis d’isoler la souche B25 produisant 3 fois plus. Une première
mutagénèse aux UV a donné une souche X1612 (500 IU/ml). Elle a été suivie par une mutagènése
chimique qui a permis d’isoler la souche Wisconsin Wis Q176 qui produisait 900 IU/ml.
L’amélioration de la souche industrielle a pu être encore améliorée à la suite de la découverte de la
voie de biosynthèse qui a permis d’imaginer des méthodes de sélections différentes
L’amélioration des connaissance du cycle de développement de Penicillium c. et de son mode de
reproduction a permis d’améliorer les croisements par les méthodes de fusion d’hyphes haploïdes,
recombinaison mitotique, et fusions de protoplastes.
Ces techniques de plus en plus sophistiquées ont abouti à l’obtention d’une souche produisant
85000 IU/ml; soit plus de 700 fois plus que la souche de P. c. d’origine. Environ 40 000 fois plus que la
Souche P. n. de Fleming.
L’amélioration des souches industrielle déjà performantes est difficile. Il est en effet compliqué de
différencier une souche qui produirait 1000 IU (soit un peu plus de 1%) de plus que la souche
actuellement utilisée.

Haploïde

Production Industrielle de penicilline
La pénicilline est synthétisée à partir de la valine et de la cystéine. L’efficacité de la synthèse dépend de
l’apport de val et de souffre. La lysine rétroinhibe la synthèse de pénicilline. Il y a également un effet de
répression catabolique par le glucose
La production se fait sur un extrait de blé ou de maïs (riche en protéines), enrichi en ammoniaque et en sels.
La source de carbone est le glucose, le lactose ou la mélasse (sous produit de sucreries).
La production se fait dans un réacteur (batch) agité de 2,5 10 5 litres à partir d’une ampoule de spores
Le réacteur est stérilisé à la vapeur. Il est alimenté avec un milieu stérile et en oxygène stérilisé par filtration
Il faut développer un inoculum de taille suffisante qui puisse se développer dans un très grand volume. Cela
est réalisé en effectuant des cultures successives dans les fermenteurs de tailles croissantes. La première
préculture est faite dans un erlen de 1 litre. Les bactéries en phase exponentielles sont transférées dans un
fermenteur plus grand de 10 L où la culture continue jusqu’à être transférée dans un récipient de 10 3 L puis
10 4 L puis enfin le fermenteur final.
La fermentation est étroitement surveillée : le glucose est ajouté en continu, le pH est contrôlé; elle dure 6 à 8
jours. La température peut varier au cours de la fermentation pour favoriser le développement du mycélium
(30°C) ou la production d’antibiotique (25°C)
L’arrêt de la fermentation et la récupération des produits est basée sur quatre critères
mesure de la concentration de pénicilline
réduction de la consommation de glucose
réduction de 0 2 dissout
tendance forte à un changement de pH

Autres antibiotiques
Aminoglucosides : streptomycines, kanamycine, gentamycine, neomycine
Actives contre les bactéries à gram-
A permis de lutter efficacement contre la tuberculose (avancée majeur)
Inconvénients : beaucoup de résistantes dues à des mutations des protéines ribosomales
Supplanté par pénicillines actives sir gram-
Macrolides : Erythromycine, oléandomycine, tétracyclines…
Très utilisées, large spectres sur gram+ et -
Problème des spectres d’action (voir tableau)

Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
Bordetella pertussis
Staphylococcus aureus
Mycobacterium tuberculosis

Amylose (linéaire)
Amylopectine (branché)
~ 40000 résidus glucose
gluco-amylases
liaisons "1-6
liaisons "1-4
"-amylases
!-amylases

Préparée à partir de Bacillus subtilis,
Bacillus licheniformis ou Aspergillus oryzae.
L’enzyme thermostable à 110°C de
B. Licheniformis permet de réaliser en une
étape la liquéfaction (à haute température
= 110°C) et la dégradation de l’amidon.
La gluco-amylase qui coupe les
liaisons "1-6 est isolée de
champignons filamenteux :
Aspergillus niger ou orizae

L’amidon est dégradé jusqu’à différents stades
Hydrolyse partielle faible -> malto dextrines (aliments pour bébés)
Hydrolyse partielle -> Sirop de glucose + maltose (Confiserie biscuiterie)
-> Sirop de glucose (Confiserie, brasserie, confiturerie, boissons
Hydrolyse totale -> Sirop de glucose à 90-99%
Concentration et cristallisation (Alimentation, Fermentation, Pharmacie : excipients)
Isomérisation sous forme de fructose (Boisson, pâtisserie, biscuiterie, confiserie, confitures
hydrogénation -> sorbitol (plastifiants, textile, papeterie, diététique, vitamine C)
L’hydrolyse de glucose modifie plusieurs propriétés de l’amidon
pouvoir sucrant
fermentescibilité
viscosité
pouvoir liant
L’isomérisation du glucose en fructose augmente le pouvoir sucrant

Le pouvoir sucrant du glucose est faible par rapport à celui du saccharose (canne à sucre et betterave)
et du fructose (saccharose = glucose + fructose)
pouvoir édulcorant relatif
glucose 68
saccharose 100
fructose 120 à 150
Saccharose
Le glucose est incubé en présence de glucose isomérase isolée de Bacillus coagulens ou de Streptomyces
murinus.
Dans la cellule cet enzyme est une xylose-isomérase dont l’activité est dévoyée en remplaçant le Mn 2+ par
des ions Co 2+ . Elle est fixée sur une résine et introduite dans des colonnes (réacteurs) sur lequelles ont fait
passer le glucose. .
La réaction s’arrère quand 55% du glucose est transformé en fructose. C’est ce mélange : HFCS 55
(High Fructose Corn Syrup) préparé à partir de Maïs (mais aussi à partir de blé) qui est utilisé pour préparer
les soft drinks (Coca, Pepsi).
Le fructose peut être purifié par chromatographie (HFCS 90) pour être utilisé en patisserie