PrÃ©sentation des outils du laboratoire: l t h i h t hi les techniques ...

Présentation des outils du 

laboratoire: 

les techniques chromatographiques 

hi 

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE 

HAUTE PERFORMANCE (HPLC) 

& 

CHROMATOGRAPHIE EN PHASE 

GAZEUSE (GC) 

Emeline Houël – 04/06/2007

RAPPELS THEORIQUES 

• Principe de la CHROMATOGRAPHIE: 

◦ Technique d’analyse pour séparer les constituants d’un mélange en 

phase liquide ou gazeuse 

◦ Les molécules l à séparer sont entrainées par un fluide (liquide id ou gaz) 

= phase mobile 

◦ Elles interagissent (ou pas) avec un support fixe (solide ou liquide 

fixé) = phase stationnaire 

Séparation différence d’affinité des substances à analyser à l’égard 

des deux phases.


Mais aussi: 

CCM & 

Chromatographie 

sur colonne 

GPC / GPCHT: 

HPLC: 

CI: 

GC: 

Chromatographie par perméation de gel 

Chromatographie liquide haute performance 

Chromatographie ionique 

Chromatographie en phase gazeuse


• Résultats t obtenus: 

◦ Sous la forme d’un CHROMATOGRAMME 

= tracé représentatif de la concentration de chaque constituant 

en fonction du temps 

◦ « Un pic = une molécule » 

Exemple de chromatogramme GC

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE 

PERFORMANCE (HPLC) 

• Pi Principe: i 

◦ Exploiter les interactions entre les solutés et deux phases 

◦ Pour séparer les solutés en 

fonction de leurs affinités 

◦ Et les identifier et/ou les doser



• Appareillage: 

◦ Injection: 

Injecteur = 

vanne haute pression 

(manuelle ou non) 

à plusieurs voies 

Chaine HPLC semi-preparative: 

de l’ordre de 45 000 € 

http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/

◦ Colonnes: 



Beaucoup moins rétentif que le 

C18 (généralement nécessite 

un plus grand % d’eau en mode 

phase inverse) 

Analytique: 15 cm x 4.6 mm x 5 µm 

(450 €) 

Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm 

x 5 µm (2500 €) 

Analytique: 15 cm x 4 6 mm x 5 µm 

Analytique: 15 cm x 4.6 mm x 5 µm 

(510 €) 

Semi-préparative: 25 cm x 21.2 mm 

x 5 µm (2800 €)



◦ Détecteurs: 

UV (détecteur à barrette de diodes) 

Indice de réfraction ( RID) 

Diffusion de lumière 

Viscosimétrie, i i conductivité, i électrochimique, i fluorescence, RMN…



• Exemples d’applications 

◦ Etude d’une tisane de Quassia amara 

¤ Profil suivi à 245 nm 

¤ Phase stationnaire C 18 

Time (min) flow (mL/min) % water % ACN curve 

1,00 70 30 

10,00 1,00 50 50 6 

12,00 1,00 0 100 11 

Bertani, S., Houël, E., Stien, D., Chevolot, L., Jullian, V., Garavito, G., Bourdy, G., Deharo, E., 

Simalikalactone D is responsible for the antimalarial properties of an amazonian traditional 

remedy made with Quassia amara L. (Simaroubaceae), J. Ethnopharmacol., 108 (2006), 155-157



◦ Dosage d’un composé: exemple de la Simalikalactone D 

1. Courbe de calibration 

Concentration (mg/mL) Aire du pic 

0 0 

0,0061 137258 

1,22 13933630 

84000000 

305 3,05 38926414 

6,1 69117131 70000000 

56000000 

42000000 

28000000 

14000000 

0 

Aire du pic 

Courbe de calibration 

0 1 2 3 4 5 6 7 

Concentration (mg/ml) 

Droite de régression: Y= 11611021,7856 X 

Quassine 

SkD 

Quassine 

SkD 

Bertani,S.,Houël,E.,Bourdy,G.,Stien,D.,Landau,I.,Deharo,E.,Quassia amara L. (Simaroubaceae) leaf tea: effect of 

the growing stage and dessication status on the antimalarial activity of a traditional preparation, J. 

Ethnopharmacol.,(2007), 111, 40-42



◦ Etude d’extraits de Vouacapoua americana (Wacapou) 

80:20 90:10 95:5 98:2 

99:1 


¤ Phae mobile Hexane / Isopropanol 

¤ Phase stationnaire PEG (mode NP)



◦ Mise au point d’un protocole HPLC pour l’étude d’extraits 

méthanoliques d’Eperua falcata (Wapa): influence de la 

colonne 



¤Mode isocratique i (100 % ACN) 

¤ Phase stationnaire ti i PEG (mode NP) 

¤ Phase stationnaire C 18 

Time (min) flow (mL/min) % hexane % iProp curve 

1,00 99 1 

10,00 1,00 90 10 6 

11,00 100 1,00 99 1 11



Thèse Mariana Royer 

◦ Identification de composés: extraits d’Eperua falcata (Wapa) 

Catéchine = composé 

majoritaire i des extraits 

Chromatogramme de la 

catéchine pure. 

Chromatogramme de 

l’extrait de Wapa à l’acétate 

d’éthyle déthyle. 

Chromatogramme de 

l’extrait d’aubier de Wapa 

au méthanol. 

Chromatogramme 

de l’extrait de 

duramen externe de 

Wapa au méthanol.

Chromatographie en phase gazeuse (GC) 

• Pi Principe: i 

◦ Technique de séparation basée sur les interaction entre les 

composés gazeux et la phase stationnaire


• Appareillage 

Phase mobile 

= gaz vecteur (exemple Hélium) 

Élution 

Injecteur 

Colonne 

= tube de silice qui contient la 

phase stationnaire 

Mass spectrometer 

detector 

Colonne et détecteur 

Traitement 

des données 

GC/MS: de l’ordre de 70 000 €


• Détection: 

◦ Détecteurs universels 

Catharomètre (ou détecteur à conductibilité thermique - DTC): tous 

composés (1 à 10 ng) ) 

Détecteur à ionisation de flamme (FID): composés organiques (20 à 100 pg) 

1. Les composés organiques 

sont ionisés par la flamme 

2. Les ions sont collectés 

dans l’électrode 

3. Obtention d’un courant 

électrique 

◦ Détecteurs spécifiques: sensibilité pour certaines familles de 

composés 

Détecteur à capture d’électrons: composés halogénés é (0,1 pg) ) 

http://perso.orange.fr/sand4/CPG.htm 

http://www.cnrs.fr/cw/dossiers/dosart/ 

http://www.ac-nancy-metz.fr/


• Détectionti 

◦ Détecteurs donnant des informations structurales 

Infra-rouge (IR) 

Spectrométrie de masse (MS) 

g 

g 

MCount s AN024. SMS 30: 450 

30:450 

30 

25 

1A 

20 

15 

10 

5 

0 

GC/MS : Gas Chromatography/ Mass 

Spectrometry 

-GC = séparation des molécules 

volatiles 

-MS = analyse des molécules 

pour leur identification 

10 20 30 40 

minut es 

Spectrum 1A 

BP 161,0 (534543=100%) an024. sms 

19.194 min. Scan: 1011 30:450 Ion: 51 us RIC: 3,471e+6 (BC) 

161.0 

100% 

534543 

105.1 

413708 

75% 

119.1 

367949 

50% 

204.0 

193352 

41.0 

146721 

25% 

81.0 

39.0 

114898 

120.0 

103847 

162.0 

100821 

93300 

43.1 

117.0 

66568 

205.0 

79.2 

60693 

95.1 

54444 

42298 

33195 

0% 

100 200 300 400 

m/z

Chromatographie en phase gazeuse (GC)


• Analyse de l’espace de tête (headspace) par GC (HS/GC) 

◦ Headspace statique: 

◦ Préconcentration: 

Headspace dynamique (DHS) et méthode « purge & trap » (P&T) 

SPME (Solid Phase Microextraction) 

Pérès, C., Begnaud, F., Eveleigh, L., Berdagué, J.-L., Fast 

Characterization of Foodstuff by HeadspaceMassSpectrometry 

(HS-MS), Trends in Analytical Chemistry, 22(11), 2003, 858-866.


• SPME/GC/MS (Solid Phase Micro Extraction) 

Extraction des composés volatils contenus 

dans une matrice solide ou liquide 

Fibre qui piège les volatils 

contenus dans l’espace de 

tête (headspace) 

FIBRE 

SPME 

= EXTRACTION 

GC 

= SEPARATION 

MS 

= IDENTIFICATION

MCounts AN115.SMS 30:450 

30:450 

10.0 

7.5 

5.0 

2.5 

0.0 

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 

minutes 

MCounts an118.sms 30:450 

30:450 

7 

6 

5 

4 

3 

2 

1 

0 

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 

minutes 


30:450 

1.5 

1.0 

0.5 

0.0 

18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 

Seg 1, , Time: 0.00-44.00, EI-Auto-Full, 30-450 m/z 

minutes 


• Influence de la quantité et du temps d’extraction: 

ti 

◦ Analyse de volatils dans des feuilles 

Scan Range: 1 - 2796 Time Range: 0.00 - 43.97 min. Date: 05/04/2007 13:26 



100 mg - 15 minutes 100 mg - 5 minutes 15/30 mg - 5 minutes 

Stage Elodie Courtois, 2007


• Influence du choix de la fibre: 

◦ Analyse des volatils d’un même échantillon d’écorce 


30:450 

4 

Fibre PDMS/DVB 

3 

2 

1 

0 


30:450 

4 

3 

2 

1 

0 

Fibre PDMS 


30:450 

4 

3 

2 

1 

Fibre CAR/PDMS 

PDMS PDMS PDMS PA PDMS/ CAR/ CAR/ CAR/ 

100µm 30µm 7 µm DVB DVB PDMS PDMS/ 

DVB 

volatils 

Semivolatils 

apolaires 

Composés 

apolaires 

de haut 

PM 

Semivolatils 

polaires 

Volatils, 

amines, 

composés 

aromatiques 

nitrés 

Alcools et 

composés 

polaires 

Gaz et 

composés 

de faible 

poids 

moléculaire 

Volatils 

et semivolatils 

: 

arômes et 

odeurs 

Pillonel, L., Bosset, J.O., Rapid Preconcentration and Enrichment Techniques 

for the Analysis of Food Volatile. A Review, Lebensmittel Wissenschaft, 35, 

2002,1-14. 

0 

10 20 30 40 

minutes 

Échelles identiques 



• Influence du choix du programme de température 

◦ Comparaison de la séparation des sesquiterpènes d’un échantillon 

d’écorce 


30:450 

20 

15 

10 

5 

30°C (1 min) 5°C/min 

150°C (5 min) 5°C/min 

250°C 

0 


30:450 

10.0 

7.5 

5.0 

2.5 

30°C (1 min) 5°C/min 

150°C (7 min) 7,5°C/min 

250°C 

0.0 


30:450 

7.5 

5.0 

2.5 

30°C 10°C/min 100°C 

(3 min) 3°C/min 

150°C (4 min) 

7,5°C/min à 250°C 

0.0 

17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 

minutes 



• Exemples d’utilisation: 

◦ Obtention de signatures chimiques d’écorces de bois par 

SPME/GC/MS 

MCoun ts an024.sms 30:450 

30 :45 0 

30 

25 

20 

15 

10 

5 

Vouacapoua americana (Caesalpiniaceae) 

0 

kCoun ts 

30 :45 0 

700 

600 

500 

400 

300 

200 

an037.sms 30:450 

Eperua falcata (Caesalpiniaceae) 

100 

0 

MCoun ts 

30 :45 0 

15 

10 

an049.sms 30:450 

Duguetia surinamensis (Annonaceae) 

5 

0 

kCoun ts an061.sms 30:450 

30 :45 0 

700 

600 

500 

400 

300 

200 

Iryanthera sagotiana (Myristicaceae) 

100 

0 

kCoun ts an068.sms 30:450 

800 30 :45 0 

700 

600 

500 

400 

300 

Gustavia hexapetala (Lecythidaceae) 

200 

100 

0 

1 0 20 30 40 

minutes 


Présentation des outils du laboratoire: 

les techniques chromatographiques 

MERCI DE VOTRE ATTENTION !


• Principe i de la spectrométrie de masse 

y 

z 

- Source d’ions: Bombardement des 

molécules par des électrons qui vont 

les ioniser 

-Φ 0 

Source d'ions 

d 

+Φ 0 

Electrode en calotte 

+Φ 0 

-Φ 0 

x 

Source 

d'ions 

y 

Quadripôle 

Détecteur 

z 

U+V 

y 

Electrode en anneau 

x 

Ions piègés 

x 

- filtres d’ions: 

z 

Electrode en calotte 

de type quadripôle ou trappe ionique 

ne vont laisser passer qu’un type d’ions 

Détecteur

PrÃ©sentation des outils du laboratoire: l t h i h t hi les techniques ...

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