stabilisation de nanoparticules polymères en dispersion aqueuse ...

332 Emmanuel Landreau et al.s'avère très difficile à cause de faible nombre detels produits décrits. Il est ainsi très fréquent de nepas trouver de produit émulsifiant dont lespropriétés soient réellement satisfaisantes parrapport à la propriété recherchée de stabilisationd'une émulsion ou d'une suspension. L'utilisationd'un nouveau composé nécessite une étude detoxicologie très longue et coûteuse car il fautfournir de nombreuses preuves de l'absence detoxicité des composés. On n'entreprend une telledémarche que si on est certain de la qualitéoptimale du composé. Il y a donc un grand intérêt àrechercher de nouveaux composés à propriétésaméliorées et qui puissent être satisfaisants auregard des contraintes de l'application en pharmacieou cosmétique.Parmi les produits émulsifiants pour lesquels ilest possible d'espérer un gain de propriétés, lestensioactifs polymères 2 présentent des avantagescertains qui justifient les études que nousdécrivons. En particulier, les copolymères à blocsqui possèdent un bloc hydrophile et un blochydrophobe (non polaire) ont une structuresimilaire à celle des tensioactifs classiques, maisles propriétés de chaque bloc sont exacerbées: lapartie hydrophile est beaucoup plus polaire quecelle d'un tensioactif classique et il en est de mêmepour la partie hydrophobe. La conséquence estl'obtention de propriétés émulsifiantes commel'abaissement de tension interfaciale pour de trèsfaibles concentrations d'émulsifiant. 3 Cettepropriété permet d'utiliser des quantités moindresd'émulsifiant pour stabiliser une émulsion ou unesuspension. Cela est éventuellement un avantageéconomique, mais surtout, la concentrationrésiduelle d'émulsifiant dans la phase aqueuse estréduite, ce qui diminue les effets secondaires telsl'entraînement d'air et le moussage, l'adsorptionaux autres interfaces, en particulier les surfaces desmembranes cellulaires.Outre l'absence de toxicité des composés et deleur métabolites, les émulsifiants doivent êtrecapables de stabiliser les émulsions ou lessuspensions pendant des périodes très longues, êtrebiocompatible et biodégradables. Enfin pour uneapplication en pharmacie où une substance activesera encapsulée dans une émulsion ou dans departicules de polymère en suspension, il estnécessaire que la forme galénique puisse atteindrela cible thérapeutique et soit donc véhiculéelongtemps dans l'organisme. Un moyen efficaced'éviter la reconnaissance et l'élimination desparticules par le système immunitaire est derecouvrir sa surface par une couche protectrice depolymère hydrophile. 4,5 La partie hydrophile d'unémulsifiant de type copolymère à blocs peutévidemment jouer ce rôle qu'un émulsifiantclassique, très mobile et de petite taille, peutdifficilement assurer.Notre étude s'est portée sur la synthèse etl'évaluation des propriétés émulsifiantes decopolymères à blocs de type poly(caprolactone) –b – poly(oxyde d'éthylène), PCL – b – POE. Leschéma 1 montre la structure chimique générale deces copolymères. Ce type de copolymère etcertains copolymères similaires sont largementétudiés pour des applications en encapsulation etvectorisation, bien qu'aucune exploitation dans uneapplication pharmaceutique n'ait encore vu le jour.Les formulations généralement décrites concernentdes micelles de copolymères à blocs plutôt que leurutilisation pour stabiliser des suspension denanoparticules. 6-11CH 3 (OCH 2 CH 2 ) n (OCCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ) m OHOSchéma 1 – Structure générale des copolymères à blocs poly(oxyde d'éthylène)–b–poly(caprolactone).De tels copolymères comportent un blochydrophobe poly(caprolactone) (PCL) qui est unpolyester biocompatible et biodégradable bienconnu. 12-14 La PCL est en effet largement utiliséecomme polymère de base pour l'encapsulation desubstance actives dans des microsphères ou desnanosphères de polymère. 1 Le bloc hydrophile estcomposé de poly(oxyde d'éthylène) (POE) qui estbiocompatible mais faiblement biodégradable.L'utilisation de POE dans de nombreuxémulsifiants nonioniques tels les Tween® estcependant très courante et bien acceptée. Il est eneffet difficile de trouver des produits hydrophilesde substitution dont les propriétés soientsatisfaisantes. Les deux paramètres qui contrôlentles propriétés de ces copolymères sont les degrésde polymérisation des blocs PCL et POE. Leprocédé de synthèse que nous décrivons permet defaire varier à volonté les degrés de polymérisationdes deux blocs afin de pouvoir effectuer une étudesystématique sur les relations entre structurechimique et propriétés.

Stabilisation de nanoparticules polymères 333L'évaluation des propriétés consiste en uneétude de l'émulsification de la poly(caprolactone)dans l'eau par la méthode de "nanoprécipitation" 15,16en utilisant les copolymères à blocs commeémulsifiants. Deux paramètres principaux serontétudiés: i) la possibilité de fabriquer une suspensionde PCL à l'aide de ces émulsifiants; ii) la stabilitédes suspensions ainsi préparées à long terme etdans un test de floculation accélérée.Les nanoparticules de PCL biocompatible etbiodégradable 12-14 qui sont produites par un telprocédé peuvent être utilisées pour la vectorisationde substances actives hydrophobes qui auraient étédissoutes dans la phase organique au moment de lapréparation de la suspension de nanoparticules [1].La structure globale des nanoparticules ainsipréparées (Fig. 7) consiste en un cœur depoly(caprolactone) entouré d'une écorce decopolymères à blocs qui assure la stabilitécolloïdale de la suspension et prévient lareconnaissance des particules par le systèmeimmunitaire dans l'organisme. Cette structure estsemblable à celle des micelles de copolymères àblocs qui a été beaucoup étudiée par ailleurs ; 3,17-20les particules de l'étude que nous présentons sontcependant différentes car elles contiennent de laPCL à l'intérieur et la taille des particules est doncbeaucoup plus grande.RÉSULTATS ET DISCUSSION1. Synthèse des copolymèresLa synthèse des copolymères à blocs MPEG –b – PCL a été effectuée par polymérisationanionique coordinée de l'ε-caprolactone enprésence de MPEG comme agent de transfert etAlEt 3 pour la synthèse de l'alcoolate qui seral'amorceur de la polymérisation. Le principe de lapolymérisation de l'ε-caprolactone en présenced'un agent de transfert, couramment utilisée pour lasynthèse d'oligomères fonctionnels, 21-23 peut êtretrès facilement étendu à la synthèse decopolymères à blocs lorsque le premier bloc peutlui-même jouer le rôle de l'agent de transfert, ce24, 25qui est le cas des chaînes POE ou MPEG(Schéma 2).OOCH 3 (OCH 2 CH 2 ) n OHCH 3 (OCH 2 CH 2 ) n (OCCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ) mSchéma 2 – Schéma de principe de la synthèse des copolymères à blocs MPEG – b – PCL.OOHLe degré de polymérisation moyen en nombre X nest facilement contrôlé par la quantité de l'agent detransfert mis en œuvre selon la relation usuelle :Xn=[ caprolactone][ MPEG]Trois MPEG commerciaux de masse molairecroissante (M n = 350, 750 et 5000 g/mol ce quicorrespond à des X n = 7,6, 16,7 et 113,3respectivement) ont été utilisés comme agent detransfert. Les copolymères ont été caractérisés parRMN du 1 H et par spectrométrie de masse Maldi –Tof. Connaissant la longueur de la chaîne MPEGinitiale, il est aisé par RMN d'en déduire lalongueur de la chaîne PCL greffée (Fig. 1). Lespectre de masse Maldi – Tof est a priori plusdélicat à interpréter mais permet dans un premiertemps de vérifier l'absence de produits secondaires,ainsi que de produits cycliques qui seraientindécelables par RMN. La Fig. 2 montrel'élargissement d'une zone du spectre de masse. Cespectre est la résultante de la distribution du MPEGde départ sur laquelle s'ajoute la distribution deschaînes PCL sur chaque chaîne de MPEG. Onretrouve ainsi les pics spécifiques de chaque chaînecopolymère avec des écarts de m/z de 114correspondant à une unité caprolactone et 44 pourl'unité oxyde d'éthylène. La structure descopolymères utilisés dans la suite de l'étude estrapportée dans le tableau 1.

334 Emmanuel Landreau et al.α β γ δ εCH 3 (OCH 2 CH 2 ) n (OCCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 ) mOHOεαCH 3β + δγ35.84 3.0038.28 76.4637.844.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0Fig. 1 – Spectre RMN du 1 H d'un copolymère à blocs MPEG – b – PCL. La raie à δ = 3,65 ppm correspond aux unités -CH 2 CH 2 O-.∆m = 114,07[17,8]∆m = 44,03[17,9][19,8]1716.7 [18,8]1786.71829.71715.71741.7 1785.71803.71759.71811.71761.7[12,10]1769.71813.81724.7 [10,11] 1778.7 1821.71725.7[11,11][12,11]Fig. 2 – Élargissement d'une zone du spectre de masse Maldi-Tof d'un copolymère. Les nombres entre crochets correspondent aunombre d'unités CL et OE du copolymère.2. Formulation des dispersionset caractérisationsTous les copolymères répertoriés dans leTableau 1 sont solubles dans l'acétone. Seul lecopolymère (113 – 10) présente une certainesolubilité dans l'eau. La valeur du nombre HLB aété estimée selon la formule de Griffin :MnPEGHLB = 20×M copolymèreLes dispersions de polycaprolactone sontpréparées par nanoprécipitation de la PCL ennsolution dans l'acétone dans un plus grand volumed'eau. Selon sa solubilité, le copolymère est présentdans la phase organique avec la PCL oupréalablement mis en solution dans l'eau. De façon,générale, le protocole opératoire consiste àdissoudre 0,2 g de PCL (M n = 80000 g/mol) et0,1 g de copolymère à blocs dans 25 mL d'acétone.Cette solution est alors injectée rapidement dans50 mL d'eau. L'acétone est ensuite éliminée àl'évaporateur rotatif.La dernière colonne du Tableau 1 rapporte lesobservations concernant la stabilité des dispersionsobtenues. Seuls les copolymères avec une chaînePEG de masse 5000 g/mol (Xn = 113) conduisent à

Stabilisation de nanoparticules polymères 335des dispersions stables. La diminution de la longueurde la séquence PEG provoque une floculationpartielle et souvent immédiate de la suspension.Dans le cas des suspensions stables, la mesuredes tailles de particules a été effectuée pardiffusion dynamique de lumière. On vérifie bienque l'augmentation de la proportion de tensioactifpolymère provoque une diminution de la taille desparticules (Fig. 3). D'autre part, la stabilitécolloïdale des dispersions dans le temps a étévérifiée par mesure des tailles pour différentstemps de stockage (Fig. 4).Tableau 1Structure chimique et propriétés des dispersions de PCL obtenuesX n MPEG X n PCL HLB Aspect de la suspension8 10 4,6 Précipitation immédiate17 5 11,2 Précipité + Suspension laiteuse17 10 7,8 Précipité + Suspension laiteuse113 10 16,2 Suspension laiteuse113 20 13,6 Suspension laiteuse113 25 12,6 Suspension laiteuse113 30 11,7 Suspension laiteuse113 40 10,3 Suspension laiteuse270Fig. 3 – Évolution de la taille des particules avec laquantité de tensioactif polymère (113 – 10).270diamètre (nm)250230210190170Copolymère / PCL(masse)0 0,5 1 1,5 2 2,5 3tailles des particules (nm)250230210190100 joursFig. 4 – Taille des particules et effet du stockage sur lastabilité colloïdale.X n (MPEG) = 113; X n (PCL) = 10 (); 30 (∗); 40 ().3. Stabilité des particulesLa stabilité des particules peut être abordée enétudiant sa vitesse de déstabilisation par additionde sel (Na 2 SO 4 ) de façon à provoquer la floculation(coagulation) par effondrement de la couche depolymère adsorbée. La vitesse de coagulation estobtenue par mesure de l'évolution de l'absorbancedes dispersions en fonction du temps. La Fig. 5montre le profil habituel rencontré pour ce typed'expérience avec deux zones distinctes. Lapremière zone, observée pour de faibles quantitésde sel ajouté, correspond à une coagulation lente,la vitesse de coagulation augmentant avec laquantité de sel ajouté. La deuxième zonecorrespond à une vitesse de coagulation indépendantede la quantité de sel. La vitesse de coagulation yest maximale (coagulation rapide). On définit lerapport de stabilité de Fuchs W par le rapport de lavitesse rapide sur la vitesse observée. Laconcentration critique de coagulation (CCC) est laconcentration d'électrolyte nécessaire pour atteindre

336 Emmanuel Landreau et al.le régime de coagulation rapide où W est égal àl'unité. La Fig. 6 montre l'évolution de log(W) enfonction de la concentration d'électrolyte pour desdispersions stabilisées par quelques copolymères.On observe que la valeur de la CCC restesensiblement la même autour de 190 g/L quelleque soit la longueur de la chaîne PCL avectoutefois un comportement différent pour lecopolymère à 10 unités PCL. La valeur de Wdiminue très rapidement, traduisant une stabilisationmoindre de ces dispersions.Vitesse decoagulationCoagulationlenteCoagulationrapideFig. 5 – Comportement de principe observé dans une expériencede coagulation par un électrolyte.CCCLog [sel]Fig. 6 – Évolution delog log(W) avec la concentration desel ajouté à la dispersion.Influence de la nature du copolymère.Log(W)3,532,521,510,50MPEG 113 - PCL 10MPEG 113 - PCL 20MPEG 113 - PCL 402,13 2,17 2,20 2,23 2,25 2,28 2,30 2,42 2,52Log[Na 2 SO 4 ]La déstabilisation des dispersions se fait à desteneurs élevées en sel. Cette déstabilisation est laconséquence de la "déshydratation" des chaînesPEG par le sulfate de sodium, les solutions salinesétant des mauvais solvants pour les chaînes PEG.Les chaînons PEG ont alors tendance à s'effondrersur elles-mêmes (diminution du volumehydrodynamique), diminuant par là la stabilisationstérique des suspensions. On retrouve globalementles mêmes valeurs de CCC car la longueur de laséquence PEG est la même pour tous lestensioactifs étudiés ici. La longueur de la séquencePCL doit influer sur "l'ancrage" du copolymère àl'interface, une faible longueur diminuantl'efficacité de l'adsorption (Fig. 7).Fig. 7 – Représentation schématique de la stabilisation de nanoparticules parles copolymères PEG – PCL. La chaîne PCL hydrophobe (gris foncé) est"ancrée" à l'intérieur de la nanoparticule tandis que séquence PEGhydrophile (gris clair) est déployée à l'extérieur.

Stabilisation de nanoparticules polymères 337CONCLUSIONLes copolymères à blocs de type PCL-b-POE sesont révélés être des émulsifiants efficaces pourréaliser les suspensions aqueuses de PCL. L'étudesystématique en fonction de la longueur des blocs amontré qu'il est nécessaire d'avoir les copolymèresdont le bloc POE soit suffisamment long,typiquement 5000 g/mol (X n = 113). Lescopolymères qui donnent des résultats négatifs nepermettent pas l'émulsification de la PCL par leprocédé de nanoprécipitation ou donnent dessuspensions instables qui coagulent et sédimententtrès rapidement. Même si le copolymère est solubledans l'eau, il est préférable de l'introduire dans laphase organique lors de l'émulsification.Les suspensions de tailles typiques comprisesentre 200 et 300 nm sont obtenues avec tous lesémulsifiants copolymères pour lesquels X n = 113.Ces suspensions sont stables pendant plusieursmois de stockage et résistent très bien à lacoagulation par les électrolytes.Ces copolymères sont donc de bons candidatspour une utilisation en formulation de suspensions.Bien que l'étude n'ait été réalisée que sur leprocédé de nanoprécipitation, il est raisonnable depenser que de tels émulsifiants polymères puissentconvenir pour d'autres procédés d'émulsification etaussi pour l'émulsification d'autres polymères quele PCL, voire d'huiles diverses. L'utilisation pourdes application en galénique pharmaceutiquedemandera un travail d'évaluation plus approfondi,d'une part de manière évidente sur la toxicité deces composés, mais aussi sur leur comportement invivo. En particulier, l'évaluation de leur résistanceau système immunitaire et de leur compatibilitéavec les autres composés véhiculés dans lacirculation sanguine est d'une grande importance.REFERENCES1. R. Arshady, "Microspheres, Microcapsules & Liposomes",R. Arshady Editeur Citus Books, 1999, Vo1 1.2. I. Piirma, "Polymeric surfactants", Marcel Dekker, 1992.3. G. Riess, Prog. Polym. Sci., 2003, 28, 1107.4. R. Gref, A. Domb, P. Quellec, T. Blunk, R.H. Müller,J.M. Verbavatz et R. Langer, Adv. Drug Delivery Rev.,1995, 16, 215.5. K. Holmberg, F. Tiberg, M. Malmsten et C. Brink,Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 1997,123-124, 297.6. M.N.V. Ravi Kumar, N. Kumar, A.J. Domb et M. Arora,Adv. Polym. Sci., 2002, 160, 45.7. P.L. Soo, L. Luo, D. Maysinger et A. Einsenberg,Langmuir, 2002, 18, 9996.8. F. Ravenelle et R.H. Marchessault, Biomacromolecules,2003, 4, 856.9. B. Shi, C. Fang, M.X. You, Y. Zhang, S. Fu et Y.Y. Pei,Colloid Polym. Sci., 2005, 283, 954.10. S.-J. Park, K.-S. Kim et S.-H. Kim, Colloids Surfaces B:Biointerfaces, 2005, 43, 238.11. A. Mahmud et A. Lavasanifar, Colloids Surfaces B:Biointerfaces, 2005, 45, 82.12. U. Edlund et A.-C. Albertsson, Adv. Polym. Sci., 2002,157, 67.13. A.-C. Albertsson et I.K. Varma, Biomacromolecules,2003, 4, 1466.14. S. Wang, Q. Cai et J. Bei, Macromol. Symp., 2003, 195, 263.15. I. Montasser, S. Briançon, J. Lieto et H. Fessi, J. Pharm.Belg., 2000, 55, 155.16. I. Montasser, H. Fessi, S. Briançon et J. Lieto, Brevets FR2806005 (2000); US 2003059473 (2001); WO 0168235(2001).17. C.R. Heald, S. Stolnik, K.S. Kujawinski, C. De Matteis,M.C. Garnett, L. Illum, S.S. Davis, S.C. Purkiss,R.J. Barlow et P.R. Gellert, Langmuir, 2002, 18, 3669.18. T. Riley, C.R. Heald, S. Stolnik, M.C. Garnett, L. Illum,S.S. Davis, S.M. King, R.K. Heenan, S.C. Purkiss,R.J. Barlow, P.R. Gellert et C. Washington, Langmuir,2003, 19, 8428.19. P. Vangeyte, S. Gautier et R. Jérome, Colloids Surfaces A:Physicochem. Eng. Aspects, 2004, 242, 203.20. K. Letchford, J. Zastre, R. Liggins et H. Burt, ColloidSurfaces B : Biointerfaces, 2004, 35, 81.21. C. Delaite-Miola, Th. Hamaide et R. Spitz, Macromol.Chem. Phys., 1999, 200, 1771.22. Th. Hamaide, M. Pantiru et H. Fessi. Chem. Bull."Politechnica" Univ (Timisoara), 2001, 46, 46.23. M. Pantiru, C. Iojoiu, T. Hamaide et F. Delolme, PolymInt., 2004, 53, 506.24. C. Iojoiu, C. Racles, V. Harabagiu et Th. Hamaide, Chem.Bull. "Politehnica" Univ (Timisoara), 2003, 48, 230.25. C. Iojoiu, Th. Hamaide, V. Harabagiu et B.C. Simionescu,J. Polym. Sci. Part A. Polym. Chem., 2004, 42, 689.