Régulation post-transcriptionnelle

Plan du CoursMachinerie et mécanisme de la traduction : des procaryotes aux eucaryotesRappel rapide du mécanisme de la traduction procaryote, démarrage interne, séquence Shineet Dalgarno (SD), le rôle des différents facteurs de démarrage d'élongation et de terminaisonComparaison de la traduction chez les procaryotes et les eucaryogtes- C o- ou posttranscriptionnelle, ARNm poly- ou monocistroniques- Les codons de démarrage, les extrémités des ARNm eucarytes sont modifiéesLes modifications des extrémités des ARNm eucaryotes- C a p p ing (addition de la coiffe) : les modifications chimiques et les enzymesi mpliqués, le couplage avec la transcription par l'ARNpolII : le rôle desr é p é titions de l'apendice C-terminal- L 'apendice C-terminal de l'ARNpolII intervient également dans l'épissage et lap olyadénylation de l'ARNm- La polyadénylation de l'ARNm : les réactions qui modifient l'extrémité 3' desARNm, la machinerie de polyadénylation, la processivité de la synthèse dup oly(A), le couplage entre polyadénylation et terminaison de la transcription, le rôle del'ARNpolII.Le démarrage de la traduction eucaryote- Le mécanisme de balayage ou scanning- L 'absence de séquence SD, l'abondance des facteurs de démarrage, le rôle dela coiffe, le complexe de fixation à la coiffe : eIF4E eIF4G, eIF4A et eIF4B- L hypothèse du balayage : quelques expériences- Le rôle de l'hélicase eIF4A- Le modèle du démarrage par balayage à partir de l'extrémité 5'-coiffée del'ARNm- E longation et terminaison- Le cas des Picornavirus : démarrage interne- T r a d u c tion des ARNm non coiffés (le poliovirus)- U n systéme expérimental : les ARNm dicistroniques- Les IRES : sites de démarrage interne de la traduction eucaryote- U n paradoxe : les queues poly(A) stimulent le démarrage de la traduction au niveaude la coiffe- Q u e lques observations expériementales : il y a corrélation entre traduction etp olyadénylation des ARNm- Les protéines de fixation au poly(A) s'associent avec eIF4G, la circularisationd e l'ARNmLa cellule peut incorporer un 21 ème acide aminé en détournant le code génétique : le cas de lasélénocystéine (Secys)- S e C ys est incorporé par un ARNt spécifique au niveau d'un codon stop- Le rôle du facteur d'élongation spécifique SelB et du repliement de l'ARNmQuelques images et propriétés du ribosome et de ses partenaires : ARNm et ARNt. Leribosome est un ribozyme.Régulation postranscriptionnelle de l'expression génétique ; l'ARNm est lacible d'une grande variété de facteurs de régulation. Le rôle des motifsstructuraux de l'ARNQuelques exemples de régulation traductionnelle dans les cellules procaryotes-L e paradigme de la régulation traductionnelle : la synthèse des protéines ribosomalesde Escherichia coli : notions d'opérateur traductionnel et de couplage traductionnel.- R é g u ler sans protéine : les riboswith- Le cas des opérons thi responsable de la synthèse de thiamine chez Bacilluss u btilis- La notion d'aptamère- La méthode de SELEX : une méthode de séléction de molécules d'ARN (aptamères)p ossédant une affinité pour une protéine- La régulation traductionnelle de l'ADN polymérase du bactériophage T4( G P 4 3 )- D é termination du site de fixation de GP43 sur l'ARNm- S E L E X p ermet de sélectionner plusieurs ARN ayant une affinité pourG P 4 3- La généralisation de la notion d'aptamère- L 'expression génétique peut être médiée par des petits ARN régulateurs non codants( ARNnc)- D e u x exemples historiques : le transposon Tn10 et les plasmides colE1; lesp e tits ARN régulateurs et leurs cibles sont synthétisés à partir des deux brinsc omplémentaires de l'ADN.- La grande famille des ARNnc- Leur identification in silico puis in vivo- Leurs cibles sont le plus souvent des ARNm- L ' ARNnc et l'ARNm cible sont transcrits à des loci différents dug é nome. Leur hybridation n'est que partielle (missappariements).- I ls agissent le plus souvent en bloquant la traduction de l'ARNm cible- U n contre exemple : DsrA qui active la traduction du facteur detranscription sigma SDes exemples de régulation post-transcriptionnelle chez les eucaryotes-Q u e lques exemples de mécanismes globaux basés sur la modification de facteursi mpliqués dans le démarrage de la traduction- La phosphorylation des 4E-BP inhibe la formation du complexe eIF4EeI F4G- La phosphorylation de eIF2 inhibe la traduction en stabilisant lec omplexe eIF2-eIF2B- Le kinase PKR induite par l'interferon- Le kinase HCR des hématies est induite par le fer- La protéine NSP3 des rotavirus se substitue aux PABP- Les protéases des picornavirus coupent les PABP- R é g u lation de la synthèse des protéines impliquées dans l'homéostasie du Fer- P r o téines de stockage et de transport du fer- La synthèse de la Ferritine dépend de l'apport en fer- Q u e lques expériences démontrant que la régulation estp osttranscriptionnelle

- L 'opérateur traductionnel appelé IRE pour Iron Responsive Element,e s t localisé dans la région 5' UTR de l'ARNm- La protéine IRP (Iron Regulatory Protein) inhibe la formation duc omplexe de démarrage en se fixant à l'IRE. Le fer inactive l'IRP.- La synthèse du récepteur de la transferine est inhibée en présence de fer- Q u e lques expériences qui démontrent que la régulation estp ostranscriptionnelle et que l'opérateur est localisé dans le 3' UTR.- L 'opérateur est composé de plusieurs motifs IRE.- L 'IRP se fixe sur l'opérateur 3' en absence de fer- Le fer destabilise l'ARNm- Le complexe IRE-3' IRP stabilise l'ARNm- Les microARN des eucaryotes- L 'exemple de l'ARN let-7 impliqué dans le développement deC o e n o r h a b d i t i s e l e g a n s- D e très nombreux miARN de 21 à 23 nucléotides ont été identifiés- I l sont synthètisés par maturation de précurseurs plus longs et agissente n inhibant la traduction ou en déclenchant la dégradation des ARNmc ibles.Les mécanismes de dégradation des ARN.- La dégradation des ARNm eucaryotes commence par la déadénylation des ARNm quis ont ensuite décoiffés et dégradés par une exoribonucléase de polarité 5' -> 3'- U ne voie altérnative est médiée par un complexe multienzymatique appelé exosomeq u i est composé de plusieurs exoribonucléases de polarité 3' vers 5'.- La dégradation de l'ARNm de E. coli est déclanchée par une endoribonucléase (laRNase E). Les fragments résultant de ces coupures sont ensuite dégradés par dese xoribonucléases 3' vers 5'.- La poly(A) polymérase facilite la dégradation des fragments d'ARN fortements tructurés- N o tion de contrôle de qualité des ARN dans les eucaryotes (le Non sens MediatedD e c a y) et dans les procaryotes. Le rôle de la polyadénylation et de l'exosome.L'adressage des protéines-L es protéines transitent vers le compartiment ou elles exercent leur activité- E l les traversent les membranes sous forme immature- E l les acquièrent leur structure spaciale avec l'aide concertée des chaperons de typeHSP70 qui empêchent l'aggrégation des domaines hydrophobes et HSP60 quic ontrôlent leur repliement- Les changements structuraux des HSP 60 bactériennes : GroEL-GroES dirigent ler e p l iement progressif des chaines polypeptidiques confinées à l'interieur d'une cagep r o téique.- Les sequences N-terminales déterminent le compartiment d'exercice desp r o téines : l'exemple des mitochondries- Les protéines extracellulaires sont synthétisées au niveau de la membrane dur e ticulum endoplasmique qu'elles franchissent de manière co-traductionnelle; le rôledu complexe SRP (signal recognition particule).- Le traffic au travers de la membrane nucléaire.La dégradation des protéines-L e protéasome et les protéases Clp; des complexes multiprotéiques qui dénaturent etd é g r a d e nt les protéines.- L 'ubiquitination facilite la dégradation des protéines eucaryotes.- La dégradation des protéines tronquées non fonctionnelles dans les bactéries:l'ARNtm fonctionne à la fois comme ARNt et ARNm.

ARN et thérapeutiqueOligonucléotides : Cible les régions régulatrices des gènes, intracellulaires.antisens Plusieurs difficultés doivent être surmontées : pénétration descellules, stabilité des ARN.Utilisation de nucléotides modifiés (voire page suivante).Deux thérapies antisense sont sur le marché pour traiter lesrétinites à cytomegalovirus (antiviral) et les leucémieslymphocitaires chroniques (anticancereux; inhibe l’expressiondu gène Bcl-2 en détruisant le messager).Aptamères :Peuvent agir au niveau intra- ou extracellulaire et neutralisertoutes sortes de molécules : acides aminés, peptides, acidesnucléiques, et même des cellules. Les protéines sont le plusfréquement ciblées.Les aptamères étant obtenus par SELEX les nucléotidesmodifiés utilisés pour stabiliser les ARN ou faciliter leurentrée dans la cellule doivent être reconnus pas les ARNpolet la transcriptase réverse.Les aptamères peuvent être modifié après synthèse MAISces modifications ne doivent pas affecter l’interaction avecleur cible.

Organismes unicellulaires: tétrahyména,mitochondries,chloroplastes….Exemple de ribozymes : l’auto-épissageMitochondries, chloroplastesde plantes et champignons…Transestérification n° 1 : coupure entre exon 1 et intronIntervention deprotéinesin vivoTransestérification n° 2 : coupure entre intron et exon 2et ligation des exons

Epissage et « spliceosome »U1, U2, etc… sont des ribonucleoprotéines du noyau (snRNP pour Small Nuclear RiboNucléoProteins).Il y en a cinq U1, U2, U4/U5 et U6 chacune associée avec un petit ARN snRNA (U1, U2, U4, U5 et U6)auxquels s’associent des protéines.On a identifié environ 150 protéines qui s’associent avec le splicosome humain

Epissage : le rôle des snRNAs U1 et U2Les petits ARN jouent le rôle de guides

Les petits ARN jouent le rôle de guides

Auto-épissage : Intron de groupe 1

L’ ARN est à lafois guide etcatalyseurAuto-épissage : Intron de groupe 1

Intron de groupe II et épissage spliceosome-dépendantIntrons de groupe IIl’ARN est à la fois guide et catalyseur

Auto-épissage : un intron de groupe II

L’invention/la découverte d’un nouveau type derégulation : les riboswitchsRonald BreakerLes ARN ont une activité catalytique (ribozymes) : par exemple la capacité des’autocouper des introns autocatalytique (voir ci-dessus)Est-il possible de réguler l’activité d’un ribozyme comme cela existe pour lesenzymes de nature protéique?Tentative de fabrication de ribozymes allostérique (régulés) : dont l’activitéest modulée par un effecteur.Un enzyme allostérique comprend1 centre catalytique : ce sera un ribozyme1 site de fixation d’un effecteur : ce sera un aptamer reconnaissant l’ATP1 domaine dont la structure varie en réponse à la présence de l’effecteur et dontles variations de structure modifient l’activité du centre catalytique

Un ribozyme régulé artificielSite de coupure spontanée de l’ARNL’efficacité de coupure du ribozymediminue en présence d’ATP

Les riboswitchsOpérons contenant les gènes de biosynthèse de lavitamine B1 (Thiamine) de Bacillus subtilisthiCEFSGH et thiMDLes deux opérons possèdent dans la région 5’ UTR un motif structural de 38 nt (thi box) qui est égalementretrouvé dans d’autres bactéries (conservé)L’inducteur est la thiaminePP (thiPP)Fusion transcriptionnellethi box thi M’ Rapporteur lacZFusion traductionnellesans thiPP avec thiPPUnités "-galactosidase800 800thi box thi M’ Rapporteur lacZ900 30!thi box thi M’Rapporteur lacZ1400 1400

Le 5’UTR de thiM forme une structure secondaire quiemprisonne le site de démarrage de la traduction du gène5’ UTR de thiMD

Le 5’-UTR de thiM est un aptamère qui change de conformationen présence de TPP : ces régions régulatrices des ARNm sontappelées Riboswitchs

Les riboswitchsExpression platform

Régulation transcriptionnelle par un riboswitchEn présense de lysine il y a formationd’une tige boucle qui joue le rôle determinateur transcriptionnel.Cette structure ne se forme pas enabsence de lysine+lys-lys

Les métabolites effecteursprovoquent des appariementsalternatifs entre le riboswitchet la plateforme d’expressionqui modifient l’acces duribosome ou la progressionde l’ARNpol

La transconformation du riboswitch peut égalementprovoquer la dégradation de l’ARNmL’ARNm codant la glutamine-fructose-6-phosphate amidotransferase(qui génère le glucosamine 6P) est destabilisé en présence de glucosamine 6-PLa ligand provoque une auto-coupure de l’ARNm qui déclenche sa dégradationpar la ribonucléase J

Des riboswitchs fixant le TPP !de type bactérien ont été!identifiés dans les génomes de!plusieurs champignons.!Ils gouvernent la maturation de!plusieurs ARNm codant!des gènes du métabolisme!de la thiamine qui peuvent être!soit épissés à un site secondaire localisé!prés de l’extrémité 5’ de l’ARNm!(peu de TPP) soit au site préférentiel!localisé en aval de deux petites ORF!qui inhibent la traduction du géne!

Un autre exemple classique de transconformation de l’ARNm :l’ATTENUATION de l’opéron tryptophane dans les bactériesP trpE trpD trpC trpB trpA tRégion de contrôle (opérateur) : une petite ORF située dans la région 5’UTR codeun petit peptide contenant deux tryptophanesElle est séparée par 43 nucléotides d’une région en tige et boucle riche enpaires G.C suivie d’un succession de 8T (U sur l’ARN) qui à la capacité de provoquerl’arrêt de la transcription (terminateur Rho indépendant)pppN 26 AUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGUUGGUGGCGCACUUCGUGAN 43Met Lys Ala Ile Phé Val Leu Lys Gly TrpTrp Arg Thr SerSTOPRégion de régulationA U UUUUUUU------G CC GC GC GG CC GAC GU UAA

La séquence 3 (verte) peut s’apparier soit avec la séquence 4 (violette) pour former un terminateur transciptionnel (conformationde gauche ci-dessous) soit avec la séquence bleue (2) (conformation de droite). L’appariement de la séquence 2 avec laséquence 1 (rouge) correspondant à la fin de l’ORF favorise la formation du terminateur (conformation de gauche).En d’autres termes le 5’UTR de l’ARNm trp peut adopter deux conformations alternatives. Soit la séquence 2 est indisponibleet le terminateur transcriptionnel du à l’appariement 3:4 (vert:violet) pourra se former soit la séquence 2 reste accessible;l’appariement 2:3 est possible et le terminateur transcriptionnel ne se forme pas. Le repliement de l’ARN étant co-transcriptionnelles tiges boucles amont sont « prioritaires » car elles se forment alors que les séquences impliquées dans les structures aval nesont pas encore synthétisées. L’appariement 2:3 se fera donc au dépens de la tige boucle 3:4 du terminateur si la séquence 2est accessibleCodons TrpSTOPUGGUGGCGCACUUCCUG1 2AUGCGUAAACCACUAUGUGACGGGCAAA3GCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUUUUUUUUOHCGGGCGAGU UAA4terminateur1UGGUGGCGCAC 2UUCCUG A A A CAUGCGUAACCACUAUGUGACGGGACCAAUA G A CUACCCAG 3C GC CC GG AC GC U A A UUUUUUUUU-----------CGG4

Le repliementet la synthèsede l’ARNm trpsont gouvernéspar ladisponibilitédu TryptophaneTrp = UGG12 342 est accessibleAppariement 2-3La transcription continueLa formation duterminateur de latranscriptiondépend de laconcentrationintracellulairede tryptophane1 2342 n’est pas accessible(masquée par le ribosome)Appariement 3-4La transcription s’arrête

Un petit ARN réprime l’expression d’une transposase

Un autre exemple de petit ARNnc régulateurL’ARN I régule la réplication du plasmide ColE1Origine de réplication de ColE1 L’ARN II sert d’amorce à la réplicationL’ARN I antisens s’apparie à l’ARN IIet inhibe la réplicationARN polRNase HADN polARN IARN polARN polARN pol

Mis en évidence sur le génome…Région intracistroniquePORFtPtPPetit ARNncORFtPromoteurTerminateurLeur expression est confirmée par Northern blot

Le rôle d’une vingtaine de petits ARNnc a été déterminésRNAs targets encodesresponse/ biological roleMicFMicCMicA–––ompF mRNAompC mRNAompA mRNAporinporinporinmembrane stressmembrane stressmembrane stress?–DsrAhns mRNAtranscriptional regulator thermoregulation++RprArpoS mRNAstress response ! Sgeneral stressOxyS–fhlA mRNAtranscriptional activator oxidative stressGadYRyhBIstR+––gadX mRNAsodB mRNA etctisAB mRNAtranscriptional activatoriron-storage proteinstoxinacid stressiron homeostasisSOS responseRdlD–ldrD mRNAkilling peptidepurine metabolism?DicF–ftsZ mRNAcell division protein cell divisionGcvBSpot426S RNACsrB–oppA+dppA mRNA? periplasmic bind. proteins–galK mRNA etc gal operon enzyme?! 70Sigma factor–CsrA protein regulatorpeptide transportsugar metabolismstationary phase survivalcarbon metabolism, virulence

Les petits ARN s’hybrident avec des ARNm codés pardes gènes situé à un autre endroit sur le génomeIls forment des hybrides imparfaits (nucléotidesnon appariés)ORFORFARNncORFARNm

Identification et nature des ciblesAnalyse génomique (recherche de complémentarités ARNnc/régions 5’ des ORF)Analyse transcriptomique ou protéomique de mutants déficients pour la synthèsepetits ARNnc ou de souches surproductrices…Exemple l’ARNnc MicA régule l’expression de la porine OmpAmicAluxSgshA

Identification et nature des ciblesBeaucoup des ARNnc sont impliqués dans la réponse à des stress, desmodifications d’apport en nutriments ou la régulation de la synthèse deprotéines de membrane ou de facteurs de transcription

Cibles multiplesEffecteurs multiplesRéseaux de régulationsBeisel and Storz FEMS Microbiol Rev 2010

Gènes cas (CRISPR associated)

Les séquences spacer des éléments CRISPR forment unrépertoire de séquences qui serviront de guides pour dégraderspécifiquement des éléments génétiques invasifs

Régulation posttranscriptionnelle de l’expression génétiquechez les eucaryotesRégulation globale- Phosphorylation des protéines de fixation au facteur de démarrageeIF4E (4E-BP)- Phosphorylation du facteur de démarrage eIF2 par les kinasesPKR et HCR- La protéine NSP3 des rotavirus se fixe à eIF4G- les entérovirus coupent les PABPRégulations spécifiques- Régulation traductionnelle de la synthèse de la ferritine- Régulation potstranscriptionnelle de récepteur de la transferine

La protéine 4E-BPeIF4G et 4E-BP se fixent aumême site sur eIF4E. Il y acompétition entre les deuxprotéines.La phosphorylation de 4E-BPempèche la fixation à eIF4EProtéine kinase (mamallian target et of Rapamycine)Rapamycine: antifongique et immunosupresseurLa phosphorylation est stimuléePar des hormones (insuline),des facteurs de croissance,des acides aminés,des cytokines etdes agents mitogènes quiactivent la division cellulaire.Elle est également stimuléeen phase G1 et S.Certain virus (influenza,Encephalomyocarditis,poliovirus) ainsi que la carencenutritionnelle et des stressfavorisent la dephosphorylation

Le rôle d’eIF2 dans ledémarrage de la traduction

Régulation de eIF2GTPLe complexe 43S fixéau niveau du codonde démarrageeIF2-GDP est recyclé eneIF2-GTP par eIF2BeIF2-GDPeIF2B + GTP> eIF2-GTPeIF2B + GDPGDPLa phosphorylation de eIF2stabilise le complexe intermédiaireeIF2P-GDP-eIF2B

Régulation de eIF2 par PKRInterferonActivation transcriptionnellePKR2’-5’ oligo(A) synthétase (ds RNA activated kinase)inactiveARN Viral inactiveARNdbATPARNdb2’-5’ oligo(A) synthétaseactiveATPPKRactiveADP2’-5’ poly(A)ADPeIF2P inactivéActivation RNase LDégradation ARN viral

Domaine de dimérisationLa PKR est activée par l’ARN double brinSite de fixation de l’ATP(masqué)INACTIFSite catalytiqueXX XATPARNdbADPSite de fixation de l’ATP(accessible)PPACTIF

La kinase HCR (hemin controlled repressor)Hème incorporédans hémoglobineEn présence d’hèmeEn présence d’hèmeet d’ARNdbEn absence d’hèmetempsAnalyse des protéines phosphoryléesEn absence d’hème il y a phosphorylation de eIF2 et autophosphorylationd’une kinase : HCREn présence d’hème ni eIF2 ni HCR ne sont phosphorylésEn présence d’hème et d’ARNdb il y a phosphorylation de PKR

La kinase HCR (hemin controlled repressor)S-SHèmeSHSHS-SSHSHdimère de kinase inactivemonomère actifSynthèse de globine

Traductionchez lesrotavirus5’AAAAACellular mRNA5’

Régulation post-transcriptionnellede l’apport et du stockage du fer

RecepteurFerrotransferineTransferineApotransferineClathrineEndosome

Expression du géne de la Ferritine(L) légère(H) lourdeExpérience faite avec gène chaine H humaine

Expression du géne de la Ferritine

Expression du génede la Ferritine

Séquence du motif régulateurDémarrage de la transcriptionDémarrage de la traduction

Iron Responsive Element : un motif structural conservé

Modèle de fonctionnement des IRE : les IRP (IREBP)IRP = Iron Regulatory Protein

Régulation du gène du Récepteur de la Transferrine (TfR)

La région 3’ UTR est suffisante pour assurer la régulation

La région 3’ UTR contient plusieurs motifs « IRE-like »La région 3’ UTR contient plusieurs motifs « IRE-like »

La région 3’ UTR contient plusieurs motifs « IRE-like »qui modulent la stabilité de l’ARNm

L’IRP contrôle la traduction de l’ARNm ferritine et la stabilité de l’ARNm TfR

gène?ribonucléotides

Petits ARN, de 50

La découverte des microARN (miRNA) de !Caenorhabditis elegans!Caenorhabditis elegans est un petit nématode hermaphrodite de 0.1 à 1 mm qui contient 959 cellules!dont 302 neurones!Sa transparence permet d’étudier son développement au niveau de chaque cellule!Son cycle de reproduction-développement dure 55 heures à 22°C. Il peut être présenté de la manière!suivante!L1! L2! L3! L4! Adulte!Embryogenèse!Gonadogenèse!Oogenèse!Spermatogenèse!L1, L2, L3 et L4 sont quatre stades larvaires séparées par des mues!

Les microARN!De nombreux gènes ont été identifiés qui contrôlent le développement de C. elegans.!La mutation let-7 retarde l’apparition de certaines structures de l’adulte en phase 4 (fermeture de!structures hypodermiques). L’animal subit une mue et une phase larvaire supplémentaires (L5) avant!d’arriver au stade adulte.!let-7 a été cloné; son surdosage précipite la formation des structures dont l’apparition est retardée!chez le mutant!Le gène et les deux mutations qui confèrent le phénotype let-7 - ont été cartographiées et séquencées!

Comment agit le microARN let-7?!Recherche de complémentarités entre let-7 et les ARNm de gènes impliqués dans le développement!de C. elegans !Des complémentarités partielles sont trouvées dans la région 3"’ UTR de certains ARNm de gènes LIN!(hétérochroniques)!Ces interactions ont elles lieu? Rendent-elles compte du rôle physiologique de let-7?!

Comment agit le microARN let-7?!Une fusion entre un gène rapporteur (lacZ) et la région 3’ UTR de lin-41 est régulée par let-7!lacZ!3"’ UTR de lin-41!Délétion!

Comment est généréle petit ARN let-7 ?!Hypothèse!let-7 forme un complexe (miRNP)!qui inhibe la traduction de l’ARN!Existe-t-il d’autres petits ARN régulateurs dans la cellule?!Comment agissent-ils? !

Recherche des petits ARN dans Caenorhabditis elegans !Les ARN totaux ont été séparés sur un gel de polyacrylamide!La région du gel correspondant aux ARNs de 18-20 nucléotides a été découpée, les ARN ont été élués et!ligués avec des oligonucléotides (ADN ou ADN/ARN) bloqués à une de leur extrémités !(5’ et 3’ RACE : Rapid amplification of cDNA end on 5' or 3' end)Petit ARN!Oligo ADN 5"’!Bloqué en 5"’!Oligo ADN 3"’!Bloqué en 3"’!RT!PCR!Les petits ARN amplifiés ont ensuite été concatémerisés et séquencés!

Les microARN de Caenorhabditis elegans !#Beaucoup de ces petits ARN sont retrouvés sur le chromosome dans des régions!particulières ayant la particularité de former des tiges boucles!Ces petits ARN sont!détectés dans les cellules!à differents stades du!développement!

Un modèle de maturation des miRNA à partir de grands transcrits!Première étape de maturation!Drosha (nucléaire)!Pore nucléaire!DICER (cytoplasmique)!Petits ARN actifs!

Le mode d’action des miARN!Les miRNA peuvent aussi provoquer ladégradation des ARNm auxquels ilssont hybridésPour mémoire : les ARN responsablesde l’interférence d’ARN utilisent la mêmevoie de dégradation de l’ARN médiéepar DICER et RISC (RNA inducedsilencing complex)

Le mode d’action des miARN!Inhibition de la traduction!

Comment les siARN et les miARN déclenchant-ils la dégradation de l’ARN cible!

…is mediated by several mechanisms involving differentmachineries.It is primarily endonucleolytic in procaryotes

Complexe Ccr4/Pop2/notComplexe DCP1&2/Pat1/LSM1-7Xrn1Exosome

La voie de dégradation 5’->3’ commence par ladéadénylation de l’ARNm123Xrn1

Voie de dégradation de polarité 3’ vers 5’(agit sur des ARNm préalablement déadénylés)La dégradation 3’ -> 5’ est médiéepar un complexe multiprotéiqueappelé exosome

L’exosome est un complexe multienzymatique!composé d’exoribonucléases et d’hélicases!hélicases* Sous unité active

Contrôle de qualité (ou surveillance) de l’ARN!

Dégradation poly(A) dépendante de l’ARNt iMetde levure !Exosome!AAAAAA!AAA!TRF4 (PAP)!AAAAAA!AAA!

TRF4 est différente de la Poly(A) polymérase (PAP)!qui synthètise les queues poly(A) des ARNm !

Les différents modes de polyadénylationdéterminent le destin des ARN

Le contrôle de qualité des ARNm :!le Non sens Mediated Decay (NMD)!Les ARNm qui portent des codons stop prématurés sont rapidement dégradéspar un mécanisme appelé NMDIl protège la cellule contre l’apparition de protéines tronquéesCes codns stop «en phase» peuvent être de résultat de mutations(thalassémie) ou d’épissage illégitime…La cellule à développé des mécanismes permettant de dégrader les ARNn’ayant pas de codon stop (Non Stop Decay).EJC = Exon Junction ComplexUpfs = Up frame shift

Les P-bodies : les ARNm peuvent être stockés sous forme inactive puis réactivés