Kuliah 7 Teknologi DNA Rekombinan.pdf

Teknologi DNA RekombinanKapas biasaKapas-Bt1

Tomat biasaTidak tahan hamaTomat-BtTahan hama►Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt tahan terhadap serangan hamakarena menghasilkan toksin yang dapat membunuh hamanya.►Toksin pada kapas-Bt dan tomat-Bt disandikan oleh gen yang berasaldari bakteri Bacillus thuringiensis (Bt = Bacillus thuringiensis)Tanaman kapas-Bt dan tomat-Bt = tanaman transgenik2

Organisme transgenik: organisme yang membawa gen yangberasal dari jenis organisme lainnya.Organisme transgenik dihasilkan melalui Rekayasa GenetikaRekayasa Genetika menggunakan Teknologi DNA RekombinanTeknologi DNA Rekombinan : kumpulan teknik atau metoda yangdigunakan untuk mengkombinasikan gen-gen secara buatan.(Proses: rekombinasi; Hasil: rekombinan)Teknologi DNA Rekombinan meliputi:- Teknik untuk mengisolasi DNA.- Teknik untuk memotong DNA.- Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA.- Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehinggaDNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan.3

Teknologi DNA Rekombinan berdasarkan mekanisme yangada pada bakteri:4

Percobaan Lederberg dan Tatum (1946) menunjukkan:bakteri mempunyai mekanisme seksual:- menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yangberasal dari dua sel yang berbeda.- merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sellainnya. Mekanisme seksual pada bakteri ini tidakbersifat reproduktif (tidak menghasilkan anak atau zuriat).Lihat konjugasi !DNA dapat masuk ke dalam sel bakteri melalui 3 cara:1. Konjugasi2. Transformasi3. Transduksi5

1. Konjugasi : perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam sel bakterilainnya (sel resipien) melalui kontak fisik antara kedua sel.DNA sel donorDNA sel resipienPili seksSel donor(sel jantan)Sel resipien(sel betina)2. Transformasi : pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan disekelilingnya.DNA asingKromosom bakteri(DNA bakteri)6

3. Transduksi : cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sellainnya melalui perantaraan fage.DNA fageKromosom bakteriDNA yang masuk ke dalam sel bakteri:a. dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNArekombinan atau kromosom rekombinan.KromosomDNA asing Kromosom bakterirekombinanSel Bakterib. tidak dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteriBy Aris Tj7

Perangkat utama yang digunakan pada pembentukanDNA rekombinan:•plasmid•enzim restriksi•DNA ligase•bakteri‣ Plasmid:• Terdapat pada bakteri• DNA selain kromosom• Berbentuk sirkuler• Umumnya berukuran kecil (lebih kecil dariukuran kromosom bakteri)• Jenis, jumlah, dan ukurannya bervariasiantar sel dan antar jenis bakteri8

‣ Enzim Restriksi untuk memotong DNA:Contoh: Enzim EcoRI telah diisolasi pertama kali oleh HerbertBoyer pada tahun 1969 dari E.coli.Enzim EcoRI memotong pada bagian antara basa G dan A padasekuens GAATTC.9

Setiap enzim restriksi (endonuklease restriksi) mengenalsekuen pemotongan yang khas dan memotong DNA padasitus pemotongan yang khas.Nama Enzim Sekuens Pengenal Organisme asalEcoRI G↓AATTC Escherichia coliHindIII A↓AGCTT Haemophilus influenzaeHhaI GCG↓C Haemophilus haemolyticusTaqI T↓CGA Thermus aquaticusBsuRI GG↓CC Bacillus subtilisBalI TGG↓CCA Brevibacterium albidumNotI GC↓GGCCGC Nocardia otidiscaviarumBamHI G↓GATCC Bacillus amyloliquefaciensSmaI CCC↓GGG Serratia marcescens9

‣Enzim DNA ligase untuk menyambung DNA10

Menggunakan enzim restriksi dan DNA ligase: Jackson, Simon &Berg (1972) berhasil membuat DNA rekombinan.12

KromosombakteriBagaimana menyisipkan, memperbanyak danmengekspresikan informasi genetik dengan menggunakanteknologi DNA rekombinan?BakteriPlasmidPlasmidrekombinanBakterirekombinanIsolasi PlasmidPenyisipan genIsolasigenPerbanyakan sel bakteriGen yang diinginkanSel berisi genyang diinginkanMemasukkan plasmid ke dalam sel bakteriCopy genCopy proteinGen disisipkanpadatanamanGen untuk mengubah bakteri agardapat membersihkan limbahKlon bakteri rekombinanProtein untuk melarutkan gumpalan darahdalam terapi serangan jantungProtein untukmembuat salju13

Fungsi Plasmid pada pembentukan DNA rekombinan:a. digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan genatau mengklonkan fragmen DNA ataumengubah sifat bakteri.b. untuk memperbanyak gen (copy gene) yangtelah disisipkan dengan bantuansel bakteri

‣ Bagaimana menyimpan seluruh informasi genetik dari suatuorganisme??Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yangtelah diklonkan.• Isolasi gen menggunakan pendekatan “shotgun” dapat menghasilkan ribuanpotongan DNA (fragmen DNA)• Potongan disimpan untuk sementara waktu di dalam pustaka plasmid ataupustaka fage15

Bagaimana mendeteksi DNA atau fragmen DNA? Teknik Elektroforesis digunakanuntuk memisahkan fragmen-fragmen DNA berdasarkan ukurannya.Campuran molekulDNA dengan berbagai ukuranSumberlistrikGelMolekul berukurbesarMolekul berukurkecil(+)Fragmen DNA yang lebih besar bergerak lebih lambat, fragmen yang lebih kecilbergerak lebih cepat.16

‣ Bagaimana membuat dan menyisipkan DNA rekombinan padatanaman: Bakteri Agrobacterium tumefaciens untukmenyisipkan gen ke dalam genom tanaman.Prinsip: Agrobacterium tumefaciens strain liar (galur alami) memilikiplasmid Ti. Pada plasmid Ti terdapat T-DNA yang mengandunggen penyebab tumor. Pada waktu menginfeksi tanaman, Agrobacterium tumefaciensmenyisipkan T-DNA ke dalam kromosom sel tanaman sehinggasel-sel tanaman yang terinfeksi membentuk tumor.T-DNAPlasmid TiT-DNAKromosombakteriAgrobacteriumKromosomtanaman17

Gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam sel tanaman dengancara menitipkannya (menyisipkan) pada T-DNA. Agrobacterium yang digunakan untuk menginfeksi sel tanamanadalah Agrobacterium yang sudah tidak patogenAgrobacteriumDNA mengandunggen yang diinginkanPlasmid-TiPenyisipan genIntroduksi kedalam seltumbuhanRegenerasitanamanT-DNASitus restriksiPlasmid-TirekombinanT-DNA membawagen baru padakromosom tumbuhanTanamandengan sifat baru18

ManfaatTeknologi DNA rekombinan telah memberikan manfaat di bidang ilmupengetahuan maupun di bidang terapan.Contoh:A. Bidang Kesehatan:A1. Insulin manusia telah diproduksi secara massalmenggunakan bakteri E.coli dan telah diperdagangkanuntuk mengobati penyakit diabetis.Merek dagang: Humulin RA2. Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksivirus hepatitis. Telah diproduksi secara komersialmenggunakan S.cereviciae dalam skala industriA3. Hormon tumbuh manusia (GH) diproduksimenggunakan E.coli dan digunakan untuk mengobatikelainan pertumbuhan (misal: cebol).19

A4. Therapi gen untuk penyakitdilakukan dengan menggantikan gen yangmengalami kerusakan dengan gen yangnormal, digunakan untuk mengobatipenyakit-penyakit keturunan (geneticdisorders) dan penyakit lain yangdisebabkan oleh kerusakan gen (misal:kanker)Klon gen(alel normal)Penyisipan normalgen pada vektorDNA rekombinanVektor retrovirusInfeksi sel bonemarrowDNA rekombinanmenyisip kekromosomSel bone marrowdari pasienSel Bone marrow mengandung stem selyang mampu miningkatkan semua sel-sel darah dansistem imunInjeksi selke pasien20

B. Bidang Pertanian:B1. Bakteri Ice - (ice minus): bakteri yang telahdirekayasa sehingga tidak membeku pada suhurendah.Digunakan (disemprotkan) pada tanaman agartanaman tidak membeku di musim dingin.Telah diperdagangkan dengan merek Frostban R .B2. mikroba pendegradasi limbah.B3. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat BtB4. Tanaman tahan herbisida.21

B 5. Peningkatan nilai nutrisiTanaman Penambahannutrisi KeuntunganRice Provitamin Vitamin AsupplementTomato Flavonoid AntioxidantSugar beet Fructants Low caloriRice Iron Ironsupplement22

Bioteknologi Kelautan• Penggunaan hormon pertumbuhan untuk meningkatkanukuran ikan23

C. Bidang Hukum:Pelaku kejahatan dapatdiidentifikasi denganmenggunakan analisisSidik Jari DNAmisalnya: kasus perkosaanPenanda (marker)Tersangka 1vagina korbanTersangka 2Penanda (marker)•pola pita DNA pada darah pelaku ke 2sama dengan pola pita yang diperolehdari tempat kejadian- orang ke 2adalah pelaku kajahatannya24

Hubungan keluarga berdasarkan DNA FingerprintBagaimana mencari siapa ibu kita?-DNA mitokondria diwariskan melalui ibu

Perbedaan pada urutan DNA dapat diketahui dengan teknik RFLP(restriction fragment length polymorfism)- untuk menentukan keturunan,-perbedaan antar satu organisme dengan yang lain.Pemotongandenganenzim restriksiMolekulberukuranbesarMolekulberukurankecilDNA yang berasal dari kromosom

D. Bidang pengembangan ilmu pengetahuan:D1. Membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia(penyakit genetik) misalnya kanker payudara, Huntington’s disease.Huntington’s disease disebabkan oleh gen dominan• Gejala sakit mulai terlihat setelah usia pertengahan• Gejalanya antara lain: kemunduran mental, gerakan tubuh takterkontrol, kesulitan bicara. Biasanya meninggal 10 – 20 tahunsetelah timbul gejala.D2. Kemajuan Teknologi DNA telah mendorong para ilmuwan(konsorsium ilmuwan internasional) untuk mewujudkan proyekgenom manusia dan genom organisme lainnya25

Teknologi DNA Rekombinan juga mengandung resiko.Penyebaran pollen berpotensi menyebarkan gen yang diintroduksidalam tanaman transgenik ke dalam tumbuhan lainnya22